FENOLINIŲ JUNGINIŲ I R ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO VERTINIMAS VAISTINIO AUGALO LEONURUS CARDIACA L. ETERINIŲ ALIEJŲ ,

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA

DOVILĖ MEŠKAUSKAITĖ

VAISTINIO AUGALO LEONURUS CARDIACA L. ETERINIŲ ALIEJŲ,

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO

VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai: doc. dr. Audronis Lukošius, prof. dr. Ona Ragažinskienė, prof. habil. dr. Audrius Maruška

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

VAISTINIO AUGALO LEONURUS CARDIACA L. ETERINIŲ ALIEJŲ,

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO

VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Darbo vadovai:

prof. dr. Hiliaras Rodovičius doc. dr. Audronis Lukošius

2014-05-30 prof. dr. Ona Ragažinskienė

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ...12

1.1 Paprastosios sukatžolės (Leonurus cardiaca L.) morfologiniai požymiai, paplitimas ir kokybės reikalavimai ...12

1.2 Leonurus cardiaca L. biologiškai aktyvios medžiagos ...13

1.3 Leonurus cardiaca L. farmakologinės savybės ...14

1.4 Eterinių aliejų apžvalga ...16

1.5 Fenolinių junginių apžvalga ...17

1.6 Flavonoidų medicininė reikšmė ...18

1.7 Antioksidacinis poveikis ir jo įvertinimas ...19

1.8 Fenolinių junginių ir eterinių aliejų nustatymo metodai ...20

2. TYRIMO METODIKA ...23 2.1 Tyrimų objektas ...23 2.2 Reagentai ...23 2.3 Aparatūra ...24 2.4 Tyrimų schema...25 2.5 Tyrimų metodai ...26

2.5.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas ...26

2.5.2 Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu ...26

2.5.3 Spektrofotometriniai metodai ...27

2.5.4 Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakijos detekcija metodas ...30

2.6 Statistinė duomenų analizė ...31

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...32

3.2 Spektrofotometrinės analizės rezultatai...37

3.3 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės rezultatai ...40

4. IŠVADOS ...48

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...49

6. PRIEDAI ...54

SANTRAUKA

D. Meškauskaitės magistro baigiamasis darbas/ moksliniai vadovai: doc. dr. Audronis Lukošius, prof. dr. Ona Ragažinskienė, prof. habil. dr. Audrius Maruška; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Vytauto Didžiojo universiteto, Gamtos mokslų fakulteto, Biochemijos ir biotechnologijų katedra. – Kaunas.

Šio darbo tiriamasis objektas paprastoji sukatžolė (Leonurus cardiaca L.) – notrelinių (Lamiaceae) šeimos daugiametis, fenolinius junginius, eterinį aliejų, alkaloidus kaupiantis augalas. Leonurus cardiaca L. pasižymi antiaritminiu, kraujo spaudimą mažinančiu, raminančiu, uždegimą mažinančiu, antibakteriniu poveikiu.

Darbo tikslas – nustatyti eterinio aliejaus komponentus, fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą augalinėje paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) antžeminės dalies žaliavoje, surinktoje skirtingose augavietėse bei palyginti šių junginių pasiskirstymą lapuose, stiebuose ir žolėje. Uždaviniai – identifikuoti Leonurus cardiaca L. eterinio aliejaus komponentus dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu; nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu ir palyginti šių junginių pasiskirstymą skirtinguose augalo organuose bei bandiniuose, rinktuose skirtingose augavietėse; įvertinti atskirų fenolinių rūgščių ir flavonoidų įtaką bendram ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui, panaudojant efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija metodą.

SUMMARY

Motherwort (Leonurus cardiaca L.) is a perennial medicinal plant of Labiatae (Lamiaceae) family. It accumulates many biologically active substances (phenolic compounds, flavonoids, essential oil, alkaloids). Leonurus cardiaca L. is a perspective herb of its antiarrhythmic, hypotensive, sedative, antiinflammatory, antibacterial and antioxidative effect.

The aim of this study – to identify components of essential oil, content of phenolic compounds and antioxidant activity in motherwort (Leonurus cardiaca L.) raw material, collected from the different places of Lithuania and to compare their distribution in leaves, stems and grass. Tasks – to identify

Leonurus cardiaca L. components of essential oil by gas chromatography–mass spectrometry; to

determine the total phenolic compounds, total flavonoid content and DPPH radical scavenging activity by spectrophotometry and to compare the distribution of these active compounds in different organs of the plant and sample, collected from the different places of Lithuania; to assess the individual phenolic acids and flavonoids impact on the antioxidant activity of extracts, using postcolumn high performance liquid chromatography (HPLC)-DPPH method.

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovams doc. dr. Audroniui Lukošiui, prof. dr. Onai Ragažinskienei, prof. habil. dr. Audriui Maruškai už vertingus patarimus ir konsultacijas.

SANTRUMPOS

ABTS 2,2-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties radikalas. Jonų redukcijos antioksidacinės galios tyrimas, vykstant dvivalenčio vario jono redukcijai iki vienvalenčio jono

DPPH 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas

DVB/CAR/PDMS divinilbenzenas/karboksenas/polidimetilsiloksanas

FRAP (angl. ferric reducing antioxidant power) geležies jonų redukcijos antioksidacinės galios tyrimas

GAE galo rūgšties ekvivalentas

GS–MS dujų chromatografija–masių spektrometrija

HE hiperozido ekvivalentas

HPLC-DAD efektyvioji skysčių chromatografija su diodų matricos detektoriumi.

n imtis

ORAC (angl. oxygen radical absorbance capacity) deguonies radikalų absorbcijos galia Ph. Eur. Europos farmakopėja

R2 regresijos koeficientas

RE rutino ekvivalentas

ĮVADAS

Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, medicinoje naudojama 35 – 75 tūkstančiai augalų rūšių, o tai sudaro 14 – 28 % visų augalų rūšių [9].

Tradiciniai augaliniai vaistai įgyja vis didesnį dėmesį pasaulinėje sveikatos sistemoje, jų paklausa kasmet didėja. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, pasaulinė augalinių vaistų rinka kasmet sudaro 60 milijardų JAV dolerių [55]. Tradiciniai augaliniai vaistai ne tik pasižymi platesniu veikimu, bet ir sukelia mažiau šalutinių reakcijų nei sintetiniai vaistai, todėl vaistinių augalų ir juose esančių biologiškai aktyvių medžiagų tyrimai tampa vis aktualesne tema.

Šio darbo tiriamasis objektas – paprastoji sukatžolė (Leonurus cardiaca L.) yra notrelinių (Lamiaceae) šeimos daugiametis, fenolinius junginius, alkaloidus, eterinį aliejų, saponinus kaupiantis augalas. Atlikti moksliniai tyrimai rodo platų paprastųjų sukatžolių pritaikymą. Naujausios studijos, kuriose analizuojami tiek Leonurus cardiaca L. ekstraktai, tiek atskiri komponentai, atskleidžia įvairius

Leonurus cardiaca L. sąlygojamus farmakologinius poveikius: antiuždegiminį, antiaritminį, raminamąjį,

hipotenzinį, antibakterinį, antivirusinį [33, 39, 57, 58].

Leonurus cardiaca L. dėl patvirtintų medicininių indikacijų yra įtraukta į Rusijos (1968 m.),

Didžiosios Britanijos (1992 m.) ir Europos (2008 m.) farmakopėjas. Raminamasis, hipotenzinis ir antiaritminis poveikiai – labiausiai tyrinėjami Leonurus cardiaca L. biologiniai poveikiai [46].

Lietuvoje Leonurus cardiaca L. preparatai gana plačiai naudojami gydymo ir profilaktiniais tikslais. Europos vaistų agentūros duomenimis, Lietuvoje Leonurus cardiaca L. vartojama arbatai ruošti daugiau nei 55 metus [15]. Valstybinės vaistų kontrolės duomenimis, Lietuvoje yra registruoti 5 augaliniai vaistiniai preparatai, sudėtyje turintys Leonurus cardiaca L. etanolinio (70 %) ekstrakto. Indikacijos pagrįstos ilgalaikiu vartojimu, preparatai vartojami nervinei įtampai mažinti, taip pat komplekse su

Valerianae officinalis L. ir Crataegus oxyacantha L. – širdies ir kraujagyslių funkcijų gerinimui [31].

Fenoliniai junginiai, eterinis aliejus yra vieni svarbesnių biologiškai aktyvių Leonurus cardiaca L. junginių, todėl jų analizė moderniais dujų chromatografijos–masių spektrometrijos, efektyviosios skysčių chromatografijos ir spektrofotometrijos metodais leidžia įvertinti augalinės žaliavos kokybę, palyginti kaip šie biologiškai aktyvūs junginiai pasiskirsto skirtinguose augalo organuose.

Darbo tikslas – nustatyti eterinio aliejaus komponentus, fenolinių junginių kiekį bei

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Nustatyti eterinio aliejaus komponentus, fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą augalinėje paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) antžeminės dalies žaliavoje, surinktoje skirtingose augavietėse bei palyginti jų pasiskirstymą lapuose, stiebuose ir žolėje.

Darbo uždaviniai:

1. Identifikuoti paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) eterinio aliejaus komponentus dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu.

2. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu ir palyginti šių junginių pasiskirstymą skirtinguose augalo organuose bei bandiniuose, rinktuose skirtingose augavietėse.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) morfologiniai požymiai, paplitimas

ir kokybės reikalavimai

1 pav. Paprastoji sukatžolė (Leonurus cardiaca L.)

Paprastoji sukatžolė (Leonurus cardiaca L.) (1 pav.) yra notrelinių (Lamiaceae) šeimos daugiametis 40–100 cm aukščio žolinis augalas. Šakniastiebis trumpas, sumedėjęs, stiebas status, šakotas, keturbriaunis, tuščiaviduris, apaugęs žemyn palinkusiais trumpais plaukeliais. Stiebo lapai kotuoti, 4–8 cm ilgio ir 2–6 cm pločio. Žiedynas ilgas, 10–25 cm aukščio. Žiedai smulkūs, 8–10 mm ilgio, susitelkę lapų pažastyse į tankius gausiažiedžius menturius. Vainikėlis rožinis arba baltas. Apatinės lūpos vidurinė skiautė ištisinė, nusmailėjusi, su raudonomis gyslelėmis. Paprastosios sukatžolės žydi birželio–rugsėjo mėnesiais, vaisius subrandina liepą–rugpjūtį. Dauginasi sėklomis, žiedai savidulkiai, kartais apdulkina vabzdžiai, renkantys nektarą [10].

DUMORT, Leonurus trilobatus (LAM.) DULAC, Cardiaca vulgaris MOENCH, Cardiaca trilobata LAM, Cardiaca vulgaris MOENCH [15].

Pagal Europos farmakopėją, kaip augalinė žaliava farmacinių preparatų gamybai naudojama antžeminė augalo dalis. Kokybiškoje žaliavoje turi būti mažiausiai 0,2 % flavonoidų, išreikštų hiperozidu. Drėgmės žaliavoje gali būti ne daugiau kaip 12 % [23]. Džiovinimui antžeminė dalis pjaunama 30–40 cm aukštyje nuo žemės paviršiaus, džiovinama 40–50oC temperatūroje, ekstrakcinių medžiagų (ekstrahuojant 70 % etanoliu) turėtų būti ne mažiau kaip 10 % [10].

1.2 Leonurus cardiaca L. biologiškai aktyvios medžiagos

Apžvelgus literatūrą ir susisteminus kitų autorių mokslinių tyrimų duomenis, įvertinta Leonurus

cardiaca L. fitocheminė sudėtis:

 Fenoliniai junginiai: fenilpropanoidinis glikozidas – lavandulifoliozidas (iki 1 %), fenolinės rūgštys: chlorogeninė, rozmarinų, kavos, p-kumaro, p-hidroksibenzoinė, vanilo, ferulo. Fenoliniai glikozidai – kavos rūgšties-4-O-rutinozidas 0,1 %.

 Flavonoidai: dažniausi kvercetino ir kemferolio O-glikozidai – rutinas, hiperozidas, kvercitrinas, izokvercitrinas, astragalinas, apigeninas. Flavonoidų C-glikozidai – viteksinas, izoviteksinas. Laisvi anglikonai – kvercetinas, kemferolis, genkvaninas.

 Pirolidino tipo alkaloidai: stachidrinas 0,5–1,5 %, leonurinas 0,0068 %, leonuridinas, leonurininas ir 4-hidroksistachidrino stereoizomerai – betonicinas, turicinas. Bendras alkaloidų kiekis – 0,1–2,1 %.

 Eterinis aliejus: 0,01–0,02 %, dažniausiai turi seskviterpenų – germakreno D 26–32 %, α-humuleno 6,5–8,8 %, β-kariofileno, β-burboneno; monoterpenų – α-pineno 0,5–1 %, dehidro-1,8-cineolo.

 Terpenai: iridoidglikozidai (ajugolis, reptozidas, ajugozidas); labdano tipo diterpenoidai (leokardinas 0,003 %, leosibiricinas. Šviežioje žolėjė randama jų apie 4 mg/g. Didžiausias kiekis randamas žieduose ir jaunuose lapuose iki 2,6–3,2 mg/g šviežios žolės); triterpenoidai (ursolo rūgštis 0,26 %, oleanolinė rūgštis, korozolinė rūgštis).

 Taninai 5–9 %.

1.3 Leonurus cardiaca L. farmakologinės savybės

Liaudies medicinoje paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) preparatai pagrinde naudojami mažinti nervinei įtampai, nes pasižymi centrinę nervų sistemą raminančiu poveikiu. Taip pat veikia raminančiai esant patologiniam klimaksui: malšina karščio bangas, širdies plakimą, jaudulį. Paprastųjų sukatžolių antpilas nesukelia mieguistumo, bet švelniai atpalaiduoja, slopina įtampą. Sedatyvinis poveikis net kelis kartus stipresnis negu valerijono. Taip pat paprastųjų sukatžolių preparatai vartojami esant nerviniams širdies sutrikimams, mažina širdies susitraukimų dažnį ir didina susitraukimų jėgą, gydo esant stenokardijai, hipertonijai [2, 4, 10, 12, 24, 58].

Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Leonurus cardiaca L. antiaritminis poveikis prilygsta III ir IV klasės antiaritminiams vaistams: blokuojant kalcio kanalus pasireiškia vainikinių kraujagyslių vazodilatacinis poveikis, širdis geriau aprūpinama deguonimi; blokuojant kalio kanalus ilgėja veikimo potencialo trukmė širdies laidžiojoje sistemoje, dėl to pasireiškia antiaritminis poveikis [39, 57, 58]. Šį poveikį įrodo Vokietijos ir Italijos mokslininkų M. Ritter ir kt. (2010) atlikti širdies eletrofiziologiniai tyrimai. Išgrynintas paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) vandeninis ekstraktas buvo perleidžiamas per izoliuotas triušių širdis, panaudojant Langendorfo techniką. Eksperimentai su 256 elektrodais ant širdies paviršiaus parodė kairiojo skilvelio spaudimo sumažėjimą (15±5 mmHg). Be to, buvo atlikti tyrimai su kitais ląstelių modeliais, siekiant įvertinti elektrofiziologinį išgryninto Leonurus

cardiaca L. ekstrakto profilį. Naujagimių žiurkių skilvelių kardiomiocitai buvo naudoti, norint įvertinti

tai sąlygoja kardioprotekcinį poveikį bei sumažina miokardo infarkto riziką [32]. Leonurus cardiaca L. yra vienas svarbiausių vaistinių augalų, teikiančių efektyvią naudą širdies ligų gydyme, tačiau kai kurioms indikacijoms (kraujo spaudimo mažinimas, krūtinės angina) pagrįsti trūksta didesnės apimties tyrimų [26]. Raminamasis poveikis. A. N. Shikov ir kt. (2011) atliko klinikinį tyrimą su pacientais, turinčiais I ir II laipsnio arterinę hipertenziją, kurią lydėjo miego sutrikimas ir nerimas. Buvo nustatyta, kad 1200 mg per dieną aliejinio Leonurus cardiaca L. ekstrakto, turinčio 0,6 mg iridoidų, padeda I laipsnio hipertenzija sergantiems asmenis reikšmingai sumažinti arterinį kraujo spaudimą per 28 dienas, taip pat pagal Clinical Global Impression skalę (tai skalė, pagal kurią vertinamas klinikinės būklės sunkumas sergant psichinėmis ligomis) reikšmingas nerimo, miego sutrikimų, depresijos būklės pagerėjimas nustatytas 32 % pacientų, vidutinis pagerėjimas – 48 % tiriamųjų. Pacientams, sergantiems II laipsnio hipertenzija, pagerėjimas buvo nustatytas 1–2 savaitėmis vėliau [52]. Palyginus Leonurus cardiaca L. ir

Valeriana officinalis tinktūrų raminamajį poveikį triušiams, nustatyta, kad Leonurus cardiaca L.

pasižymėjo 2–3 kartus stipresniu centrinę nervų sistemą slopinančiu poveikiu negu Valeriana officinalis [57]. Anksčiau buvo manyta, kad lavandulifoliozidai atsakingi už sedacinį poveikį, tačiau K. Milkowska-Leyck ir kt. (2002) nustatė, kad 800–1600 mg/kg lavandulifoliozidų dozės pelėms turėjo tik silpną raminamąjį poveikį, kuris nebuvo statistiškai reikšmingas. Tačiau, skiriant neišskirstyto Leonurus cadiaca L. ekstrakto 800 mg/kg dozę, spontaninis motorinis aktyvumas sumažėjo 65 % [40]. K. B. Ovanesov (2006; cit. iš K. Wojtyniak et al., 2012) atliko tyrimą su pacientais, sergančiais depresija, nerimo sutrikimu. Jie buvo suskirstyti į tris grupes: placebo, gavusių melatonino ir gavusių paprastųjų sukatžolių tinktūros. Įvertinus, kokį poveikį sąlygojo skirti preparatai, nustatyta, kad paprastųjų sukatžolių tinktūra pasižymėjo reikšmingu nerimą mažinančiu poveikiu, nors melatonino veikimas buvo stipresnis [57].

Uždegimą ir skausmą mažinantis poveikis. S. Ali ir kt. (2007) tyrinėjo ursolo rūgšties, išskirtos iš Leonurus cardiaca L., antiuždegiminį aktyvumą. Buvo nustatyta, kad ursolo rūgštis pasižymi stipriu laisvųjų radikalų, kurie susidaro esant uždegimui ląstelių sistemose, slopinimu. Slopinimas buvo stipresnis negu klinikinėje praktikoje naudojamų antiuždegiminių preparatų – indometacino, aspirino [13]. 10 mg/kg dozė furanlabdano tipo diterpenų, išskirtų iš Leonurus cardiaca L., slopina spazmus pelėms, kurioms buvo injekuojama 80–95 % acto rūgšties spazmų sukėlimui. Furanlabdano tipo diterpenų slopinimas buvo efektyvesnis negu aspirino ar paracetamolio [57].

58]. Kinijos augalinių produktų rinkoje įregistruotas Leonurus japonicus Houtt. ekstraktas, skirtas lengvinti menopauzės simptomus, nes sukatžolių žolės alkaloidas leonurinas pasižymi gimdą stimuliuojančiu poveikiu. Taip pat – reguliuoti menstruacijų ciklą, ypatingai tada, jei sutrikimai atsiranda dėl nuolatinio nerimo ir įtampos. Pagrindinį poveikį sąlygoja ekstrakte esantys alkaloidai stachidrinas ir leonurinas [42]. Šie alkaloidai kaupiasi ir Leonurus cardiaca L., taigi galima teigti, kad Leonurus

cardiaca L.ekstraktas sąlygotų tokį patį poveikį kaip ir Leonurus japonicus Houtt. ekstraktas. Tačiau

duomenų, kurie leistų pagrįsti Leonurus cardiaca L. veiksmingumą lengvinant menopauzės simptomus, nėra pakankamai, todėl būtų tikslinga atlikti išsamius tyrimus šiai indikacijai pagrįsti.

1.4 Eterinių aliejų apžvalga

Eteriniai aliejai – įvairios cheminės struktūros ir sudėties lakių organinių medžiagų mišiniai. Nustatyta, kad iš visų augalų rūšių apie 5 % (17500 rūšių) yra aromatiniai [56]. Iš jų, daugiau kaip 400 rūšių yra naudojami pramonėje eterinių aliejų gamybai. Eterinių aliejų ekstrakcijai naudojami šie metodai: distiliacija vandens garais, šalto spaudimo ekstrakcija, tirpiklio ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija. Dažniausiai pramonėje naudojami šalto spaudimo ekstrakcijos ir distiliacijos metodai. Ekstrakcija organiniais tirpikliais turi trūkumų, nes tirpiklio likučiai gali sukelti alergijas, imuninės sistemos sutrikimus, dėl to šis metodas naudojamas vis rečiau.

Eteriniuose aliejuose esantys junginiai sudaryti iš alifatinių ir aromatinių angliavandenilių, turinčių įvairių funkcinių grupių, dėl to eteriniuose aliejuose yra junginių, priskiriamų esteriams, eteriams, aldehidams, alkoholiams, oksidams, ketonams, fenoliams. Didžiausią eterinių aliejų dalį sudaro terpenai, kurie klasifikuojami pagal struktūroje esančių izopreno (C5H8) molekulių skaičių: 1 izopreno molekulė –

pusiauterpenai, 2 – monoterpenai, 3 – seskviterpenai, 4 – diterpenai, 6 – triterpenai, 8 – tetraterpenai, 100– 5000 – politerpenai. Eterinių aliejų sudėtis priklauso nuo augalo augimo stadijos, augimo vietos bei aplinkos salygų.

kvapą, esantį aplinkoje.Iki šių dienų eteriniai aliejai plačiai naudojami kosmetikos, maisto, žemės ūkio ir farmacijos pramonėje [10, 16, 18, 56].

1.5 Fenolinių junginių apžvalga

Fenoliniai junginiai – tai antriniai augalų metabolitai, priklausomai nuo jų cheminės struktūros skirstomi į 8 pagrindines grupes: flavonoidus, fenolines rūgštis, stilbenus, chinonus, kumarinus, ligninus, ksantonus ir chromonus [51]. Flavonoidai ir fenolinės rūgštys – svarbiausios ir labiausiai ištirtos fenolinių junginių grupės. Leonurus cardiaca L. žaliavoje flavonoidai ir fenolinės rūgštys (hidroksicinamo rūgšties dariniai) yra svarbiausi fenolinių junginių atstovai [57], dėl to plačiau aptariamos tik šios dvi grupės.

Fenolinės rūgštys pagal struktūros pagrindą skirstomos į du poklasius: hidroksibenzoinės rūgšties derivatus, turinčius C6-C1 fragmentą ir hidroksicinamo rūgšties derivatus, turinčius C6-C3 fragmentą [51].

Hidroksicinamo rūgščiai priskiriami šie derivatai: chlorogeno r., kavos r., m-kumaro r., p-kumaro r., ferulo r., sinapo r., cikorinė r., kumarinas, cinamo r., diferulo r. [17]. X. L. Jin ir kt. (2012) nustatė hidroksicinamo rūgšties derivatų giminingumą. Didžiausiu giminingumu hidroksicinamo rūgščiai pasižymėjo chlorogeno r., mažesniu (visi junginiai surašyti giminingumo mažėjimo tvarka) kavos r., m-kumaro r., p-m-kumaro r., ferulo r. ir sinapo r. [28]. Hidroksibenzoinei rūgščiai priskiriami šie derivatai: galo r., vanilo r., izovanilo r., siringo r., gentizino r., p-hidroksibenzoinė r., salicilo r., α- ir β-rezorcilo r. [17].

Šiuo metu yra identifikuota daugiau kaip 6500 skirtingos cheminės struktūros flavonoidų. Jų struktūros pagrindą sudaro charakteringa C6-C3-C6 konfigūracija. Augaluose flavonoidai yra aptinkami

aglikonų, bet dažniausiai – O-glikozidų pavidalu, sujungtų su cukraus molekule per C3 ar C7 padėtį. C4

padėties glikozidų pasitaiko labai retai, nėra aprašyta nė vieno C5 padėties glikozido. Yra žinoma 80

skirtingų cukrų, su kuriais jungiasi flavonoidai. Labiausiai paplitę monosacharidai – D-gliukozė, L-ramnozė, galaktozė, ksilozė, disacharidai – rutinozė, soforozė [3, 21, 22, 25].

Klasifikuojant flavonoidus pagal jų cheminę sandarą ir propaninio fragmento oksidacijos laipsnį, flavonoidai, kurie turi hidroksilo (-OH) grupę C3 padėtyje skirstomi į:

 flavonolius – kvercetinas, kemferolis, mircetinas ir kvercetino glikozidai – rutinas, kvercitrinas, hiperozidas.

 dihidroflavonolius – pinobaksinas, taksifolinas, silibinas.

 katechinus (flavanolius) – katechinas, epikatechinas, galokatechinas.  antocianidinus – cianidinas, pelargoninas, delfinidinas, malvidinas.  leukoantocianidinus – leukoantocianidinas, leukopianidinas.

Flavonoidai, kurie C3 padėtyje neturi pakaito skirstomi į:

 flavonus – apigeninas, liuteolinas, viteksinas, izoviteksinas, orientinas, izoorientinas, diosminas.

 flavanonus – likviritigeninas, likviritinas, naringeninas, hesperidinas Kiti flavonoidai, nepriskiriami jokiai grupei:

 izoflavononai – skiriasi nuo abiejų prieš tai paminėtų grupių, nes benzeno žiedas yra prijungtas ne prie C2, bet prie C3. Jiems priskiriami ononinas, genistinas.

 chalkonai – izolikviritinas, 3,4-dihidroksichalkonas. Tai junginiai, kuriuos galima vertinti kaip flavonoidus su atviru pirano žiedu.

 auronai – gispidolis. Šios grupės junginiai struktūroje turi penkianarį furano žiedą, aptinkami glikozidų pavidalu.

 neoflavonoidai – struktūriškai ir biologiškai yra panašūs į izoflavonoidus ir sudaro 4-arilkumarinus, 3,4-dihidro-4-arilkumarinus ir neoflavenus.

 biflavonoidai – polimerai, sudaryti iš kelių flavonoidų poklasių – flavonų, flavononų ir izoflavonų [3, 17, 22, 25, 51].

1.6 Flavonoidų medicininė reikšmė

ląstelių augimas. Su antioksidaciniu poveikiu siejamas ir trombocitų agregaciją mažinantis poveikis, nes inhibuojant uždegimo mediatorius, slopinama ir tromboksano A2 sintezė. Mažėjant tromboksano A2

kiekiui, mažėja ir trombocitų agregacija [44]; antivėžiniu – poveikis siejamas taip pat su gebėjimu surišti laisvuosius radikalus, tokiu būdu neleidžiama įvykti ląstelių mutacijoms, kartu flavonoidai stabdo ir nekontroliuojamą angiogenezę, todėl nebesiformuoja naujos kraujagyslės, navikas nebegali savęs aprūpinti krauju ir pradeda žūti [44]; antilipideminiu – būdami stiprūs antioksidantai, flavonoidai stabdo mažo tankio lipoproteinų oksidaciją, tokiu būdu sumažina kraujagyslių pažeidimo riziką ir aterosklerozės išsivystymą [35, 44]; antibakteriniu – vieni flavonoidai stabdo nukleorūgščių sintezę, kiti – sutrikdo citoplazminės membranos funkciją, treti – inhibuoja energijos metabolizmą; antigrybeliniu – flavonoidai geba inhibuoti sporų augimą; antivirusiniu – teigiama, kad antivirusinį poveikį sąlygoja C3 padėtyje esanti

hidroksilo grupė, veikimas pagrįstas viruso replikacijos stabdymu, viruso infekcinių savybių slopinimu [20, 47]; kraujavimą stabdančiu [4]; osteoporozės vystymosi riziką mažinančiu – flavonoidai geba didinti kaulų mineralinį tankį [44, 47]. Flavonoidų gydomąjį poveikį sustiprina steroliai ir terpenai [4]. Abiejų šių medžiagų yra randama ir Leonurus cardiaca L., todėl galima teigti, kad jos turi įtakos flavonoidų gydomajam poveikiui, veikdamos jį stiprinančiai.

1.7 Antioksidacinis poveikis ir jo įvertinimas

Reaktyviosios deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formos skatina senėjimo procesus organizme, sąlygoja širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių ligų (Parkinsono, Alzhaimerio, Hantingtono, depresijos), kataraktos, vėžio, reumatoidinio artrito, odos (atopinio dermatito, melanomos, dilgėlinės, eritemos) ir kitų ligų atsiradimą. Vis labiau ieškoma natūralios kilmės antioksidantų, kurie priešingai nei sintetiniai, nesukelia toksinio poveikio organizmui. Leonurus cardiaca L. gali būti vienas iš potencialių antioksidantų šaltinių, nes atlikti tyrimai rodo reikšmingas Leonurus cardiaca L. antioksidacines savybes [27, 45, 53].

orto ir para padėtyse. Kavos r (hidroksilo grupė orto padėtyje) ir protokatechino r (hidroksilo grupė para padėtyje) sąlygoja didesnį aktioksidacinį aktyvumą nei hidroksibenzoinės r. derivatai [17, 43]. Didžiausia DPPH radikalų surišimo geba pasižymi kavos r., toliau aktyvumo mažėjimo tvarka sinapo r., ferulo r., p-kumaro r. [45]. Nustatyta, kad antioksidaciniu poveikiu tarp flavonoidų labiausiai pasižymi flavonai ir katechinai. Karbonilo, hidroksilo grupės, jų padėtis molekulėje, dvigubas ryšys, esantis tarp 2 ir 3 anglies atomo labiausiai nulemia antioksidacinį poveikį flavonoiduose [26].

Leonurus cardiaca L. bei kitų vaistinių augalų antioksidacinis aktyvumas tiriamas, panaudojant

modelines sistemas su įvairiais radikalais. Prie metodų, paremtų antioksidanto vandenilio atomo atidavimu laisvajam radikalui, priskiriami ORAC, fotochemiliuminescencinis, mažo tankio lipoproteinų oksidacijos, β-karotino blukinimo metodai. Prie metodų, paremtų laisvojo radikalo nesuporuoto elektrono prisijungimu prie antioksidanto, priskiriami FRAP, CUPRAC metodai. ABTS, DPPH metodais matuojamas antioksidanto gebėjimas tiek atiduoti savo vandenilio tomą, tiek prisijungti laisvą elektroną. DPPH radikalų surišimo metodas, kuris dėl savo stabilumo, greitumo, paprastos analizės, kuriai atlikti užtenka UV-Vis spektrofotometro, yra plačiai taikomas metodas antioksidantų analizėje. Išvystyta daug DPPH metodikų, tačiau, naujausiais duomenimis, tirpinant DPPH radikalus buferiuotuose organiniuose tirpikliuose bei vandeniniuose tirpaluose, panaudojant miceles, surfaktantus, gaunama didesnė DPPH radikalų surišimo geba, tikslesni tyrimų rezultatai [17, 45, 48, 54].

1.8 Fenolinių junginių ir eterinių aliejų nustatymo metodai

Vieni iš svarbiausių mokslininkų uždavinių – naujų molekulių kūrimas bei junginių identifikavimas biologinėse struktūrose. Analizės metodas pasirenkamas, atsižvelgiant į jo jautrumą, atrankumą, efektyvumą. Fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui taikoma chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, o apjungus šiuos metodus su masių spektrometrija galima įvertinti identifikuotų junginių struktūrą, tai labai padidina tyrimų efektyvumą ir informatyvumą. Spektrofotometrijos metodu galima kiekybiškai įvertinti fenolinius junginius augaluose ar kitose žaliavose [14, 25, 49]. Eterinių aliejų kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui rutininėje praktikoje taikoma dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, masių spektrometrija, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija. Sujungus dujų chromatografiją su masių spektrometrija ar branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija, padidėja metodo jautrumas, efektyvumas, galima identifikuoti net labai mažus junginių kiekius, dėl šių priežasčių šie metodai analizėje taikomi dažniausiai [56].

Chromatografija. Dažniausiai taikomos: dujų, skysčių ir plonasluoksnė chromatografija. Dujų chromatografija pagrįsta skirtingų dujų ar garų mišinio sudedamųjų dalių adsorbcija pasirinkto adsorbento paviršiuje. Judančioji fazė – dujos (azotas, helis, argonas, rečiau vandenilis, anglies dioksidas) [6]. Dujų chromatografija taikoma tiriant tik lakius, aukštoje temperatūroje neskylančius junginius. Šiuo metodu dažniausiai nustatomi eteriniai aliejai. Dujų chromatografijoje dažniausiai naudojami šie detektoriai: masių spektrometrinis, liepsnos jonizacinis, elektronų gaudyklės, infraraudonasis, šiluminio laidumo [19, 49]. Pastaruoju metu daugėja tyrimų, kuriuose naudojama dujų chromatografija–masių spektrometrija. Chromatografinėje kolonėlėje tiriamas bandinys išskirstomas į atskirus junginius. Išskirstyti junginiai masių spektrometre esančiame vakuume jonizuojami, defragmentuojami ir rūšiuojami pagal masės ir krūvio santykį. Junginiai identifikuojami, lyginant gautus spektrus su kompiuterinėje duomenų bazėje esančiais duomenimis [5, 38].

Spektrofotometrija. Kadangi fenolinių junginių struktūroje yra nors vienas aromatinis žiedas, tai jie gali absorbuoti UV šviesą, dėl to spektrofotometrijos metodu galima įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.

2. TYRIMO METODIKA

2.1 Tyrimų objektas

Paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) antžeminė dalis, rinkta 4 skirtingose augavietėse, žydėjimo metu.

Bandinių rinkimo vietos, koordinatės žemėlapyje, data:

1. Survilų k., Raseinių r. (55.2408455,23.4790266). Rinkta 2013-07-06. 2. Gyvolių k., Mažeikių r. (56.2221727,22.5593094). Rinkta 2013-07-04. 3. VDU Botanikos sodas, Kaunas (54.870453,23.908354). Rinkta 2013-07-10. 4. Vencloviškių k., Jurbarko r. (55.115648, 23.039222). Rinkta 2013-07-01.

5. Komercinis bandinys – UAB „Švenčionių vaistažolės“ paprastųjų sukatžolių (Leonurus

cardiaca L.) vaistinė arbata. Pirkta 2014-01-07. Serijos numeris – L271309, galioja iki

2016-09.

Augalinė žaliava buvo džiovinta gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinta augalinė žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25oC temperatūroje, sausoje, gerai vėdinamoje vietoje.

2.2 Reagentai

Acetonitrilas (99,9 %, Roth, Vokietija)

Metanolis (≥99,9 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Rutinas (≥95 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija) Aliuminio chloridas (≥98 %, bevandenis, Roth, Vokietija) Natrio acetato trihidratas (≥99,9 %, CHEMPUR, Lenkija) Natrio karbonatas (bevandenis, CHEMPUR, Lenkija)

Folin-Ciocalteu reagentas (Merck, Vokietija)

DPPH reagentas (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, ALDRICH, Vokietija) Trifluoracto rūgštis (>99 %, Merck, Vokietija)

Galo rūgštis (>99 %, Fluka, Lenkija)

Chlorogeno rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Vanilo rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Kavos rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, JAV) Siringo rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, JAV)

Trans-p-kumaro rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Ferulo rūgštis (>99 %, Fluka, Vokietija)

Trans-sinapo rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Katechinas (>96 %, Fluka, Lenkija)

Hiperozidas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Naringeninas (~95 %, Fluka, Lenkija)

Kvercetino dihidratas (98 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Luteolinas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

2.3 Aparatūra

Bandinio ekstrakcija atlikta orbitalinėje purtyklėje VWR Mini Shaker (J&M Scientific, JAV). Eterinio aliejaus komponentai nustatyti GCMS-QP2010 dujų chromatografu su masių spektrometru (Shimadzu, Japonija). Naudotas automatinis injektorius AOC-5000 (Shimadzu, Japonija), valdantis kietafazės mikroekstrakcijos švirkštą su Stableflex pluošteliu, padengtu 50/30 µm DVB/CAR/PDMS sluoksniu (Supelco, JAV); elektronų jonizacijos detektorius prie 70 eV; kolonėlė RTX–5MS (Restek, JAV), kurios ilgis 30 m, diametras 0,25 mm, nejudančios fazės storis 0,25 µm.

Bendras fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis, antioksidacinis aktyvumas nustatyti spektrofotometru Milton Roy Spectronic 1201 (JAV). Naudotos 1 cm skersmens kvarcinės kiuvetės.

detektoriaus λ= 254 nm (4), DPPH reagento siurblio (5), DPPH reakcijos detektoriaus λ=517 nm (6) ir duomenų registravimo sistemos (7).

3 pav. Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija principinė schema

2.4 Tyrimų schema

4 pav. pateikta schema atspinti analizuotus objektus ir taikytus instrumentinės analizės metodus.

4 pav. Tyrimų schema

2.5 Tyrimų metodai

2.5.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas

Nuodžiūvio vertinimas. Nuodžiūvis vertintas pagal Europos farmakopėjoje (Ph. Eur. 2.2.32) nurodytą metodiką. Atsveriamas 1 g susmulkintos (mažiausiai 95 % 1400 µm dydžio dalelių pagal Ph. Eur 2.9.12) žaliavos, džiovinama 105°C temperatūroje 2val. Atlikus analizę nuodžiūvis atitiko ribas, t.y. buvo <12 % [23].

Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,5 g (0,001 g tikslumu) orasausės susmulkintos (mažiausiai 95 % 1400 µm dydžio dalelių pagal Ph. Eur 2.9.12) [23] paprastųjų sukatžolių Leonurus cardiaca L. antžeminės dalies (žolės), lapų ir stiebų. Ekstrakcija buvo vykdoma su 20 ml 75 % metanoliu orbitalinėje purtyklėje, leidžiant purtytis 200 k/min greičiu 24 valandas. Gauti ekstraktai buvo filtruojami per 0,2 µm porų dydžio filtravimo popierių.

2.5.2 Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu

Eterinio aliejaus komponentų nustatymui pasirinkta kietafazė mikroekstrakcija, nes šis metodas yra efektyvesnis, tikslesnis nei superkritinių skysčių ekstrakcija, taip pat nereikia naudoti papildomų reagentų.

Analizės metu atliekama viršerdvės kietafazė mikroekstrakcija. Ekstrakcijai atsveriama 100 mg orasausės vaistinės augalinės žaliavos, kuri patalpinama į stiklinį buteliuką su kamščiu, turinčiu ertmę adatai įleisti. Adatos paviršiuje vyksta eterinio aliejaus komponentų, išsiskyrusių iš vaistinės augalinės žaliavos, absorbcija. Eterinio aliejaus išsiskyrimui bandiniai termostatuojami 50oC temperatūroje 10 min. Terminė desorbcija atliekama prie 280oC 1 min.

2.5.3 Spektrofotometriniai metodai

Bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu, nustatomas Folin-Ciocalteu metodu.

Pirmiausia paruošiamas 20% natrio karbonato tirpalas. 35,08 g natrio karbonato ištirpinama 1052,4 ml dibistiliuoto vandens, pagamintas tirpalas laikomas 2oC temperatūroje. Analizei imama 3000 µl 20% natrio karbonato tirpalo, pilama 100 µl vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, sumaišoma ir įpilama 100 µl Folin-Ciocalteu (2N) reagento. Laikoma 30 min. kambario temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 760 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus. Esant didesnei vaistinės augalinės žaliavos absorbcijai nei etaloninių rutino tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai – skiedžiami.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 3000 µl 20% natrio karbonato tirpalo ir 100 µl 75% metanolio. Sumaišoma ir įpilama 100 µl Folin-Ciocalteu (2N) reagento. Laikoma 30 min. kambario temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 760 nm bangos ilgio.

Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami palyginamasis ir tiriamieji skirtingų koncentracijų (0,01– 1,0 mg/ml) rutino tirpalai. Pradinės koncentracijos rutino tirpalas ruošiamas 25 mg rutino tirpinant 25 ml 75 % metanolio. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5–7 skirtingų tirpalo koncentracijų.

Gauti duomenys įvertinti pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y =1,4717x; R2 = 0,9960.

y = absorbcijos dydis;

x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.

5 pav. Rutino kalibracinis grafikas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti

Bendras flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu, nustatomas AlCl3 kolorimetriniu

metodu.

Pirmiausia paruošiamas reagentas iš 60 ml 100% metanolio, 3 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 12 ml 5% heksametilentetramino tirpalo, 9 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo ir 60 ml dibistiliuoto vandens. Pagamintas reagentas laikomas 2oC temperatūroje. Analizei imama 1920 µl paruošto reagento, pilama 80 µl vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, sumaišoma ir 30 min. laikoma 2oC temperatūroje. Po to matuojama absorbcija prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 1920 µl paruošto reagento ir 80 µl 75 % metanolio. Sumaišoma ir laikoma 30 min 2oC temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus.

Tomiomis pačiomis sąlygomis ruošiami skirtingų koncentracijų (0,01–1,0 mg/ml) rutino tiriamieji ir palyginamasis tirpalai. Pradinės koncentracijos rutino tirpalas ruošiamas 25 mg rutino tirpinant 25 ml 75% metanolio. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5–7 skirtingų rutino tirpalo koncentracijų.

Gauti duomenys įvertinti pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 0,8836x; R2 = 0,9990.

y = absorbcijos dydis;

x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE mg/ml.

6 pav. Rutino kalibracinis grafikas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti

Antioksidacinis aktyvumas nustatomas panaudojant DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidrato) radikalų surišimo metodą.

Pirmiausia paruošiami reagentai, reikalingi analizei atlikti:

1. 5,5 pH 100 mM buferis. 3,402g natrio acetato ištirpinama 250 ml dibistiliuoto vandens; 5,5 pH gaunamas, naudojant 33 % acto rūgštį.

2. Pradinis DPPH tirpalas. 10 mg DPPH radikalų ištirpinama 125 ml acetonitrilo ir įpilama 125 ml metanolio. Pagamintas tirpalas laikomas tamsoje.

3. Pradinis DPPH tirpalas sumaišomas su buferiu ir spektrofotometru matuojama absorbcija prie 515 nm bangos ilgio. Absorbcijos dydis turi būti 0,500, norint jį sureguliuoti naudojamas buferio: acetonitrilo: metanolio tirpalas santykiu 1: 1,25: 1,25.

Analizei imama 3000 µl DPPH tirpalo, pilama 77 µl vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, sumaišoma ir laikoma 15 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Po to matuojama absorbcija prie 515 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus. Esat per didelei absorbcijai, t.y., kai ekstrakto absorbcijos dydis yra didesnis nei etaloninių rutino tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai – skiedžiami.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 3000 µl DPPH tirpalo įpilant 77 µl 75% metanolio. Sumaišoma ir laikoma 15 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Absorbcija matuojama prie 515 nm bangos ilgio.

Nukalibravimui naudojamas 75% metanolis. DPPH radikalų surišimo absorbcija apskaičiuojama iš palyginamojo tirpalo absorbcijos dydžio atėmus vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto absorbcijos dydį.

Tomiomis pačiomis sąlygomis ruošiami skirtingų koncentracijų (0,05–0,25 mg/ml) rutino tiriamieji ir palyginamasis tirpalai. Pradinės koncentracijos rutino tirpalas ruošiamas 25 mg rutino tirpinant 25 ml 75% metanolio.

Gauti duomenys įvertinti pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 1,4999x; R2 = 0,9982.

y = absorbcijos dydis;

7 pav. Rutino kalibracinis grafikas antioksidaciniam aktyvumui nustatyti

2.5.4 Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakijos detekcija

metodas

Principinė efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH radikalų surišimo reakcija schema pateikta 3 pav.

Analizės sąlygos:

 Tirpikliai: A – vanduo, parūgštintas trifluoracto rūgštimi (0,05 %), B – metanolis;  Gradientas: 0 min – 90 % A ir 10 % B, 30–33 min – 5 % A ir 95 % B, 37 min –

90 % A ir 10 % B, 48 min – 90 % A ir 10 % B, 58 min – 90 % A ir 10 % B;  Injekcija 10 µl;

 Tėkmės greitis: 0,75 ml/min;  Detekcija: λ= 254 nm, λ=517 nm;

 DPPH reagentas ruošiamas taip pat, kaip 2.5.3 skyriuje pateiktas DPPH reagento ruošimas spektrofometriniam antioksidaciniam aktyvumui įvertinti.

Gauti duomenys vertinti pagal identifikuotų fenolinių junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtis. Antioksidacinis aktyvumas vertintas pagal rutino DPPH radikalų surišimo reakcijos kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį. Visos identifikuotų junginių standartų kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtys ir regresijos koeficientai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Leonurus cardiaca L. identifikuotų fenolinių junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtys ir regresijos koeficientai

Junginio pavadinimas Kalibracinio grafiko tiesinės

regresijos lygtis Regresijos koeficientas R

2

Rutinas y = 12013,61x R² = 0,9987

Rutinas (antioksidacinis aktyvumas) y = 2408,99x R² = 0,9994

Ferulo r. y = 9775,18x R² = 0,9996 Trans-sinapo r. y = 5 460,73x R² = 0,9996 Trans-p-kumaro r. y = 7457,53x R² = 0,9991 Chlorogeno r. y = 5 954,32x R² = 0,9997 Kvercetinas y = 17 131,91x R² = 0,9988 Hiperozidas y = 8 927,96x R² = 0,9870

2.6 Statistinė duomenų analizė

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Eterinio aliejaus komponentų identifikavimas

2 lentelė. Pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai ir jų pasiskirstymas augalinėje Leonurus cardiaca L. antžeminės dalies žaliavoje.

Junginio pavadinimas Survilų k., Raseinių r. Gyvolių k., Mažeikių r. VDU Botanikos sodas Vencloviškių k., Jurbarko r. UAB „Švenčionių vaistažolės“ Germakrenas D + + + + + β-kariofilenas + + + + + α humulenas + + + + Trans-verbenolis + + + + Limonenas + + + + Verbenonas + + + + + α-kamfoleno aldehidas + + + + Biciklogermakrenas + + β-kubebenas + + + + + β-burbonenas + + + + + β-ocimenas + + + β-elemenas + + + Pinokarvonas + + + Transpinokarveolis + + + + + Mirtenalis + + + Linalolis + + + Mentolis + + + Kamparas + Izoborneolis + δ-kardinenas + + Sabinenas + + α-kopaenas + + + +

daug α-humuleno, β-kariofileno, trans-verbenolio, β-kubebeno, limoneno, mažiau – β-burboneno, verbenono, α-kamfoleno aldehido, trans-pinokarveolio, β-elemeno, β-ocimeno. UAB „Švenčionių vaistažolės“ paprastųjų sukatžolių vaistinėje arbatoje neaptikta α-humuleno, trans-verbenolio, tačiau nustatyta kamparo, izoborneolio, eukaliptolio, mentono. Natūraliose augavietėse rinktose žaliavose šių komponentų neidentifikuota.

8 pav. Bendras Leonurus cardiaca L. eterinio aliejaus komponentų smailių plotas skirtingose augavietėse rinktoje žaliavoje (SSN≤ 5%, n=3)

Didžiausiu eterinio aliejaus kiekiu pagal bendrą smailių plotą pasižymėjo Gyvolių k., Mažeikių r. rinkta žaliava, iš viso nustatyti 41 skirtingo sulaikymo laiko junginys, iš kurių 25 identifikuoti. Bendras smailių plotas 27,8 x106. Survilų k., Raseinių r. rinktoje žaliavoje nustatyti 37 junginiai, identifikuoti 23. Bendras smailių plotas 17,8 x106. Vencloviškių k., Jurbarko r. rinktoje žaliavoje nustatyti 35 junginiai, identifikuoti 20, bendras smailių plotas 19,5 x106. UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje nustatyti 43 junginiai, identifikuoti 34, bendras smailių plotas 22,6 x106. Mažiausias eterinio aliejaus komponentų skaičius nustatytas VDU Botanikos sode rinktoje žaliavoje – 26, iš jų – 22 identifikuoti, bendras smailių plotas 11,8 x106. Skirtingą nustatytų ir identifikuotų junginių skaičių lemia identifikuojamo junginio koncentracija augale ir gauto spektro sutapimas su kompiuterinėje duomenų bazėje esančiais duomenimis.

9 pav. Bendras Leonurus cardiaca L. eterinio aliejaus komponentų smailių plotas skirtinguose augalo organuose (SSN≤ 4,4%, n=3)

Eterinio aliejaus komponentų skirtinguose augalo organuose nustatymui ir palyginimui naudota Gyvolių k., Mažeikių r. rinkta žaliava. Nustatyta, kad didžiausias eterinio aliejaus kiekis pagal bendrą smailių plotą yra žolėje (27,8 x106), lapuose šiek tiek mažesnis (26,7 x106), o stiebuose – mažiausias (3,7 x106). Žolėje nustatyti 41, identifikuoti 25 junginiai, lapuose – 31, identifikuoti 23 junginiai, stiebuose – 15, identifikuota 10 junginių.

10 pav. Pagrindinių Leonurus cardiaca L. eterinio aliejaus komponentų pasiskirstymas skirtingose augavietėse rinktoje žaliavoje (SSN≤ 3,9 %, n=3)

27,8 26,7 3,7 0 5 10 15 20 25 30 35 Gyvolių k., Mažeikių r. žolė Gyvolių k., Mažeikių r. lapai Gyvolių k., Mažeikių r. stiebai B en d ra s sm a il ių p lo ta s, x 1 0 6 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 S m ai li ų p lo ta s, x 1 0 6

Išanalizavus visus bandinius, nustatyti 6 vyraujantys komponentai – germakrenas D, α-humulenas, β-kariofilenas, trans-verbenolis, β-kubebenas ir limonenas. Pagrindinis komponentas visose augavietėse rinktose žaliavose – germakrenas D, jo kiekiai didžiausi, lyginant su kitais identifikuotais junginiais. Germakreno D kiekis pagal bendrą smailių plotą analizuotuose bandiniuose svyruoja nuo 2,34 x106 iki 12,64 x106. Didžiausias jo kiekis nustatytas Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje žaliavoje, o mažiausias – UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje. α-humuleno kiekis analizuotuose bandiniuose svyruoja nuo 0,92 x106 iki 2,07 x106, β-kariofileno – nuo 1,19 x106 iki 2,76 x106, limoneno – nuo 0,25 x106 iki 1,07 x106, β-kubebeno – nuo 0,14 x106 iki 1,99 x106, trans-verbenolio – nuo 0,12 x106 iki 2,97 x106. Tikslūs atskirų junginių kiekiai skirtingose augavietėse rinktoje žaliavoje pateikti 1 priede. Survilų k., Raseinių r. rinktoje žaliavoje nustatyti didesni nei kituose bandiniuose α-humuleno, β-kariofileno kiekiai, Vencloviškių k., Jurbarko r. rinkta žaliava yra sukaupusi didesnį nei kiti bandiniai trans-verbenolio kiekį, o limoneno ir β-kubebeno daugiausia nustatyta Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje žaliavoje. UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje visai neidentifikuota α-humuleno, o Survilų k., Raseinių r. rinktoje žaliavoje – limoneno.

Atlikus eterinio aliejaus komponentų analizę, pastebėta, kad UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje vyraujančių komponentų kiekis mažesnis nei kituose bandiniuose, nors bendras smailių plotas didesnis. Taip yra dėl to, kad UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje nustatytos didesnės nei 5% pagal bendrą smailių plotą kamparo, izoborneolio, mentono, karvono, α-terpinilacetato koncentracijos, o kituose bandiniuose šių junginių nebuvo identifikuota.

Gautus rezultatus patvirtina ir D. Mockutės ir kt. (2005 ir 2006) atlikti tyrimai. Šiuose tyrimuose buvo analizuoti hidrodistiliacijos būdu gauti Leonurus cardiaca L. eteriniai aliejai. Nustatyta, kad vyraujantys komponentai yra seskviterpenai, iš kurių pagrindiniai germakrenas D, α-humulenas, β-kariofilenas [7, 8]. K. Morteza-Semnani ir kt. (2008) atlikti hidrodistiliacijos būdu gauto Leonurus

cardiaca L. eterinio aliejaus tyrimai parodė kitokius rezultatus. Didžiausia koncentracija nustatyta

11 pav. Pagrindinių Leonurus cardiaca L. eterinio aliejaus komponentų pasiskirstymas skirtinguose augalo organuose (SSN≤ 4,3%, n=3)

Eterinio aliejaus komponentų identifikavimui ir palyginimui tarp skirtingų augalo organų naudota Gyvolių k., Mažeikių r. rinkta žaliava. Nustatytas vyraujantis komponentas žolėje ir lapuose – germakrenas D, lapuose jo koncentracija 51,29 % (13,68 x106 bendro smailių ploto), žolėje – 45,49 % (12,64 x106 bendro smailių ploto). Stiebuose vyraujantis komponentas – β-kubebenas, jo koncentracija 41,06 % (1,50 x106 bendro smailių ploto), o germakreno D visai neidentifikuota. Lapuose yra daugiau α-humuleno, β-kariofileno ir limoneno negu žolėje, tačiau žolėje nustatyta didesnė trans-verbenolio ir β-kubebeno koncentracija negu lapuose. Stiebuose be β-kubebeno nustatyta ir nedidelė 0,12 x106 limoneno koncentracija. Kitų junginių stiebuose nenustatyta arba dėl per mažos koncentracijos kompiuterinės sistemos neturi galimybės jų identifikuoti.

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 2,49 12,64 1,68 _2,09 1,07 1,99 0,76 13,68 1,80 2,31 1,26 1,37 0,12 1,50 S m ai li ų p lo ta s, x 1 0 6

12 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktų Leonurus cardiaca L. žaliavų chromatograma. Žalia spalva – lapai, mėlyna – stiebai, raudona – žolė. 1 – limonenas, 2 – trans-verbenolis, 3 – β-kubebenas,

4 - β-kariofilenas, 5 – α-humulenas, 6 – germakrenas D

12 pav. pateikta Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos žaliavos (žolės, lapų, stiebų) chromatograma atspindi 11 pav. pateiktą diagramą. Šeštu numeriu pažymėta smailė (germakrenas D) lapuose ir žolėje yra ženkliai didesnė negu kitos, tai tik įrodo, kad germakrenas D yra dominuojantis junginys. Kaip ir buvo minėta prieš tai – stiebuose dominuoja β-kubebenas, o germakreno D nenustatyta.

3.2 Spektrofotometrinės analizės rezultatai

Spektrofotometrijos metodu metanoliniuose paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) ekstraktuose buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas, panaudojant DPPH radikalus. Antioksidacinis aktyvumas, kaip ir bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu (RE) mg/g orasausės žaliavos. RE mg/g parodo, koks junginių kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu, gali neutralizuoti DPPH radikalus ir taip sukelti antioksidacinį poveikį.

13 pav. Bendras Leonurus cardiacaL. fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas skirtingose augavietėse rinktoje Leonurus cardiaca L. žaliavoje (SSN< 3%)

Atlikus spektrofotometrinę analizę, didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Vencloviškių k., Jurbarko r. rinktoje žaliavoje (61,98 RE mg/g), mažiausias – Survilų k., Raseinių r. rinktoje žaliavoje ir UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje, atitinkamai po 42,91 RE mg/g ir 34,17 RE mg/g. Bendras flavonoidų kiekis didžiausias Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje žaliavoje (17,01 RE mg/g), kituose regionuose rinktose žaliavose kiek mažesnis (nuo 10,5 RE mg/g iki 16,82 RE mg/g), o UAB „Švenčionių vaistažolės“vaistinėje arbatoje – mažiausias (5,15 RE mg/g).

Atlikus antioksidacinio aktyvumo analizę, panaudojant DPPH radikalus, nustatyta, kad Vencloviškių k., Jurbarko r. rinktos žaliavos antioksidacinis aktyvumas didžiausias (51,63 RE mg/g), kituose bandiniuose jis svyruoja nuo 31,00 RE mg/g iki 49,39 RE mg/g. Antioksidacinis aktyvumas yra statistiškai priklausomas nuo bendro fenolinių junginių kiekio. Nustatyta stipri koreliacija tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo (koreliacijos koeficientas 0,973) bei stipri koreliacija tarp bendro flavonoidų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo (koreliacijos koeficientas 0,939). S. Jafari ir kt. (2010) taip pat nustatė stiprią koreliaciją (0,969) tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo (antioksidacinis aktyvumas taip pat nustatytas naudojant DPPH radikalus), tačiau silpną koreliaciją (0,349) tarp bendro flavonoidų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo [27]. Rezultatų skirtumus galėjo įtakoti tyrimams taikytos skirtingos metodikos ir rezultatų reiškimo būdai.

Reikšmingą Leonurus cardiaca L. antioksidacinį aktyvumą patvirtina ir A. Matkowski ir kt. (2006) atliktas spektrofotometrinis antioksidacinio aktyvumo, panaudojant DPPH radikalus, tyrimas. Nustatyta, kad metanolinis Leonurus cardiaca L. ekstraktas (naudojant 2 µg/ml kocentracijos ekstraktus)

pasižymėjo didesniu antioksidaciniu aktyvumu nei kiti analizuoti augalai (baltažiedė notrelė (Lamium

album), raudonžiedė notrelė (Lamium purpureum), paprastoji šantra (Marrubium vulgare), vaistinė notra (Stachys officinalis), geltonžiedė aklė (Galeopsis speciosa)), nes jau po 1 min surišo 80 % DPPH radikalų

ir surišimui reikėjo mažiausios ekstrakto koncentracijos iš visų analizuotų augalų [37]. J. Bernatonienė ir kt. (2009) ištyrė dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.), paprastosios sukatžolės (Leonurus cardiaca

L). ir vienapiestės gudobelės (Crataegus monogyna Jacq.) ekstraktus ir nustatė, kad didžiausiu

antioksidaciniu aktyvumu, panaudojant DPPH radikalus, pasižymi Leonurus cardiaca L. ekstraktas (surišo 84,89±0,18% DPPH radikalų) [1]. Tokius rezultatus patvirtina ir R. Masteikova ir kt. (2008) atlikti antioksidacinio aktyvumo tyrimai, kur nustatyta, kad Leonurus cardiaca L. tinktūra pasižymi didesniu DPPH radikalų surišimu nei Crataegus monogyna Jacq. tinktūra [36]. Aptartų ir šio tyrimo tikslius rezultatus lyginti nėra korektiška, nes aptartuose tyrimuose buvo naudotos skirtingos metodikos bei rezultatų reiškimo būdai, tačiau galima teigti, kad Leonurus cardiaca L. sukeliamas antioksidacinis aktyvumas yra reikšmingai didesnis negu kitų plačiai naudojamų vaistinių augalų.

14 pav. Bendras Leonurus cardiaca L. fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas skirtinguose augalo organuose (SSN< 3%)

Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas lapuose (71,69 RE mg/g), žolėje kiek mažesnis (61,92 RE mg/g), o stiebuose – mažiausias (20,42 RE mg/g). Bendras flavonoidų kiekis svyruoja taip pat: didžiausias jų kiekis nustatytas lapuose (22,21 RE mg/g), žolėje kiek mažesnis (17,01 RE mg/g), o stiebuose – mažiausias (4,41 RE mg/g). Kadangi lapuose buvo nustatytas didžiausias bendras fenolinių junginių ir bendras flavonoidų kiekis, tai ekstrakto, gauto iš lapų, antioksidacinis aktyvumas taip pat

didžiausias (67,71 RE mg/g), nes kai minėta aptariant 13 pav., antioksidacinis aktyvumas yra statistiškai priklausomas nuo bendro fenolinių junginių ir bendro flavonoidų kiekio. Antžeminė augalo dalis (žolė) pasižymi kiek mažesniu (49,39 RE mg/g), o stiebai – mažiausiu (12,79 RE mg/g) antioksidaciniu aktyvumu.

3.3 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės rezultatai

Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija metodu buvo ištirti metanoliniai Leonurus cardiaca L., rinktų skirtingose augavietėse, ekstraktai. Šis analizės metodas dažnai taikomas tiriant ir kitus augalus, nes vienos analizės metu galima ne tik identifikuoti junginius, bet ir nustatyti, kuris junginys ir kokio stiprumo antioksidacinį aktyvumą sąlygoja. Kokybinis fenolinių junginių identifikavimas pagrįstas standarto sulaikymo laiko atitikimu su analitės sulaikymo laiku. Etalonais buvo pasirinkta 14 vaistiniuose augaluose dominuojančių junginių. Standartų tyrimo rezultatai pateikti 3 lentelėje.

15 pav. Skirtingose augavietėse rinktoje Leonurus cardiaca L. antžeminėje dalyje (žolėje) identifikuotų fenolinių junginių kiekiai (SSN≤ 4,2 %, n=3)

Atlikus efektyviosios skysčių chromatografijos analizę buvo identifikuoti 7 junginiai: chlorogeno r., trans-p-kumaro r., ferulo r., trans-sinapo r., rutinas, hiperozidas ir kvercetinas. Kiekvieno identifikuoto junginio kiekis buvo nustatytas pagal to junginio standarto kalibracinį grafiką. Kalibraciniam grafikui sudaryti buvo naudoti 5 skirtingų koncentracijų (0,015–1 mg/ml) tirpalai. Kaip ir Leonurus

cardiaca L. ekstraktai, jie buvo analizuojami tokiomis pačiomis sąlygomis. Sąlygos nurodytos 2.3

skyriuje.

15 pav. matyti, kad dominuojantys junginiai yra rutinas, trans-sinapo r. ir ferulo r. Trans-sinapo r.

Leonurus cardiaca L. žaliavoje buvo identifikuota pirmą kartą, nes, apžvelgus anksčiau atliktus tyrimus,

tokių duomenų nepastebėta. Atlikus analizę kelis kartus, duomenys atsikartoja, tačiau, norint pagrįsti trans-sinapo r. buvimą, reikalinga atlikti papildomus, struktūros identifikavimo, tyrimus. Gyvolių k., Mažeikių r. ir Vencloviškių k., Jurbarko r. rinktose žaliavose didžiausią fenolinių junginių kiekį sudaro rutinas (atitinkamai 6,06 mg/g ir 6,79 mg/g orasausės žaliavos). R. Masteikova ir kt. (2008) taip pat nustatė, kad didžiausią flavonoidų kiekį Leonurus cardiaca L. žaliavoje sudaro rutinas [36]. Survilų k., Raseinių r. ir VDU Botanikos sode rinktose žaliavose didžiausią fenolinių junginių kiekį sudaro trans-sinapo r., atitinkamai 1,33 mg/g, 6,18 mg/g, o UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje – ferulo r. (2,77 mg/g). Didesni ferulo r. kiekiai nustatyti ir kituose bandiniuose (svyruoja nuo 1,26 mg/g iki 4,28 mg/g). Trans-p-kumaro r. kiekis svyruoja nuo 0,7 mg/g iki 4,34 mg/g, chlorogeno r. nuo 0,42 mg/g iki

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Chlorogeno r. Trans-p-kumaro r.

Ferulo r. Trans- sinapo r. Rutinas hiperozidas Kvercetinas

K ie k is , m g /g

2,09 mg/g. Hiperozido ir kvercetino nustatyti tik nedideli kiekiai. Daugiausia hiperozido nustatyta Vencloviškių k., Jurbarko r. rinktoje žaliavoje (0,76 mg/g), kvercetino – Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje žaliavoje (0,13 mg/g). Survilų k., Raseinių r. ir UAB „Švenčionių vaistažolės“ vaistinėje arbatoje neaptikta nei hiperozido, nei kvercetino. Be to, atlikus analizę buvo gauta keletas didesnių smailių, tačiau jos nebuvo identifikuotos. Tikslūs visų identifikuotų fenolinių junginių kiekiai pateikti 2 priede. J. Bernatonienė ir kt. (2009) efektyviosios skysčių chromatografijos metodu taip pat identifikavo Leonurus

cardiaca L. žaliavoje rutiną (52 µg/ml), chlorogeno r. (46 µg/ml), hiperozidą (8 µg/ml), kvercetiną

(8 µg/ml). Be to, identifikavo ir ursolo r., mažesnius kiekius viteksino (17 µg/ml), izoviteksino (17 µg/ml), astragalino(1 µg/ml) ir luteolino (1 µg/ml) [1]. O. R. Pereira (2013) atlikti tyrimai priešingi prieš tai aptartiems. O. R. Pereira HPLC-DAD metodu nustatė, kad didžiausią fenolinių junginių dalį (apie 70 %) sudaro feniletanoidiniai glikozidai (lavandulifoliosidas, verbaskozidas, leukoseptozidas A) taip pat nustatytas rutinas, kvercetino-3-o-glikozidas, kavos rūgšties glikozidas, tačiau jų kiekiai ženkliai mažesni negu feniletanoidinių glikozidų. Skirtumus galima pagrįsti tuo, kad analizei buvo naudotas išgrynintas

Leonurus cardiaca L. ekstraktas, taikytos kitos analizės sąlygos ir naudoti skirtingi standartai [46].

16 pav. Skirtingose augavietėse rinktoje Leonurus cardiaca L. antžeminėje dalyje (žolėje) identifikuotų fenolinių junginių antioksidaciniai aktyvumai (SSN≤ 5,6%, n=3)

Kiekvieno fenolinio junginio antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas pagal rutino antioksidacinio aktyvumo kalibracinį grafiką, sudarytą iš 5 skirtingų koncentracijų (0,015–1 mg/ml) taškų. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi trans-sinapo r. (skirtingose augavietėse rinktoje žaliavoje

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00

Chlorogeno r. Trans-p-kumaro r. Ferulo r. Trans- sinapo r. Rutinas hiperozidas Kvercetinas

A n ti o k si d ac in is a k ty v u m as , R E m g /g

svyruoja nuo 3,84 RE mg/g iki 21,31 RE mg/g). Trans-sinapo r. yra vienas iš dominuojančių junginių pagal kiekį žaliavoje, todėl ir antioksidacinis aktyvumas jos didžiausias. Tačiau priešingai yra su rutinu, nors rutino ir trans-sinapo r. kiekiai yra panašūs, tačiau rutino antioksidacinis aktyvumas skirtingose augavietėse rinktoje žaliavoje (0,31 RE mg/g – 5,53 RE mg/g) ženkliai mažesnis negu trans-sinapo r. (3,84 RE mg/g – 21,31 RE mg/g). Stipriu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi ferulo r. (5,48 RE mg/g – 12,69 RE mg/g), kiek mažesniu – trans-p-kumaro r. (0,84 RE mg/g – 8,76 RE mg/g) ir chlorogeno r. (0,9 RE mg/g – 2,02 RE mg/g). Kadangi hiperozido ir kvercetino buvo nustatyti tik nedideli kiekiai, tai jų sąlygojamas antioksidacinis aktyvumas taip pat mažas. Bandiniai, kuriuose buvo nustatytas didesnis fenolinių junginių kiekis, pasižymėjo ir didesniu antioksidaciniu aktyvumu (Gyvolių k., Mažeikių r., Vencloviškių k., Jurbarko r., VDU Botanikos sode rinktos žaliavos). Tikslūs visų identifikuotų fenolinių junginių antioksidaciniai aktyvumai pateikti 2 priede.

17 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos Leonurus cardiaca L. žaliavos (žolės) ekstrakto chromatograma. 4 - chlorogeno r., 5 – trans-p-kumaro r., 6 – ferulo r., 7 – trans-sinapo r., 9 – rutinas, 10 –hiperozidas,

11 – kvercetinas, 1, 2, 3, 8 – neidentifikuoti junginiai

18 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje Leonurus cardiaca L.žaliavoje (žolėje) identifikuotų fenolinių rūgščių, flavonoidų kiekiai ir antioksidacinis aktyvumas. Mėlyna spalva – junginio kiekis mg/g,

raudona - antioksidacinis aktyvumas RE mg/g

18 pav. atspindi Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos žaliavos (žolės) fenolinių junginių kiekius ir jų sąlygojamą antioksidacinį aktyvumą. Kaip buvo minėta aptariant 16 pav. ir 17 pav., 18 pav. vyrauja tokia pati tendencija: nors rutino kiekis (6,06 mg/g) didesnis negu trans-sinapo r. (4,34 mg/g) kiekis, tačiau trans-sinapo r. sąlygoja ženkliai didesnį antioksidacinį aktyvumą (trans-sinapo r. 20,77 RE mg/g, rutino 5,47 RE mg/g). Ties raudona kreive pažymėti skaičiai rodo kiekvieno junginio antioksidacinį aktyvumą. Skaičiuojant atskirų junginių kiekius mg/g, SSN≤ 4,1 %, skaičiuojant antioksidacinį aktyvumą RE mg/g SSN≤ 5,2 %, pakartojimų skaičius – 3.

19 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos Leonurus cardiaca L. žaliavos (lapų) ekstrakto chromatograma. 4 – chlorogeno r., 5 – trans-p-kumaro r., 6 – ferulo r., 7 – trans-sinapo r., 9 – rutinas,

10 – hiperozidas, 1, 2, 3, 8 –neidentifikuoti junginiai

19 pav. pateikta Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos žaliavos (lapų) ekstrakto chromatograma. Pagrindiniai skirtumai tarp žolės ir lapų chromatogramų: lapų ekstrakto chromatogramoje 4 numeriu pažymėta smailė (chlorogeno r.) ženkliai mažesnė; 5 smailė (trans-p-kumaro r.) didesnė; neaptikta kvercetino.

20 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje Leonurus cardiaca L. žaliavoje (lapuose) identifikuotų fenolinių rūgščių, flavonoidų kiekiai ir antioksidacinis aktyvumas. Mėlyna spalva – junginio kiekis

mg/g, raudona – antioksidacinis aktyvumas RE mg/g

21 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos Leonurus cardiaca L.žaliavos (stiebų) ekstrakto chromatograma. 4 – chlorogeno r., 5 – trans-p-kumaro r., 6 – ferulo r., 7 – trans-sinapo r., 9 – rutinas, 10 – kvercetinas,

1, 2, 3, 8 – neidentifikuoti junginiai

21 pav. pateikta Leonurus cardiaca L. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktos žaliavos (stiebų) ekstrakto chromatograma. Stiebuose, kaip ir lapuose bei žolėje, dominuoja rutinas. Trans-sinapo r., ferulo r. ir trans-p-kumaro r. smailės ženkliai mažesnės. Skirtingai nei lapuose, stiebuose nustatytas nedidelis kvercetino kiekis, tačiau neaptikta hiperozido, nors lapuose jo buvo nustatyta. Stiebuose visų smailių plotai mažesni, taigi ir antioksidacinis aktyvumas ženkliai mažesnis negu lapų ar žolės.

22 pav. Gyvolių k., Mažeikių r. rinktoje Leonurus cardiaca L. žaliavoje (stiebuose) identifikuotų fenolinių rūgščių, flavonoidų kiekiai ir antioksidacinis aktyvumas. Mėlyna spalva – junginio kiekis

mg/g, raudona –antioksidacinis aktyvumas RE mg/g

4. IŠVADOS

1. Dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu identifikuoti paprastųjų sukatžolių (Leonurus cardiaca L.) eterinio aliejaus komponentai. Pagrindinis komponentas – germakrenas D, taip pat yra daug α-humuleno, β-kariofileno, trans-verbenolio, β-kubebeno, limoneno. Tiek atskirai lapuose, tiek žolėje vyraujantis komponentas – germakrenas D, stiebuose dominuoja β-kubebenas, o germakreno D visai neidentifikuota.

2. Spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis skirtingose augavietėse rinktoje žaliavoje svyruoja nuo 34, 17 RE mg/g iki 68,01 RE mg/g, bendras flavonoidų kiekis – nuo 10,5 RE mg/g iki 19,25 RE mg/g, antioksidacinis aktyvumas – nuo 31,00 RE mg/g iki 61,28 RE mg/g. Didžiausias šių biologiškai aktyvių junginių kiekis nustatytas lapuose, žolėje kiek mažesnis, o stiebuose – mažiausias. Antioksidacinis aktyvumas yra statistiškai priklausomas nuo bendro fenolinių junginių kiekio (koreliacijos koeficientas 0,973) ir bendro flavonoidų kiekio (koreliacijos koeficientas 0,939).

3. Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metu identifikuoti šie fenoliniai junginiai: trans-sinapo r., trans-p-kumaro r., ferulo r., chlorogeno r., rutinas, kvercetinas ir hiperozidas. Leonurus

cardiaca L. žaliavoje didžiausias kiekis nustatytas rutino, o stipriausią antioksidacinį aktyvumą sąlygoja