FARMACIJOS FAKULTETAS
GABRIELĖ SONGAILAITĖ
TURKIŠKŲJŲ RAUDONĖLIŲ (ORIGANUM ONITES L.)
EKSTRAKTO ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
LABORATORINIŲ PELIŲ ORGANUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Vientisųjų studijų programa ,,Farmacija“ valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis ,,Farmacija“
Darbo vadovas
Doc.dr. Asta Kubilienė Konsultantas Prof.dr. Ilona Sadauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė: prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
TURKIŠKŲJŲ RAUDONĖLIŲ (ORIGANUM ONITES L.)
EKSTRAKTO ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
LABORATORINIŲ PELIŲ ORGANUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas Darbo vadovas
Prof. dr. Ilona Sadauskienė Doc. dr. Asta Kubilienė
Data Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Gabrielė Songailaitė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare L.) ir turkiškojo raudonėlio (Origanum onites L.) paplitimas ir morfologija ... 11
1.2 Origanum onites L. biologiškai aktyvios medžiagos bei jų poveikis žmogaus organizmui ... 12
1.3 Karvakrolis ir jo savybės ... 12
1.4 Rozmarino rūgštis ir jos savybės ... 13
1.5 Laisvieji radikalai ... 14
1.6 Oksidacinis stresas ir jo biologinis vaidmuo ... 15
1.7 Antioksidantai ir jų vaidmuo ... 16
1.8 Redukuotas glutationas ... 17
1.9 Katalazė ... 18
1.10 Malondialdehidas ... 18
1.11 Aliuminis ir jo keliami pavojai ... 19
1.12 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1 Tyrimo objektas ... 21
2.2 Tyrimo metu naudoti reagentai ... 21
2.3 Tyrimo metu naudota aparatūra ... 22
2.4 Origanum onites L. ekstrakto paruošimas ... 22
2.6 Tiriamųjų organų mėginių paruošimas tyrimui ... 23
2.7 Redukuoto glutationo nustatymas laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse ... 24
2.8 Malondialdehido koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse ... 25
2.9 Katalazės aktyvumo nustatymas laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse ... 25
2.10 Statistinė duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1 Origanum onites L. esktrakto gamybos sąlygų parinkimas ... 27
3.2 Origanum onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių smegenyse ... 27
3.3 Origanum onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ... 29
3.4 Origanum onites L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių smegenyse ... 30
3.5 Origanum onites L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse ... 31
3.6 Origanum onites L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių smegenyse ... 32
3.7 Origanum onites L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių kepenyse ... 34
3.8 Rezultatų apibendrinimas ... 35
4. IŠVADOS ... 36
5. MAGISTRO DARBO TEMA SKELBTU PUBLIKACIJU SĄRAŠAS ... 37
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 38
SANTRAUKA
G.Songailaitės magistro baigiamasis darbas ,,Turkiškųjų raudonėlių (Origanum Onites L.) ekstrakto antioksidacinio aktyvumo įvertinimas laboratorinių pelių organuose”. Mokslinė vadovė doc. dr. A.Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2021.
Darbo tikslas - įvertinti turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) etanolinio ekstrakto antioksidacinį poveikį pelių organuose.
Darbo objektas. Laboratorinių pelių, paveiktų turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) ekstraktu, smegenys ir kepenys.
Tyrimo metodai. Eksperimentui naudotos 4-6 savaičių amžiaus nelinijinės baltosios laboratorinės pelės suskirstytos į 5 grupes po 8 peles kiekvienoje. Šiose grupėse pelės: girdytos fiziologiniu tirpalu, etanoliu 10 proc., O. onites L. ekstraktu, O. onites L. ekstraktu + leista AlCl3 tirpalas ir leista AlCl3 tirpalas.
Tyrimas buvo atliekamas 21 dieną.
Rezultatai. Pelių smegenyse, kurioms buvo leidžiamas AlCl3 tirpalas ir po 20 min. girdomas O.onites
L. ekstraktas lyginant su pelių grupe, kurioms buvo tik leistas AlCl3 tirpalas nustatytas statistiškai
reikšmingas MDA (300 proc.) GSH (131 proc.) ir CAT (514 proc.) koncentracijos padidėjimas. Pelių kepenyse, kurioms buvo leidžiamas AlCl3 ir po 20 min. girdomas O.onites L. ekstraktas, lyginant su
pelių grupe, kuriai buvo leidžiamas AlCl3 tirpalas, nustatyti statistiškai reikšmingi MDA( 323 proc.) ir
GSH (300 proc.) koncentracijų padidėjimai.
Išvados. O.onites L. augalinės žaliavos ekstrakcijai, remiantis moksline literatūra, siekiant išekstrahuoti didžiausius antioksidaciniu poveikiu pasižyminčius junginių kiekius, pasirinkta ekstrakcija vykdoma 90 proc. etanoliu, kaitinant ir taikant grįžtamąjį šaldytuvą. O. onites L. ekstraktas vartojamas: po aliuminio jonų sukelto oksidacinio streso, padidina redukuoto glutationo koncentraciją kepenyse, tačiau nedaro statistiškai reikšmingo poveikio GSH koncentracijai pelių smegenyse; didina MDA koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po aliuminio jonų sukelto oksidacinio streso; padidina katalazės aktyvumą pelių kepenyse ir smegenyse po aliuminio jonų sukeltos prooksidacijos rodydamas gebėjimą sumažinti aliuminio jonų sukeltą peroksidaciją organų ląstelės. Nustatytas Origanum onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo, malondialdehido koncentracijoms ir katalazės aktyvumui pelių smegenyse bei kepenyse, po AlCl3 tirpalu sukelto oksidacinio streso, rodo šio ekstrakto galimą
SUMMARY
Master thesis of G. Songailaitė “Evaluation of antioxidant activity of turkish oregano (Origanum onites L.) extract in organs of laboratory mice”. Scientific supervisor: doc. dr. A. Kubilienė; Lithuanian university of health sciences Faculty of medicine Department of analytical and toxicological chemistry. Kaunas, 2021.
The aim of the research was to evaluate the antioxidant effect of ethanolic extract of Origanum onites L. on mice organs.
Object of the study: Brain and liver of laboratory mice affected by turkish oregano (Origanum onites L. ) extract.
Methods. Experiments were done with 4-6 weeks old outbred mice. Mice were divided into 5 groups of 8 mice. Groups received: 0,9% NaCl solution; O.onites L. extract; O. onites L. extract + AlCl3 solution;
10% ethanol; AlCl3. The experiment lasted for 21 days. Glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA)
concentrations and catalase (CAT) activity were determined spectrophotometrically. Results was evaluated by Stjudent’s test.
Results. In the mice brain, that got O.onites L. extract 20 minutes after AlCl3 injection, MDA (300 %)
GSH (131 %) and CAT (514%) concentration increased, compared with group which was affected by AlCl3. In the mice liver that got AlCl3 injection and after 20 minutes O.onites L. extract MDA (323%)
and GSH (300%) concentration was increased compared to AlCl3 affected mice group.
PADĖKA
SANTRUMPOS
DNR - deoksiribonukleorūgštis OR - oleanolo rūgštis UR - ursolo rūgštis KA - karvakrolis RR - rozmarino rūgštisADJ - aktyvūs deguonies junginiai CAT- katalazė
MDA - malondialdehidas GSH - redukuotas glutationas TchA - trichloracto rūgštis LD50 - vidutinė mirtina dozė
TGF-𝛃1 - transformuojantis augimo faktorius CTFG - jungiamojo audinio augimo faktorius LPO - lipidų peroksidacija
NAD + - oksiduotasnikotinamido adenino dinukleotidas NADH - redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas TNF𝛂 - alfa naviko nekrozės faktorius
ĮVADAS
Kasdieninėje mūsų aplinkoje yra labai daug įvairių egzogeninių laisvųjų radikalų šaltinių, kurių mes negalime išvengti ir kurie kelia pavojų mūsų sveikatai. Tokie radikalai gali susidaryti dėl oro taršos, UV spinduliuotės poveikio, cigarečių dūmų, alkoholio, įvairių metalų ar radiacijos. Susidarius dideliam laisvųjų radikalų kiekiui, jis neigiamai veikia ląstelių struktūras, tokias kaip membraną, lipidus, baltymus, lipoproteinus ir dezoksiribonukleino rūgštį (DNR). Ląstelių struktūrų pažeidimai organizme lemia vėžio, arterinės hipertenzijos, kardiovaskulinių ligų, Parkinsono, Alzheimerio bei kitų ligų išsivystymą. [1].
Apsaugoti ląsteles nuo pažaidos bei neutralizuoti laisvuosius radikalus padeda antioksidantai, kurie yra mūsų organizme arba yra gaunami su maistu ar vartojant maisto papildus, kurie pasižymi šiomis savybėmis [2]. Gamtoje yra daug augalų, kurie kaupia veikliuosius junginius, pasižyminčius antioksidacinėmis savybėmis. Vienas tokių yra ir turkiškasis raudonėlis (Origanum onites L.), kaupiantis monoterpenoidus, triterpenoidus ir fenolines rūgštis [3]. Šios biologiškai aktyvios medžiagos pasižymi ne tik antioksidaciniu poveikiu organizmui, bet ir kitomis organizmui svarbiomis funkcijomis. Jau XVIIIa. K’Eoghas raudonėlį rekomendavo esant skrandžio ar širdies skausmui, kosuliui, taip pat kaip priemonė nerimo simptomų lengvinimui [4].
Origanum onites L. augalas paplitęs pietinėje ir vakarinėje Turkijos dalyje, dažniausiai auga uolėtose vietose ar miškuose, tarp pušų [5,6]. Šio augalo ekstrakte yra nustatyti keturi pagrindiniai komponentai: karvakrolis (KA), rozmarino rūgštis (RR), ursolo rūgštis (UR) ir oleanolo rūgštis (OR) [7]. KA ir RR yra pagrindiniai ekstrakte vyraujantys junginiai ir pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu organizmo ląstelėms, tačiau šie junginiai pasižymi ir kitomis organizmui vertingomis savybėmis. Įvairių tyrimų metu nustatyta, kad KA pasižymi ir stipriu priešgrybeliniu poveikiu prieš Candida albicans [8], yra veiksmingas mažinant bakterijų, tokių kaip Salmonella Typhimurium, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus ir Escherichia coli, atsparumą antibiotikams. Tyrimai parodė, kad RR antioksidacinis aktyvumas yra stipresnis nei tokoferolio (vitamino E) [9]. Be to, pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš E. coli, P. aeruginosa, E. faecalis, B. cereus ir K. pneumoniae bakterijas [10].
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Įvertinti turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) ekstrakto antioksidacinį poveikį pelių kepenyse ir smegenyse.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) augalinei žaliavai.
2. Įvertinti turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) ekstrakto poveikį redukuoto glutationo koncentracijai laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse.
3. Įvertinti turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) ekstrakto poveikį malondialdehido koncentracijai laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare L.) ir turkiškojo raudonėlio
(Origanum onites L.) paplitimas ir morfologija
,,Origanum“ genties augalai yra gerai žinomi ir daugelį metų naudojami ne tik kulinariniais, bet ir medicininiais tikslais. Dažniausiai naudojamos raudonėlio rūšys yra dviejų tipų: paprastasis (Origanum vulgare L.) ir turkiškasis (Origanum onites L.). Pavadinimas ,,Oregano“ yra kilęs iš graikiško žodžio ,,oros“ (kalnai) ir ,,ganos“ (džiaugsmas), išvertus ,,kalnų džiaugsmas“, taip buvo vadinama dėl gamtoje natūraliai ant kalnų augusio raudonėlio skleidžiamo malonaus kvapo bei žiedų grožio. Jau XVIII a. žolininkas K’Eoghas raudonėlį rekomendavo vartoti esant skrandžio ar širdies skausmui, kosuliui, taip pat kaip priemonė nerimo simptomų lengvinimui [4].
Paprastasis raudonėlis (Origanum vulgare L.) yra daugiametis žolinis augalas, priskiriamas magnolijūnų (Magnoliophyta) genčiai bei notrelinių (Lamiaceae) šeimai. Augalas yra 30 – 90 cm aukščio, jo šakniastiebiai yra horizontalūs, šliaužiantys. Stiebai statūs ir prie pagrindo sumedėję, šakoti, keturkampiai ir plaukuoti, gali būti violetinės arba rausvai žalios spalvos. Lapai žalios spalvos, 10 – 40 mm ilgio ir 4 – 25 mm pločio. Žiedai dvilyčiai, pažiedlapiai elipsės formos, smailūs, tamsiai violetinės spalvos. Vainikėlio spalva gali būti nuo rožinės ar violetinės iki baltos apie 6 mm ilgio. Vaisius - tamsiai rudas 0,5 – 1 mm ilgio riešutėlis. Vaistinė augalinė žaliava yra džiovinta augalo žolė, kurią sudaro žiedai, lapai ir stiebai. Augalas yra plačiai paplitęs beveik visame pasaulyje. Gimtine laikoma Vakarų ir Pietvakarių Eurazija ir Viduržemio jūros regionas [11].
1.2 Origanum onites L. biologiškai aktyvios medžiagos bei jų poveikis žmogaus
organizmui
Turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) ekstrakte nustatyti pagrindiniai komponentai yra karvakrolis ( 22,618 ± 0,089 mg/g), rozmarino rūgštis (14,8 ± 0,074 mg/g), ursolo rūgštis (3,863 ± 0,05 mg/g) ir oleanolo rūgštis (1,51 ± 0,045 mg/g) [7]. Karvakrolis yra junginys, pasižymintis stipriomis antioksidacinėmis, priešnavikinėmis ir priešgrybelinėmis savybėmis [12]. Rozmarino rūgštis pasižymi priešvirusiniu, antibakteriniu bei antioksidaciniu poveikiu [13]. Ursolo rūgštis (UR) (3β-3-hidroksi-12 urs- 12en- 28o rūgštis) yra pentaciklinis triterpenoidas. Šios rūgšties yra augaluose, kurie turi gydomąjį poveikį ir tuose, kuriuos naudojame maisto ruošimui: rozmarinas, levanda, čiobrelis ar obuolio žievelėje. Ji pasižymi priešuždegiminiu, antioksidaciniu, priešdiabetiniu, kardioprotekciniu, neuroprotekciniu ir hepatoprotekciniu poveikiu [14]. Oleanolo rūgštis (OR) (3-β- hidroksi-olea-12-en-28-olinė rūgštis) taip pat pentaciklinis triterpenoidas. Oleanolo rūgštis yra paplitusi vaisiuose, lapuose ir stiebo žievėje, jos yra alyvuogėse, ženšenio šaknyje, meškauogėse, obuoliuose, šeivamedyje, čiobrelyje ir gvazdikėlyje. Ši rūgštis pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, gastroprotekciniu, analgeziniu ir žaizdų gijimą skatinančiu poveikiu [15,16]. A. Gabriel ir kt. atliko tyrimą, kurio metu buvo siekiama išsiaiškinti antituberkuliozinių vaistų sukeliamos steatozės prevenciją, todėl kartu su vaistais, pelėms buvo girdomas ursolo rūgšties ir oleanolo rūgšties mišinys, ištirpintas labai gerai išvalytame alyvuogių aliejuje. Po 11 savaičių trukusio tyrimo, kurio metu buvo tiriamas ursolo ir oleanolo rūgšties mišinio poveikis prieš kepenų pažeidimą sukeliančius antituberkuliozinius vaistus, pastebėti reikšmingi skirtumai tarp pelių, kurioms buvo duodami antituberkulioziniai vaistai ir girdomas mišinys ir tarp tų, kurioms mišinys nebuvo girdomas. Taigi, buvo padaryta išvada, kad šis mišinys padeda apsaugoti kepenis nuo žalingo antituberkuliozinių vaistų poveikio [17].
1.3 Karvakrolis ir jo savybės
pūtimąsi. Dėl šių pokyčių įvyksta ląstelių apoptozė, todėl galima teigti jog karvakrolis gali būti stiprus priešnavikinis darinys prieš metastazavusias krūties vėžio ląsteles [18]. Taip pat pasižymi stipriu priešgrybeliniu poveikiu prieš Candida albicans [19], yra veiksmingas mažinant bakterijų, tokių kaip Salmonella Typhimurium, Streptococcus pyogenes , Staphylococcus aureus, Escherichia coli, atsparumą antibiotikams [20]. Priešuždegiminis efektas pasireiškia PGE2 slopinimu, katalizuojant COX-2 inhibitorius. Taigi manoma, kad karvakrolio priešuždegiminis poveikis yra susijęs su slopinančiu poveikiu PG sintezei, vykstant arachidono rūgšties sintezei [21].
1.4 Rozmarino rūgštis ir jos savybės
1.5 Laisvieji radikalai
Laisvieji radikalai yra atomai, jonai ar molekulės, kurios išorinėje orbitalėje turi vieną ar kelis nesuporuotus elektronus. Šie radikalai yra labai aktyvūs, todėl gali atakuoti kitas ląsteles ir prisijungti laisvą elektroną. Nors laisvieji radikalai pasižymi dideliu aktyvumu, daugumos jų veikimo pusperiodis biologinėse sistemose yra trumpesnis nei 10-6 s.
Dauguma laisvųjų radikalų yra kilę iš aktyvių deguonies junginių (ADJ), kurie yra skirstomi į radikalinius ir neradikalinius. Radikaliniai gali būti: superoksido jono (O2.), hidroksilo (OH.) ir peroksilo
(ROO.) radikalai. Neradikaliniai: vandenilio peroksidas (H
2O2), hipochlorinė rūgštis (HOCl), ozonas
(O3) ir peroksinitritas (ONOOH). Jie gali susidaryti mitochondrijose, chloroplastuose ar
endoplazminiame tinkle. Junginiai susidaro dėl vidinės ir tarpląstelinės fermentų signalizavimo reakcijos [2]. Laisvieji radikalai ne visada yra kenksmingi, žema ar vidutinė ADJ koncentracija yra reikalinga ląstelių struktūrų brendimo procesui ir svarbi gynybiniam organizmo procesui, kuris vyksta, kai įvairūs fagocitai (neutrofilai, makrofagai ir monocitai) išskiria laisvuosius radikalus tam, kad sunaikintų patogenus, patekusius į žmogaus organizmą [26].
Laisvųjų radikalų šaltiniai yra:
• endogeniniai, kurie susiję su kvėpavimo grandine, citochromo P450 sistema, fagocitoze ir prostaglandinų sintezės reakcijomis;
• egzogeniniai, nefermentinės reakcijos tarp deguonies ir organinių junginių;
• išoriniai: aplinkos užterštumas, cigarečių dūmai, alkoholis, ultravioletiniai spinduliai, radiacija ar pesticidai.
• fiziologiniai: stresas, emocijos bei ligos.
Kai ADJ koncentracija organizme yra didesnė nei antioksidantų, kurie organizme neutralizuoja laisvuosius radikalus ir taip apsaugo ląsteles nuo pažaidos, prasideda oksidacinio streso procesas, kuris skatina tokių ligų kaip Alzheimerio, vėžio, aterosklerozės, Parkinsono bei daugelio kitų ligų progresavimą [2].
1.6 Oksidacinis stresas ir jo biologinis vaidmuo
Oksidacinis stresas – tai procesas, kurio metu sutrinka aktyvių deguonies junginių (ADJ) ir antioksidantų pusiausvyra. Kad organizme išliktų mažos ADJ koncentracijos, ląstelės tam turi gerai išvystytas fermentines sistemas. Pusiausvyra tarp ADJ ir antioksidantų, gali sutrikti dėl įvairių priežasčių: padidėjęs endogeninių ir egzogeninių junginių kiekis, mažos molekulinės masės antioksidantų atsargų trūkumas ar antioksidacinių fermentų inaktyvavimo ląstelėje [27] Pagrindiniai ADJ, turintys fiziologinę bei biologiškai pavojingiausią reikšmę, yra trys: superoksido (O!∙#) radikalas, turintis nesuporuotą elektroną, hidroksilo radikalas (OH.) ir vandenilio peroksidas (H
2O2) [28]. ADJ
šaltiniai ląstelėje yra plazminė membrana, mitochondrijos, endoplazminis tinklas, lizosomos ir peroksisomos [2].
Yra atlikta daugybė tyrimų, kurių metu, buvo nustatyta, kad oksidacinis stresas turi įtakos daugelio ligų atsiradimui. Neurodegradacinėmis ligomis: Parkinsono, Alzheimerio ar išsėtinė sklerozė, galima susirgti dėl oksidacinio streso pažaidos smegenyse, kurios metu įvyksta mitochondrijų disfunkcija ir ląstelių apoptozė. Smegenys yra labiausiai pažeidžiamas organas, nes turi daug nesočiųjų lipidų, kurie yra jautrūs peroksidacijai ir oksidacinei modifikacijai. Antioksidacinis aktyvumas smegenyse yra mažesnis nei kituose organuose, pavyzdžiui ~ 10% mažesnis nei kepenyse [29].
ADJ taip pat gali sukelti lipidų peroksidaciją (LPO), kurią galime apibūdinti kaip procesą, kurio metu laisvieji radikalai atakuoja ląstelėje esančius lipidus, ypač polinesočiąsias riebalų rūgštis, turinčias dvigubų jungčių. LPO procesą apima trys etapai: pradėties, kurios metu iš nesočiosios riebalų grandinės yra atimamas H atomas ir susidaro lipidinis radikalas L•; sklidimo fazėje, lipidinis radikalas (L•) greitai
grandinės atima H atomą ir sudaro lipidinį radikalą L•, o pats pavirsta lipidų hidroperoksidu (LOOH).
Grandininė reakcija vyksta tol, kol neprasideda baigties etapas, kuriame susijungia du laisvieji radikalai ir susidaro neradikaliniai junginiai. LPO ir proceso metu susidarę junginiai pažeidžia ląstelių ir jų membranų pralaidumą bei vientisumą, šie pažeidimai lemia įvairių ligų vystymąsi organizme [30].
Malondialdehidas (MDA) yra plačiai naudojamas žymuo lipidų peroksidacijos nustatymui, nes lengvai reaguoja su tiobarbitūro rūgštimi. Šiai rūgščiai reaguojant su MDA, susidaro intensyvios spalvos fluorescuojantis chromogeno aduktas, kurį galima lengvai nustatyti naudojant spektrofotometrą, esant 540 nm. ilgio bangai [31, 32].
1.7 Antioksidantai ir jų vaidmuo
Antioksidantai yra junginiai, kurie organizme neutralizuoja laisvuosius radikalus ir taip apsaugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų neigiamo poveikio. Antioksidantai gali būti endogeniniai, kurie yra susintetinami žmogaus organizme, arba egzogeniniai, kurie patenka į organizmą su maistu. Antioksidantų biologinis poveikis yra įvardijamas jų gebėjimu neutralizuoti laisvųjų radikalų poveikį ir gebėjimu reguliuoti signalinius kelius tarp ląstelių. Ląstelinių signalinių kelių reguliavimas gali padėti išvengti įvairių ligų, pavyzdžiui, vėžio atsiradimo [33].
Antioksidantai pagal aktyvumą gali būti:
1. Fermentiniai, kurie veikia suskaidydami ir pašalindami laisvuosius radikalus: superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT) ir glutationo peroksidazė (GPx). Jie padidina endogeninių antioksidantų kiekį.
2. Nefermentiniai, kurie veikia nutraukdami laisvųjų radikalų grandinines reakcijas: askorbo rūgštis (Vitaminas C), tokoferolis (Vitaminas E), karotinoidai ir augalų polifenoliai. Šie antioksidantai organizme nėra sintetinami, jie gaunami su maistu ir yra vadinami egzogeniniais.
Antioksidantai pagal tirpumą skirstomi:
1. Vandenyje tirpūs – pavyzdžiui, vitaminas C, kuris yra ląstelių skysčiuose, tokiuose kaip citozolis. 2. Riebaluose tirpūs - vitaminas E, karotinoidai ir lipoinė rūgštis, šių medžiagų daugiausia yra
Antioksidantai pagal dydį:
1. Mažos molekulės - neutralizuoja ADJ, taip iš ląstelių jie yra pašalinami. Pagrindiniai šios kategorijos antioksidantai: vitaminas C ir E, karotinoidai ir glutationas (GSH).
2. Didelės molekulės- joms priskiriami fermentai: superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT) ir glutationo peroksidazė (GPx). Jie absorbuoja ADJ ir apsaugo kitus baltymus nuo pažaidos. [34].
1.8 Redukuotas glutationas
Redukuotas glutationas (GSH) - sieros junginys, sudarytas iš trijų amino rūgščių (glutamo rūgšties, cisteino ir glicino) ir pagrindinio nebaltyminio - tiolio, esančio gyvuosiuose organizmuose bei augaluose (3 pav.). Organizme jis susidaro citoplazmoje ir galima aptikti daugelyje organizmo audinių, didelė jo koncentracija yra kepenyse [35]. GSH yra mažiau jautrus oksidacjai, lyginant su cisteinu, todėl geriau palaiko tarpląstelinio redokso potencialą. Redukuoto glutationo svarbą nuo redokso priklausomuose procesuose lemia jo įsitraukimas reguliuojant ląstelių redoksą ir transkripcijos veiksnių aktyvumą. Taip pat šis peptidas yra tarpląstelinis atioksidantas, kuris šalina laisvuosius radikalus. Jis veikia kaip substratas peroksido detoksikacijos reakcijoje, kurią katalizuoja glutationo peroksidazė (GPx) ir glutationo transferazė (GST) [36].
1.9 Katalazė
Katalazė (vandenilio peroksido oksidoreduktazė, CAT) yra antioksidacinis fermentas. CAT aptinkama gyvūnų ir augalų audiniuose, daugiausia yra kepenų ląstelių peroksisomose ir eritrocituose, tačiau funkcinė katalazė yra randama citoplazmoje, žiurkių kardiomiocitų mitochondrijose ir žmogaus vėžinių ląstelių citoplazminėje membranoje. Fermentas pasižymi galimybe vandenilio peroksidą suskaidyti į vandenį ir molekulinį deguonį [37]:
2H
!O
! #$%$&$'ė$⎯⎯⎯⎯& 2H
!O + O
!CAT yra tetrameras, turintis keturias polipeptidines grandines, kurių kiekvienos ilgis yra 500 aminorūgščių. Šis fermentas turi keturias porfirino hem (geležies) grupes, kurios leidžia reaguoti fermentui su vandenilio peroksidu [38]. Be šios ,,katalizinės” funkcijos (skaidymo), ji gali skaidyti peroksinitritą: oksiduoja azoto oksidą iki azoto dioksido, pasižymi ribine peroksidaze (vyksta organinių substratų oksidacija, kurios metu taip pat mažinamas peroksido kiekis), taip pat silpnu oksidazės aktyvumu (nuo deguonies priklausomų organinių substratų oksidavimas) [2,39].
Katalazės veikimo mechanizmo reakcijos yra dvi. Pirmame etape fermentas yra oksiduojamas į geležies junginį, oksoferilo porfirino katijono radikalą (Por∙$ − Fe%& = O):
E (por – 𝐅𝐞𝐈𝐈𝐈 ) +H
2O2 → ( 𝐏𝐨𝐫∙$- 𝐅𝐞𝐈𝐕 = O)+ 𝐇𝟐𝐎 Kitame etape (Por∙$ - Fe%& = O) molekulė dalyvauja reakcijoje su antrąja H
2O2 molekule, šios
reakcijos metu susidaro E ( Por - Fe%%% ) ir išsiskiria vanduo bei deguonis: (𝐏𝐨𝐫∙$- 𝐅𝐞𝐈𝐕 = O) + 𝐇
𝟐𝐎𝟐→ 𝐄(𝐏𝐨𝐫 − 𝐅𝐞𝐈𝐈𝐈) + 𝐇𝟐𝐎 + 𝐎𝟐
Literatūros duomenimis, katalazės aktyvumo sumažėjimas ir oksidacinis stresas organizme yra susijęs su Alzheimerio, cukrinio diabeto ar vėžio vystymusi [40,41].
1.10 Malondialdehidas
membranoje. Jis yra tirpus vandenyje, metanolyje ir etanolyje, sunkiai tirpsta metileno chloride ir netirpsta dietilo eteryje. MDA gali lengvai polimerizuotis ir dalyvauti reakcijoje su įvairiomis biomolekulėmis, tokiomis kaip: DNR, aminorūgštimis ir baltymais. MDA koncentracija gali būti matuojama iš įvairių audinių ir biologinių skysčių, pavyzdžiui šlapimo, kraujo serumo ar kraujo plazmos. MDA yra susijęs su citotoksiniu, kancerogeniniu, neurodegradaciniu poveikiu, turi įtakos cukrinio diabeto bei širdies ir kraujagyslių ligų vystymuisi [42,43].
1.11 Aliuminis ir jo keliami pavojai
Aliuminis (Al) yra trečias pagal paplitimą elementas ir sudaro apie 8 proc. visų mineralinių komponentų žemėje. Į mūsų organizmą jis gali greitai patekti, nes plačiai naudojamas kasdieninėje aplinkoje dėl maisto, laikomo aliuminio folijoje ar gėrimų skardinėse, taip pat aliuminis gali patekti per geriamąjį vandenį, su vakcinomis ar parenteriniais skysčiais. Al kaupiasi tokiuose organuose kaip širdis, kraujas, inkstai, kepenys ar smegenys. [44].
E. Kowalczyk et al. atlikto tyrimo metu, po trijų mėnesių aliuminio chlorido (80 mg/l) vartojimo buvo nustatyta ženkliai padidėjusi baltymų karbonilo grupių koncentracija eritrocitų hemolizate. Karbonilo grupių kiekio padidėjimas yra požymis, kad vyksta laisvųjų radikalų procesai in vivo [45].
Alzheimerio liga (AD) sergančių pacientų smegenyse nustatyta pažeidimų, susijusių su laisvųjų radikalų kiekio padidėjimu organizme ir įrodyta, kad Al turi katalizinį aktyvumą išskiriant laisvuosius radikalus. Be to, žmonių, sergančių AD, β- amiloidiniai baltymai esantys smegenyse yra agreguoti ir skatina laisvųjų radikalų išsiskyrimą. Kiti tyrimai parodė, kad aliuminis sukelia oksidacinį stresą, kuris skatina lipidų peroksidaciją ir keičia antioksidacinių fermentų aktyvumą [44].
1.12 Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Oksidacinis stresas - procesas, kai sutrinka aktyvių deguonies junginių ir antioksidacinių medžiagų pusiausvyra organizme. Šis procesas gali įvykti dėl padidėjusių endogeninių ir egzogeninių junginių kiekio bei mažos molekulinės masės antioksidantų atsargų trūkumo. Oksidacinis stresas gali lemti Parkinsono, Alzheimerio bei kitų ligų etiologiją. Dauguma laisvųjų radikalų yra kilę iš ADJ, kurie gali būti endogeniniai, egzogeniniai, išoriniai ir fiziologiniai.
Antioksidantai yra jungiai, kurie organizme neutralizuoja laisvuosius radikalus ir taip apsaugo organizmo ląsteles nuo laisvųjų radikalų neigiamo poveikio. Organizme esantys antioksidaciniai ląstelės komponentai: redukuotas glutationas, katalazė ir malondialdehidas, saugo organų ląsteles nuo oksidacinio streso pažaidos.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – turkiškųjų raudonėlių (Origanum onites L.) susmulkinta žolė, gauta iš Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto (LSMU) Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros. Rūšis pasirinkta remiantis ankstesnių tyrimų rezultatais, kurių metu buvo tiriama trijų raudonėlio rūšių (Origanum Onites L., Origanum vulgare ssp hirtum L. ir Origanum vulgare L.) biologiškai aktyvių veikliųjų junginių (karvakrolio ir rozmarino rūgšties) pasiskirstymas ir nustatyta, kad Origanum onites L. augalas kaupia daugiasia šių medžiagų, kurios lemia antioksidacinį aktyvumą [7].
Eksperimentams naudotos nelinijinės 4-6 savaičių baltosios laboratorinės pelės, kurių svoris nuo 23 iki 33 gramų. Bendras pelių skaičius, naudotas tyrime, 40. Eksperimente naudotos pelės atvežtos iš LSMU Veterinarijos akademijos vivariumo. Pelės laikytos atsižvelgiant į geros laboratorijos praktikos (GLP) reikalavimus. Kai pelės buvo atvežtos į laboratoriją, joms taikytos 7 dienų karantino sąlygos: optimali temperatūra ~ 20 °C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc., natūralios šviesos (diena/naktis) rėžimas. Pelės šertos pilnaverčiu maistu ir girdytos vandentiekio vandeniu ad libidum. Pakratams naudotas šienas ir medienos drožlės, kurios buvo keičiamos kiekvieną dieną.
Moksliniai tyrimai su laboratorinėmis pelėmis atlikti vadovaujantis Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymu, Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2012 m. spalio 31 d. įsakymu Nr. B1-866 ,,Dėl mokslo ir mokymo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo“, Europos konvencija dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų stuburinių gyvūnų apsaugos ir remiantis Lietuvos bandomųjų gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2018-03-19 išvada ,,Dėl leidimo atlikti bandymus su gyvūnais“. (žr. Priedas Nr. 1).
2.2 Tyrimo metu naudoti reagentai
• Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė);
• Trichloracto rūgštis (TchA), n-butanolis (Lietuva);
• Tris-HCl buferis, tiobarbitūro rūgštis (TBR), 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) (DTNB) (,,Serva“, Vokietija);
• Kalio chloridas, vandenilio peroksidas, fosforo rūgštis (,,Merck“, Vokietija);
• Tirpalų gamybai buvo naudojamas išgrynintas vanduo, dejonizuotas vanduo bei fiziologinis tirpalas.
2.3 Tyrimo metu naudota aparatūra
• Analitinės svarstyklės (,,Shimadzu AUW 120D”,Bellingen, Vokietija); • Automatinės pipetės (,,Eppendorf Research“, Eppendorf, JAV);
• Spektrofotometras (,,LAMBDA 25”, JAV); • Centrifuga (,,Beckman J2-21”, JAV);
• Bandinių tyrimui naudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
2.4 Origanum onites L. ekstrakto paruošimas
Ekstrakcija atlikta remiantis J.Baranauskaitės disertacija. Ekstraktui paruošti, džiovinta vaistinė augalinė žaliava buvo smulkinama laboratoriniu smulkintuvu, pasverta 5 g žaliavos, suberta į apvaliadugnę kolbutę ir užpilta 100 ml 90 proc. (v/v) etanolio. Remiantis mokslinių tyrimų rezultatais, ekstrakcijai panaudojant tirpiklį etanolį, iš žaliavos išgaunama daugiau rozmarino rūgšties, lyginant su kitais tirpikliais [46]. Kolba yra užkemšama plastikiniu kamščiu ir atliekama ekstrakcija glicerolio vonelėje naudojant grįžtamąjį šaldytuvą. Kaitinama 4 val. 95℃ temepratūroje. Pasibaigus procesui, ekstraktas atvėsinamas, praskiedžiamas iki reikiamos 10 proc. koncentracijos ir filtruojamas pro Albet 400 (Dublinas, Airija) filtravimo popierių (porų dydis 38-43µm) į stiklinaitę.
2.5 Tyrimo su laboratorinėmis pelėmis planas
Tyrimo metu pelės buvo suskirstytos į 5 grupes, po 8 peles kiekvienoje:
2. Etanolio, kurioms intragastriniu būdų buvo girdomas 10% etanolis;
3. Ekstrakto grupei tiesiai į skrandį per zondą sušvirkščiamas O. onites L. ekstraktas;
4. AlCl3 grupei į pilvo ertmę suleidžiama AlCl3 tirpalo (0,15 LD50 Al3+ vienam kilogramui kūno
masės);
5. Ekstrakto ir AlCl3 tirpalo grupės pelėms į pilvo ertmę suleidžiamas AlCl3 tirpalas (7,5 mg. Al
vienam kūno masės kilogramui) ir po 20 minučių į skrandį per zondą sugirdomas O. onites L. ekstraktas.
Pelių žymėjimui naudota geltonos spalvos pikrino rūgštis. Kas antrą dieną pelės buvo sveriamos, svoris žymimas žurnale ir pagal jį paskaičiuojamas tirpalo tūris (10 g pelės svoriui 0,1 ml tiriamojo tirpalo). Tiriamųjų medžiagų įvedimui į pelių skrandį naudotas 1 ml švirkštas su specialiu pritvirtintu zondu, o AlCl3, ištirpinto fiziologiniame tirpale, suleidimui į pilvo ertmę naudotas 1 ml
insulininis švirkštas. Kontrolinės grupės tiriamiesiems gyvūnams tiesiai į skrandį buvo girdomas fiziologinis ( 0,9 % NaCl ) tirpalas, etanolio grupės tiriamiesiems tiesiai į skrandį instiliuotas 10 proc. etanolis, turkiškųjų raudonėlių esktrakto grupei tiesiai į skrandį sušvirkščiamas O. onites L. ekstraktas, AlCl3 ištirpintas fiziologiniame tirpale (0,278 mmol arba 7,5 mg ar 0,15 LD50 Al vienam kūno masės
kilogramui) leidžiamas į pilvo ertmę, o O.onites L. ekstrakto + AlCl3 tiriamosioms pelėms
sušvirkščiamas AlCl3 ištirpintas fiziologiniame tirpale (0, 15 LD50 Al vienam kūno masės kilogramui)
ir po 20 minučių girdomas O. onites L. ekstraktas. Pelėms aliuminio vidutinė mirtina dozė (LD50) buvo
pasirinkta remiantis I.Stanevičienės ir bendraautorių tyrimo metu gautais rezultatais [47].
2.6 Tiriamųjų organų mėginių paruošimas tyrimui
Po 21 dienos laboratorinėms pelėms atlikta cervikalinė dislokacija ir dekapitacija, vadovaujantis Europos konvencija dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų stuburinių gyvūnų apsaugos. Išpreparuotos tiriamųjų smegenys bei kepenys buvo plaunamos fiziologiniu (0,9% NaCl ) tirpalu ir iškart dedamos į Petri lėkšteles bei užšaldomos -40℃ temperatūroje iki tyrimo.
tyrimams, o likę homogenizatai centrifuguojami 10000 x g pagreičiu 15 minučių. Vėliau viršutinis centrifugatų sluoksnis (supernatantas) atsargiai nupilamas į Eppendorf tipo mėgintuvėlius, ir jie padedami į šaldiklį, kurio temperatūra -40℃, saugojimui iki tyrimo.
2.7 Redukuoto glutationo nustatymas laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse
Redukuoto glutationo (GSH) koncentracija kepenyse ir smegenyse nustatoma pagal J.Sedlak ir bendraautorių metodiką [48]. Pirmiausia pasveriamas organas (kepenys arba smegenys), dedamas į mėgintuvėlį ir užpilamas 6 kartus didesniu už svorį tūriu 5 proc. trichloracto rūgšties (TchA) tirpalu, vėliau homogenizuojama, naudojant audinių smulkintuvą. Homogenatas centrifuguojamas 10000 g pagreičiu 7 minutes. Supernatantas nupilamas į atskirą mėgintuvėlį ir vėliau naudojamas GSH koncentracijos nustatymui.
GSH koncentracijos nustatymui į mėgintuvėlį įpilama 2 ml 0,6 mM DTNB (Elmano reagentas/ 5,5’-ditio-bis (2- nitrobenzenkarboksirūgštis), 200 µl supernatanto frakcijos bei 800 µl 0,2 M fosfatinio buferio. Koncentracija nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį esant 412 nm bangos ilgiui. GSH koncentracija pelių organuose išreiškiama mol/g kepenų arba smegenų masės ir apskaičiuojama pagal formulę:
C (µmol/g audinio )= * , - , &!,/! , 0!"#
A - supernatanto sugerties reikšmė esant 412 nm bangos ilgiui; 3 – koeficientas;
Vgal - tirpalo tūris po centrifugavimo;
2.8 Malondialdehido koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių smegenyse ir
kepenyse
MDA koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir smegenyse atliktas pagal Uchiyama M. ir bendraautorių metodiką [49]. Organai buvo sveriami ir užpilami šaltu KCl tirpalu, kurio tūris nustatomas organo svorį dauginant iš 9. Viskas yra homogenizuojama ir gaunamas 10 proc. homogenatas. Kitame mėgintuvėlyje įpilama 0,5 ml 10 proc. homogenato (kepenų ar smegenų), 3ml 1 proc. fosforo rūgšties (H3PO4) ir 1 ml 0,6 proc. TBR vandeninio tirpalo, viskas gerai išmaišoma ir inkubuojama verdančio
vandens vonioje 45 min., po inkubacijos 10 min. mėgintuvėliai šaldomi ledo vonioje. Į atšaldytą mišinį pilama 4 ml n-butanolio ir stipriai stikline lazdele išmaišoma. Butanolio sluoksnis atsiskiria centrifuguojant 10 min. 8000 x g pagreičiu. Po centrifugavimo butanolio sluoksnis nusiurbiamas ir spektrofotometriškai matuojama sugertis esant 535 ir 520 nm ilgio bangoms. Lyginamasis tirpalas – 0,6 proc. TBR. MDA koncentracija kepenyse ir smegenyse yra išreiškiama vienam gramui smegenų ar kepenų masės ir apskaičiuojama pagal formulę:
Cµmol/l= ∆ 2.&.× 566666
55-O.V. – optinių vienetų skirtumas; 100000/113 – koeficientas.
2.9 Katalazės aktyvumo nustatymas laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse
Katalazės aktyvumas pelių kepenų ir smegenų homogenatuose nustatytas remiantis T.I. Rachmanova ir kt. metodika [50]. Reakcija yra sustabdoma amonio molibdato tirpalu, kuris su vandenilio peroksidu sudaro geltonos spalvos kompleksinį junginį. Reakcijos mišinys sudarytas iš buferio – substrato mišinio (,,B-S“) pagaminto iš 10ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 30 ml 0,08 proc. vandenilio peroksido (H2O2) ir 100 µl smegenų arba kepenų homogenato. Reakcijai naudojamas
tirpalas – 1 ml ,,B-S”, 3ml dejonizuoto vandens ir 100 supernatanto mišinys, kuris inkubuotas 3 min. 37 °C vandens vonioje.
Katalazės aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę:
A= (89#8:)×(5! × 56(!!,! × 56%$) × - (=) )× (<,5 × 56%)
A – katalazės aktyvumas (vnt./mg. baltymo), vnt - katalazės kiekis, skaidantis 1 µmol H2O2 per 1 min.;
Ek – sugertis (kontrolės mėginio vidurkis); Eb – sugertis (bandymo mėginio vidurkis); 12 x 103 – praskiedimo faktorius;
4,1 x106 – perskaičiavimo į mikromolius koeficientas;
22,2 x 106– H
2O2 molinės ekstinkcijos koeficientas;
3 (t) – inkubacijos laikas min. Inkubacijos laikas priklauso nuo supernatanto šaltinio (kepenų atveju – 1 min., smegenų – 3 min.).
2.10 Statistinė duomenų analizė
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Origanum onites L. esktrakto gamybos sąlygų parinkimas
Ekstrakcijos sąlygos pasirinktos remiantis J. Baranauskaitės disertacija , atsižvelgiant į ekstrakcijos tirpiklio įtaką veikliųjų junginių kiekiui turkiškųjų raudonėlių ekstrakte. Ekstrakcijai ultragarsinėje vonelėje parinktas žaliavos ir tirpiklio santykis buvo 1:20, ekstrakcija truko 10 min, esant 25 ℃ . Šio tyrimo metu nustatyta, kad triterpeninių rūgščių koncentracija ekstrahuojant 90 proc. (v/v) etanoliu buvo žymiai didesnė nei su 60 proc. etanoliu. Todėl savo tyrimams ekstrahentu pasirinkome 90 proc. (v/v) etanolį, siekiant išekstrahuoti didžiausius karvakrolio, rozmarino rūgšties, oleanolo rūgšties ir ursolo rūgšties kiekius. Ekstrakcija kaitinant, taikant grįžtamąjį šaldytuvą, padidina antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių medžiagų išskiriamus kiekius [7], todėl tyrimai atlikti su O.onites L. ekstraktu, pagamintu taikant žaliavos ir tirpiklio santykį 1:20, ekstrahentu naudojant 90 proc. etanolį, ekstrakciją atliekant kaitinant 4 valandas 95℃ temperatūroje.
3.2 Origanum onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių
smegenyse
Po 21 dienos kasdienio pelių girdymo O.onites L. ekstraktu per os, nustatyta redukuoto glutationo koncentracija pelių smegenyse pateikta 4 paveiksle. Antioksidanto GSH koncentracija kontrolinių pelių smegenyse, girdytų 0,9 proc. NaCl tirpalu, siekė 0,25 ± 0,02 μmol/g, o AlCl3 tirpalu
sukėlus antioksidacinį stresą – 0,13 ± 0,01 μmol/g (p ≤ 0,05). Pelių grupės, girdytos turkiškųjų raudonėlių ekstraktu, smegenyse nustatyta 0, 19 ± 0,01 μmol/g GSH koncentracija, kuri buvo statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) mažesnė nei kontrolinės grupės pelių smegenyse. Statistiškai reikšmingas (p ≤ 0,05) GSH koncentracijos sumažėjimas smegenyse (0,17 ± 0,01 μmol/g) nustatytas ir pelių grupėje, kuriai iš pradžių buvo sukeliamas oksidacinis stresas AlCl3 tirpalu, o vėliau girdomas O.onites L.
Po 21 dieną trukusio tyrimo nustatyta, kad injekuojamas AlCl3 tirpalas sukėlė statistiškai
reikšmingą GSH koncentracijos sumažėjimą pelių smegenyse. Literatūros duomenimis, aliuminis sumažina GSH koncentraciją, nes skatina laisvųjų radikalų gamybą, kuri prisideda prie oksidacinio streso proceso vystymosi. GSH koncentracijos sumažėjimas buvo pastebėtas pas pacientus, sergančius Parkinsono ir Alzheimerio ligomis [51]. Mūsų tyrimo metu gauti rezultatai sutampa su šio tyrimo duomenimis. Turkiškųjų raudonėlių ekstraktas nežymiai padidina nefermentinio antioksidanto koncentraciją pelių smegenyse po aliuminio jonų sukelto oksidacinio streso, rodydamas galimą teigiamą poveikį oksidacinio streso pažeistų organų ląstelių antioksidacinei apsaugai [52]. Tačiau etanoliu girdytų pelių smegenyse nustatytas statistiškai reikšmingas GSH koncentracijos padidėjimas, lyginant su kontroline grupe, o turkiškųjų raudonėlių ekstrakto grupėje – statistiškai reikšmingas GSH koncentracijos sumažėjimas bei nežymus GSH koncentracijos didėjimas po sukelto oksidacinio streso rodo, kad poveikį galėtų lemti ne turkiškųjų raudonėlių ekstrakte esantys biologiškai aktyvūs junginiai, o pats etanolis. Todėl būtų tikslinga pratęsti šiuos tyrimus, siekiant išsiaiškinti, ar šį GSH koncentracijos didėjimą lėmė ekstrakte esantys biologiškai aktyvūs junginiai.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Kontrolė Etanolis Raudonėlio
ekstr. Raudonėlioekstr.+Al Aliuminis
GS H ko n cen tr ac ij a (µm ol /g )
*
4 pav. Redukuoto glutationo koncentracija (μmol/g baltymo) pelių smegenyse
3.3 Origanum onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių
kepenyse
Tyrimo metu įvertintas O.onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse po 21 dienos kasdienio šio ekstrakto vartojimo tiesiai į skrandį. Kontrolinės pelių grupės kepenyse nustatyta 1,96 ± 0,04 μmol/g redukuoto glutationo koncentracija, o AlCl3 tirpalu sukėlus oksidacinio streso procesą, ši koncentracija statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) sumažėja (0,36 ± 0,04 μmol/g). Pelių grupėje, kuri girdyta turkiškųjų raudonėlių ekstraktu, nustatytas statistiškai reikšmingas (p ≤ 0,05) GSH koncentracijos sumažėjimas kepenyse (1,08 ± 0,05 μmol/g), lyginant su kontroline grupe. Po oksidacinio streso sukėlimo AlCl3 tirpalu girdant peles O.onites L. ekstraktu nustatytas statistiškai reikšmingas (p ≤ 0,05) redukuoto glutationo koncentracijos padidėjimas kepenyse, lyginant su kontroline aliuminio grupe, ir pasiekia tokią pačią koncentraciją, kaip ir pelių grupėje, kurioje buvo girdomas tik O.onites L. ekstraktas. GSH koncentracija kepenyse pavaizduotos 5 paveiksle.
Tyrimo metu nustatyta, kad 21 dieną trukusios injekcijos AlCl3 tirpalu sukėlė statistiškai
reikšmingą GSH koncentracijos sumažėjimą kepenyse. Šie rezultatai sutampa su kitų mokslininkų atliktu tyrimu, kurio metu pastebėta, kad aliuminio jonų sukeltas GSH koncentracijos sumažėjimas rodo poveikį autooksidacinei apsaugos sistemai [53]. Pelių, kurioms iš pradžių buvo leidžiamas AlCl3 tirpalas
5 pav. Redukuoto glutationo koncentracija (μmol/g baltymo) pelių kepenyse * - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe 0 1 2 3 4 5 6 7
Kontrolė Etanolis Raudonėlio ekstr. Raudonėlio
ir po 20 min. girdomas ekstraktas, matomas GSH koncentracijos kepenų ląstelėse padidėjimas, kuris leidžia manyti, kad ekstraktas sumažina kepenų ląstelių pažaidą ir turi teigiamą poveikį antioksidacinio poveikio procesui kepenyse. Tačiau etanolis turėjo žymų poveikį GSH koncentracijos padidėjimui kepenyse, o turkiškųjų raudonėlių ekstrakto girdymas nesukeliant oksidacinio streso statistiškai reikšmingai sumažino GSH koncentraciją, todėl šio fermento koncentracijos didėjimą po sukelto oksidacinio streso galėtų lemti ne turkiškųjų raudonėlių ekstrakte esantys biologiškai aktyvūs junginiai, o pats etanolis. Siekiant išsiaiškinti, kas lėmė šį koncentracijos padidėjimą pelių kepenų ląstelėse, reikėtų atlikti tolimesnius tyrimus.
3.4 Origanum onites L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių
smegenyse
Po 21 dienos kasdienio pelių girdymo Origanum onites L. ekstraktu per os nustatyta malondialdehido koncentracija pelių smegenyse pateikta 6 paveiksle. Kontrolinių pelių grupėje ji siekė 26,77 ± 3,81 μmol/g, o sukėlus oksidacinį stresą AlCl3 tirpalu - 22,28 ± 2,83 μmol/g (p ≤ 0,05).
Turkiškųjų raudonėlių ekstrakto grupės pelių smegenyse nustatyta 110,65 ± 10,08 μmol/g MDA koncentracija, kuri buvo statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) didesnė nei nustatyta kontrolinės grupės pelių smegenyse. Statistiškai reikšmingas (p ≤ 0,05) MDA koncentracijos padidėjimas (66,83 ± 11,31 μmol/g) nustatytas ir tų pelių smegenyse, kurios girdytos O.onites L. ekstraktu, prieš tai sukėlus oksidacinį stresą AlCl3 tirpalu. 0 20 40 60 80 100 120 140
Kontrolė Etanolis Raudonėlio
ekstr. Raudonėlioekstr.+Al Aliuminis
MD A k on ce nt ra ci ja ( µ m ol /g )
Tyrimo metu nustatėme, kad AlCl3 tirpalo injekavimas 21 dieną sukelia statistiškai reikšmingą
MDA koncentracijos sumažėjimą. Literatūros duomenimis, aliuminis skatina laisvųjų radikalų gamybą, kuri prisideda prie lipidų peroksidacijos proceso formavimosi [54]. Kadangi tiek turkiškųjų raudonėlių ekstrakto vartojusių pelių smegenyse, tiek po jo vartojimo AlCl3 tirpalu sukėlus oksidainį stresą pelių
smegenyse padidino MDA koncentraciją, galime teigti, kad raudonėlio ekstraktas aktyvina antioksidacinę sistemą organizme prieš lipidų peroksidaciją smegenyse.
3.5 Origanum onites L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių
kepenyse
Tyrimo metu įvertintas Origanum onites L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse po 21 dienos kasdienio šio ekstrakto vartojimo tiesiai į skrandį. Kontrolinės grupės pelių kepenyse nustatyta 108,85 ± 27,28 μmol/g MDA koncentracija, o AlCl3 tirpalu sukėlus oksidacinį stresą
ši koncentracija statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) sumažėja (11,63 ± 1,53 μmol/g). Girdant peles turkiškųjų raudonėlių ekstraktu, taip pat nustatytas statistiškai reikšmingas (p ≤ 0,05) MDA koncentracijos sumažėjimas pelių kepenyse (43,60 ± 9,03 μmol/g), lyginant su kontroline grupe. Tam įtakos galėjo turėti ir ekstrahentas etanolis, kurio kontrolinėje grupėje taip pat nustatytas statistiškai reikšmingas šios koncentracijos sumažėjimas (87,1 ± 4,06 μmol/g), lyginant su kontroline pelių grupe. Nors O. onites L. ekstraktas po AlCl3 sukelto oksidacinio streso padidino MDA koncentraciją (37,68 ±
Atlikus tyrimą nustatėme, kad 21 dieną trukęs aliuminio tirpalo injekavimas sukėlė statistiškai reikšmingą MDA koncentracijos sumažėjimą pelių kepenyse. Gauti rezultatai prieštarauja E. Cheraghi ir bendraautorių atlikto tyrimo rezultatams [55]. Tyrimo metu nustatytas MDA koncentracijos kepenų ląstelėse padidėjimas. Vis dėlto, remiantis šiuo rodikliu, matome aliuminio jonų įtaką lipidų peroksidacijai, vykstančiai ląstelės membranoje, dėl kurios padidėja laidumas ir pakinta receptorių funkcijos bei formuojasi oksidacinio streso procesas. Siekiant išsiaiškinti, kodėl tyrimų metu gaunami skirtingi rezultatai, reikėtų atlikti tolimesnius tyrimus. MDA koncentracijos didėjimas pelių kepenyse, kurios buvo girdytos turkiškųjų raudonėlių ekstraktu po AlCl3 sukelto oksidacinio streso leidžia daryti
prielaidą, kad šio ekstrakto vartojimas turi teigiamą poveikį atstatant MDA koncentraciją ir taip apsaugant kepenų lipidus nuo peroksidacijos.
3.6 Origanum onites L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių smegenyse
Po 21 dienos trukusio kasdienio pelių girdymo Origanum onites L. ekstraktu per os nustatytas katalazės aktyvumas kontrolinės grupės pelių smegenyse siekė 8,15 ± 3,79 vnt/mg baltymo, o sukėlus oksidacinį stresą AlCl3 tirpalu, aktyvumas statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) sumažėjo (4,69 ± 1,46
vnt/mg baltymo). Pelių, girdytų turkiškųjų raudonėlių ekstraktu, smegenyse CAT aktyvumas statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) sumažėjo (4,69 ≤ 1,46 vnt/mg baltymo). Pelių, girdytų turkiškųjų raudonėlių
0 20 40 60 80 100 120 140
Kontrolė Etanolis Raudonėlio ekstr. Raudonėlio
ekstr.+Al Aliuminis MD A k on ce nt ra ci ja ( µm ol /g )
ekstraktu, smegenyse CAT aktyvumas statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) padidėjo (28,17 ± 3,34 vnt/mg baltymo), lyginant su kontroline pelių grupe. Statistiškai reikšmingas katalazės aktyvumo padidėjimas (24,13 ± 2,88 vnt/mg baltymo) taip pat nustatytas ir pelių grupėje, kurioje girdytas turkiškųjų raudonėlių ekstraktas po AlCl3 sukelto oksidacinio streso, lyginant su kontroline aliuminio grupe. Galime teigti,
kad tam įtakos turėjo turkiškųjų raudonėlių ekstrakto poveikis suaktyvinti antioksidacinę sistema. CAT aktyvumas pelių smegenyse pavaizduotas 8 paveiksle.
Po 21 dieną trukusio tyrimo nustatyta, kad AlCl3 tirpalas sukėlė statistiškai reikšmingą CAT
aktyvumo sumažėjimą pelių smegenyse. Taip nutinka dėl AlCl3 gebėjimo generuoti laisvuosius
radikalus ir sukelti antioksidacinių fermentų pokyčius in vitro ir in vivo, kurie pasireiškia neurotoksiniu ir hepatotoksiniu poveikiu [45]. Tačiau turkiškųjų raudonėlių ekstrakto girdymas statistiškai reikšmingai padidino CAT aktyvumą pelių smegenyse kompensuojant aliuminio jonų neigiamą poveikį smegenų ląstelėms. Kadangi etanoliu girdytų pelių smegenyse nustatytas statistiškai reikšmingas CAT aktyvumo sumažėjimas, lyginant su kontroline pelių grupe, o turkiškųjų raudonėlių ekstrakto grupėje – statistiškai reikšmingas CAT aktyvumo padidėjimas, galime teigti, kad šį padidėjimą lemia ekstrakte esantys biologiškai aktyvūs junginiai, todėl O.onites L. ekstraktas veikia kaip antioksidantas prieš aliuminio jonų toksišką poveikį tiriamųjų pelių smegenų ląstelėms.
0 5 10 15 20 25 30 35
Kontrolė Etanolis Raudonėlio ekstr. Raudonėlio
ekstr.+Al Aliuminis CAT ak ty vu m as ( vn t/ mg b al ty mo )
8 pav. CAT aktyvumas (vnt/mg baltymo) pelių smegenyse
3.7 Origanum onites L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių kepenyse
Po 21 dienos kiekvieną dieną pelėms girdyto O.onites L. ekstrakto per os nustatytas katalazės aktyvumas pelių kepenyse pavaizduotas 9 paveiksle. Kontrolinių pelių grupėje, nustatytas 40,47 ± 5,07 vnt/mg baltymo katalazės aktyvumas, tuo tarpu po AlCl3 tirpalu sukelto oksidacinio streso šis aktyvumas
statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) sumažėjo ir siekė 26,86 ± 0,66 vnt/mg baltymo. Turkiškųjų raudonėlių ekstrakto grupės pelių kepenyse CAT aktyvumas sumažėjo (35,48 ± 14,56 vnt/mg baltymo), lyginant su kontroline grupe. CAT aktyvumo sumažėjimas nustatytas ir turkiškuoju raudonėliu girdytų pelių, prieš tai AlCl3 sukėlus oksidacinį stresą, kepenyse, tačiau šie skirtumai nebuvo statistiškai reikšmingi.
Po 21 dieną trukusio AlCl3 injekavimo CAT aktyvumas kepenyse statistiškai reikšmingai
sumažėjo. Katalazės fermentai yra svarbūs organizmui palaikant homeostazę ląstelėse bei reguliuojant ADJ koncentraciją organizme ir taip sumažinant tikimybę oksidacinio streso sukėlimui. Taigi, aliuminio jonai sumažino antioksidacinių fermentų aktyvumą kepenyse ir padidino laisvųjų radikalų kiekį ląstelėje [44]. Pelių grupėje, kurioje girdytas raudonėlio ekstraktas po AlCl3 sukelto oksidacinio streso, matome
CAT aktyvumo padidėjimą, kas leistų manyti, kad ekstraktas turi savybių daryti teigiamą poveikį antioksidacinei kepenų ląstelių sistemai. Tačiau turkiškųjų raudonėlių ekstrakto girdymas nesukeliant
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Kontrolė Etanolis Raudonėlio ekstr. Raudonėlio
ekstr.+Al Aliuminis CAT ak ty vu m as ( vn t/ m g ba lt ym o)
oksidacinio streso, taip pat sukėlė CAT aktyvumo sumažėjimą. Todėl kol kas negalime patvirtinti, kad teigiamą antioksidacinį poveikį kepenų ląstelėms daro biologiškai aktyvūs junginiai, esantys ekstrakte.
3.8 Rezultatų apibendrinimas
Literatūros duomenimis aliuminio jonai geba generuoti laisvuosius radikalus ir sukelti antioksidacinių fermentų pokyčius in vitro ir in vivo, kurie pasireiškia neurotoksiniu ir hepatotoksiniu poveikiu [45]. Origanum onites L. ekstraktas, po AlCl3 sukelto oksidacinio streso, GSH koncentraciją
statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) padidino pelių kepenyse, tačiau pelių smegenyse šis padidėjimas buvo nežymus. Nors šis ekstraktas statistiškai reikšmingai sumažino GSH koncentraciją tiek pelių smegenyse, tiek kepenyse, lyginant su kontroline pelių grupe, gauti rezultatai rodo, kad ekstraktas teigiamai veikia oksidacinio streso pažeistas organų ląsteles. O. onites L. ekstraktas statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) padidino MDA koncentraciją, po AlCl3 tirpalu sukelto oksidacinio streso, pelių smegenyse ir kepenyse,
tai leidžia daryti prielaidą, kad turkiškųjų raudonėlių ekstraktas aktyvina antioksidacinę sistemą ir gali apsaugoti šiuos organus nuo lipidų peroksidacijos. Turkiškųjų raudonėlių ekstraktas statistiškai reikšmingai (p ≤ 0,05) padidino CAT aktyvumą pelių smegenyse po AlCl3 sukelto oksidacinio streso,
tačiau pelių kepenyse šis padidėjimas nebuvo statistiškai reikšmingas. Kadangi O.onites L. ekstraktas padidino CAT aktyvumą pelių smegenyse tiek kontrolinėje ekstrakto grupėje, tiek po AlCl3 sukelto
oksidacinio streso, galime teigti, kad šis ekstraktas pasižymi antioksidaciniu poveikiu pelių smegenyse dėl jame esančių biologiškai aktyvių junginių. Tuo tarpu CAT aktyvumo padidėjimas pelių kepenyse, girdant turkiškųjų raudonėlių ekstraktu po oksidacinio streso sukėlimo AlCl3 tirpalu, nebuvo statistiškai
4. IŠVADOS
1. Ekstrakcijos metodas iš O.onites L. augalinės žaliavos pasirinktas remiantis moksline literatūra, siekiant išekstrahuoti didžiausius antioksidaciniu poveikiu pasižyminčius junginių kiekius – ekstrakcija vykdoma 90 proc. etanoliu, kaitinant ir taikant grįžtamąjį šaldytuvą.
2. O. onites L. ekstraktas, vartojant po aliuminio jonų sukelto oksidacinio streso, padidina redukuoto glutationo koncentraciją pelių kepenyse, tačiau nedaro statistiškai reikšmingo poveikio GSH koncentracijai pelių smegenyse.
3. O. onites L. ekstraktas didina MDA koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po aliuminio jonų sukelto oksidacinio streso.
4. O. onites L. ekstraktas padidina katalazės aktyvumą pelių kepenyse ir smegenyse po aliuminio jonų sukeltos prooksidacijos, rodydamas gebėjimą sumažinti aliuminio jonų sukeltą peroksidaciją organų ląstelėse.
5. Nustatytas Origanum onites L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo, malondialdehido koncentracijoms ir katalazės aktyvumui pelių smegenyse bei kepenyse, po AlCl3 tirpalu sukelto
5. MAGISTRO DARBO TEMA SKELBTU PUBLIKACIJU
SĄRAŠAS
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Pizzino G, Irrera N, Cucinotta M, Pallio G, Mannino F, Arcoraci V, Squadrito F, Altavilla D, Bitto A. Oxidative stress: harms and benefits for human health. Oxidative medicine and cellular longevity. 2017 Oct;2017
2. Engwa GA. Free radicals and the role of plant phytochemicals as antioxidants against oxidative stress-related diseases. Phytochemicals: Source of Antioxidants and Role in Disease Prevention. BoD–Books on Demand. 2018 Nov 7:49-74.
3. Rashtbari S, Dehghan G, Yekta R, Jouyban A. Investigation of the binding mechanism and inhibition of bovine liver catalase by quercetin: Multi-spectroscopic and computational study. Bioimpacts: Bi. 2017;7(3):147.
4. Charles DJ. Antioxidant properties of spices, herbs and other sources. Springer Science & Business Media; 2012 Nov 27.
5. Origanum L. Plants of the World Online. Kew Science [Prieiga per internetą].
http://www.plantsoftheworldonline.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:21080-1
6. Vokou D, Kokkini S, Bessiere JM. Origanum onites (Lamiaceae) in Greece: distribution, volatile oil yield, and composition. Economic Botany. 1988 Jul;42(3):407-12.
7. Baranauskaitė J. Technologinių veiksnių įtaka miltelių su raudonėlių (Origanum onites L.) žolės ekstraktu fizikomechaninėms savybėms ir veikliųjų junginių atpalaidavimui iš kapsulių: daktaro disertacija: biomedicinos mokslai, farmacija (08B).
8. Rao A, Zhang Y, Muend S, Rao R. Mechanism of antifungal activity of terpenoid phenols resembles calcium stress and inhibition of the TOR pathway. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2010 Dec 1;54(12):5062-9.
9. Bulgakov VP, Inyushkina YV, Fedoreyev SA. Rosmarinic acid and its derivatives: biotechnology and applications. Critical reviews in biotechnology. 2012 Sep 1;32(3):203-17. 10. Mahomoodally MF, Zengin G, Aladag MO, Ozparlak H, Diuzheva A, Jekő J, Cziáky Z,
Aumeeruddy MZ. HPLC-MS/MS chemical characterization and biological properties of Origanum onites extracts: a recent insight. International journal of environmental health research. 2019 Nov 2;29(6):607-21.
12. Sharifi‐Rad M, Varoni EM, Iriti M, Martorell M, Setzer WN, del Mar Contreras M, Salehi B, Soltani‐Nejad A, Rajabi S, Tajbakhsh M, Sharifi‐Rad J. Carvacrol and human health: A comprehensive review. Phytotherapy Research. 2018 Sep;32(9):1675-87
13. Petersen M. Rosmarinic acid: new aspects. Phytochemistry Reviews. 2013 Mar 1;12(1):207-27. 14. Seo DY, Lee SR, Heo JW, No MH, Rhee BD, Ko KS, Kwak HB, Han J. Ursolic acid in health and disease. The Korean journal of physiology & pharmacology: official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology. 2018 May;22(3):235.
15. Shanmugam MK, Dai X, Kumar AP, Tan BK, Sethi G, Bishayee A. Oleanolic acid and its synthetic derivatives for the prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical evidence. Cancer letters. 2014 May 1;346(2):206-16. ]
16. Ayeleso TB, Matumba MG, Mukwevho E. Oleanolic acid and its derivatives: biological activities and therapeutic potential in chronic diseases. Molecules. 2017 Nov;22(11):1915. 17. Gutiérrez-Rebolledo GA, Siordia-Reyes AG, Meckes-Fischer M, Jiménez-Arellanes A.
Hepatoprotective properties of oleanolic and ursolic acids in antitubercular drug-induced liver damage. Asian Pacific journal of tropical medicine. 2016 Jul 1;9(7):644-51.
18. Arunasree KM. Anti-proliferative effects of carvacrol on a human metastatic breast cancer cell line, MDA-MB 231. Phytomedicine. 2010 Jul 1;17(8-9):581-8.
19. Rao A, Zhang Y, Muend S, Rao R. Mechanism of antifungal activity of terpenoid phenols resembles calcium stress and inhibition of the TOR pathway. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2010 Dec 1;54(12):5062-9.
20. Nostro A, Papalia T. Antimicrobial activity of carvacrol: current progress and future prospectives. Recent patents on anti-infective drug discovery. 2012 Apr 1;7(1):28-35.
21. Andrade LN, De Sousa DP. A review on anti-inflammatory activity of monoterpenes. Molecules. 2013 Jan;18(1):1227-54.
22. Shekarchi M, Hajimehdipoor H, Saeidnia S, Gohari AR, Hamedani MP. Comparative study of rosmarinic acid content in some plants of Labiatae family. Pharmacognosy magazine. 2012 Jan;8(29):37.
23. Fallarini S, Miglio G, Paoletti T, Minassi A, Amoruso A, Bardelli C, Brunelleschi S, Lombardi G. Clovamide and rosmarinic acid induce neuroprotective effects in in vitro models of neuronal death. British Journal of Pharmacology. 2009 Jul;157(6):1072-84.
of Rosmarinus officinalis in rat models of local and systemic inflammation. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 2015 May;116(5):398-413.
25. Mahomoodally MF, Zengin G, Aladag MO, Ozparlak H, Diuzheva A, Jekő J, Cziáky Z, Aumeeruddy MZ. HPLC-MS/MS chemical characterization and biological properties of Origanum onites extracts: a recent insight. International journal of environmental health research. 2019 Nov 2;29(6):607-21.
26. Ozsurekci Y, Aykac K. Oxidative stress related diseases in newborns. Oxidative medicine and cellular longevity. 2016 Oct;2016.
27. Lushchak VI. Free radicals, reactive oxygen species, oxidative stress and its classification. Chemico-biological interactions. 2014 Dec 5;224:164-75
28. Rahal A, Kumar A, Singh V, Yadav B, Tiwari R, Chakraborty S, Dhama K. Oxidative stress, prooxidants, and antioxidants: the interplay. BioMed research international. 2014;2014
29. Mao X, Gu C, Chen D, Yu B, He J. Oxidative stress-induced diseases and tea polyphenols. Oncotarget. 2017 Oct 6;8(46):81649.]
30. Ayala A, Muñoz MF, Argüelles S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxidative medicine and cellular longevity. 2014 Oct;2014.]
31. Ayala A, Muñoz MF, Argüelles S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxidative medicine and cellular longevity. 2014 Oct;2014
32. Uchiyama M, Mihara M. Determination of malonaldehyde precursors in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 1978;86:271–8.
33. Škrovánková S, Mišurcová L, Machů L. Antioxidant activity and protecting health effects of common medicinal plants. InAdvances in food and nutrition research 2012 Jan 1 (Vol. 67, pp. 75-139). Academic Press.
34. Nimse SB, Pal D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. Rsc Advances. 2015;5(35):27986-8006.
36. Kalinina EV, Chernov NN, Novichkova MD. Role of glutathione, glutathione transferase, and glutaredoxin in regulation of redox-dependent processes. Biochemistry (Moscow). 2014 Dec 1;79(13):1562-83.
37. Bhatia S, Drake DM, Miller L, Wells PG. Oxidative stress and DNA damage in the mechanism of fetal alcohol spectrum disorders. Birth defects research. 2019 Jul 15;111(12):714-48.
38. Erol K, Cebeci BK, Köse K, Köse DA. Effect of immobilization on the activity of catalase carried by poly (HEMA-GMA) cryogels. International journal of biological macromolecules. 2019 Feb 15;123:738-43.
39. Glorieux C, Zamocky M, Sandoval JM, Verrax J, Calderon PB. Regulation of catalase expression in healthy and cancerous cells. Free Radical Biology and Medicine. 2015 Oct 1;87:84-97. 40. Rashtbari S, Dehghan G, Yekta R, Jouyban A. Investigation of the binding mechanism and
inhibition of bovine liver catalase by quercetin: Multi-spectroscopic and computational study. Bioimpacts: Bi. 2017;7(3):147.
41. Krych-Madej J, Gebicka L. Interactions of nitrite with catalase: enzyme activity and reaction kinetics studies. Journal of Inorganic Biochemistry. 2017 Jun 1;171:10-7.
42. Tsikas D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical biochemistry. 2017 May 1;524:13-30.
43. Papastergiadis A, Mubiru E, Van Langenhove H, De Meulenaer B. Malondialdehyde measurement in oxidized foods: evaluation of the spectrophotometric thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) test in various foods. Journal of agricultural and food chemistry. 2012 Sep 26;60(38):9589-94.
44. Moneim AE. Evaluating the potential role of pomegranate peel in aluminum-induced oxidative stress and histopathological alterations in brain of female rats. Biological trace element research. 2012 Dec 1;150(1-3):328-36.
45. Niedworok J, Fijałkowski P. Effect of Long-Term Aluminium Chloride Intoxication on Selected Biochemical Parameters and Oxidative--Antioxidative Balance in Experimental Animals. Polish Journal of Environmental Studies. 2004;13(1):41-3.
47. Staneviciene I, Ivanov L, Kursvietiene L, Viezeliene D. Short-term effects of aluminum and selenium on redox status in mice brain and blood. Trace Elements and Electrolytes. 2017;34(2):74.
48. Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman reagent. Anal Biochem. 1968;25:192–205.
49. Uchiyama M, Mihara M. Determination of malonaldehyde precursors in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 1978;86:271–8.
50. Rachmanova TI, Matasova LV, Semenichina AV, Safonova OA, Makeeva AV, Popova TN. Oxidative status evaluation methods. Publishing and Printing Center of Voronezh State University. 2009, 62.
51. Abdel-Salam OM, Hamdy SM, Seadawy SA, Galal AF, Abouelfadl DM, Atrees SS. Effect of piracetam, vincamine, vinpocetine, and donepezil on oxidative stress and neurodegeneration induced by aluminum chloride in rats. Comparative Clinical Pathology. 2016 Mar 1;25(2):305-18
52. Sushma NJ, Priyanka S, Rao KJ. Neuroprotective role of Melatonin against aluminum-induced oxidative stress in the hippocampus of mouse brain. Journal of Applied Pharmaceutical
Science. 2011 Dec 1;1(10):126.
53. Adedosu OT, Adeleke GE, Alao TA, Ojugo NE, Akinsoji OE. Effects of vitamin E administration on certain biochemical and antioxidants indices in some rat tissues treated with aluminium chloride. Annual Research & Review in Biology. 2018 Jul 7:1-3.
54. Li L, Jiao Y, Jin T, Sun H, Li S, Jin C, Hu S, Ji J, Xiang L. Phenolic alkaloid oleracein E attenuates oxidative stress and neurotoxicity in AlCl3-treated mice. Life sciences. 2017 Dec 15;191:211-8
PRIEDAI
2 priedas. Dalyvavimas tarptautinėje konferencijoje ,, Farmacijos mokslas ir praktika: problemos, pasiekimai, perspektyvos“. 2021m. balandžio 15-16 dienomis.
Мі і е в и зд в Ук аї и На і ал ий а а ев и ий іве и е І и ідви е квалі іка ії е іалі ів а а ії Ка ед а загал ї а а ії а без еки ліків Ци за від ий ав ла а IІІ науково-практи ній інтернет-конференції з міжнародно у аст ФАРМАЦЕВТИЧНА НАУКА ТА ПРАКТИКА ПРОБЛЕМИ ДОСЯГНЕННЯ ПЕРСПЕКТИВИ РОЗВИТКУ PHARMACEUTICAL SCIENCE AND PRACTICE PROBLEMS ACHIEVEMENTS PROSPECTS
