LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARINĖS MEDICINOS STUDIJŲ PROGRAMA
Laima Šimkutė
6 kursas 2 grupėVirusinių ligų paplitimas kai kuriuose galvijininkystės
ūkiuose
The prevalence of viral diseases in some of the livestock
farms
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. Dr. Algirdas Šalomskas
2
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Virusinių ligų paplitimas kai kuriuose galvijininkystės ūkiuose “.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1 GALVIJININKYSTĖS BŪKLĖ LIETUVOJE ... 10
1.2 LIGŲ PAPLITIMAS LIETUVOJE... 11
1.3 ROTAVIRUSAS ... 13 1.3.1 Sukelėjas ... 13 1.3.2 Plitimas ir patogenezė ... 13 1.3.3 Epidemiologija ... 14 1.3.4 Klinikiniai požymiai ... 14 1.3.5 Diagnozė ... 15 1.3.6 Gydymas ... 15 1.4 KORONAVIRUSAS ... 16 1.4.1 Sukelėjas ... 16 1.4.2 Plitimas ir patogenezė ... 16 1.4.3 Epidemiologija ... 17 1.4.4 Klinikiniai požymiai ... 17 1.4.5 Diferencinė diagnozė ... 18 1.4.6 Gydymas ... 18
1.5 RESPIRATORINIS SINCITINIS VIRUSAS ... 19
1.5.1 Sukelėjas ... 19
1.5.2 Epidemiologija ... 19
1.5.3 Klinikiniai požymiai ... 20
1.5.4 Patologiniai anatominiai pokyčiai ... 20
4
1.6.5 Patologiniai anatominiai pokyčiai ... 23
1.6.6 Gydymas ... 23
1.7 VERŠELIŲ PASYVI IMUNIZACIJA ... 24
2. METODIKA ... 25
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 29
4. APTARIMAS... 34
5. IŠVADOS ... 37
5
SANTRUMPOS
CV – koronavirusas
GVD – galvijų virusinė diarėja IFA – imunofermentinė analizė
IGR – infekcinis galvijų rinotracheitas
NMVRVI - Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas OT – optinis tankis
PI – pasikliautinasis intervalas
6
SANTRAUKA
VIRUSINIŲ LIGŲ PAPLITIMAS KAI KURIUOSE GALVIJININKYSTĖS ŪKIUOSE Ypač svarbią reikšmę Lietuvos žemės ūkiui turi viena iš gyvulininkystės šakų – galvijininkystė. Jos plėtrai didelę žalą daro galvijų užkrečiamosios, ypač virusinės, ligos, todėl būtina greitai, tiksliai ir efektyviai diagnozuoti galvijų virusines ligas, užkirsti kelią jų plitimui Lietuvoje. Kvėpavimo ir virškinimo trakto ligomis galvijų prieauglis serga visose pramoninės gyvulininkystės šalyse, dėl šių ligų galvijai gaišta žymiai dažniau, nei nuo reprodukcijos, medžiagų apykaitos ligų ar mastitų. Didesnį veršelių susirgimų skaičių ir gaišimą nuo enteritų bei respiratorinių ligų galima būtų paaiškinti dideliu virusinių ligų – GVD, IGR, PG-3, RSV, adenovirusų ,RV, CV ir bakterinių infekcijų išplitimu. Mūsų darbo tikslas buvo atlikti galvijų užkrečiamųjų virusinių ligų paplitimo analizę, ištirti CV, RV, RSV ir adenovirusų paplitimą galvijų bandose.
Dėl rota ir korona virusų buvo ištirti 56 išmatų mėginiai, dėl antikūnų prieš adenovirusą – 20, RS virusą 28 kraujo serumo mėginiai. Šiems tyrimams buvo naudojami komerciniai standartizuoti imunofermentinės analizės (IFA) rinkiniai. Veršelių 30 kraujo serumo mėginių buvo ištirti pusiau kiekybiniu natrio sulfito precipitacijos metodu, dėl imunoglobulinų kiekio nustatymo. Tyrimai atlikti LSMU VA Užkrečiamųjų ligų katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologijos skyriuje 2013 metais.
Įvertinus padėtį 3 ūkiuose, kur buvo atlikti ligų tyrimai, nustatyta, kad rotavirusine infekcija vidutiniškai buvo užsikrėtę 31,25% tirtų galvijų, koronavirusais 0%. Antikūnų prieš RSV rasta 56,67%, prieš adenovirusus 30% tirtų veršelių. Vidutiniškai 23,33% tirtų veršelių savo kraujyje turėjo labai žemą Ig kiekį.
Darbo apimtis: 46 puslapiai, panaudoti 112 literatūros šaltiniai, 4 lentelės, 5 paveikslai.
Raktažodžiai: rotavirusai, koronavirusai, adenovirusai, respiratoriniai sincitiniai virusai,
7
SUMMARY
THE PREVALENCE OF VIRAL DISEASES IN SOME OF THE LIVESTOCK FARMS
Cattle take a very important place in Lithuanian agriculture. Since the development of livestock can be seriously affected by contagious diseases, especially viral ones, it is highly important quickly, accurately and efficiently diagnose viral disease of cattle, and to prevent its spreading in Lithuania. In all livestock farming industry countries, cattle offspring are suffering from respiratory and digestive tract diseases. They are dying from these diseases more often than from reproductive, metabolic diseases and mastitis. Increasing calves’ cases and mortality rate from enteritis and respiratory diseases can be explained by the high viral diseases such as GVD, IGR, PG-3, RSV, adenovirus, RV, CV and bacterial infections spread. The goal of our study was to analyze the spread of livestock infectious viral diseases and examine the CV, RV, RVS and adenovirus prevalence in the cattle herds.
56 fecal samples were tested for the rotavirus and coronavirus, 20 – for antibodies against adenovirus, and 28 blood serum samples for RS virus. To test these samples, we used standardized commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. 30 blood serum samples of calves were analyzed by quantitative sodium sulfite precipitation method for the determination of immunoglobulin. The tests took place at LSMU VA Department of Infectious Diseases and National Food and Veterinary Risk Assessment Institute, Department of Virology in 2013.
Cattle from 3 farms were assessed for anticipated diseases and the results showed that on average 31.25% of the tested cattle had rotavirus infection, 0% coronaviruses. 56.67% had antibody against RVS and 30% of tested cattle had antibody against adenovirus. On average 23.33% of tested cattle had very low amount of Ig in their blood.
Work size – 46 p., used literature 112., 4 tables and 5 imagines
Keywords: Rotavirus, coronavirus, adenovirus, respiratory syncytial viruses, immunoglobulins,
8
ĮVADAS
Ypač svarbią reikšmę Lietuvos žemės ūkiui turi viena iš gyvulininkystės šakų – galvijininkystė. Jos plėtrai didelę žalą daro galvijų užkrečiamosios, ypač virusinės ligos, todėl būtina greitai, tiksliai ir efektyviai diagnozuoti galvijų virusines ligas, užkirsti kelią jų plitimui Lietuvoje. Anksčiau nustatant virusines ligas galima išvengti didelių ekonominių nuostolių, kurie susidaro susirgus galvijams, gaišimo atveju, sumažėjus mėsos, pieno ir kitai produkcijai, netekus gyvulių prieauglio ir bandų veislinio branduolio ( Milius ir kt., 2005).
Dažnai galvijų virusinės ligos esti besimptomės arba pasireiškia nebūdingais požymiais. Tai priklauso nuo galvijų organizmo rezistentiškumo, laikymo sąlygų, ligos sukėlėjų atsparumo aplinkos sąlygoms, jų virulentiškumo, persistencijos ir kt. Taigi tikslinga išsiaiškinti, kokios virusų padermės cirkuliuoja, kaip jos kinta, kokią reikšmę tai turi profilaktikai. Lietuvos galvijininkystės ūkiuose reikia nuolatinės epizootinės virusinių galvijų ligų analizės bei šių ligų sukėlėjų biologinių savybių tyrimo. Palyginus tokių tyrimų duomenis ir įvertinus virusų cirkuliacijos bandose ypatumus, galima kurti ir tobulinti galvijų bandų stebėsenos ir ligų kontrolės programas. (Šalomskas ir kt., 2008).
Galvijų kvėpavimo takų ligų kompleksas, kuriam būdingi įvairūs klinikiniai simptomai ir epidemiologiniai požymiai, registruojamas daugelyje pasaulio šalių. Kvėpavimo takų ligomis serga įvairaus amžiaus galvijai, bet dažniausiai – prieauglis tuo metu, kai susilpnėja pasyvusis imunitetas ir dar nėra susidaręs aktyvusis imunitetas. Tokie veršelių susirgimai vadinami enzootine pneumonija, arba bronchopneumonija (Radostits et al., 2000).Dažni bronchopneumonijų sukėlėjai yra paragripo 3 virusai ir respiratoriniai sincitiniai (RS) virusai, rečiau – infekcinio galvijų rinotracheito virusai, adenovirusai, koronavirusai ar mikoplazmos (Šiugždaitė, 2002; Snowder et al., 2006; Autio et al., 2007). Pastaruoju metu įrodyta, kad veršelių kvėpavimo takų ligas sukelia galvijų virusinės diarėjos virusai, kurie, kaip manyta anksčiau, gali sukelti tik viduriavimą (Ganheim et al., 2003).
9 Adeno virusų infekcijos sukėlėjas – Adenoviridea šeimos, Mastadenovirus genties DNR virusai. Adeno virusų infekcijos šaltinis yra sergantys gyvūnai, platinantys virusus per nosies išskyras ir fekalijas. Šiais virusais užsikrečiama aerogeniniu ir alimentiniu keliu. Pasireiškia konjuktyvitas, dusulys, padažnėjęs kvėpavimas ir viduriavimas. Būdingos serozinės išskyros iš nosies gali būti su krauju. Ypač sunkiai serga 2–3 savaičių amžiaus veršeliai, mirtingumas gali siekti 50%-60% (Mattson, 1973; Horner et al., 1989).
Lietuvoje atliktas tyrimas parodė, kad galvijai ypač dažnai serga virškinamojo trakto ligomis ir net 65 proc. atvejų diagnozuojamos veršelių viduriavimo ligos. Nustatyta, kad dažniausiai veršeliams viduriavimą sukelia rotavirusai ir koronavirusai arba jų asociacijos. Ypač sunkiai veršeliai serga, jei virusinį enteritą komplikuoja bakterijos (Šalomskas ir kt, 2008).
Rotavirusas priklauso Rotavirus genčiai, Reoviridae šeimai. Rotavirusais veršeliai užsikrečia per užkrėstą pieną, vandenį ir pašarus. Veršeliai išskiria virusą su išmatomis antrą dieną po infekcijos ir išskyrimas tęsiasi 7-8 dienas. Jautriausi veršeliai 2-3 savaičių amžiaus. Vyresni kaip 3 mėnesių veršeliai paprastai neužsikrečia. Sergamumas 100%, mirtingumas gali siekti iki 80%. Veršeliams pasireiškia sunkus viduriavimas, dehidratacija, depresija, vystosi acidozė (Steele et al., 2004; Desselberger et al., 2005).
Koronavirusas – viengrandis RNR virusas, priklauso Coronavirus genčiai, Coronaviridae šeimai (Lai, 1990; Clark, 1993). Infekcija plinta fekaliniu - oraliniu keliu, rečiau aerozoliniu. Ligos klinikiniai požymiai dažniausiai pasireiškia 5-30 amžiaus dienų veršeliams. Užsikrėsti gali 15 - 70% veršelių. Prasideda viduriavimas su gleivių ar kraujo priemaiša, depresija, dehidratacija ir laiku negydomas veršelis gali nugaišti (Kapil et al., 1991; Gunn et al., 2009).
Išaiškinus galvijų virusinių ligų epidemiologinę situaciją, galima efektyviau taikyti ligų diagnostiką, profilaktiką bei ligų likvidavimo priemones ir taip sumažinti Lietuvos ūkiui galvijų virusinių ligų padarytus nuostolius (J. Milius ir kt., 2005).
Darbo tikslas: įvertinti virusinių ligų paplitimą galvijininkystės ūkiuose. Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie virusines ligas. 2. Įvertinti virusinių ligų paplitimą atskiruose ūkiuose.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 GALVIJININKYSTĖS BŪKLĖ LIETUVOJELietuvoje galvijininkystė yra svarbiausia gyvulininkystės šaka. Tai lėmė gamtinės sąlygos ir tradicinė auginimo patirtis. Ūkio pajamos iš galvijininkystės, įskaitant skersti ir veislei parduodamus galvijus, sudaro apie 60 proc. visų už gyvulininkystės produkciją gaunamų pajamų. (Klimas ir kt., 2000). Lietuvoje tradiciškai plėtojama pieno krypties galvijininkystė. Lietuvoje daugiausia auginama Lietuvos juodmargių (72%) ir Lietuvos žalųjų (26%) veislių karvių. Galvijų prieauglio struktūroje didžiausią dalį sudarė veršeliai iki vienerių metų – 53%, buliai nuo 1 iki 2 metų – 36%, dar vyresni – 11% (Sederevičius ir Bertašius, 1993; Gapšys, 2005).
11
1.2 LIGŲ PAPLITIMAS LIETUVOJE
Šalyje auginami galvijai kasmet turi įvairių sveikatos sutrikimų. 1990-1992 metų laikotarpiu atlikti tyrimai parodė, jog vidutiniškai 48% ir 30% visų Lietuvoje esančių galvijų ligų susiję su virškinimo bei kvėpavimo organų sutrikimais. Tuo pat metu buvo nustatyta, kad Lietuvoje buvo gydyta net 83,4% galvijų (Sederevičius ir Bertašius, 1993).
Gydymo duomenų analizė parodė, kad Lietuvoje 1999–2002 metais nuo 13,9% iki 11,1% visų laikomų galvijų persirgo vienokia ar kitokia liga. Dažniausiai buvo registruojamos veršelių virškinimo ir kvėpavimo organų ligos. Šiomis ligomis 1999 metais sirgo atitinkamai 5,03% ir 2,58% visų tuo metu laikytų galvijų. Vėlesniais metais veršelių susirgimų virškinimo ir kvėpavimo organų ligomis palaipsniui mažėjo ir 2002 metais buvo 3,45% ir 1,8%. Jei 1999 metais daugiausia galvijų gaišdavo nuo kvėpavimo organų ligų, tai 2002 metais padidėjo galvijų gaišimas nuo virškinimo organų ligų – atitinkamai 10,3% ir 10,2%. Dėl galvijų infekcinių ligų išbrokuojama tik 1,1% gyvulių, nors laboratoriniai tyrimai rodo, kad galvijų užkrečiamosios ligos labai išplitę (Šalomskas ir kt., 1997; Šalomskas et al., 1998; Mockeliūnienė ir kt., 2004).
Išsamesnė galvijų virškinimo organų ligų dinamikos analizė rodo, kad 34,9–36,3% visų galvijų susirgimų buvo virškinimo organų ligos, kurių dauguma pasireiškė prieaugliui. Nuo virškinimo organų ligų gaišo taip pat daug gyvulių – daugiau kaip pusė. Kad šios grupės ligas sunku gydyti, rodo faktas, jog net 14,1% gydyto galvijų prieauglio nugaišo (Mockeliūnas ir kt., 2005).
Dėl virškinimo ir kvėpavimo organų ligų galvijai gaišo žymiai dažniau, nei nuo reprodukcijos, medžiagų apykaitos ligų ar mastitų (Mockeliūnas ir kt., 2005). Didesnį veršelių susirgimų skaičių ir gaišimą nuo enteritų bei respiratorinių ligų galima būtų paaiškinti dideliu virusinių ligų – galvijų virusinės diarėjos, infekcinio galvijų rinotracheito, rotavirusinio enterito, koronavirusų infekcijos ir bakterinių infekcijų išplitimu (Šalomskas ir kt., 1997; Mockeliūnienė ir kt., 2004; Milius ir kt., 2005).
12 NMVRVI duomenimis 2013 m. virusinės ligos Corona antigenas (Ag) buvo ištirtas 35 galvijuose, iš kurių buvo nustatyta 2,8% Corona virusine liga sergančių galvijų, o 2013 iki rugsėjo mėn. – 3,3%. 2013 m.virusinės ligos Rota antigenas (Ag) buvo ištirtas 30 galvijų, iš kurių 30% buvo nustatyta Rota virusinė infekcija, o 2013 iki rugsėjo mėn. – 70% (http://www.nmvrvi.lt/lt/naujienos/459/).
Kvėpavimo takų ligomis galvijų prieauglis serga visose pramoninės gyvulininkystės šalyse. Užsienio ir Lietuvos mokslininkų tyrimai rodo, kad veršelių bronchopneumonijas gali sukelti daugelis priežasčių, todėl apibendrintai šios ligos dar vadinamos respiratorinių ligų kompleksu. Mokslininkai ir praktikai sutaria, kad pagrindinė bronchopneumonijų priežastis yra infekcijos sukėlėjai. Pirmiausia, tai virusai, sukeliantys bronchopneumoniją, bakterijos (sukelia vadinamąją transporto karštinę), virusų ir bakterijų asociacijos, mikoplazmos, chlamidijos ir net parazitiniai helmintai. Retesnės priežastys yra alergija (kreikiant supelijusiais šiaudais) ir apsinuodijimas (Tegtmeier et al., 1999).
Tiriant galvijų prieauglio kvėpavimo takų ligas nustatyta, kad pagrindiniai bronchopneumonijų sukėlėjai yra paragripo 3 (PG-3) virusai ir respiratoriniai sincitiniai (RS) virusai, rečiau – infekcinio galvijų rinotracheito virusai, adenovirusai, koronavirusai ar mikoplazmos (Šiugždaitė, 2002; Snowder et al., 2006; Autio et al., 2007). Pastaruoju metu įrodyta, kad veršeliams kvėpavimo takų ligas sukelia net ir galvijų virusinės diarėjos (GVD) virusai, kurie, kaip manyta anksčiau, gali būti tik viduriavimo priežastis (Ganheim et al., 2003). Tačiau, vertinant atskirus bronchopneumonijų sukėlėjus, reikėtų išskirti PG-3 ir RS virusus (Autio et al., 2007).
Lietuvoje atlikto tyrimo duomenimis net 95 proc. tirtų ūkių buvo rasta galvijų, turinčių antikūnų prieš PG-3 ir RS virusus. Ūkių, kur IGR ir GVD virusų infekcija nustatyta serologiškai, buvo kiek mažiau – atitinkamai 84,2 proc. ir 85 proc. Vidutiniškai PG-3 buvo persirgę 72,2 proc., RS virusų infekcija – 54,5 proc., IGR – 30,5 proc., o GVD – 43,4 proc. galvijų. Seroteigiamų galvijų įvairiuose ūkiuose rasta nevienodas skaičius. Turinčių antikūnų PG-3 virusams galvijų dalis svyravo nuo 28 proc. iki 93,3 proc. Dar labiau seroteigiami galvijai pasiskirstė tiriant RS, IGR ir GVD virusų infekcijas – atitinkamai nuo 12,5 proc. iki 100 proc., nuo 2,4 proc. iki 100 proc. ir nuo 6,7 proc. iki 94,4 proc (Šalomskas ir kt., 2008).
13
1.3 ROTAVIRUSAS
1.3.1 Sukelėjas
Virusas pirmą kartą buvo išskirtas iš viduriuojančio veršelio išmatų 1969 metais (Mebus et
al., 1969). Virusas priklauso Rotavirus genčiai, Reoviridae šeimai, yra 65-70 nm skersmens. Tai
dvigubą RNR turintis virusas, susidedantis iš 11 segmentų, kuriuos apsupa trijų sluoksnių baltymų
kapsulė. Virusas yra iksoedrinės simetrijos, genomas -16-21kb (Murphy et al., 1999; Desselberger et al., 2005).
Rotavirusai pagal VP6 baltymą skirstomi į 7 grupes nuo A iki G. A grupės rotavirusai dažniausiai sukelia viduriavimą galvijams ir žmonėms. B ir C grupės retai turi įtakos veršeliams ir žmonėmis. Nors kartais gali būti išskiriama iš galvijų ir netipinių jiems rotavirusų (priklausančių kitoms grupėms) (Snodgrass et al., 1984; Steele et al., 2004; Ghosh et al., 2007).
Virusai ilgai išgyvena išmatose ir išlieka infekcijos šaltiniu jautriems gyvūnams. Atsparūs drėgmei ir esant pH3-9. Atsparūs eteriui, chloroformui, natrio hipochloritui ir amonio dezinfekcinėms medžiagoms. Tačiau neatsparūs etanoliui, fenoliui, formalinui, kurie naudojami kaip dezinfekavimo priemonės. 37% formaldehidas, 0,75% heksachlorofenas ir 67% chloraminas-T gali efektyviai sunaikinti rotavirusus (Tan and Schnagl, 1981; Murphy et al., 1999; Steele et al., 2004).
1.3.2 Plitimas ir patogenezė
Rotavirusais veršeliai užsikrečia per užkrėstą pieną, vandenį ir pašarus. Užsikrėtę gyvūnai išskiria didelias koncentracijas viruso su išmatomis, o užsikrėtimui užtenka mažo viruso kiekio, todėl net mažas užkrato šaltinis gali infekuoti daug imliu veršelių (Holland 1990; Chauhan and Singh 1996; Steele et al., 2004; Malik et al., 2005).
Veršeliai išskiria virusą su išmatomis antrą dieną po infekcijos, ir išskyrimas tęsiasi 7-8 dienas. Jautriausi veršeliai 2-3 savaičių amžiaus. Vyresni kaip 3 mėnesių veršeliai paprastai neužsikrečia (Holland, 1990; Murphy et al., 1999; Bendali et al., 1999; Steele et al., 2004).
Nehigieniškos laikymo sąlygos, temperatūros svyravimai ir didelis veršelių tankumas ūkiuose, taip pat gali padidinti ligos sunkumą. Pagrindiniai streso veiksniai kurie stiprina infekciją tai šaltas klimatas, ir temperatūros svyravimai dienos ir nakties metu (Woode, 1976; Chauhan and Singh, 1996).
14 gaurelius dėl ko sutrinka skysių absorbcija ir sekrecia, todėl pradeda kauptis skystis žarnų sprindyje. Sutrinka gliukozės, natrio ir laktozės apykaita. Subrendusių enterocitų sunaikinimas sutrikdo hidrokarbonatų, natrio, kalio chlorido ir vandens apykaitą, ko pasekoje išsivysto acidozė (Holland, 1990; Murphy et al., 1999; Ramig, 2004; Chauhan et al., 2008). Mikrobinės fermentacijos būdu nesuvirškintas pienas yra dar vienas svarbus veiksnys sukeliantis acidozę (Mebus et al., 1977). Visi šie veiksniai kartu su uždegiminias pokyčias žarnyno epitelyje sukelia veršelių viduriavimą. Vėliau enterocitai regeneruojasi, todėl rotavirusinė infekcija yra laikoma savaime praeinanti, jei dehidratacija nėra smarkiai pažengusi, kad sukeltu mirtį (Holland, 1990; Steele et al., 2004).
1.3.3 Epidemiologija
Rotavirusinė infekcija yra plačiai paplitusi pasaulyje ir sukelia jaunų veršelių viduriavimą. Rotavirusinė infekcija turi sudėtingą epidemiologiją, dėl įvairių viruso serotipų cirkuliavimo
vienoje vietoje ir gebėjimo persitvarkyti savo genomą (Shen et al., 1994; Murphy et al., 1999;
Steele et al., 2004). Aplinkoje dveji skirtingi rotavirusai gali sukurti 211 skirtingų palikuonių
virusų, kai tuo tarpu paukščių gripo virusai sukuria tik 8 segmentus (Desselberger et al., 2005;
Dhama et al., 2005).
Virusų paplitimas ir dažnumas svyruoja tarp 7-98%, nors vidurkis laikomas 30-40%. JAV (1979m.) buvo aukštesnis nei 98%, o Italijoje (1988m.) sergamumas siekė 90% (Schlafer and Scott 1979; Castrucci et al., 1988b).
Galvijų rotavirusinės infekcijos dažnis įvairiuose šalyse:
Anglijoje 66–67% (Woode, 1976), Kanadoje 26.4% (Hussein et al., 1995), Prancūzijoje 45.1% (Vende et al., 1999), Japonijoje 16.7% (Fukai et al., 1998), Airijoje 91% (Reidy et al., 2006),
Turkijoje 41.2% (Gumusova et al., 2007), Švedijoje 43.8% (de Verdier Klingenberg, Svensson,
1998), Brazilijoje 19.4% (Alfieri et al., 2006) ir Šveicarijoje 46% (Luginbuhl et al., 2005), Lietuvoje 44,7 % ( Šalomskas ir kt., 1997).
1.3.4 Klinikiniai požymiai
Rotavirusas veršeliams pasireiškia ūmia forma su trumpu inkubacijos periodu 12-24 valandas, kartais svyruoja 18-96 val. Sergamumas iki 100%, mirtingumas naujagimiams veršeliams gali siekti iki 80%, tačiau dauguma duomenų rodo, kad jis yra maždaug 5-20% (Chauhan and Singh 1996; Steele et al., 2004).
15
yra be kraujo ar gleivių, išskyrus jei ligą kompikuoja antrinė bakterinė infekcija (Steele et al.,
2004).
Mirtis dažniausiai įvyksta dėl sunkios dehidratacijos, nes naujagimiai veršeliai turi mažesnį skysčių rezervą, nei vyresni, todėl yra labiau pažeidžiami. Ligą komplikavus antrinei bakterinei infekcijai ligos eiga būna sunkesnė ir dažnai baigiasi mirtimi (Murphy et al., 1999). Mikroskopiniai pokyčiai yra tipiški enteritui, išnykę plonujų žarnų gaureliai, suragėjusios ląstelės ir infiltracija uždegiminėmis ląstelėmis (Mebus et al. 1971b; Holland, 1990).
1.3.5 Diagnozė
Greitas ir tikslus diagnozės nustatytmas svarbus užkirsti kelią tolesniam infekcijos plitimui tarp gyvūnų. Diagnozė yra grindžiama viruso išskyrimu ir identifikavimu iš žarnų turinio ar išmatų.
Naudojamas imunofluorescentinis testas, imunoperoksidazės testas (Hall et al. 1985; Chauhan and
Singh 2001; Steele et al. 2004). Taip pat naudojams latekso agliutinacijos tyrimas greitam nustatymui rotaviruso antigenų (Hammami et al. 1990; Reidy et al. 2006). Plačiausiai naudojams metodas ELISA, yra labai jautrus ir specifiškas (Holland 1990; Barbosa et al. 1998; de Verdier Klingenberg and Svensson 1998; Murphy et al. 1999).
1.3.6 Gydymas
16
1.4 KORONAVIRUSAS
1.4.1 Sukelėjas
Korona virusas – viengrandis RNR virusas, priklauso Coronavirus genčiai, Coronaviridae šeimai. Virusas yra rutulio formos su iškiliomis paviršio projekcijomis, todėl primena karūną. Viruso paviršius susideda iš lipidų sluoksnio, praradęs šį sluoksnį virusas netenka aktyvumo (Lai, 1990; Clark, 1993).
1.4.2 Plitimas ir patogenezė
Infekcija plinta fekaliniu - oraliniu keliu, rečiau kvėpavimo (aerozoliniu) keliu. Galvijų enteropatogeninis koronavirusas išsiskiria su gleivingomis išskyromis iš viršutinių kvėpavimo takų ir virškinimo trakto. Tarp suaugusių galvijų virusas vyrauja dažniausiai subklinikine forma, tačiau esant stresui suaugę galvijai virusą gali išskirti su išmatomis ir nosies sekretu. Dažniausiai viruso perdavimas yra horizontalus, užsikrečia palikuonys po gimdymo nuo viruso nešiotojos pateles arba kliniškai sergančių veršelių laikomų tame pačiame gardelyje (Collins et al.1987; Heckertet al.1990; Thomas et al. 2006).
Mokslininkai teigia kad viruso replikacija ir išskyrimas prasideda kvėpavimo takuose, tada plinta virškinimo traktu ir didelias kiekiais išsiskiria su išmatomis. Virusas iš pradžių replikuojasi plonajame žarnyne, vėliau išplinta ir storajame žarnyne iki tiesiosios žarnos sukeldamas vandeningą viduriavimą. Didelę viruso koncentraciją galima rasti gaubtinėje žarnoje. Infekcija sunaikina žarnų gaurelių epitelines ląsteles atsakingas už medžiagų įsisavinimą. Infekuotos epitelio ląstelės žūsta, nusilupa ir pakeičiamos nesubrendusiomis ląstelėmis. Žarnyno paviršiaus ploto praradimas ir nesubrendusių ląstelių buvimas, kurios negali išskirti normalaus virškinimo enzimo sukelia absorbcijos ir virškinimo sutrikimus žarnyne, ko pasekoje prasideda vandeningas viduriavimas (Langpap et al. 1979; Babiuk et al.1985; Clark et al.1993; Thomas et al. 2006).
17 praradimas su išmatomis, padidėjusi endogeninės L –pieno rūgšties gamyba dėl dehidratacijos ir prastos audinių perfuzijos (Moon, 1978; Ewaschuk et al. 2004).
Virusas nėra toks atsparus aplinkoje kaip rotavirusas, tačiau organinėse medžiagose virusas gali išlikti užkrečiantis iki 3 dienų. Pažymėtina, kad korona virusas gali ilgai išsilaikyti molyje ir anglyje. Šie rezultatai rodo, kad molinguose dirvožemiuose susikaupia didelė viruso koncentracija, kuri gali būti galvijų ganomų tokiose ganyklose užsikrėtimo šaltiniu ( Clark et al. 1998).
1.4.3 Epidemiologija
Galvijų korona virusai yra plačiai išplitę galvijų populiacijoje, todėl sukelia didelių ekonominių nuostolių mėsos ir pieno pramonėje visame pasaulyje. Virusas buvo aptiktas visuose žemynuose ir serologinis paplitimas (>90%) rodo kad dauguma galviju buvo užsikrėtę CV per savo gyvenimą (Kapil et al.2008). Ligos klinikiniai požymiai dažniausiai pasireiškia 5-30 amžiaus dienų veršeliams. Pagal atliktus tyrimus imunofermentine analize (ELISA) 1 iš 3 veršelių diarėjos priežasčių 1-9 savaičių veršelių grupėse buvo CV. Klinikinė liga gali pasireikšti ir jauniems iki 24 val amžiaus veršeliams, kuriems nebuvo sugirdytas priešpienis (Langpap et al. 1979; Heckert et al. 1990; Hoet et al. 2003).
Užsikrėsti gali 15 - 70% veršelių. Užsikrėtęs veršelis išskiria iki 1 mlrd viruso dalelių 1ml išmatų per 48 val po infekcijos, ir tai gali trukti iki 14 dienų. Kliniškai pasveikęs veršelis gali ir toliau išskirti virusus iki 1 savaitės. Pastebėtina, kad virusas gali būti aptiktas tiek viduriuojančio tiek sveiko veršelio išmatose. Ištyrus kliniškai sergančio veršelio išmatas dažniau gaunamas teigiamas (8%–69%) rezultatas, palyginti su kliniškai sveiku gyvūnu (0%–24%). Žemo patogeniškumo BCV buvo aptiktas 70% kliniškai sveikų karvių išmatose, nepaisant specifinių antikūnų buvimo serume (Crouch, Acres, 1984; Kapil et al. 1990; Bendali et al. 1999).
Viename tyrime kuriame buvo ištirta 132 karvės ir telyčios, kurios nebuvo skiepytos nuo CV, buvo nustatyta didelė koncentracija antikūnų. Nevakcinuotose karvėse viruso išskyrimas žiemos mėnesiais padidėja iki 50-60%, veršiavimosi metu iki 65%, ir 71% iki 2 savaičių po veršiavimosi. Veršeliai gimę iš viruso nešiotojos patelės turi žymiai didesnę riziką susirgti CV diarėja dėl išmatų užteršimo veršiavimosi ir tešmens žindymo metu (Collins et al. 1987; Crouch et al. 2000).
1.4.4 Klinikiniai požymiai
18 geltonos spalvos, kartais su gleivių ar kraujo priemaiša, specifinio kvapo, vėliau pereina į vandeningą diarėją (Saif et al. 1986; Kapil et al. 1991).
Kai išeikvojami organizmo skysčiai ir jų negauna pakankamai iš aplinkos gyvūnas dehidratuoja, prasideda depresija, silpnumas, hipotermija, ir veršelių žindymo refleksas išnyksta. Dauguma veršelių pasveiksta, bet pas kitus gali atsirasti karščiavimas, jie nebesikelia, ir progresuoja širdies ir kraujagyslių kolapsas (dėl dehidratacijos, acidozės ir hiperkalemijos), koma ir ištinka mirtis, jei viduriavimas yra ypač sunkus ir laiku veršelis negydomas ( Mebus et al. 1973; Bridger et al. 1978; Gunn et al. 2009).
Pas kai kuriuos gali išsivystyti pneumoenteritinis sindromas, kai pasireiškia ne tik viduriavimas, bet ir lengvi kvėpavimo takų ligos požymiai. Užsikrėtę tokie veršeliai išskiria virusą ne tik su išmatomis, bet ir nosies sekretu (Kapil et al. 1991; Carman, Hazlett, 1992; Storz, 1998).
1.4.5 Diferencinė diagnozė
Kiti enteropatogenai tokie kaip rotavirusas dažnai aptinkami išmatose kartu su korona virusu. Rota ir korona virusai yra pagrindinė veršelių viduriavimo priežastis, tačiau koronavirusinė infekcija yra sunkesnė, nes pažeidžia tiek plonajį tiek storajį žarnyną. Tai pat reikia diferencijuoti nuo Cryptosporidium parvum, Escherichia coli ir Salmonella spp. kurie yra svarbūs veršelių viduriavimo sukelėjai. Be specialių tyrimų yra neįmanoma nustatyti diagnozę, vien remiantis klinikinias požymias (Moon et al.1978; Hoet et al. 2003; Gunn et al. 2009).
1.4.6 Gydymas
19
1.5 RESPIRATORINIS SINCITINIS VIRUSAS
Galvijų kvėpavimo sincitinis virusas yra vienas iš svarbiausių kvėpavimo takų ligų galvijams, o ypač veršeliams sukelėjas, sukeliantis pneumonija, intersticinę edemą ir emfizema. Infekcija plačiai paplitusi visame pasaulyje. Buvo apskaičiuota, kad ūkiai patiria nuo $ 23,23 iki $ 151,18 nuostolių už kiekvieną BRSV infekcija sergantį gyvulį. Kiekvienais metais Jungtinėse Valstijose dėl kvėpavimo takų ligų gaišta maždaug 32 mln galvijų ir tai sukelia milijardinius nuostolius gyvūnų augintojams (Gillette and Smith, 1985; Smith, 2009).
1.5.1 Sukelėjas
RS virusai tai Paramixoviridae šeimos Pneumovirus genties viengubos ribonukleorūgšties virusas. Genomas 15,2kb. RS virusai plačiai išplitęs visame pasaulyje tarp galvijų, avių, ožkų bei kitų gyvūnų. Ožkų ir avių RS virusai genetiškai yra giminingi, tačiau netapatūs galvijų RS virusui. Taigi, savo savybėmis galvijų RS virusas yra artimas žmonių respiratoriniam sincitiniam virusui (Easton et al., 2004).
1.5.2 Epidemiologija
RS virusai plačiai paplitę tiek pieninių, tiek mėsinių galvijų bandose. Dažniausiai serga prieauglis nuo 6 iki 10 mėn., bet serga ir suaugę galvijai. Suaugusiems galvijams dažniausiai pastebimi nežymūs ligos simptomai, bet daug labiau jie pasireiškia prieaugliams. Bandose dažnai kartojasi infekcijos, dalis gyvulių gali būti persistenciškai infekuoti virusų nešiotojai. RS virusų infekcijos klinikai įtakos turi gyvulių amžius bei organizmo specifinės savybės (Philippou et al., 2000).
20
1.5.3 Klinikiniai požymiai
Klinikiniai požymiai RSV infekcijos dažniausiai prasideda 3 -5 dieną po užsikrėtimo. Liga gali trukti nuo 1 iki 2 savaičių. Užsikrėtusiems gyvūnams būdingos vandeningos, vėliau tirštos gleivingos išskyros iš nosies ir akių. Temperatūra pakyla iki 40 – 42,5ºC, padidėja kvėpavimo dažnis, daugiau kaip 40 kartų per minutę. Sumažėjęs apetitas, depresija, melžiamoms karvėms gali sumažėti pieno gamyba. Jei liga progresuoja gali pasireikšti sausas kosulys ir apsunkintas kvėpavimas. Gyvuliai stovi nuleidę galvą ir ištiesę kaklą. Kvėpuoja išsižioję, iškišę liežuvį. Seilės putotos, gali būti su krauju. Iškvėpimo metu girdimas švokštimas, auskultuojant krūtinės ląstą girdimas traškesys. Dėl apsunkinto kvėpavimo, sutrikęs vandens gėrimas. Todėl gyvūnai dažnai sulysta ir dehidratuoja, nenori judėti, stovi vienoje vietoje. Priverstinai pagainiojus, dar labiau sutrinka kvėpavimas ir tai gali baigtis gyvūno mirtim. RSV paprastai pasireiškia kartu su kitais kvėpavimo takų virusais ir bakterijomis. Antrinės bakterinės infekcijos apsunkina ligos eigą (Baker, 1986).
1.5.4 Patologiniai anatominiai pokyčiai
Pažeisti plaučiai yra kieti, paviršius šiurkštus, raudonas. Plaučių edema ir emfizema. Šie pakitimai daugiausia apima kranioventralines plaučių sritis ir atskiras skilteles. Kai kurias atvejais gali būti emfizema ir kituose plaučių srityse (daugiausia kaudodorsalinėje) (Castleman et al. 1985). Mikroskopiškai bronchų ir bronchiolių epitelio nekrozė. Epitelio ląstelėse kartais matomi eozinofiliniai intracitoplazminiai intarpai ( Sorden et al. 2000; Woolums et al. 2004).
1.5.5 Diagnozė
21
1.5.6 Gydymas
Gydymas simptominis. Dehidratuotiems gyvūnams skiriama oraliniai arba intraveniniai skysčiai ir elektrolitų tirpalai. Galvijai su RSV dažnai užsikrečia ir antrinėmis bakterinėmis infekcijomis, dažniausiai Pasteurella haemolytic, Pasteurella multocida ar Hemophilus somnus. Todėl skiriama antimikrobinė terapija, plataus veikimo spektro antibiotikais. Priešuždegiminiai vaistai gali būti naudojami galvijams turintiems sunkius kvėpavimo sutrikimo simptomus. Trumpalaikis kortikosteroidų ir antihistamininių vaistu naudojimas 1-2 dienas, gali sumažinti kvėpavimo ligos sunkumą (Baker, 1986).
1.5.7 Kontrolės priemonės
Nuo RSV ir antrinių bakterinių infekcijų sukeltas plaučių ligas sunku gydyti, todėl kontroliuojant ligą reikia didelį dėmesį skirti ligos prevencijos priemonėms. RSV infekcija dažniausiai nepasireiškia kliniškai pas vyresnio amžiaus galvijus. Todėl norint apsaugoti imlius veršelius, juos reikia atskirti nuo suaugusių ir laikyti atskiruose pastatuose (Baker, 1986).
RSV infekcija gali atsirasti ir pas veršelius kurie turi motininių antikūnų prieš šią ligą. Tačiau atlikti tyrimai, tarp natūraliai įgyto ir eksperimentinio RSV infekcijos, rodo, kad pasireiškimas ir sunkumas atvirkčiai proporcingas RSV specifinių antikūnų lygiui užkrėstų veršelių kraujo serume (Kimman et al. 1988; Belknap et al. 1991).
22
1.6 ADENOVIRUSAS
1.6.1 Sukelėjas
Adenovirusų infekcijos sukėlėjas – Adenoviridea šeimos, Mastadenovirus genties DNR virusai. Adenovirusai klasifikuojami į 10 serotipų, priklausančius dviem pogrupiam. Pirmam pogrupiui priklauso 1, 2, 3, 9 serotipai, antram pogrupiui nuo 4 iki 8 ir 10 serotipo, kurie vienas nuo kito skiriasi savo antigeninėmis savybėmis ( Norrby et al., 1976; Benko et al., 1988; Horner et al.1989).
1.6.2 Plitimas ir patogenezė
Adeno virusų infekcijos šaltinis yra sergantys gyvūnai, platinantys virusus per nosies išskyras ir fekalijas. Šiais virusais užsikrečiama aerogeniniu ir alimentiniu keliu. Jautriausi 1 - 4 mėnesių veršeliai. Adenovirusas dauginasi kvėpavimo ir virškinimo trakte sukeldamas ląstelių lizę. Gyvūnas po infekcijos virusą platina su nosies išskyromis ir fekalijomis apie 10 dienų, virusas taip pat gali būti išskiriamas ir su šlapimu iki 10 savaičių (Áldásy et al., 1965). Veršeliams infekcija sukelia enzootinę pneumoniją ir karščiavimą, o vyresnio amžiaus gyvūnams ji dažniausiai praeina subklinikine forma. Stresas, aplinkos temperatūros pokyčiai, ūkio higienos nesilaikymas, bloga ventiliacija, gyvūnų transportavimas, staigus raciono pakeitimas ir kiti veiksniai daro didelę įtaką aktyvuojant kvėpavimo takų ligos sukėlėjus (Erol et al., 2007).
1.6.3 Epidemiologija
23
1.6.4 Klinikiniai požymiai
Galvijų adenovirusai sukelia rimtas kvėpavimo takų ligas praeinančias ūmia arba poūmia forma, kurioms būdingas karščiavimas, išskyros iš nosies ir akių, pneumonija.(Akca et al., 2004)
Virusams jautriausi yra veršeliai nuo 2 savaičių iki 4 mėnesių, vyresni serga latentine forma ir išlieka viruso nešiotojais. Veršeliams šios ligos inkubacinis periodas yra 3-4 paros. Pasireiškia bendras silpnumas, depresija, svorio kritimas, konjuktyvitas, dusulys, padažnėjęs kvėpavimas ir viduriavimas. Būdingos serozinės išskyros iš nosies gali būti su krauju. Vystosi limfadenopatija, poliartritas ir gali ištikti staigi mirtis (Mattson, 1973).
1.6.5 Patologiniai anatominiai pokyčiai
Ūmus plaučių uždegimas. Plaučiai tamsiai raudoni, vietomis sukėtėję. Pastebimi nekrozės židinėliai plaučiuose ir epitelio ląstelių deskvamacija. Alveolių sienelės sustorėjusios. Infiltracija uždegiminėmis ląstelėmis - makrofagais, neutrofilais, limfocitais. Randamas fibrinas bronchų spindyje. Bronchiolių ir tarpusienio limfmazgiai patinę, pripildyti kraujo, pas kai kuriuos veršelius pastebimas pūlingas limfadenitas ( Narita et al. 2003).
1.6.6 Gydymas
24
1.7 VERŠELIŲ PASYVI IMUNIZACIJA
Naujagimiai veršeliai gimsta neturėdami imunoglobulinų. Pasyvus imunitetas gaunamas su karvės priešpieniu, kuriame esantys Ig patenka į veršelio kraują per žarnyno epitelį, kuris išlieka pralaidus maždaug 24h po gimimo. Ig absorbcija aktyvus procesas vadinamas pinocitoze per žarnyno epitelį. Ig prasiskverbęs per epitelį patenka į limfinę sistemą, o iš jos į kraują. Epitelio gebėjimas absorbuoti Ig kas valandą mažėja ir po 24 val. aprūpinti veršelį antikūnais su krekenimis nebeįmanoma. Todėl siekiant užtikrinti tinkamą veršelių apsaugą nuo ligų, krekenis turi būti suduodamos per kuo trumpesnį laiką po veršelio gimimo (Staley, Bush, 1985; Quigley, 2002).
Susidaryti tinkamam pasyviam imunitetui įtakos turi daugelis veiksnių - Ig koncentracija krekenyse, suduoto priešpienio kiekis, laikas po gimimo per kurį suduodamas priešpienis, taip pat įtakos turi veršelio patiriamas stresas. Žema Ig koncentracija kraujyje yra tiesiogiai susijusi su veršelių sergamumu ir gaištamumu. Kai Ig koncentracija serume yra didesnė nei 10 g/l manoma, kad toks veršelis yra gerai apsaugotas nuo ligų, jei koncentracija mažesnė, tokiems veršeliams padidėjusi rizika susirgti (Besser, Gay, 1994; Quigley, 2002).
25
2. METODIKA
Tyrimo objektas: Tyrimui buvo pasirinkti ūkiai, kuriuose veršeliams dažnai pasireikšdavo
kvėpavimo ir virškinamojo trakto ligos. Mėginiai buvo renkami iš 3 Lietuvos galvijų ūkių. Mėginiai tyrimams atrinkti iš įvairaus amžiaus ir lyties galvijų grupių atsitiktinės atrankos būdu. Iš viso šiuose ūkiuose buvo surinkta 56 viduriuojančių veršelių iki 3 mėnesių išmatų mėginiai ir 30 kraujo serumo mėginių iš 1-2 dienų amžiaus veršelių.
Tirtų ūkių veršeliai buvo suskirstyti į grupes pagal amžių (1 lent.). 1 lentelė. Veršelių pasiskirstymas pagal amžių
Veršelių amžius, dienomis
Tirtų gyvulių skaičius grupėje
Ūkis Nr. 1 Ūkis Nr. 2 Ūkis Nr. 3
≤ 14 15 15 8
> 14 5 5 8
Iš viso 20 20 16
Tiriamųjų mėginių surinkimas. Kraujas serologiniams tyrimams buvo steriliai paimtas iš
jungo venos į vakuuminius mėgintuvėlius be antikoagulianto. Atsiskyręs kraujo serumas nupilamas į mėgintuvėlius, sunumeruojamas ir iki tyrimo laikomas - 20ºC temperatūroje. Išmatų mėginiai buvo imami iš viduriuojančių veršelių tiesiosios žarnos į polietileninius maišelius, sunumeruoti ir laikomi - 20ºC temperatūroje iki tyrimo.
1 Tyrimo metodas. Veršelių išmatų mėginių tyrimams dėl RV ir CV buvo naudojami
komerciniai standartizuoti imunofermentinės analizės (IFA) rinkiniai. Tyrimui naudojama 96 šulinėliu mikroplokštelė, padengta specifiniais koronavirusams ir rotavirusams monokloniniais antikūnais. Šie antikūnai sudaro specifinį junginį su išmatose esančiais virusais.
Eilutės A, C, E, G yra padengtos specifiniais monokloniniais antikunais, o eilutės B, D, F, H yra padengtos nespecifiniais antikūnais. Šios kontrolės leidžia diferencijuoti specifines imunologines reakcijas nuo nespecifiniu kryžminiu reakciju. Išmatos yra praskiedžiamos skiedimo buferiu ir inkubuojamos mikroplokštelėje 1 valanda kambario temperatūroje.
26 Jei tiriamajame išmatu mėginyje yra koronavirusu/rotavirusų, tai konjugato likučiai bus prijungti prie mikroplokštelės duobučių ir chromogenas enzimų katalizės transformacijos metu pakeis spalva.
Mėlynos spalvos intensyvumas yra proporcingas mėginyje esančių koronavirusų/rotavirusų titrui. Enziminė reakcija stabdoma ir optinių tankių rezultatai užrašomi spektrofotometru, naudojant 450 nm ilgio bangą.
Kontrolinis antigenas testo rezultatatams validuoti yra pateikiamas kartu su rinkiniu. Šį kontrolini antigena sudaro liofilizuota galviju rotavirusų/ koronavirusų kultūra.
Procedūra:
1.1. Prieš naudojima visus reagentus palaikyti kambario temperatūroje. 1.2. Atskiedžiame koncentruota plovimo tirpala 1:20 distiliuotu vandeniu. 1.3. Atskiedžiame skiedimo tirpala 1:5 distiliuotu vandeniu.
1.4. Praskiesti išmatu mėginius 1:1 skiedimo buferiu, kuris buvo paruoštas kaip nurodyta
1.3 punkte. Tai kokybinis praskiedimas, kuris naudojamas pipetuojant išmatų suspensiją. Nupilti galimas pluduriuojančias atliekas po 10 minuciu po naturalaus nusistovėjimo. Suspensijos necentrifuguoti.
1.5. Po 100 μl praskiestu mėginiu išpilstome į šulinėlius tokiu būdu: mėginys Nr.1 į
šulinėlius A1 ir B1, mėginys Nr.2 į šulinėlius C1 ir D1, ir t.t. Tokiu būdu išpilstoma ir referentinė teigiama kontrolė (pvz. G1 ir H1) (2 lent.).
2 lentelė. Mėginių ir teigiamos kontrolės išpilstymo schema mikroplokštelėje
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1 t.t. B 1 C 2 D 2 E 3 F 3 G TK H TK
1.7. Mikroplokštelė inkubuojama kambario temperatūroje (21±2ºC) 1 valandą.
27 apverčiant plokštele virš kriauklės. Visa procesa kartojame dar du kartus, atkreipiant dėmesį, kad šulinėliuose nesusidarytu oro burbuliuku.
1.9. Konjugatas yra paruoštas naudojimui. Į kiekvieną naudota mikroplokštės šulinėlį pripilame po 100 μl skiesto konjugato tirpalo. Mikroplokštelė inkubuojama kambario temperatūroje (21±3ºC) 1 valandą.
1.10. Po inkubacijos mikroplokštelė plaunama pagal 1.8 punkta.
1.11. TMB tirpalas yra paruoštas naudojimui. Išpilstome po 100 μl TMB tirpalą į kiekvieną naudota mikroplokštelės šulinėlį. TMB tirpalo spalva išpilstymo metu turi būti visiškai bespalvė. Jeigu šiame etape pasirodo mėlyna spalva reiškia, kad pipetė su kuria buvo pilstomas chromogeno tirpalas buvo nešvari. Reikia naudoti tik ypatingai švarias pipetes.
1.12. Mikroplokštelė inkubuojama 10 minučių kambario temperatūroje (+21±2ºC). Šis laikas nurodomas tik kaip rekomendacija, nes kai kuriomis aplinkybėmis gali buti naudinga sutrumpinti arba pailginti inkubacijos laiką.
10.13. Po inkubacijos užpilame po 50 μl „Stop“ tirpalo į kiekvieną naudotą mikroplokštelės šulinėlį.
Optini tanki mikroplokštelės šulinėliuose nuskaitome naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (spektrofotometrą) ir matuojant 450 nm ilgio bangą. Rezultatus nuskaityti reikia
nedelsiant po „Stop“ tirpalo užpildymo, nes chromogenas šulinėliuose su labai stipriais teigiamais signalais gali kristalizuotis ir iškraipyti rezultatus.
2 tyrimo metodas. Imunoglobulino G ir M kiekis veršelių kraujo serume buvo tiriamas
pusiau kiekybiniu natrio sulfito precipitacijos metodu. Šiuo metodu iš viso buvo ištirta 30 veršelių kraujo serumo mėginiai.
28 nuosėdos. Jeigu tik atvestų veršelių kraujo serume buvo normali koncentracija imunoglobulinų ir jie laiku gavo reikiamą kiekį krekenų, tai kraujo serumas gerai precipituoja visuose natrio sulfito tirpaluose, tai bendra imunoglobulinų koncentracija yra daugiau kaip 15mg/ml. Jei precipitacija įvyko 18% tirpale ir lengvai susidrumstė 16% natrio sulfite, o 14% tirpalas liko skaidrus, tai bendra imunoglobulinų koncentracija kraujo serume yra nuo 5 iki 15 mg/ml. Jei precipitacija įvyko tik 18% tirpale, o 16% ir 14% tirpalai liko skaidrūs tai bendra imunoglobulinų koncentracija kraujo serume yra mažesnė nei 5 mg/ ml. Tokie veršeliai sunkiai išgyvena ir linkę sirgti infekcinėmis ligomis.
3 tyrimo metodas: 28 veršelių kraujo serumo mėginiai buvo ištirti dėl RSV antikūnų ir 20
kraujo serumo mėginių buvo ištirti dėl adenovirusų antikūnų. Kraujo mėginių tyrimams dėl antikūnų adeno ir RS virusams buvo naudojami komerciniai standartizuoti imunofermentinės analizės (IFA) rinkiniai (Institute Pourquier, Prancūzija). Plastikinės mikroplokštelės lyginių skaičių stulpelių duobutės buvo padengiamos adeno ar RS viruso antigenu. Serumas buvo praskiedžiamas ir inkubuojamas plastikinėse plokštelėse su 96 duobutėmis. Jei mėginyje yra specifinių antikūnų adeno ar RS virusams, jie suformuoja antigeno ir antikūno kompleksus, su kurių pagalba tiriamų galvijų antikūnai prisitvirtina prie plokštelės. Į praplautas duobutes buvo įpilama ir inkubuojama galvijų anti-IgG antikūno – peroksidazės konjugato, kuris jungiasi su imuniniu kompleksu. Pakartotinai praplovus, į duobutes buvo įpilama substrato tirpalo, dažančio reakcijos produktus. Antikūnų kiekį mėginyje parodo reakcijos metu atsirandanti mėlyna spalva, kuri reakciją sustabdžius rūgštimi, tampa geltona. Spalvos intensyvumas parodo antikūnų kiekį mėginyje ir žymimas pliusais.
Tyrimo vieta. Tyrimai buvo atliekami 2013 metais LSMU VA Užkrečiamųjų ligų katedroje
ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologijos skyriuje.
Tyrimai atlikti laikantis 1997 11 06 Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. 8-500 („Valstybės žinios“, 1997 11 28, Nr.108).
Statistinis duomenų vertinimas. Duomenų suvedimui ir tyrimo duomenų analizei buvo
29
3. TYRIMŲ REZULTATAI
Galvijų bandų apibūdinimas. Tyrimams mėginiai buvo paimti iš trijų Lietuvos rajonuose
esančių ūkių.
Ūkyje Nr 1 esančiame Kauno rajone laikoma iki 200 suaugusių galvijų, ir jų prieauglis iki 3 mėnesių amžiaus. Galvijai laikomi viename pastate, palaidi, grupėmis. Karvės turi tiesioginį kontaktą su prieaugliu. Galvijai neganomi ir visus metus laikomi tvarte. Vasarą šeriami ganyklų žole, žiemą savos gamybos pašarais. Per metus gimsta apie 200 veršelių, gaišta iki 4 proc. veršelių iki 1 mėnesio amžiaus per metus. Dažniausios ūkyje pasireiškiančios ligos tai veršelių viduriavimas ir kvėpavimo takų ligos. Iki šiol ūkyje jokie virusologiniai tyrimai nebuvo atliekami.
Ūkyje Nr. 2 esančiame Vilniaus rajone laikoma apie 900 galvijų, iš jų apie 450 prieauglis. Galvijai laikomi viename padalinyje esančiame pastatų komplekse vienoje vietoje. Dvi karvidės kuriose laikoma po 200 karvių, gimdykla ir trys pastatai prieaugliui. Ūkyje atskirų tvartų gyvuliai tiesioginio kontakto neturi, bet juos prižiūri tas pats personalas. Karvės pastatuose laikomos pririštos, vasarą ganomos ganykloje. Galvijai žiemos metu šeriami šienainiu, kukurūzų silosu ir koncentruotais pašarais. Per metus gimusių veršelių skaičius apie 450, gaišta apie 3,34 proc. veršelių iki 1 mėnesio amžiaus. Dažniausiai ūkyje pasireiškiančios ligos viduriavimas ir pneumonija. Iki šiol ūkyje jokie virusologiniai tyrimai nebuvo atliekami.
Ūkyje Nr. 3 esančiame Kauno rajone laikoma apie 1500 galvijų, iš jų apie 1000 vyresnių kaip 3 mėn. amžiaus. Galvijai laikomi viename padalinyje esančiame pastatų komplekse. Atskirų tvartų galvijai tiesioginio kontakto neturi, bet juos prižiūri tas pats personalas. Pieniniai galvijai neganomi, laikomi grupėse palaidi, šeriami savos gamybos pašarais. Ūkyje periodiškai buvo registruojami veršelių viduriavimo ir kvėpavimo takų ligų protrūkiai. Veršeliai įprastai viduriuodavo nuo 2 d. iki 1,5 mėn. amžiaus, kvėpavimo takų ligomis sirgo nuo 2 mėn. amžiaus. 2009 – 2010 metų laikotarpiu kai kuriais mėnesiais nuo šių ligų nugaišo iki 40 – 60 proc. gimusių veršelių. Nuo 2010 metų gegužės mėnesio buvo pradėti išsamesni sergamumo ir gaišimo priežasčių tyrimai ir pritaikytos profilaktikos priemonės (vakcinacija nuo respiratorinių ligų – RSV ir PG-3), bei tinkami gydymo metodai, kurie gaištamumą padėjo sumažinti nuo 37,4 proc. iki 8,2 proc.
30 3 lentelė. Tiriamųjų ūkių veršelių bandų sveikatingumo apibūdinimas
Ūkis Laikoma galvijų
Nugaišusių veršelių iki 1 mėn amžiaus
Nustatyti virusai
% PI
Nr.1 200 4 ± 2,72 RV, RSV, adeno virusas
Nr.2 900 3,34 ± 1,17 RV, RSV, adeno virusas
Nr.3 1500 8,36 ± 2,9 RV, RSV, IGR, GVD
Kadangi visuose ūkiuose pagrindinė liga buvo jaunų veršelių viduriavimas, veršelių išmatos buvo ištirtos dėl rota ir korona virusų. Gauti duomenys pateikti 1 paveiksle.
1pav. Sergamumas rota ir korona virusiniu enteritu atskiruose ūkiuose.
Pirmas paveikslas parodo RV ir CV paplitimo analizės rezultatus. CV infekcija nebuvo nustatyta nė viename ūkyje. RV užsikrėtusių gyvūnų ūkiuose svyravo nuo 20 iki 43,75%. Antrame ūkyje užsikrėtusių veršelių buvo mažiausiai 20%, pirmame 30%, o trečiame daugiausiai 43,75%. Vidutiniškai RV infekcija sirgo 31,25% tirtų veršelių. (p>0,05)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 ūkis 2 ūkis 3 ūkis
31 Kadangi IFA tyrimo mėginio optinis tankis yra tiesiogiai proporcingas virusų kiekiui tirtame mėginyje, toliau analizavome RV OT pasiskirstymą atskiruose ūkiuose (2 pav.)
2 pav. Veršelių fekalijų tyrimo dėl RV antigeno rezultatai išreikšti optiniu tankiu (OT)
Iš rezultatų matyti, kad didžiausia virusų koncentracija buvo pirmajame ūkyje 1,196. Antrame 0,998,o trečiajame atitinkamai 0,432. Vidutiniškai virusų titras tirtuose ūkiuose buvo 0,875(p<0,05)
Toliau analizavome RV sergamumą skirtingo amžiaus veršelių grupėse (3 pav.)
3 pav. Sergamumas rotavirusiniu enteritu įvairaus amžiaus veršelių grupėse
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
1 ūkis 2 ūkis 3 ūkis
32 Iš duomenų matoma, kad veršeliai iki 2 sav. amžiaus RV infekcija sirgo dažniau, nei vyresni, atitinkamai 34,21 ir 22,22%. Tačiau gauti duomenys statistiškai nepatikimi (p >0,05).
Tirtuose ūkiuose veršeliams be virškinimo organų ligų, dažnai pasireikšdavo ir kvėpavimo takų ligos. Norėdami išsiaiškinti kokie virusai vyrauja ūkiuose 28 mėginius ištyrėme serologiškai dėl RSV ir 20 mėginių dėl adenovirusų. Gauti duomenys pateikti 4 paveiksle.
4 pav. Veršelių turėjusių kontaktą su RSV ir adenovirusu dalis procentais.
Išanalizavus duomenis matome, kad tirti virusai ūkiuose pasiskirstę nevienodai. Daugiausia seroteigiamų mėginių dėl RSV buvo trečiajame ūkyje 100%, kiek mažiau antrajame 60%, o pirmajame tik 10%. Vidutiniškai 56,67% tirtų veršelių turėjo antikūnus prieš RSV (p<0,05). Antikūnai prieš adenovirusus buvo tirti tik pirmame ir antrame ūkiuose. Antrame ūkyje seroteigiamų mėginių buvo 50%, o pirmajame 10%. Vidutiniškai 30% tirtų veršelių buvo seroteigiami (p<0,05).
Kadangi IFA tyrimo mėginio optinis tankis yra tiesiogiai proporcingas antikūnų kiekiui tirtame mėginyje, toliau analizavome antikūnų prieš RSV ir adenovirusus OT pasiskirstymą, atskiruose ūkiuose, išreikštą procentais. (5 pav.)
Iš gautų rezultatų matyti, kad didžiausias antikūnų titras prieš RSV buvo antrajame ir trečiajame ūkiuose ir siekė atitinkamai 174,08% ir 169,13%. Pirmajame ūkyje buvo mažiausias 52,27% Vidutiniškai antikūnų titras visuose tirtuose ūkiuose buvo 131,83% (p<0,05). Antikūnų
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 ūkis 2 ūkis 3 ūkis
33 titras prieš adenovirusus pirmajame ūkyje siekė 21,39%, antrajame 56,28% , vidutiniškai – 38,84% (p<0,05).
5 pav. Antikūnų titras, išreikštas IFA optinio tankio procentais
Siekdami išsiaiškinti tokį virusų pasiskirstymą ūkiuose ištyrėme krekeninio imuniteto kokybę nustatydami Ig kiekį veršelių kraujo serume. Tyrimų rezultatai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. Vienos – dviejų amžiaus dienų veršelių kraujo serumo tyrimo dėl Ig rezultatai
IgM ir IgG koncentracija mg/ml
kraujo serume
1 ūkis 2 ūkis 3 ūkis
sk. % sk. % sk. %
Daugiau nei 15 1 10% 2 20% 5 50%
Nuo 5 iki 15 2 20% 8 80% 5 50%
Mažiau nei 5 7 70% 0 0% 0 0%
Iš lentelės duomenų matome, kad 1 ūkyje didžioji dalis veršelių kraujo serume turėjo nepakankamą Ig kiekį, 70% tirtų veršelių jų buvo mažiau kaip 5mg/ml. Tuo tarpu antrame ir trečiame ūkiuose jų buvo nustatyta daugiau nei 5mg/ ml. Vidutiniškai 23,33%tirtų veršelių turėjo nepakankamą Ig kiekį.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
1ūkis 2 ūkis 3 ūkis
34
4. APTARIMAS
Galvijų kvėpavimo takų ir virškinimo organų ligos plačiai paplitusios visame pasaulyje ir sukelia didelius ekonominius nuostolius gyvūnų augintojams (Smith, 2000; Kapil et al, 2008). Lietuvoje šios ligos taip pat išplitusios. Dėl virškinimo ir kvėpavimo organų ligų galvijai gaišta žymiai dažniau, nei nuo reprodukcijos, medžiagų apykaitos ligų ar mastitų (Mockeliūnas ir kt, 2005).
Lietuvoje atliktas tyrimas parodė, kad galvijai ypač dažnai serga virškinamojo trakto ligomis ir net 65 proc. atvejų diagnozuojamos veršelių viduriavimo ligos. Nustatyta, kad dažniausiai veršeliams viduriavimą sukelia rotavirusai ir koronavirusai arba jų asociacijos (Šalomskas ir kt. 2008).
Mūsų atlikto tyrimo rezultatai prieš KV parodė, kad virusas paplitęs visuose tirtuose ūkiuose (atitinkamai 30%, 20% ir 43,75 %). Buvo pastebėta tendencija, kad 3 ūkyje RV aptinkama sąlyginai dažniau (43,75%). Tačiau nepavyko gauti statistiškai patikimų duomenų (p>0,05). Rotavirusais užsikrėtusiems veršeliams pasireiškia sunkus viduriavimas, dehidratacija ir depresija. Veršeliai yra apatiški, negeria, visą laiką guli. Viduriavimas paprastai trunka keturias – aštuonias dienas (Steele et al. 2004). Ankstesnių tyrimų duomenimis rotavirusinė infekcija buvo nustatyta 44,7% tirtų veršelių (Šalomskas ir kt., 1997), 90,8% turėjo antikūnų rotavirusams (Šalomskas ir kt, 2005). NMVRVI duomenimis 2013m. virusinė infekcija buvo nustatyta 30% tirtų galvijų (http://www.nmvrvi.lt/lt/naujienos/459/). Kas sutampa su mūsų tyrimo gautais rezultatais (1pav.)
Fekalijų teigiamų mėginių OT analizė parodė, kad 3 ūkyje veršeliai išskiria mažiau virusų į aplinką (OT - 0,432), nei 1 ir 2 ūkio veršeliai (atitinkamai 1,196 ir 0,998) ( p<0,05), nors jų paplitimas 3 ūkyje yra didžiausias (43,75%). Tai gali būti susiję su tuo, kad didžioji dalis veršelių gauna pakankamą kiekį krekenų, kuriuose esantys antikūnai gali stabdyti virusų dauginimasį, o didelį RV paplitimą šio ūkio veršelių galima būtu paaiškinti, didele gyvūnų koncentracija vienoje vietoje (Woode, 1976; Chauhan and Singh, 1996), nes tirtame ūkyje laikoma 1500 galvijų.
Taip pat didelį veršelių gaišimą 3 ūkyje (8,36%) lyginant su 1 ūkiu (4%) ir 2 ūkiu (3,34%), būtu galima paaiškinti didele gyvūnų koncentracija ir, kad šiame ūkyje veršeliai dažniau sirgo RV infekcija, lyginat su kitais ūkiais (1pav.).
35 Tyrime dėl CV infekcijos nebuvo rasta nė vieno teigiamo mėginio. Nors CV infekcijos paplitimas Lietuvoje nustatytas ir 1997m. siekė 43,4% (Šalomskas ir kt. 1997), o 2013m. - 3,3% (http://www.nmvrvi.lt/lt/naujienos/459/).
Mūsų tyrimo rezultatus dėl CV neišplitimo tyrimo metu būtu galima paaiškinti tuo, kad mes mėginius rinkome vasarą, o ankstesni tyrimai dėl CV buvo atliekami žiemos metu. CV yra labai jautrus aukštai temperatūrai ir ultravioletiniams spinduliams, todėl jie dažniau plinta šaltuoju metu laiku ir sukelia viduriavimą ne tik veršeliams, bet ir suaugusiems galvijams t.y vadinamąją žiemos dizenteriją (Tsunemitsu and Saif, 1995; Brandao et al.2007).
Užsienio ir Lietuvos mokslininkų tyrimai rodo, kad veršelių bronchopneumonijas gali sukelti daugelis priežasčių, todėl apibendrintai šios ligos dar vadinamos respiratorinių ligų kompleksu. Tiriant galvijų prieauglio kvėpavimo takų ligas nustatyta, kad pagrindiniai bronchopneumonijų sukėlėjai yra paragripo 3 (PG-3) virusai ir respiratoriniai sincitiniai (RS) virusai, rečiau – infekcinio galvijų rinotracheito virusai, adenovirusai, koronavirusai ar mikoplazmos (Šiugždaitė, 2002; Snowder et al., 2006; Autio et al., 2007).
Mūsų atlikto tyrimo metu nustatėme, kad tirtuose ūkiuose plačiai išplitę kvėpavimo takų ligų sukelėjai RSV ir adenovirusai.
1 ūkyje buvo nustatyta 10% veršelių turinčių antikūnus RSV ir adenovirusams, tuo tarpu 2 ir 3 ūkiuose antikūnų šiems virusams buvo nustatyta daugumoje kraujo serumų (50-100%) (4pav). Gauti duomenys buvo statistiškai patikimi (p<0,05). Ankstesnių tyrimų duomenimis RS virusų infekcija vidutiniškai buvo persirgę 54,5 % galvijų (Šalomskas ir kt. 2008), 2011m.- 61,18%, 2012m. - 51,29%, o 2013 iki rugsėjo mėn. – 61,47% (http://www.nmvrvi.lt/lt/naujienos/459/).
Taip pat galima pastebėti, kad pirmojo ūkio kraujo serumuose antikūnų titrai šiems virusams buvo žemesni, negu antrojo ir trečiojo ūkio veršelių kraujo serumuose (5pav.). Tai galima būtu paaiškinti tuo, kad 1 ūkio didžioji dalis veršelių (70%) savo kraujyje turėjo labai žemą Ig kiekį. Žemas Ig kiekis susijęs su nelaiku ar blogos kokybės krekenų sudavimu.
36 yra didesnė nei 10 g/l manoma, kad toks veršelis yra gerai apsaugotas nuo ligų, jei koncentracija mažesnė, tokiems veršeliams padidėjusi rizika susirgti (Besser, Gay, 1994; Quigley, 2002).
Didelius antikūnų titrus 2 ir 3 ūkiuose, bei didelį seroteigiamų veršelių kiekį prieš RSV ir adenovirusus tuose ūkiuose galima būtu paaiškinti tuo, kad jie turėjo didelį Ig kiekį (4 lent.), tai reiškia, kad krekenų girdymas buvo vykdomas sėkmingiau, nei 1 ūkyje ir veršeliai antikūnų gavo iš persirgusių karvių.
37
5. IŠVADOS
1) Imunofermentinės analizės metodu ištyrus mėginius visuose 3 ūkiuose buvo nustatyta RSV ir RV infekcija. Atitinkamai 56,67% ir 31,25%.
2) Dviejuose ūkiuose buvo nustatyta adenovirusinė infekcija, trečias ūkis netirtas. Vidutinis paplitimas ūkiuose buvo 30%.
3) Nė viename ūkyje tyrimo metu nebuvo nustatyta CV infekcija (0%).
4) Didelis skaičius veršelių turinčių antikūnus prieš RSV ir adenovirusus 2 ir 3 ūkiuose rodo ne išplitusią infekciją veršelių grupėje, o gerą krekenų sudavimo sistemą ir kontrolę.
38
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Akca Y, Burgu I, Gür S, Bilge-Dagalp S, 2004, A study on investigations of occurence of
some virus infection in Buffaloes in Turkey, Rev Med Vet, 156, 268-71.
2. Áldásy, P., Rusvai, M., Bartha, A. Pneumo-enteritis in calves caused by adenoviruses. Acta Veterinaria Academiae Scientiarum Hungaricae 1965, 15:167-175. I
3. Alfieri, A.A., Parazzi, M.E., Takiuchi, E., Medici, K.C. and Alfieri, A.F., 2006. Frequency of group A rotavirus in diarrhoeic calves in Brazilian cattle herds, 1998–2002. Tropical Animal Health andProduction, 38, 521–526
4. Autio T., Pohjanvirta T., Holopainen R., Rikula U., Pentikainen J., Huovilainen A., Rusanen H., Soveri T., Sihvonen L., Pelkonen S. Etiology of respiratory disease in non-vaccinated, non-medicated calves in rearing herds. Veterinary Microbiology, 2007, Vol. 119, P. 256– 265.
5. Babiuk LA, Sabara M, Hudson GR. Rotavirus and coronavirus infections in animals. Prog Vet Microbiol Immunol 1985;1:80–120.
6. Baker JC, Ames TR, Markham RJ. Seroepizootiologic study of bovine respiratory syncytial virus in a dairy herd. Am J Vet Res 1986;47(2):240–5.
7. Baker JC, Ames TR, Werdin RE. Seroepizootiologic study of bovine respiratory syncytial virus in a beef herd. Am J Vet Res 1986;47(2):246–53.
8. Baker, JC, 1986. Bovine respiratory syncytial virus: pathogenesis, clinical signs, diagnosis, treatment, and prevention. Compend Cont Ed. 8:F31-F38.
9. Barbosa, E.F., Figueiredo, H.C.P., Garcia, A.M., Lobato, Z.I.P. and Lage, A.P., 1998. Group A rotavirus in calves in Minas Gerais State, Brazil. Ciencia Rural, 28, 435–439
10. Belknap, E.B., et al. 1991. The role of passive immunity in bovine respiratory syncytial virus infected calves. J Infect Dis 163:470-476.
11. Bendali F, Bichet H, Schelcher F, et al. Pattern of diarrhoea in newborn beef calves in south-west France. Vet Res 1999;30(1):61–74
12. Benko,M., Bartha,A., Wadell,G. DNA restriction enzymeanalysis of bovine adenoviruses. Intervirology 1988,29: 346-350
13. Besser, T. E., and C. C. Gay. The importance of colostrum to the health of the neonatal calf. Vet. Clinics North Am, 1994, 10:107–117.
39 15. Bridger JC, Woode GN, Meyling A. Isolation of coronavirus from neonatal calf diarrhea in
great Britain and Denmark. Vet Microbiol 1978;3(2):101–13.
16. Carman PS, Hazlett MJ. Bovine coronavirus infection in Ontario, 1990-1991. Can Vet J
1992;33(12):812–4.
17. Castleman WL, Lay JC, Dubovi EJ, et al. Experimental bovine respiratory syncytial virus
infection in conventional calves: light microscopic lesions, microbiology, and studies on lavaged lung cells. Am J Vet Res 1985;46(3):547–53.
18. Castrucci, G., Frigeri, F., Ferrari, M., Cilli, V., Gualandi, G.L. and Aldrovandi, V., 1988b. Neonatal calf diarrhea induced by rotavirus. Comparative Immunology and Microbiology, 11, 71–84
19. Chauhan, R.S., Dhama, K. and Mahendran, M., 2008. Pathobiology of rotaviral diarrhea in calves and its diagnosis and control: A review. Journal of Immunology and Immunopathology, 10, 1–13
20. Chauhan, R.S. and Singh, N.P., 2001. Demonstration of antirotavirus antibody producing cells inintestine of calves using immunoperoxidase technique. Journal of Immunology and Immunopathology, 3, 41–44
21. Chauhan, R.S. and Singh, N.P., 1996. Epidemiology of rotavirus infection in calves in India. International Journal of Animal Sciences, 11, 221–223
22. Clark KJ, Sarr AB, Grant PG, et al. In vitro studies on the use of clay, clay minerals and charcoal to adsorb bovine rotavirus and bovine coronavirus. Vet Microbiol 1998;63(2– 4):137–46.
23. Clark, M.A. (1993). Bovine coronavirus. Brit. Vet. J. 149(1), 51-70.
24. Collins JK, Riegel CA, Olson JD, et al. Shedding of enteric coronavirus in adult cattle. Am J Vet Res 1987;48(3):361–5.
25. Collins JK, Teegarden RM, MacVean DW, et al. Prevalence and specificity of antibodies to bovine respiratory syncytial virus in sera from feedlot and range cattle. Am J Vet Res 1988;49(8):1316–9.
26. Crouch CF, Oliver S, Hearle DC, et al. Lactogenic immunity following vaccination of cattle with bovine coronavirus. Vaccine 2000;19(2-3):189–96.
27. Crouch CF, Acres SD. Prevalence of rotavirus and coronavirus antigens in the feces of
normal cows. Can J Comp Med 1984;48(3):340–2.
40 29. Desselberger, U., Gray, J. and Estes, M.K., 2005. Rotaviruses. In: B.W.J. Mahy and V.T. Meulen(eds), Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial infections, ASM press, USA, 946–958
30. Dhama, K., Chauhan, R.S., Kataria, J.M., Mahendran, M. and Tomar, S., 2005. Avian Influenza: The current perspectives. Journal of Immunology and Immunopathology, 7, 1–33 31. D.R., Herring, J.A., Campbell, I., Inglis, J.M., Hargreaves, F.D., 1984. Comparison of
atypical rotavirus from calves, piglets, lambs and man. Journal of General Virology, 65, 909–914
32. Ellis J.A., et al. 1996. Effects of perinatal vaccination on humoral and cellular immune responses in cows and young calves. J Am Vet Med Assoc 208:393-400.
33. Erol N, Gür S, Yildirim Y, Tolga Tan M. A serological investigation on parainfluenza -3(PI-3) and bovine adenovirus (bav) infections in dairy cow enterprises in aydın province. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 13 (1): 43-47, 2007
34. Ewaschuk JB, Naylor JM, Palmer R, et al. D-Lactate production and excretion in diarrheic calves. J Vet Intern Med 2004;18(5):744–7.
35. Fukai, K., Sakai, T. and Kamata, H., 1998. Distribution of G serotypes and P genotypes of bovine group A rotavirus isolated in Japan. Australian Veterinary Journal, 76, 418–422 36. Ganheim C., Hulten C., U. Carlsson, H. Kindahl, R. Niskanen, K. P. Waller. The Acute
Phase Response in Calves Experimentally Infected with Bovine Viral Diarrhoea Virus and/or Mannheimia haemolytica. J. Vet. Med., 2003, B 50, P. 183–190.
37. Gapšys A. Mėsa. Lietuvos žemės ūkis ir kaimo plėtra 2004. Vilnius, Lietuvos agrarinės ekonomikos institutas, 2005, P. 47–60.
38. Ghirotti M, Semproni G,De Meneghi D, Mungaba FN, Nannini D, Calzetta G et al. Seroprevalences of selected cattle disease in the Kafue flats of Zambia, Vet Res Com,1991. 15: 25-36.
39. Ghosh, S., Varghese, V., Sinha, M., Kobayashi, N. and Naik, T.N., 2007b. Evidence for interstate transmission and increase in prevalence of bovine group B rotavirus strains with a novel VP7 genotype among diarrhoeic calves in Eastern and Northern states of India. Epidemiology of Infections, 135, 1324–1330
40. Gillette, K.G. and Smith, P.C. (1985). Respiratory syncytial virus infection in transported calves. Am. J. Vet. Res., 46 (12): 2596-2600.
41
42. Gunn AA, Naylor JA, House JK. Diarrhea. In: Smith BP, editor. Large animal internal
medicine. 4th edition. St. Louis (MO): Mosby Elsevier; 2009. p. 340–63.
43. Hall, G.A., Parsons, K.R., Reynolds, D.J. and Morgan, J.H., 1985. Detection of enteropathogenic viruses in paraffin embedded intestinal tissue of calves by immunoperoxidase. Journal of Medical Microbiology, 19, 14
44. Hammami, S., Castro, A.E. and Osburn, B.I., 1990. Comparison of polyacrylamide gel electrophoresis, an enzyme-linked-immunosorbent assay, and an agglutination test for the direct identification of bovine rotavirus from feces and coelectrophoresis of viral RNAs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2, 184–190
45. Heckert RA, Saif LJ, Hoblet KH, et al. A longitudinal study of bovine coronavirus enteric and respiratory infections in dairy calves in two herds in Ohio. Vet Microbiol 1990;22(2– 3):187–201.
46. Hoet AE, Smiley J, Thomas C, et al. Association of enteric shedding of bovine torovirus
(Breda virus) and other enteropathogens with diarrhea in veal calves. Am J Vet Res 2003;64(4):485–90.
47. Holland, R.E., 1990. Some infectious causes of diarrhea in young farm animals. Clinical Microbiological Reviews, 3, 345–375
48. Horner GW, Hunter R, Bartha A, Benkö M: A new subgroup 2 bovine adenovirus proposed as the prototype strain 10. Arch Virol 1989, 109:121-124.
49. Hussein, A.H., Cornaglia, E., Saber, M.S. and el-Azhary, Y., 1995. Prevalence of serotypes G6 and G10 group A rotaviruses in dairy calves in Quebec. Canadian Journal of Veterinary Research, 59, 235–237
50. Kapil S, Pomeroy KA, Goyal SM, et al. Experimental infection with a virulent pneumoenteric isolate of bovine coronavirus. J Vet Diagn Invest 1991;3(1):88–9.
51. Kapil S, Trent AM, Goyal SM. Excretion and persistence of bovine coronavirus in neonatal calves. Arch Virol 1990;115(1–2):127–32
52. Kapil S, Lamm CG, McVey DS, et al. Detection of bovine respiratory coronavirus in beef cattle. In: Proceedings of the 27th annual meeting of the American Society of Virologists. Cornell University, Ithaca, NY, July 15, 2008. p. 9–1.
53. Kimman, T.G., et al. 1988. Epidemiologic study of bovine respiratory syncytial virus in calves: influence of maternal antibodies on the outcome of disease. Vet Rec 123:104-109. 54. Klimas R., Darbutas J., Zapasnikienė B. ir kt. Gyvulininkystė. Mokslo darbai. 2000
