LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Tomas Lileikis
Karpių kaviozės paplitimas žuvininkystės ūkiuose bei gydymo
efektyvumo įvertinimas naudojant flubendazolą
Prevalence of Carp khawiosis in fish farms and assessment of the
treatment efficacy using flubendazole
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. dr. Artūras Stimbirys
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Karpių kaviozės paplitimas žuvininkystės ūkiuose bei gydymo efektyvumo įvertinimas naudojant flubendazolą“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Tomas Lileikis
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Gražina Aranauskienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Prof. dr. Artūras Stimbirys
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Prof. dr. Mindaugas Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)
vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas Lekt. dr. Marius Virgailis
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Paprastasis karpis ... 91.1.1 Paprastojo karpio svarba pasaulio gėlavandenėje žuvininkystėje ... 9
1.1.2 Paprastojo karpio mityba bei sinergizmas su kitomis žuvų rūšimis ... 10
1.1.3 Paprastojo karpio vystymasis ... 10
1.1.4 Paprastojo karpio helmintozių svarba... 11
1.2 K. sinensis morfologija, vystymosi ciklas ... 11
1.3 K. sinensis paplitimas pasaulyje bei jo reikšmė akvakultūrai ... 14
1.4 Organizmo reakcija į parazitą ... 15
1.5 Vaistinių medžiagų naudojimas užsikrėtimui gydyti ... 16
1.5.1 Niklozamidas ... 16
1.5.2 Prazikvantelis ... 16
1.5.3 Fenbendazolas ... 16
1.6 Flubendazolo farmakokinetinės bei farmakodinaminės savybės ... 16
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 18
2.1 Gydymo flubendazolu efektyvumo tyrimas ... 19
2.2 Skrodimas, duomenų rinkimas ... 20
2.3 Statistinė analizė ... 21
3. REZULTATAI ... 22
3.1 K. sinensis paplitimas žuvininkystės ūkiuose ... 27
4 3.2.1 Y tvenkinys ... 29 3.2.2 Z tvenkinys ... 30 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32 IŠVADOS ... 34 REKOMENDACIJOS ... 35 PADĖKA ... 36 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37
5
SANTRAUKA
Tyrimo tikslas - nustatyti cestodo K. sinensis paplitimą kai kuriuose Lietuvos žuvininkystės ūkiuose bei įvertinti gydymo efektyvumą naudojant flubendazolą. Darbas atlikas LSMU VA VF Maisto saugos ir kokybės katedroje. Žuvų skrodimai atlikti LSMU VA Patobiologijos katedros Patologijos centre.
Tyrimas, siekiant nustatyti K. sinensis paplitimą Lietuvos žuvininkystės ūkiuose, truko nuo 2020 m. gegužės 15 d. iki 2020 m. liepos 31 d.
Tyrimas, siekiant įvertinti flubendazolo efektyvumą gydant karpių kaviozę, truko nuo 2020 m. birželio 21 d. iki 2020 m. liepos 31 d.
Paplitimo tyrimai atlikti 5 žuvininkystės ūkiuose A, B, C, D ir X, gydymo efektyvumas naudojant flubendazolą buvo nustatomas ūkyje X.
Viso tyrimo metu ištirti 403 karpiai, kurių amžius buvo 1 arba 2 metai. Skrodimo metu buvo matuojamas žuvų ilgis bei svoris, rasti cestodai identifikuojami binokuliaru bei skaičiuojami ir fotografuojami. Nustatant cestodo K. sinensis paplitimą gauti šie rezultatai: X ūkyje Y tvenkinyje nustatytas 38,4 proc. užsikrėtimas, Z tvenkinyje nustatytas 31,2 proc. užsikrėtimas, A ūkyje nustatytas 5 proc. užsikrėtimas, B ūkyje J tvenkinyje nustatytas 23,81 proc. užsikrėtimas, K tvenkinyje – 3,09 proc. užsikrėtimas, L tvenkinyje ir C ūkyje užsikrėtimo K. sinensis nenustatyta, D ūkyje nustatytas 10,53 proc. užsikrėtimas. Iš 5 tirtų žuvininkystės ūkių 4 nustatytas užsikrėtimas cestodu K. sinensis, nustatytas paplitimas – 80 proc.
Gydymo efektyvumo naudojant flubendazolą tyrimas atliktas X ūkio Y ir Z tvenkiniuose. Birželio 21 d. Y tvenkinyje nustatytas 38,5 proc. užsikrėtimas, Z tvenkinyje nustatytas 31,2 proc. užsikrėtimas. Sudarytas gydymo planas: karpius gydyti 3 mg/kg žuvies biomasės flubendazolo doze per dieną, tris dienas iš eilės. Flubendazolas karpiams buvo šeriamas liepos 8, 9, ir 10 kartu su pašaru, po gydymo atlikti 3 karpių skrodimai užsikrėtimo dinamikai stebėti po 7, 14 ir 21 d. po gydymo. Praėjus pirmajai savaitei po gydymo, užsikrėtimas Y tvenkinyje sumažėjo iki 12,5 proc., po dviejų savaičių užsikrėtimas susilpnėjo iki 11,11 proc., tačiau po 3 savaičių nustatytas užsikrėtusių karpių skaičius siekė 13,3 proc. Z tvenkinyje užsikrėtimas atitinkamai susilpnėjo iki 6,7 proc. praėjus 1 savaitei po gydymo, iki 6,2 proc. praėjus dviem savaitėms po gydymo ir sustiprėjo iki 13,3 proc. praėjus trims savaitėms po gydymo. Atlikus gautų duomenų analizę nustatyta, jog gauti duomenys nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05). Gydymas naudojant 3 mg/kg žuvies biomasės flubendazolo per dieną tris dienas iš eilės nebuvo efektyvus.
6
SUMMARY
The objective of my thesis was to determine prevalence of the cestode Khawia sinensis in some Lithuanian fish farms and to assess the treatment efficacy using flubendazole. Research was conducted in the Department of Food Safety and Quality. Dissections of carp were performed in the Pathology Center of The Pathobiology Department at the Lithuanian University of Health Sciences.
The research to determine prevalence of K. sinensis was carried out from 15th of May, 2020 to 31st of July, 2020.
The research to assess the efficacy of flubendazole for treating carp khawiosis was carried out from 21st of June, 2020 to 31st of July, 2020.
Prevalence studies were conducted in 5 Lithuanian aquaculture farms A, B, C, D and X, efficacy of treatment using flubendazole was assessed in farm X.
During the research a total of 403 carp aging from 1 to 2 years-old were dissected. The weight and lenght of each fish were registered. Found cestodes were identified using a binocular microscope (MBC 9, Russia) then counted, measured and photographed. Results from research to determine the prevalence of the cestode in Lithuanian fish farms: the intensity of infection assessed in X farm Y pond was 38.4% with infection in Z pond of 31.2%. Intensity of infection in A farm was 5% with intensity in B farm‘s J pond of 23.8%, K pond 3.1% respectively while no infection was measured in L pond. There was no infection found in C farm while there was an infection of 10.5% in D farm. From total of 5 aquaculture farms studied the cestode was found in 4 of them, the total prevalence of K. sinensis was 80%.
The research to determine the efficacy of treatment using flubendazole was conducted in X farm‘s ponds Y and Z. On June 21st the intensity of infection assessed in Y pond was 38.4% and 31.2% in Z pond respectively. A treatment scheme was created, it was decided to use a daily dose of 3 mg for 1 kg of fish biomass of flubendazole for 3 days in a row. Carp were fed a special feed mix with flubendazole in 8th, 9th, and 10th of July. After the treatment carp from both ponds were dissected 1 week, 2 weeks and 3 weeks after the treatment in order to assess the dynamics of infection. When the first week passed after the treatment was performed, intensity of infection in pond Y decreased to 12.5%, after two weeks it decreased even more to 11.11% but after three weeks an increase to 13.33% was observed. Respectively, intensity of infection in Z pond decreased to 6.7% after the first week, decreased a little bit more to 6.2% after two weeks and an increase to 13.3% after three weeks was observed. The analysis of the obtained data revealed that the findings were not statistically significant. (P>0.05) Treatment using 3 mg/kg of flubendazole for 3 days in a row was not effective.
7
SANTRUMPOS
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas VA – Veterinarijos akademija
SSRS – Sovietų socialistinių respublikų sąjunga ES – Europos sąjunga
ŠGP – šalutiniai gyvūniniai produktai
SE – standartinė paklaida (angl. Standard error) mm – milimetras ml – mililitras cm – centimetras ha – hektaras l – litras proc. – procentai
8
ĮVADAS
K. sinensis – 1935 m. Kinijoje atrastas ir iki šių dienų plačiai Europoje bei Azijoje išplitęs cestodas.
Sėkmingas plitimas vyko dėl besivystančios žuvininkystės, importuojant gyvas karpines žuvis, o cestodo įsitvirtinimą naujuose regionuose lėmė nemažas dažnai sutinkamų tarpinių šeimininkų skaičius (mažašerės žieduotosios kirmėlės).
Mokslinėje literatūroje vyrauja skirtingos nuomonės dėl K. sinensis daromos žalos žuvims. Vieni šaltiniai teigia, jog pažeidimai sunkūs: žarnų opų susidarymas, hemoragijos, enteritas, kai kuriais atvejais dėl didelio kiekio kaspinuočių gali plyšti žarnos. Naujesnių tyrimų rezultatai rodo, jog tokių kardinalių ir žalingų pokyčių cestodas žuvims nesukelia, dažniausiai dėl parazito prisitvirtinimo truputį pažeidžiamas epitelis tvirtinimosi vietoje, sukeliamas imuninis atsakas, tačiau mirtingumas dėl invazijos nėra toks didelis, kaip buvo manyta anksčiau. Nepaisant vyraujančių skirtingų nuomonių manau, jog bet kokio dydžio invazija neigiamai veikia užsikrėtusias žuvis, mažėja jų augimo greitis ir tokiu būdu žuvininkystės ūkiai patiria ekonominių nuostolių. Ypač aktualus mailiaus sveikatingumas, kadangi jis įvairiems užsikrėtimams gali būti daug jautresnis nei suaugusios žuvys.
Karpių kavioze susidomėjau, nes nemaža dalis apie K. sinensis surinktos informacijos yra pasenusi, be to, informacijos apie šį cestodą Lietuvoje beveik iš viso nėra. Dėl to nusprendžiau atlikti jo paplitimo Lietuvos žuvininkystės ūkiuose tyrimą bei nustatyti gydymo efektą naudojant flubendazolą. Ši veiklioji medžiaga buvo pasirinkta dėl to, jog ūkiai nuolatos ieško ekonomiškesnių problemų sprendimo būdų, o geru veikimu prieš cestodus pasižymintis prazikvantelis yra gana brangus.
Darbo tikslas: Nustatyti cestodo Khawia sinensis paplitimą kai kuriuose Lietuvos žuvininkystės ūkiuose bei įvertinti gydymo efektyvumą naudojant flubendazolą.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti užsikrėtusių karpių amžių, ilgį bei svorį. 2. Nustatyti K. sinensis paplitimą tirtuose ūkiuose.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Paprastasis karpis
1.1.1 Paprastojo karpio svarba pasaulio gėlavandenėje žuvininkystėje
Paprastasis karpis (Cyprinus carpio) – tai karpžuvių (Cypriniformes) būrio žuvis, priklausanti didžiausiai gėlavandenių žuvų šeimai - karpinėms (Cyprinidae) žuvims. Dėl savo gebėjimo prisitaikyti prie įvairių sąlygų, paprastasis karpis yra plačiai paplitęs daugelyje pasaulio šalių, tačiau yra itin populiarus Azijoje bei Europoje (1). Azijoje ši žuvis buvo pradėta auginti daugiau nei 500 m. pr. Kr., Vokietijoje ir Lenkijoje ši žuvis maistui pradėta auginti beveik prieš 1000 metų (2-4). Kai kuriose Europos šalyse daugiau nei 80 proc. žuvies produkcijos yra gaunama iš paprastojo karpio (1 pav.) (5,6). Pasaulyje produkcija gaunama iš paprastojo karpio sudaro apie 10 proc. visos gėlavandenės akvakultūros produkcijos, 2010 m. ši žuvis buvo 3 pagal populiarumą verslinė gėlavandenių žuvų rūšis pasaulyje po baltojo amūro (Ctenopharyngodon idella) bei baltojo plačiakakčio (Hypophthalmichthys molitrix) (7).
1 pav.Karpių produkcijos kiekis daugiausia karpių auginančiose Europos šalyse (2). Vokietijoje stebimas kritimas dėl pasikeitusios apskaitos – grafike vaizduojamas tik žuvų kiekis, parduotas žmonių reikmėms. Žuvų kiekis,
10 1.1.2 Paprastojo karpio mityba bei sinergizmas su kitomis žuvų rūšimis
Paprastieji karpiai yra laikomi visaėdžiais, tačiau labiau yra linkę maitintis ant dugno gyvenančiais organizmais – vandens vabzdžiais, jų lervomis, kirmėlėmis, moliuskais bei zooplanktonu, taip pat gali misti vandens augalų stiebeliais, lapais bei sėklomis (8).
Subtropinio/tropinio klimato juostose polikultūriniuose tvenkiniuose auginami karpiai gali priaugti 2-4 proc. kūno masės per parą, t.y. po vieno auginimo sezono žuvis gali siekti 1 kg svorį. Vėsesniame klimate auginami karpiai 1,5 kg svorį pasiekia per 3 sezonus (9). Šeriamos grūdais ar peletėmis šios žuvys greitai prisitaiko, pakeisdamos savo mitybos įpročius. Pastebėta, jog šėrimas peletėmis yra efektyvesnis nei kiti šėrimo būdai (10-12).
Dėl savo mitybos įpročių karpiai išjudina dugno nuosėdas, taip padidindami ištirpusių maisto medžiagų kiekį vandenyje. Dėl šios priežasties padaugėja fitoplanktono, kuriuo minta kitos žuvys, todėl šiltesnio klimato zonose propaguojama kartu su karpiais auginti kitas žuvų rūšis. Vis dėlto, Rytų Europoje labiau vyrauja monokultūrinis karpių auginimas tvenkiniuose (13).
1.1.3 Paprastojo karpio vystymasis
Europoje karpių patelės subręsta po maždaug 11000-12000 laipsniadienių, patinai subręsta 25-35 proc. greičiau. Neršimas prasideda vandens temperatūrai pasiekus 17-18°C, visus ikrus į vandenį karpiai išleidžia per keletą valandų. Po kontakto su vandeniu ikrai tampa lipnūs ir prisitvirtina prie vandens žolių (3).
Karpio embrioninis vystymasis užtrunka apie 3 dienas 20-23°C temperatūros vandenyje (60-70 laipsniadienių), išsiritusios lervutės laikosi prie substrato. Per maždaug 3 dienas po išsiritimo išsivysto užpakalinė plaukiojamosios pūslės dalis, lervutės ima plaukioti horizontaliai bei maitintis. Šiuo laikotarpiu didžiąją dalį raciono sudaro verpetės (Rotifera gentis). Praėjus 4 – 5 dienoms po išsiritimo, lervutės perkeliamos į auginimo tvenkinius. Labiausiai tokio amžiaus karpių jaunikliams auginti tinka 0,5–1 ha seklūs tvenkiniai, kuriuose jie laikomi 3–4 savaites. Pasiektas mailiaus svoris būna apie 0,2–0,5 g, išgyvenamumas siekia 40-70 proc. Paaugintas mailius perkeliamas į didesnius tvenkinius, rekomenduojamas tankis - 50000–200000 vnt/ha. Čia pirmaisiais metais žuvys pasiekia 30 – 100 g svorį; antraisiais metais siekiama, jog karpis pasiektų 250-400 g svorį. Karpių priesvoris gali varijuoti priklausomai nuo pašaro rūšies, kokybės, kiekio, tvenkinyje esančio natūralaus maisto, tvenkinio dydžio ir kitų faktorių (14). (2 pav.)
11 2 pav. Karpio gyvenimo ciklo stadijų schema (15)
1.1.4 Paprastojo karpio helmintozių svarba
Europoje paprastojo karpio helmintų įvairovė anksčiau buvo intensyviai tyrinėjama dėl šios žuvų rūšies populiarumo akvakultūroje. 2002 m. paprastųjų karpių parazitų sąraše buvo 310 parazitų rūšių (16). Iš Rytų Azijos į Europą įvežti tokie cestodai, kaip Bothriocephalus acheilognathi bei Khawia
sinensis, laikomi svarbiais patogenais, galinčiais įtakoti karpių sveikatingumą. Šios įvežtinės rūšys
nukonkuravo 1950-1960 m. Centrinėje bei Rytų Europoje paplitusį cestodą Caryophyllaeus fimbriceps (17).
1.2 K. sinensis morfologija, vystymosi ciklas
K. sinensis iš kitų, cestodų klasei priklausančių kirmėlių, išsiskiria nesegmentuotu (monozoišku)
kūnu bei viena pora vyriškų ir moteriškų genitalijų (18). Kūno ilgis gali siekti iki 190 mm, plotis 1,3 – 4 mm. Skoleksas šviestuvo arba gvazdiko žiedo formos, su giliomis raukšlėmis, 2,0 – 2,4 mm pločio. Kaklelio plotis 0,7 – 1,1 mm (19,20). Sėklidės ovalios, difuziškai išsidėsčiusios nuo priekinės kūno dalies iki ciruso maišelio priekinės ribos. Trynio maišai truputį mažesni už sėklides, jų išsidėstymas prasideda kiek labiau priekyje negu sėklidžių ir baigiasi ties priekinėmis gimdos vijomis. Kiaušidė dviskiltė, H formos, priekinės atšakos ilgesnės ir didesnės negu galinės. Aprašyta atvejų, kai K. sinensis kiaušidė buvo apverstos A formos. Taip turbūt yra dėl to, jog galinės kiaušidės atšakos lenkiasi į vidų ir kai kuriais atvejais net susiliečia.
12
K. sinensis vystymosi ciklas labai priklauso nuo vandens temperatūros. Kiaušinėlių dėjimas
prasideda vandens temperatūrai pasiekus ~15 - 16°C. Į aplinką kiaušinėlius išleidęs suaugęs cestodas žūva (21). Kiaušinėliai į aplinką išleidžiami dar nepradėjus formuotis embrionui, todėl onkosfera, galinti užkrėsti tarpinius šeimininkus, susiformuoja tik po 2 – 4 savaičių, priklausomai nuo vandens temperatūros vystymosi metu (22). Esant žemesnei nei +5 °C temperatūrai onkosferos nesusidaro (23). Susiformavusi onkosfera aplinkoje infektyvi išlikti gali 2 – 3 mėnesius (19). Tarpiniais K. sinensis šeimininkai literatūroje įvardijami Tubifex tubifex, Limnodrilus hoffmeisteri, L. udekemianus, Ilyodrilus
templetoni, Potamothrix hammoniensis bei Psammoryctides barbatus. Visos šios kirmėlių rūšys
priklauso mažašerių žieduotųjų kirmėlių poklasiui (Oligochaeta). Šitoks platus tarpinių šeimininkų spektras užtikrina parazito išsilaikymą regionuose, kuris jau yra išplitęs, taip pat dėl to lengviau plinta ir naujose teritorijose. Patekusi į tarpinio šeimininko organizmą, onkosfera skevarbiasi į kūno ertmę ir po 8-9 savaičių tampa metacestodu. Įrodyta, jog K. sinensis metacestodai tarpiniuose šemininkuose sugeba išgyventi žiemą net nusausintų tvenkinių dugne (19). Į pagrindinį šemininką – karpinių (Cyprinidae) šeimos žuvį – patekęs metacestodas tampa suaugusiu individu. (3 pav.) Cestodo augimo greitis gali siekti net iki 5 mm per dieną (24,25).
3 pav. Khawia sinensis vystymosi ciklas. a) iš žuvies pasišalinę parazito kiaušinėliai nusėda ant dugno, b) kiaušinėliai suėdami mažašerių žieduotųjų kirmėlių, kuriose išsivysto plerocerkoidai, c) žuvys užsikrečia suėsdamos
mažašeres žieduotąsias kirmėles (21)
K. sinensis cestodus pagal lytinę brandą galima suskirstyti į 4 grupes (4 pav.): I grupė – jauni
kaspinuočiai (matomos genitalijų užuomazgos), II grupė – bręstantys kaspinuočiai (vystosi genitalijos), III grupė – suaugę kaspinuočiai (genitalijos susiformavusios, tačiau gimdoje kiaušinėlių dar nėra) ir IV grupė – vaisingi individai (gimda pilna kiaušinėlių) (26). Eksperimentiškai užkrėstose žuvyse K. sinensis brendimo ciklas buvo:
13
I grupė – 2 – 12 dienų po užkrėtimo
II grupė – 19 – 24 dienos po užkrėtimo
III grupė – 36 – 62 dienos po užkrėtimo
IV grupė – 78 – 91 diena po užkrėtimo
Pilna K. sinensis vystymosi ciklo trukmė įvairių šaltinių duomenimis gali svyruoti nuo 1,5 mėn. iki 3 mėn (21,27).
4 pav. K. sinensis cestodai iš eksperimentiškai užkrėstų karpių (Cyprinus carpio) (26). (A – 2 dienos po užkrėtimo, B – 7 dienos po užkrėtimo, C – 10 dienų po užkrėtimo, D – 12 dienų po užkrėtimo, E – 16 dienų po užkrėtimo, F
– 19 dienų po užkrėtimo, G – 51 diena po užkrėtimo, H – 55 dienos po užkrėtimo, A-D, F-H – temperatūra 15-16°C, E – 20-22°C)
14
1.3 K. sinensis paplitimas pasaulyje bei jo reikšmė akvakultūrai
Pirmą kartą K. sinensis išskirtas iš paprastojo karpio ir aprašytas 1935 m. Kinijoje, Pekino apylinkėse (28,29). Manoma, jog tuomet cestodas buvo paplitęs Kinijoje bei tolimuosiuose Rusijos rytuose. Vėliau cestodas, pervežant karpines žuvis, ypač paprastuosius karpius (Cyprinus carpio), baltuosius amūrus (Ctenopharyngodon idella) bei įvairius karpinių žuvų hibridus ėmė plisti į Sovietų Sąjungos vakarinę dalį. 1954-1955 m. K. sinensis pirmą kartą, greičiausiai parazitui į Lietuvą atkeliavus su iš Latvijos ar Baltarusijos įvežtomis karpinėmis žuvimis, aptiktas karpiuose augintuose Lietuvos žuvininkystės ūkiuose. Labai staigus K. sinensis plitimas Europoje (5 pav.) prasidėjo nuo 1960 m. kai užsikrėtimas parazitais iki 1970 m. buvo nustatytas daugiau nei 8 Europos valstybėse, taip pat Japonijoje bei Kazachstane (30).
5 pav. Khawia sinensis paplitimas Europoje. Šalys, kuriose aptiktas cestodas, užtamsintos (30)
Iki 1986 m., K. sinensis išplito dar labiau, ypatingai dažnai buvo aptinkamas Rusijoje ir centrinėje Europoje. Slovakijoje šis parazitas pirmą kartą aptiktas tik 2009 m.; taip pat tai pirmas užfiksuotas atvejis apie užsikrėtimą, nustatytą upėje gyvenančių karpių populiacijoje.
1970-ųjų pradžioje pasirodę pranešimai apie K. sinensis nurodė, jog šis kaspinuotis gali turėti didelę reikšmę žuvininkystėms ūkiams dėl galimai didelės neigiamos įtakos karpių sveikatai bei produktyvumui. Remiantis histopatologinių tyrimų duomenimis buvo teigiama, jog užsikrėtimas K.
15 kraujo rodiklius (sukelti anemiją bei sumažinti leukocitų aktyvumą). Greičiausio K. sinensis plitimo Europoje periodo metu (1960-1970 m.), šis cestodas buvo laikomas gana patogenišku, ypač karpių mailiui, nes šiuo periodu buvo užfiksuota nemažai pranešimų apie karpių mailiaus gaišimus. Kita vertus, naujesnių tyrimų duomenimis nustatyta, jog K. sinensis patogeniškumas gali būti gerokai mažesnis, negu manyta. 2009 metais Slovakijoje atliktų tyrimų metu nenustatyta jokių patologinių, tokių, kaip enteritas ar mechaniniai epitelio pažeidimai, pakitimų, taip pat nepastebėta neigiamo užsikrėtimo poveikio žuvų fiziologinei būklei (30). Mokslinėje bendruomenėje vyraujant skirtingoms nuomonėms dėl K. sinensis patogeniškumo, drįstu manyti, jog parazitas vis tiek yra patogeniškas (ypač jei užsikrėtimas intensyvus), todėl vertėtų stebėti jo cirkuliaciją žuvininkystės ūkiuose siekiant apsaugoti karpines žuvis ir ypač jų mailių.
K. sinensis reikšmė Europoje bei pasaulyje per paskutiniuosius dešimtmečius gerokai nukrito:
mažėja tiek naujų mokslinių pranešimų apie šį cestodą skaičius, tiek naujų pranešimų apie užsikrėtimus. Taip gali būti dėl to, jog po staigaus išplitimo Europoje, šis parazitas buvo sėkmingai kontroliuojamas naudojant įvairius preparatus, pvz. piperazino druską ar niklozamidą.
1.4 Organizmo reakcija į parazitą
K. sinensis kaspinuočiai dažniausiai randami prisitvirtinę pirmajame žarnos trečdalyje, iki
pirmosios žarnos kilpos (31). Sunkių infekcijų atveju parazitai gali būti randami ir kituose žarnos trečdaliuose ar net kyšantys pro analinę angą. Dažniausiai šie cestodai žarnoje būna prisitvirtinę grupėmis iki 6 individų. K. sinensis skoleksas neturi kitiems cestodams būdingų prisitvirtinimo organų (botrijų, siurbtukų ar chitininių kabliukų), todėl prie žarnos gleivinės tvirtinasi įsiskverbdamas į ją iki kaklelio. Nepaisant tokio prisitvirtinimo būdo, be gleivinės epitelio suplokštėjimo prisijungimo vietoje bei padidėjusio gleivėtumo tvirtinimosi plote ir ant pačios kirmėlės, nepastebėta didesnių neigiamų morfologinių pakitimų (30,32). Epitelio pažeidimai nustatyti visoms užsikrėtusioms žuvims tik cestodo tvirtinimosi prie gleivinės vietoje, nepriklausomai nuo parazitų dydžio. Aplink cestodo tvirtinimosi vietą pastebėta padidėjusi enterocitų vakuolizacija galimai indikuojanti autolizės pradžią (20).
Pastebėta, jog parazitas sukėlė žarnos sienelės ląstelinį atsaką – eozinofilų, makrofagų bei limfocitų infiltraciją tvirtinimosi vietoje. Ši reakcija buvo gerokai stipresnė stambesnių individų (>20 mm) tvirtinimosi vietoje. Taip pat užfiksuota ir leukocitų infiltracija, dalis leukocitų net buvo išsidėstę ant cestodo tegumento. Keista, tačiau nepastebėta jokios leukocitų cestodui padarytos žalos (20).
16
1.5 Vaistinių medžiagų naudojimas užsikrėtimui gydyti
1.5.1 Niklozamidas
Niklozamidas naudojamas kaip antihelmintikas dėl savo savybių sutrikdyti cestodų oksidacinio fosforilinimo reakcijas mitochondrijose, taip pat stabdyti gliukozės įsisavinimą. SSRS niklozamidas buvo plačiai naudojamas gydyti žuvų cestodozes, aprašyta atvejų, kai gydymo efektyvumas siekdavo 93-100 proc.
Šiais laikais, vadovaujantis 2009 m. gruodžio 22 d. Komisijos reglamentu (ES) Nr. 37/2010 „Dėl farmakologiškai aktyvių medžiagų, jų klasifikacijos ir didžiausios leidžiamosios koncentracijos gyvūniniuose maisto produktuose“, niklozamidas nėra nurodytas kaip medžiaga, kurią galima naudoti maistiniams gyvūnams. Atlikdamas literatūros analizę radau šaltinių, teigiančių, jog niklozamidas toksiškas visoms žuvų rūšims nuo 0,5 mg/l.
1.5.2 Prazikvantelis
Prazikvantelis veikia rezorbuodamasis per cestodų tegumentą bei padarydamas jį jautriu virškinimo fermentams, keičia kalcio jonų pralaidumą taip sukeldamas cestodo raumenų spazmus bei paralyžių, sutrikdo parazito medžiagų apykaitą (33). Literatūroje aprašyto tyrimo metu naudota 50 mg/kg žuvies biomasės prazikvantelio dozė, nustatytas reikšmingas efektyvumas siekiant kontroliuoti ar eliminuoti K. sinensis užsikrėtimą (31,34).
1.5.3 Fenbendazolas
Tai plataus veikimo spektro benzimidazolo karbamato grupės antihelmintikas. Veikimo mechanizmas – trikdo citoskeleto formavimąsi, medžiagų įsisavinimą bei pernešimą ląstelėje. Fenbendazolas pasižymi lėta rezorbcija iš žarnyno, dalis jo metabolitų, susidariusių kepenyse, pavyzdžiui oksfendazolas, veikia antihelmintiškai. 2019 m. Lietuvoje atlikto tyrimo duomenimis, karpių užsikrėtimui K. sinensis gydyti skirta vienkartinė 300 mg/kg fenbendazolo dozė nedavė reikšmingų rezultatų (35).
1.6 Flubendazolo farmakokinetinės bei farmakodinaminės savybės
Flubendazolas (fluoromebendazolas) – tai benzimidazolų karbamatų grupei priklausančio mebendazolo ir fluoro junginys (36). Mažai tirpus vandenyje, dažniausiai gaminamas tablečių, pastų granulių ar miltelių formose. Tai plataus veikimo spektro antihelmintikas, veikiantis nematodus, kai kuriuos cestodus bei trematodus. Dažniausiai naudojamas veterinarinėje medicinoje, tačiau yra preparatų, skirtų vartoti ir žmonėms.
17 Flubendazolas yra mažai tirpus vandenyje, todėl iš gyvūnų organizmo rezorbuojasi lėtai (maksimali koncentracija pastebima po 2-5 valandų). Su kraujo serumo baltymais susijungia 90-95 proc.. Tik apie 50 proc. skirtos flubendazolo dozės rezorbuojama į gyvūno organizmą, likusi dalis išsikiriama su išmatomis nepakitusi. Tai nėra blogai, kadangi veiklioji medžiaga tiesiogiai kontaktuoja su žarnyne esančiu cestodu. Pagrindinis flubendazolo veikimo mechanizmas pagrįstas jo jungimusi prie baltymo tubulino, dėl ko pakinta helminto lastelių mikrovamzdelių struktūra bei sutrinka ląstelės funkcijos: maisto medžiagų transportavimas, angliavandenių apykaita (37). Taip pat flubendazolas išplečia parazito šalinimo kanalėlius, ardo epidermį bei slopina mitochondrijų aktyvumą. Kepenyse susidarę metabolitai (karbamatai, fenilmetanai) neturi antihelmintinių savybių, iš organizmo didžioji dalis (~80 proc.) pašalinama su išmatomis (38,39).
18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
6 pav. Tyrimo schema
Iš Lietuvos žuvininkystės ūkių A, B, C, D ir X gauti karpiai X ūkyje Y ir Z tvenkiniuose vykdomas karpių skrodimas, identifikuojamas cestodas bei nustatomas
užsikrėtimo stiprumas
Sudaromas gydymo planas, pagaminamas
pašaras, gydoma
Po gydymo praėjus 1, 2 bei 3 savaitėms, karpiai
skrodžiami, identifikuojamas cestodas bei nustatomas
užsikrėtimas Nustatomas gydymo efektyvumas Iš A, B, C ir D ūkių gauti karpiai skrodžiami, identifikuojamas cestodas bei nustatomas
19 Tyrimo metu siekta nustatyti cestodo Khawia sinensis paplitimą kai kuriuose Lietuvos žuvininkystės ūkiuose, taip pat atliktas tyrimas X ūkyje siekiant įvertinti gydymo efektyvumą naudojant flubendazolą. Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete Maisto saugos ir kokybės katedroje, žuvų skrodimai atlikti Veterinarinės Patobiologijos katedros patologijos centre. Tyrimų metu iš viso išskrosti 403 paprastieji karpiai (Cyprinus carpio) iš 5 skirtingų Lietuvos žuvininkystės ūkių. Kai kurių ūkių savininkų pageidavimu karpiai skrosti iš daugiau nei 1 tvenkinio. Karpiai būdavo pagaunami tinklais (bučiukais) ir gabenami į LSMU maišuose su deguonies prisotintu vandeniu arba užmušami smūgiu per galvą pagavimo vietoje ir transportuojami negyvi. Visi karpiai būdavo išskrosti per 6 h nuo pagavimo tvenkinyje (užtrukdavo karpių transportavimas, kai kurie ūkiai buvo toli nuo Kauno) išskyrus vieną atvejį, kai žuvų skaičius buvo itin didelis. Šiuo atveju neišskrosti karpiai buvo laikomi šaldytuve ir skrodimas baigtas kitą dieną. Tyrimo rezultatams tarp pagavimo ir skrodimo praėjęs laiko tarpas įtakos neturėjo, kadangi rastus cestodus reikėjo tik identifikuoti. Tyrimo trukmė 2020-05-15 – 2020-07-31.
2.1 Gydymo flubendazolu efektyvumo tyrimas
2020 m. birželio 21 d., X ūkyje Y ir Z tvenkiniuose buvo pagauti ir tyrimams pristatyti karpiai siekiant įvertinti užsikrėtimą K. sinensis cestodais. Iš Y tvenkinio tyrimams pristatyta 13 žuvų, iš Z tvenkinio – 16. Nustatytas 38.6 proc. užsikrėtimas Y tvenkinyje bei 31,25 proc. užsikrėtimas Z tvenkinyje. Abiejuose tvenkiniuose buvo auginami dvimečiai karpiai. 2020 m. liepos 8 d. karpiai Y ir Z tvenkiniuose buvo pradėti šerti specialiai pagamintu vaistiniu kombinuotu pašaru su flubendazolu. Naudotas vaistas – FLUBENDAZOL 50 mg/g milteliai (Bela-Pharm GmbH & Co. KG, Vokietija). Į toną pašaro buvo dedama 2 kg preparato (100 g flubendazolo). Pašaro vidutiniškai suduota ~3 proc. nuo karpio biomasės, žuvys šiuo pašaru šertos 3d. iš eilės. Vidutinė susidariusi vaisto dozė – 3 mg/kg per dieną. Po vaistinio pašaro sudavimo karpiai skrosti 3 kartus (1 lentelė).
1 lentelė. Skrostų karpių skaičius tvenkiniuose, kuriuose taikytas gydymas
Y tvenkinio karpiai, vnt. Z tvenkinio karpiai, vnt.
2020.06.21 13 16
Gydymas 2020.07.8-10 dienomis - -
2020.07.17 16 15
2020.07.23 18 16
20
2.2 Skrodimas, duomenų rinkimas
Žuvys skrostos LSMU Patologijos centre. Iš pradžių karpiai buvo užmušami smūgiu per galvą, tada sveriami, matuojamas jų ilgis. Pagal amžių karpiai skirstyti į vienmečius (H1) bei dvimečius (H2). Dėl tikslumo karpius nuspręsta matuoti nuo galvos priekio iki uodegos peleko pradžios. Po svėrimo ir matavimo karpiai buvo skrodžiami dviem būdais:
didesniems karpiams atliekamas pjūvis nuo analinės angos iki kaudalinės galvos dalies, žarna išimama, atskiriama nuo pasaito ir žirklėmis perkerpama išilgai, ieškoma cestodų;
mažesniems karpiams atliekamas pjūvis nuo analinės angos iki kaudalinės galvos dalies arba nukerpamas vienos pusės šonkaulių lankas, išimama žarna bei atskiriama nuo pasaito ir preparavimo adatomis po truputį ardoma, ieškoma cestodų (7 pav.);
7 pav. Karpio skrodimas (autoriaus nuotrauka)
Radus cestodų, jie buvo suskaičiuojami bei identifikuojami naudojant binokuliarą (MBC -9, Rusija), kai kurie individai buvo nufotografuojami bei pamatuojamas jų ilgis (8 pav.). Dėl savo unikalaus gvazdiko/šviestuvo formos skolekso didesnius K. sinensis individus buvo galima identifikuoti ir plika akimi.
21 8 pav. Skrodimo metu rastų cestodų ilgio matavimas (autoriaus nuotrauka)
Po skrodimų susidarę šalutiniai gyvūniniai produktai buvo laikomi LSMU VA Patologijos centro ŠGP sandėliavimo patalpoje, vėliau išvežami utilizuoti į UAB „Rietavo veterinarinė sanitarija“.
2.3 Statistinė analizė
Surinkti duomenys susisteminti ir išanalizuoti naudojant Microsoft Excel 2016 programą. Kiekybiniams požymiam įvertinti naudota t-test funkcija, kokybiniai duomenys įvertinti naudojant Chi kvadrato funkciją. Skaičiuoti vidurkiai, standartiniai nuokrypiai bei standartinės paklaidos (SE).
22
3. REZULTATAI
Tyrimams atlikti skirti iš žuvininkystės ūkių gauti karpiai skyrėsi amžiumi – mano prašymu buvo pateikiami dvimečiai karpiai, tačiau kai kurių ūkių vadovai papildomai pageidavo jog užsikrėtimas K.
sinensis būtų nustatytas ir tam tikruose tvenkiniuose vienmečių karpių tarpe. Iš skirtingų ūkių gautų tų
pačių amžiaus grupių (H1 arba H2) vidutiniai karpių svoriai skyrėsi. Tam įtakos turi žuvų koncentracija tvenkinyje, naudojamo pašaro sudėtis bei per dieną suduodamas jo kiekis. Vidutinis per visą tyrimo laiką iš žuvininkystės ūkių gautų ir išstirtų dvimečių karpių (H2) svoris buvo 211,79 g (SE = 12,56, n = 226), o vienmečių (H1) – 15,82 g (SE = 0,64, n = 177) (9 pav.).
9 pav. Tirtų amžiaus grupių svorio vidurkis
Nustatytas vidutinis dvimečių karpių ilgis 17,81 cm (SE = 0,25), vienmečių – 7,93 cm (SE = 0,1) (10 pav.). 15,82 211,71 0 50 100 150 200 250 Sv o ris , g Amžius Vienmečiai Dvimečiai
23 10 pav. Tirtų amžiaus grupių ilgio vidurkis
Nustatytas vidutinis dvimečių (H2) karpių svoris X ūkyje buvo 125,02 g (SE = 3,43), A ūkyje 132,2 (SE = 6,98), , B ūkyje 429,92 g (SE = 29,57), C ūkyje 92,6 g (SE = 5,7), D ūkyje 163,68 g (SE = 5,57). (11 pav.)
B ūkyje vidutinis karpių svoris buvo didžiausias, jis 70,9 proc. (p<0,001) viršijo X ūkio, 62,2 proc. (p<0,001) A ūkio, 78,46 proc. (p<0,001) C ūkio bei 61,9 proc. (p<0,001) D ūkio vidutinį karpių svorį.
7,93 17,81 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Ilgis , cm Vienmečiai Dvimečiai
24 11 pav. Dvimečių karpių (H2) pasiskirstymas ūkiuose pagal svorį
Nustatytas vidutinis dvimečių karpių ilgis X ūkyje buvo 16,13 cm (SE = 0,15), A ūkyje 15,59 cm (SE = 0,33), B ūkyje 22,15 cm (SE = 0,51), C ūkyje 14,93 cm (SE = 0,32), D ūkyje 17,59 cm (SE = 0,2) (12 pav.)
B ūkyje taip pat nustatytas didžiausias vidutinis karpių ilgis, jis 27,17 proc. (p<0,001) viršijo X ūkio, 29,61 proc. (p<0,001) A ūkio, 32,59 proc. (p<0,001) C ūkio bei 20,58 proc. (p<0,001) D ūkio vidutinį karpių ilgį.
12 pav. Dvimečių (H2) karpių pasiskirstymas ūkiuose pagal ilgį
125,02 132,2 429,92 92,6 163,68 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
X ūkis A ūkis B Ūkis C ūkis D ūkis
Sv o ris , g Ūkiai 16,13 15,59 22,15 14,93 17,59 0 5 10 15 20 25
25 B ūkyje visų tirtų dvimečių (H2) karpių vidutinis svoris buvo 429,92 g (SE=29,57), vidutinis ilgis 22,15 cm (SE=0,51). Vienmečių (H1) karpių vidutinis svoris 15,82 g (SE=0,64), vidutinis ilgis 7,93 cm (SE=0,1). Vertinant B ūkyje tirtų žuvų užsikrėtimą, nustatyta, jog užsikrėtimas dvimečių karpių tarpe – 12,5 proc., o vienmečių karpių populiacijoje – 2,82 proc. (p<0,05) (13 pav.)
13 pav. B ūkyje tirtų karpių rodikliai pagal amžių
Analizuojant visų tirtų dvimečių karpių skrodimo duomenis, nustatyta, jog daugiausia užsikrėtusių karpių buvo iki 200g svorio grupėje (16 vnt.), t.y. 75 proc. daugiau nei 200-400 gr svorio grupėje bei virš 400 gr svorio grupėje nustatytų karpių (po 4 vnt. abiejose grupėse) (14 pav.). Išanalizavus duomenis nepastebėta ryšio tarp karpių svorio ir užsikrėtimo (p>0,05).
429,92 22,15 12,5 15,82 7,93 2,82 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00
Vid. Svoris Vid. Ilgis Užsikrėtimas, proc.
26 14 pav. Užsikrėtimų skaičius pagal žuvų svorį dvimečių karpių tarpe
Daugiausia užsikrėtusių karpių nustatyta 15-20 cm ilgio grupėje (14 vnt.), t.y. 71,4 proc. daugiau nei grupėje iki 15 cm ilgio bei 57,1 proc. daugiau nei grupėje virš 20 cm ilgio (15 pav.). Išanalizavus duomenis nepastebėta ryšio tarp karpių ilgio ir užsikrėtimo (p>0,05).
15 pav. Užsikrėtimų skaičius pagal žuvų ilgį dvimečių karpių tarpe
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 iki 200g. 200-400g. virš 400g. Užs ik rėtu sių žu vų s kaičiu s Žuvų svoris 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Iki 15 cm 15-20 cm Virš 20 cm Užsik rėtu sių žu vų s kaičiu s Žuvų ilgis
27
3.1 K. sinensis paplitimas žuvininkystės ūkiuose
Nustatant K. sinensis paplitimą Lietuvos žuvininkystės ūkiuose, buvo tirti penkiems ūkiams priklausantys tvenkiniai (2 lentelė):
X ūkyje tirti du tvenkiniai (Y ir Z), abiejuose nustatytas užsikrėtimas ir taikytas gydymas. Nustatytas pirminis užsikrėtimas Y tvenkinyje – 38,46 proc., Z tvenkinyje – 31,25 proc.
A ūkyje tirtas vienas tvenkinys, nustatytas užsikrėtimas – 5 proc.
B ūkyje tirti trys tvenkiniai (J, K ir L), J tvenkinyje nustatytas užsikrėtimas - 23,81 proc., K tvenkinyje nustatytas užsikrėtimas – 3,09 proc., L tvenkinyje užsikrėtimo nenustatyta.
C ūkyje tirtas vienas tvenkinys, užsikrėtimo nenustatyta
D ūkyje tirtas vienas tvenkinys, nustatytas užsikrėtimas – 10,53 proc.
Iš viso, iš 5 tirtų ūkių, 4 iš jų nustatytas užsikrėtimas. Bendras nustatytas karpių kaviozės paplitimas žuvininkystės ūkiuose – 80 proc.
2 lentelė. Nustatytas užsikrėtimas žuvininkystės ūkiuose
X ūkis A ūkis B ūkis C ūkis D ūkis
Y tvenkinys Z tvenkinys J tvenkinys K tvenkinys L tvenkinys Užsikrėtimas tvenkinyje, proc. 38,46 31,25 5 23,81 3,09 0 0 10,53 Užsikrėtimas
ūkyje Nustatytas Nustatytas Nustatytas Nenustatytas Nustatytas
B ūkyje J tvenkinyje buvo atlikti 5 skrodimai (gegužės 17 d., birželio 12 d., birželio 23 d., liepos 9 d., ir liepos 23 d.) siekiant nustatyti užsikrėtimo dinamiką tvenkinyje (16 pav.) Pirmojo skrodimo metu tirta 21 žuvis, vidutinis svoris 368,41 g (SE = 34,95), vidutinis ilgis 20,7 cm (SE = 0,9). Nustatytas užsikrėtimas tvenkinyje - 23,81 proc., didžiausias rastas cestodų skaičius vienoje žuvyje – 41. Dauguma cestodų buvo jauni (17 pav.) Birželio 12 d. tirtos 9 žuvys, vidutinis svoris 618,31 g (SE = 109,38), vidutinis ilgis 24,87 cm (SE = 1,75). Nustatytas užsikrėtimas – 33 proc., maksimalus žuvyje rastas cestodų skaičius - 6. Keista, tačiau po to sekusių trijų skrodimų (birželio 23 d. – 15 žuvų, liepos 9 d. – 9 žuvys, liepos 23 d. – 10 žuvų) metu užsikrėtimo nebuvo nustatyta.
28 16 pav. Užsikrėtimo dinamika B ūkyje J tvenkinyje gegužės-liepos mėnesiais
17 pav. Cestodai, rasti skrodimo metu (autoriaus nuotrauka)
23,81 33,33 0,00 0,00 0,00 53 9 0 0 0 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00
17-geg 24-geg 31-geg 07-birž 14-birž 21-birž 28-birž 05-liep 12-liep 19-liep
29
3.2 Gydymo efektyvumo nustatymas naudojant flubendazolą
3.2.1 Y tvenkinys
X ūkyje Y tvenkinyje per visą tyrimo laikotarpį buvo išskrosti 62 karpiai, nustatytas užsikrėtimas, bendras rastų K. sinensis skaičius, vidutinis cestodų skaičius užsikrėtusiose žuvyse bei jo variacija (3 lentelė).
3 lentelė. X ūkio Y tvenkinio skrodimo rezultatai
Karpiai Užsikrėtimas, proc.
K. sinensis skaičius,
vnt.
Vidutinis cestodų skaičius užsikrėtusiose žuvyse (min -
max) Ištirti, vnt. Užsikrėtę, vnt. 06.21 13 5 38,46 17 3,4 (1 - 6) 07.17 16 2 12,5 9 4,5 (4 - 5) 07.23 18 2 11,11 2 1 (1 - 1) 07.31 15 2 13,33 2 1 (1 - 1)
Prieš gydymą, birželio 21 d., ištirta 13 karpių, nustatytas užsikrėtimas – 38,46 proc., vidutinis cestodų skaičius, rastas žuvyse – 3,4 (1 – 6). Liepos 8, 9, 10 dienomis karpiai buvo gydomi 3 mg/kg flubendazolo per dieną. Po gydymo praėjus 7 dienoms atliktas skrodimas, ištirti 16 karpių, nustatytas 12,5 proc. užsikrėtimas, vidutinis cestodų skaičius 4,5 (4 – 5). Lyginant su užsikrėtimu birželio 21 dieną, užsikrėtimas sumažėjo 23,96 proc. tačiau gautas rezultatas nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05). Antrasis tyrimas atliktas 6 d. po pirmojo tyrimo, jo metu skrosta 18 karpių, nustatytas užsikrėtimas 11,11 proc., t.y. 1,39 proc. mažesnis nei praėjus savaitei po gydymo. Gauti rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05). Trečiasis skrodimas atliktas praėjus 8 dienoms nuo antrojo tyrimo (21 diena po gydymo pabaigos). Tyrimo metu išskrosta 15 karpių, nustatytas 13,3 proc. užsikrėtimas, t.y. 2,22 proc. didesnis nei po antrojo skrodimo (p>0,05) (18 pav.). Lyginant gautus tyrimų rezultatus nustatyta, jog gydymo efektyvumas naudojant flubendazolą Y tvenkinyje nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
30 18 pav. X ūkio Y tvenkinio užsikrėtimo dinamika
3.2.2 Z tvenkinys
X ūkyje Z tvenkinyje per visą tyrimo periodą išskrosti 62 karpiai, nustatytas užsikrėtimas, bendras rastų K. sinensis skaičius, vidutinis cestodų skaičius užsikrėtusiose žuvyse bei jo variacija (4 lentelė). 4 lentelė. X ūkio Z tvenkinio skrodimo rezultatai
Karpiai
Užsikrėtimas, proc. K. sinensis
skaičius, vnt. Vidutinis cestodų skaičius užsikrėtusiose žuvyse (min - max) Ištirti, vnt. Užsikrėtę, vnt. 06.21 16 5 31,25 11 0,69 (1 - 4) 07.17 15 1 6,67 4 0,27 (4) 07.23 16 1 6,25 1 0,06 (1) 07.31 15 2 13,33 6 0,4 (2 - 4) 38,46 12,5 11,11 13,33 17 9 2 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 06.21 07.17 07.23 07.31
Užsikrėtimas, proc. K. sinensis skaičius
31 Birželio 21 d. ištyrus 16 karpių nustatytas 31,25 proc. užsikrėtimas, vidutinis rastų cestodų skaičius užsikrėtusiose žuvyse – 0,69 (1 – 4). Liepos 8, 9 ir 10 dienomis taikytas toks pat gydymas kaip ir Y tvenkinyje. Praėjus savaitei po gydymo ištirti 15 karpių, nustatytas 6,67 proc. užsikrėtimas, t.y. 24,58 proc. mažesnis nei prieš gydymą. Praėjus dviem savaitėms po gydymo tirti 16 karpių, nustatytas 6,25 proc. užsikrėtimas, t.y. 0,42 proc. daugiau nei savaitė po gydymo. Trečiojo skrodimo metu, praėjus trims savaitėms po gydymo, nustatytas užsikrėtimo padidėjimas iki 13,33 proc., t.y. 7,08 proc. didesnis nei antrojo skrodimo metu (19 pav.). Atlikus duomenų analizę nustatyta, jog gydymo efektyvumo rezultatai naudojant flubendazolą nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05).
19 pav. X ūkio Z tvenkinio užsikrėtimo dinamika
31,25 6,67 6,25 13,33 11 4 1 6 0 5 10 15 20 25 30 35 06.21 07.17 07.23 07.31
Užsikrėtimas, proc. K. sinensis skaičius
32
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Atliekant statistinę analizę pastebėta gana tolygi variacija tarp vidutinio dvimečių karpių svorio skirtinguose ūkiuose, tačiau dėl šio rodiklio išsiskyrė B ūkis, kuriame auginamų karpių vidutinis svoris 61,9-78,46 proc. viršijo kituose ūkiuose auginamų karpių vidutinį svorį. Šis žymus skirtumas galėjo atsirasti dėl skirtingų pašaro rūšių, naudojamų žuvininkystės ūkiuose, jų kiekio bei kokybės, natūralaus maisto šaltinių kiekio tvenkinyje, taip pat karpų augimo greitį bei svorį įtakoti gali tvenkiniuose laikomų karpių tankis, deguonies kiekis vandenyje bei kiti rodikliai. B ūkyje dvimečių karpių tvenkiniuose taip pat buvo pagauta ir ištirta gerokai didesnių karpių (>1 kg), dėl ko galima daryti prielaidą, jog šios žuvys yra vyresnės, greičiausiai likusios iš anksčiau augintų karpių bandų. Dėl šių priežasčių B ūkyje vidutinio karpių svorio statistika galėjo būti didesnė.
Lyginant B ūkyje auginamų dvimečių bei vienmečių karpių tyrimo rezultatus nustatyta, jog dvimečiai karpiai užsikrėtę labiau nei vienmečiai karpiai. (p<0,05) Molnar, Szekely ir Lang (21) teigia, jog vyresni karpiai dažniau užsikrečia K. sinensis dėl su amžiumi kintančių mitybos įpročių (vyresni karpiai vis dažniau ima maitintis nuo dugno).
Vertinant užsikrėtimo priklausomybę nuo svorio ar ilgio nepastebėta jokio ryšio tarp šių rodiklių (p>0,05).
Iš tirtų 5 žuvininkystės ūkių, 4 iš jų buvo aptiktas K. sinensis, nustatytas paplitimas – 80 proc. Daugiau ūkių nebuvo ištirta dėl laiko stokos bei tyrimo masto. Norint detaliai ištirti K. sinensis paplitimą Lietuvos žuvininkystės ūkiuose, reikalinga atlikti labai didelio masto tyrimą, kadangi žuvininkystės ūkių Lietuvoje yra gerokai daugiau, taip pat daug ūkių turi didelį skaičių jiems priklausančių tvenkinių (kai kuriuose ūkiuose šis skaičius viršija 30 tvenkinių) ir didelėje dalyje tų tvenkinių yra auginami karpiai, todėl norint atlikti detalesnius tyrimus reikėtų daugiau laiko.
Stebint užsikrėtimo dinamiką gegužės-liepos mėnesiais B ūkio J tvenkinyje buvo pastebėtas užsikrėtimo didėjimas nuo gegužės 17 d. iki birželio 12 d. (atitinkamai užsikrėtimas didėjo nuo 23,81 proc. iki 33,33 proc.), po to užsikrėtimas staigiai krito ir sekančių trijų tyrimų metu (birželio 23 d., liepos 9d. bei liepos 23d.) užsikrėtimo nebuvo nustatyta. Autorius Scholz (27) mini, jog atliekant K. sinensis užsikrėtimo tyrimus birželio mėnesį nustatytas mažiausias cestodų skaičius, o liepos mėnesį jau buvo aptinkami jauni cestodai. Priešingą nuomonę pateikia Molnar, Szekely ir Lang (21) teigdami, jog balandžio – birželio mėnesiais K. sinensis cestodai pasiekia lytinę brandą, išskiria kiaušinėlius ir žūsta. Mano manymu, užsikrėtimo didėjimą iki birželio 12 d. galima paaiškinti invazijos tikimybe, kadangi
33 karpiai pavasarį galėjo užsikrėsti misdami sėkmingai peržiemojusiais užsikrėtusiais tarpiniais šeimininkais, taigi cestodai iki birželio 12 d. sėkmingai galėjo vystytis karpių žarnyne. Balandžio 20 d. tvenkinys buvo kalkinamas negesintomis kalkėmis, naudojamas kiekis – 150 kg/ha. Kalkinimas galėjo turėti įtakos tvenkinio dugne gyvenančiai mažašerių žieduotųjų kirmėlių populiacijai, dėl ko užsikrėtimas vėlesniu laikotarpiu sumažėjo, tačiau nesumažino užsikrėtimo gegužės-birželio mėnesiais, kadangi tvenkinio kalkinimas į pagrindinio šeiminiko organizmą anksčiau patekusiems parazitams įtakos neturėjo. Birželio mėnesį suaugę cestodai į aplinką išskyrė kiaušinėlius ir žuvo, tačiau galimai dėl kalkinimo sumažėjus mažašerių žieduotųjų kirmėlių populiacijai, išsivysčiusios onkosferos užkrėtė mažesnį kiekį tarpinių šeimininkų.
Remiantis 2020 m. mūsų atlikto tyrimo metu gautais duomenimis, 3 dienas iš eilės karpiams duota 3 mg/kg flubendazolo dozė turėjo įtakos sumažinant K. sinensis invaziją X ūkio Y bei Z tvenkiniuose (nuo 38,46 proc. iki 11,11 proc. Y tvenkinyje bei nuo 31,25 proc. iki 6,25 proc. Z tvenkinyje), tačiau gauti rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05). Mano nuomone, gydymo efektyvumą galėjo įtakoti tokie faktoriai, kaip naudota veikliosios medžiagos dozė, gydymo trukmė, metų laikas, tvenkinių būklė, jų priežiūra ir pan. Analizuodamas mokslinę literatūrą neradau atliktų tyrimų, analizuojančių flubendazolo efektyvumą gydant užsikrėtimus K. sinensis cestodais, todėl norint gauti tikslesnių rezultatų šia tema, reikėtų atlikti daugiau tyrimų.
34
IŠVADOS
1. Lyginant B ūkyje gautus rezultatus tiriant dvimečius bei vienmečius karpius, pastebėta, jog dvimečių karpių užsikrėtimo lygis yra didesnis nei vienmečių karpių (p<0,05).
1.1 Vertinant tos pačios amžiaus grupės žuvų užsikrėtimo priklausomybę nuo svorio ar ilgio nepastebėta jokio ryšio (p>0,05).
2. Iš 5 tirtų žuvininkystės ūkių nustatytas 80 proc. cestodo K. sinensis paplitimas (p>0,05).
3. Gydant karpius 3 mg/kg flubendazolo doze per dieną 3 dienas iš eilės 2 tvenkiniuose, gauti šie rezultatai:
3.1 Y tvenkinyje nustatytas užsikrėtimo sumažėjimas nuo 38,46 proc. iki 11,11 proc. (p>0,05). 3.2 Z tvenkinyje nustatytas užsikrėtimo sumažėjimas nuo 31,25 proc. iki 6,25 proc. (p>0,05). 3.3 Išanalizuoti duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05), todėl manome, kad atliktas gydymas nebuvo pakankamai efektyvus.
35
REKOMENDACIJOS
1. Siekiant sėkmingai kontroliuoti K. sinensis invaziją paveiktuose tvenkiniuose, mano nuomone, reikėtų atsižvelgti į tokius faktorius, kaip naudojama vaisto dozė, gydymo periodas, metų laikas, tvenkinio būklė bei priežiūra ir kt. Vien tik taikant dehelmintizaciją kontroliuoti arba visiškai sunaikinti užsikrėtimo gali nepavykti, kadangi dehelmintizavus karpius, sunaikinami cestodai tik jau užsikrėtusiose žuvyse, tačiau tarpiniai šeimininkai, gyvenantys tvenkinio dugne, tebėra užsikrėtę ir karpiai besimaitindami užsikrės iš naujo. Dehelmintizaciją rekomenduojama atlikti atsižvelgus į cestodo vystymosi ciklą arba tam susidarius palankioms sąlygoms, pvz. rudenį karpius perkeliant į žiemojimo tvenkinius prieš tai taikoma dehelmintizacija būtų naudinga, tačiau šiuo atveju vasarą naudotas tvenkinys turėtų būti nusausinamas, iš jo valomas susikaupęs dumblas ir/arba dugnas kalkinamas negesintomis kalkėmis 1,5-2,5 t/ha. Tokiu atveju būtų galima ženkliai sumažinti tarpinių šeimininkų skaičių. Jei įmanoma, gali būti taikomas ir tvenkinio vasarinimas.
2. Rekomenduojama didinti flubendazolo dozę 1kg biomasės, gydyti daugiau dienų iš eilės, po gydymo užsikrėtimo kitimą stebėti dažnesniais intervalais (kas 2-3 dienas) siekiant gauti kuo tikslesnius užsikrėtimo kitimo rezultatus.
3. Jei varijuojant vaisto doze, gydymo periodo trukme bei kitais rodikliais negaunamas norimas rezultatas, siūlyčiau keisti naudojamą antihelmintinę veikliąją medžiagą.
36
PADĖKA
Noriu širdingai padėkoti savo darbo vadovui profesoriui Artūrui Stimbiriui už visapusišką pagalbą renkant mėginius, atliekant tyrimus bei pagalbą įvairiais darbo rengimo eigoje iškilusiais klausimais, taip pat už pasidalintas žinias bei pamokymus rengiant šį darbą.
Taip pat noriu padėkoti profesoriui Aliui Pockevičiui už suteiktą galimybę naudotis LSMU VA Patologijos centro patalpomis atliekant tyrimus.
37
LITERATŪROS SĄRAŠAS
(1) Weber MJ, Brown ML. Effects of Common Carp on Aquatic Ecosystems 80 Years after “Carp as a Dominant”: Ecological Insights for Fisheries Management. Reviews in fisheries science 2009 Sep 4,;17(4):524-537.
(2) Lasner T, Mytlewski A, Nourry M, Rakowski M, Oberle M. Carp land: Economics of fish farms and the impact of region-marketing in the Aischgrund (DEU) and Barycz Valley (POL). Aquaculture 2020;519:734731.
(3) Moav R, Hulata G, Wohlfarth G. Genetic differences between the Chinese and European races of the common carp. Heredity 1975 Jun;34(3):323-340.
(4) Xu J, Zhao Z, Zhang X, Zheng X, Li J, Jiang Y, et al. Development and evaluation of the first high-throughput SNP array for common carp (Cyprinus carpio). BMC genomics 2014 Apr 24,;15(1):307. (5) Rahman MM. Role of common carp ( Cyprinus carpio ) in aquaculture production systems. Frontiers in life science 2015 May 22,;8(4):399-410.
(6) Mohammad Mustafizur Rahman. Effects of co-cultured common carp on nutrients and food web dynamics in rohu aquaculture ponds. Aquaculture Environment Interactions 2015 Jan 1,;6(3):223-232. (7) Xu P, Zhang X, Wang X, Li J, Liu G, Kuang Y, et al. Genome sequence and genetic diversity of the common carp, Cyprinus carpio. Nature genetics 2014 Sep 21,;46(11):1212-1219.
(8) García-Berthou E. Size- and depth-dependent variation in habitat and diet of the common carp (Cyprinus carpio). Aquat sci 2001 Dec;63(4):466-476.
(9) Svåsand T, Crosetti D, García-Vázquez E, Verspoor E, Bonhomme F, Colombo L, et al. Evaluation of genetic impact of aquaculture activities on native populations. ICES CM documents 2007.
(10) Rahman MM, Kadowaki S, Balcombe SR, Wahab MA. Common carp (Cyprinus carpio L.) alters its feeding niche in response to changing food resources: direct observations in simulated ponds. Ecol Res 2009 Nov 21,;25(2):303-309.
(11) Rahman MM, Verdegem MCJ, Nagelkerke LAJ, Wahab MA, Milstein A, Verreth JAJ. Growth, production and food preference of rohu Labeo rohita (H.) in monoculture and in polyculture with common carp Cyprinus carpio (L.) under fed and non-fed ponds. Aquaculture 2006;257:1-4. (12) Rahman MM, Meyer CG. Effects of food type on diel behaviours of common carp Cyprinus carpio in simulated aquaculture pond conditions. Journal of fish biology 2009;74(10):2269-2278. (13) Szücs I, Stündl L, Váradi L. Carp Farming in Central and Eastern Europe and A Case Study in Multifunctional Aquaculture. Species and System Selection for Sustainable Aquaculture Ames, Iowa, USA: Blackwell Publishing; 2007. p. 389-414.
38 (14) Linnaeus. Cultured Aquatic Species Information Programme. Available at:
http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Cyprinus_carpio/en. Accessed -11-26, 2020.
(15) J. Koehn, C. Todd, L. Thwaites, I. Stuart, B. Zampatti, Q. Ye, et al. Managing flows and Carp. 2016 February,.
(16) Barlas M, Ozan ST, Kir İ. Helminth parasites of common carp (Cyprinus carpio L., 1758) in Beyşehir lake and population dynamics related to month and host size. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 2008;8(2):201-205.
(17) Oros M, Hanzelová V, Scholz T. The cestode Atractolytocestus huronensis (Caryophyllidea) continues to spread in Europe: new data on the helminth parasite of the common carp. Diseases of Aquatic Organisms 2004;62(1-2):115-119.
(18) Oros M, Scholz T, Hanzelova V, Mackiewicz JS. Scolex morphology of monozoic cestodes (Caryophyllidea) from the Palaearctic Region: a useful tool for species identification. Folia parasitologica 2010;57(1):37-46.
(19) Scholz T, Brabec J, Kralova-Hromadova I, Oros M, Bazsalovicsova E, Ermolenko A, et al. Revision of Khawia spp. (Cestoda: Caryophyllidea), parasites of cyprinid fish, including a key to their identification and molecular phylogeny. Folia parasitologica 2011;58(3):197-223.
(20) Morley N, Hoole D. Ultrastructural studies on the host-parasite interface between Khawia sinensis (Cestoda:Caryophyllidea) and carp Cyprinus carpio. Diseases of aquatic organisms 1995;23:93-99. (21) Kálmán Molnár, Csaba Székely, Mária Láng. Field guide to warmwater fish diseases in Central and Eastern Europe, the Caucasus and Central Asia. FAO fisheries and aquaculture circular 2019 Jan 1,(C1182):I-108.
(22) Bruňanská M, Mackiewicz JS, Młocicki D, Świderski Z, Nebesářová J. Early intrauterine embryonic development in Khawia sinensis Hsü, 1935 (Cestoda, Caryophyllidea, Lytocestidae), an invasive tapeworm of carp (Cyprinus carpio): an ultrastructural study. Parasitol Res 2011 Sep 6,;110(2):1009-1017.
(23) Hallier E. Parasitologische Untersuchungen. Leipzig: Engelmann; 2004.
(24) Daniel Robert Sutherland. Life cycle and host-parasite relationships of Khawia iowensis Calentine and Ulmer, 1961 (Cestoidea: Caryophyllidea)Iowa State University Digital Repository; 1981.
(25) Hoole D, Bucke D, Burgess P, Wellby I. Diseases of Carp and Other Cyprinid Fishes. Chichester: John Wiley & Sons, Incorporated; 2001.
(26) Scholz T. Development of Khawia sinensis Hsü, 1935 (Cestoda: Caryophyllidea) in the fish host. Folia parasitologica 1991;38:225-234.
(27) T. Scholz, V. Spetai, J. Zajiceki. Life Cycle of the Tapeworm Khawia sinensis Hsü, 1935, a Carp Parasite, in the Pond Dražský Skaličany near Blatná, Czechoslovakia. 1990.
39 (28) Wenchuan Y. A list of fish cestodes reported from China. Syst Parasitol 2007 Sep;68(1):71-78. (29) Scholz T, Binh TT, Dezfuli BS. Khawia japonensis (Cestoda: Caryophyllidea): another invasive parasite of carp, Cyprinus carpio L., imported to Europe. Journal of fish diseases 2011 Dec;34(12):943-949.
(30) Oros M, Hanzelova V, Scholz T. Tapeworm Khawia sinensis: Review of the introduction and subsequent
decline of a pathogen of carp, Cyprinus carpio. Veterinary parasitology 2009;164:217–222.
(31) Sudová E, Piačková V, Velíšek J, Pijáček M, Svobodová Z. Efficacy testing of orally administered praziquantel to common carp naturally infected by caryophyllidean tapeworms (Platyhelminthes: Eucestoda). Acta veterinaria Brno 2010;79(9):S73-S78.
(32) Oros M, Barčák D, Bazsalovicsová E, Hanzelová V. Asian fish tapeworm, Khawia japonensis (Yamaguti, 1934), has expanded its European invasive range. Parasitol Res 2015 Apr 7,;114(5):2035-2039.
(33) Jeziorski MC, Greenberg RM. Voltage-gated calcium channel subunits from platyhelminths: Potential role in praziquantel action. International journal for parasitology 2006 May;36(6):625-632. (34) Chan JD, Zarowiecki M, Marchant JS. Ca2+ channels and praziquantel: A view from the free world. Parasitology international 2013 Dec;62(6):619-628.
(35) Kirsh TR. Study of prevalence of khawia sinensis and bothriocephalus acheilognathi and antihelmintic treatment of carp. 2020 Feb 14,.
(36) Ceballos L, Moreno L, Torrado JJ, Lanusse C, Alvarez L. Exploring flubendazole formulations for use in sheep. Pharmacokinetic evaluation of a cyclodextrin-based solution. BMC veterinary research 2012 May 28,;8(1):71.
(37) Čáňová K, Rozkydalová L, Rudolf E. Anthelmintic Flubendazole and Its Potential Use in
Anticancer Therapy. Acta medica Lékarskí fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králove 2017;60(1):5-11.
(38) Bártíková H, Skálová L, Lamka J, Szotáková B, Várady M. The effects of flubendazole and its metabolites on the larval development of Haemonchus contortus (Nematoda: Trichostrongylidae): an in vitro study. Helminthologia 2010 Dec;47(4):269-272.
(39) Tojo JL, Santamarina MT. Oral pharmacological treatments for parasitic diseases of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. I:Hexamita salmonis. Diseases of aquatic organisms 1998 May 14,;33(1):51-56.
