KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Daiva Urbonien÷
VIETINIO IR SISTEMINIO
IMUNINIO ATSAKO YPATUMAI
SERGANT LöTINE OBSTRUKCINE
PLAUČIŲ LIGA IR ASTMA
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2003−2009 metais Kauno medicinos universiteto Pulmo-nologijos ir imuPulmo-nologijos klinikoje.
Mokslinis vadovas
TURINYS
SANTRUMPOS...5
ĮVADAS...7
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI, MOKSLINIS NAUJUMAS...9
2. LITERATŪROS APŽVALGA...12
2.1 LOPL ir astmos samprata...12
2.1.1 Apibr÷žimai ...12
2.1.2 Epidemiologija, ekonominiai aspektai...12
2.1.3 Rizikos veiksniai...13
2.2 LOPL ir astmos patogenez÷ ...16
2.2.1 Vietinis ir sisteminis imuninis atsakas...16
2.2.2 Limfocitų potipiai ...20
2.2.3 C reaktyvusis baltymas ...27
2.2.4 Antikūnai prieš branduolio antigenus ...29
3. TYRIMO METODIKA...32
3.1 Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga ...32
3.1.1 Bendrieji tiriamųjų atrankos kriterijai...32
3.1.2 L÷tine obstrukcine plaučių liga sergančiųjų atrankos kriterijai...33
3.1.3 Astma sergančiųjų atrankos kriterijai ...33
3.1.4 Kontrolin÷s grup÷s asmenų atrankos kriterijai ...34
3.1.5 Tyrimo dizainas ...34
3.2 Tyrimo metodai...35
3.2.1 Plaučių funkcijos tyrimai ...35
3.2.2 Skreplių indukcijos metodika ...36
3.2.3 Fibrobronchoskopijos ir bronchoalveolinio lavažo metodika ...36
3.2.4 Limfocitų potipių tyrimas ...37
3.2.4.1 Indukuotų skreplių limfocitų potipių tyrimas ...37
3.2.4.2 Bronchoalveolinio lavažo skysčio limfocitų potipių tyrimas ...42
3.2.4.3 Periferinio kraujo limfocitų potipių tyrimas ...43
3.2.5 C reaktyviojo baltymo koncentracijos tyrimas ...44
3.2.6 Antikūnų prieš branduolio antigenus serume tyrimas ...45
4. REZULTATAI... 49
4.1 I tyrimo dalis. Limfocitų potipių tyrimas ... 49
4.1.1 Demografiniai duomenys... 49
4.1.2 Limfocitų potipių tyrimo rezultatai... 50
4.2 II tyrimo dalis. C reaktyviojo baltymo ir antikūnų prieš branduolio antigenus tyrimas ... 67
4.2.1 Demografiniai duomenys... 67
4.2.2 C reaktyviojo baltymo tyrimo rezultatai ... 68
4.2.3 Antikūnų prieš branduolio antigenus tyrimo rezultatai ... 73
5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 77
5.1 Vietinio ir sisteminio ląstelinio imuninio atsako ypatumai... 77
5.2 Sisteminių humoralinių imuninio atsako mechanizmų ypatumai .. 83
IŠVADOS ... 89
DARBO PRAKTINö REIKŠMö ... 90
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS... 91
SANTRUMPOS
AAT-1 − alfa-1 antitripsinas
ANA − (angl. antinuclear antibodies) − antikūnai prieš branduolio antigenus
BAL − bronchoalveolinis lavažas b.d. − būtinojo dydžio
°C − Celsijaus laipsnis
CD − (angl. cluster of differentiation) − diferenciacijos grup÷ CRB − C reaktyvusis baltymas
DTT − (angl. dithiothreitol) − ditiotreitolas
ERS − (angl. European Respiratory Society) − Europos respiratolo-gų sąjunga
FBS − fibrobronchoskopija
FEV1 − (angl. forced expiratory volume in 1 sec.) − forsuoto iškv÷-pimo tūris per pirmąją sekundę
FITC − (angl. fluorescein isothiocyanate) − fluoresceino izotiocianatas
FVC − (angl. forced vital capacity) − forsuota gyvybin÷ plaučių talpa
g − (angl. relative centrifuge force expressed in units of gravity) − išcentrin÷ j÷ga
GINA − (angl. Global Initiative for Asthma) − Pasaulin÷ astmos iniciatyva
GOLD − (angl. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung
Disea-se) − Pasaulin÷ l÷tin÷s obstrukcin÷s plaučių ligos iniciatyva Ig − imunoglobulinas
IL − interleukinas
IS − (angl. induced sputum) − indukuoti skrepliai į/v − į veną
K3EDTA − (angl. ethylene diamine tetra acetic acid tribasic potassium
salt) − tribazis kalio etilen diamin tetra acetatas KMI − kūno mas÷s indeksas
KMU − Kauno medicinos universitetas
KMUK − Kauno medicinos universiteto klinikos LOPL − l÷tin÷ obstrukcin÷ plaučių liga
LSB − lipopolisacharidus sujungiantis baltymas LT − leukotrienas
mAk − (angl. monoclonal antibody) − monokloninis antikūnas NaCl − natrio chloridas
NS − (angl. not significant) − statistiškai nereikšminga NK − (angl. natural killer) − NK ląstel÷s
PBS − (angl. phosphate-buffered saline) − fosfatinio buferio tirpalas PE − (angl. phycoerythrin) − fikoeritrinas
PerCP − (angl. peridinin chlorophyll a protein) − peridino chlorofilo baltymas)
PK − periferinis kraujas proc. − procentas
PŠS − (angl. forvard scatter) − priekin÷ šviesos sklaida SD − (angl. standard deviation) − standartinis nuokrypis
SEM − (angl. standart error mean) − standartin÷ vidurkio paklaida
sTNF-R75
− (angl. soluble tumor necrosis factor receptor 75) − tirpus tumoro nekroz÷s veiksnio transmembraninis receptorius 75 ŠŠS − (angl. side scatter) − šonin÷s šviesos sklaida
TCC − (angl. total cell count) − bendras ląstelių kiekis TCR − (angl. T-cell receptor) − T limfocitų receptorius Th − (angl. T helpers) − T limfocitai pagalbininkai
ĮVADAS
Obstrukcin÷s plaučių ligos – l÷tin÷ obstrukcin÷ plaučių liga (LOPL) ir astma yra vienos dažniausių l÷tinių kv÷pavimo sistemos ligų, keliančių daug visuomen÷s sveikatos problemų: sergančiųjų jomis nuolat daug÷ja, sergamumas ir mirtingumas nuo šių ligų įgauna epidemijos pobūdį [178].
Pasaulin÷s sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, LOPL serga daugiau kaip 500 milijonų gyventojų, o astma – daugiau kaip 300 milijonų gyventojų. Šiuolaikin÷s diagnostikos ir gydymo galimyb÷s neatitinka gydytojų ir pacientų poreikių [59, 66]. Numatant, kad obstrukcin÷s plaučių ligos toliau plis, mirtingumas nuo jų vis did÷s, o tuo pačiu did÷s visuomenei tenkanti socialin÷ ir ekonomin÷ našta, šių ligų moksliniams tyrimams skiriamas išskirtinis d÷mesys. Siekiama patikslinti šių ligų patogenez÷s sampratą, kad būtų galima atrasti ir pritaikyti efektyvesnes gydymo ir profilaktikos priemones.
Ilgą laiką LOPL ir astmos patogenez÷s mechanizmai buvo siejami tik su kv÷pavimo takais, tod÷l buvo analizuojami tik lokaliai vykstantys procesai. Vienu reikšmingiausiu LOPL ir astmos patogenez÷s komponentu yra pripa-žįstamas persistuojantis neinfekcinis uždegimas, kuriame dalyvauja įvairios ląstel÷s [59, 66]. Pastaraisiais metais daug÷jant naujų duomenų, keliamos hipotez÷s, kad sergant LOPL ir astma, l÷tinis neinfekcinis uždegimas neapsiriboja vien tik vietiniais procesais, bet šių ligų metu esama sisteminio pobūdžio elementų [7, 63, 82, 168]. Viena naujausių hipotezių – l÷tinis neinfekcinis uždegimas gali būti palaikomas sisteminio autoimuninio atsako, susijusio tiek su ląstelin÷m, tiek ir su humoralin÷m reakcijom [4, 47, 143, 163], moduliuojamomis rūkymo. Morfologiniai pokyčiai kv÷pavimo takuose, ligų eigos panašumas su sistemin÷mis autoimunin÷mis jungiamojo audinio ligomis, opiniu kolitu ir kt., ryšys su rūkymu [4, 50], tyrimų duomenys, nurodantys sisteminį uždegiminį LOPL ir astmos pobūdį [7, 63, 82, 168], sudaro prielaidas sisteminiam atsakui tirti, autoimuninei šių mechanizmų prigimčiai patvirtinti.
kraujotakoje [41, 84, 86, 112]. Įrodyta γδ T limfocitų potipio svarba sergant infekcin÷mis ligomis, apsaugant audinius nuo įvairių veiksnių žalojančio poveikio, dalyvaujant pažeistų audinių atstatymo procesuose [72, 84, 91]. Manoma, kad γδ T limfocitai gali būti reikšmingi sergant obstrukcin÷mis plaučių ligomis, o ypač LOPL, kurių provokuojantis žalingas veiksnys – rūkymas sutrikdo vietinius kv÷pavimo takų gleivinių apsauginius mechanizmus, pažeidžia kv÷pavimo takus ir plaučių audinį [18, 30, 146, 164, 176].
L÷tinį neinfekcinį uždegimą lemia skirtingi išoriniai (pvz., rūkymas, profesiniai aplinkos veiksniai) ir vidiniai (pvz., imuninio atsako savitumas) veiksniai ir jų deriniai [12, 43, 59, 66, 104]. Vienu svarbiausiu išoriniu žalojančiu veiksniu laikomas rūkymas, bet vienareikšm÷s nuomon÷s d÷l jo poveikio mechanizmų LOPL ir astmos metu iki šiol n÷ra [59, 66, 164, 176]. Plačiai diskutuojama apie rūkymo žalą astma sergantiems asmenims, neigiamą rūkymo poveikį sergančiųjų plaučių funkcijai, sąsajas su ligos eiga [37, 152, 164]. LOPL sergantiesiems, metusiems rūkyti, klinikiniai simptomai ir plaučių funkcija stabilizuojasi [177], o uždegimas kv÷pavimo takuose, priešingai, išlieka ir tęsiasi, net ir metusiems rūkyti sergantiesiems [176]. Manoma, kad panašūs rūkymo įtakoti uždegiminiai pokyčiai gali būti sisteminio pobūdžio, tod÷l, aktualu įvertinti ne tik vietinio, bet ir sisteminio atsako žymenis, atsižvelgiant į rūkymo įpročius ir intensyvumą.
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI, MOKSLINIS
NAUJUMAS
Darbo tikslas:
Įvertinti vietinio bei sisteminio imuninio atsako ypatumus sergant l÷tine obstrukcine plaučių liga ir astma.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti l÷tine obstrukcine plaučių liga ir astma sergančių pacientų indukuotų skreplių, bronchoalveolinio lavažo skysčio ir periferinio kraujo limfocitų populiacijas bei nustatyti galimas jų sąsajas su plaučių funkcijos rodikliais.
2. Įvertinti ir palyginti proksimalinių ir distalinių kv÷pavimo takų bei periferinio kraujo limfocitų populiacijų sud÷ties savybes sergant l÷tine obstrukcine plaučių liga ir astma.
3. Įvertinti kv÷pavimo takų sekreto ir periferinio kraujo limfocitų populiacijų sud÷ties savybes, atsižvelgiant į tiriamųjų rūkymo įpročius.
4. Nustatyti l÷tine obstrukcine plaučių liga ir astma sergančių asmenų C reaktyviojo baltymo koncentracijas plazmoje ir antikūnų prieš branduolio antigenus serume dažnį.
Mokslinis naujumas
Obstrukcin÷s plaučių ligos – LOPL ir astma yra viena aktualiausių visuo-men÷s sveikatos problemų. Skiriamas išskirtinis d÷mesys šių ligų moksliniams tyrimams, kadangi sergamumas šiomis ligomis sparčiai did÷ja visame pasaulyje. Detalesn÷ šių ligų patogenez÷s samprata leistų s÷kmingiau diagnozuoti ir gydyti min÷tas ligas.
Šio tyrimo metu LOPL ir astma buvo vertintos kaip ligos, kurių patogenezei reikšmingas tiek vietinis, tiek ir sisteminis imuninis atsakas. Tuo pačiu šiame darbe pirmą kartą Lietuvoje buvo ištirti ir palyginti LOPL ir astma sergančiųjų kv÷pavimo takų (skirtingų lygių) sekreto ir periferinio kraujo limfocitų potipių kiekiai, atsižvelgiant į rūkymo įpročius, įvertintos sąsajos su plaučių funkcijos rodikliais, rūkymo intensyvumu.
Pasaulin÷je mokslin÷je literatūroje publikuoti pavieniai panašaus pobūdžio darbai, kuriuose buvo tiriama kv÷pavimo takų sekreto limfocitų populiacijos sud÷tis, o darbų, kuriuose būtų tiriamas γδ T limfocitų potipis BAL skystyje ar indukuotuose skrepliuose – tik keli. Šio tyrimo metu sergantiesiems LOPL ir astma limfocitų potipių kiekių skirtumai buvo rasti tiriant kv÷pavimo takų sekretą, bet ne periferinį kraują. Gauti rezultatai rodo, kad limfocitų potipiai yra svarbūs vietiniam imuniniam atsakui: sergant LOPL − γδ T limfocitai ir citotoksiniai T limfocitai (CD8+), o sergant astma – T limfocitai pagalbininkai (CD4+).
Nauja ir reikšminga atlikto tyrimo dalis – γδ T limfocitų tyrimas, kuriuo nustatyta, kad sergant LOPL γδ T limfocitų kiekiai indukuotuose skrepliuose bei BAL skystyje yra mažesni nei sergant astma ar sveikų asmenų. Nustatytos reikšmingos γδ T limfocitų kiekių sąsajos su plaučių funkcijos rodikliais ir rūkymo intensyvumu rodo šių, iki šiol retai tyrin÷tų ir mažai žinomų, ląstelių svarbą LOPL patogenezei.
Šiame darbe nauja yra ir tai, kad tiriant sergančiuosius LOPL ir astma, buvo vertintas sisteminis imuninis atsakas. C reaktyviojo baltymo koncentracijos plazmoje skirtumai, jų sąsajos su plaučių funkcijos rodikliais rodo, kad sergant LOPL, esama l÷tinio sisteminio uždegimo. Sisteminių autoantikūnų (ANA) serume tyrimai parod÷, kad abiejų ligų patogeneziniuose mechanizmuose esama ir autoimuninio komponento.
galimai palaikydamas l÷tinio uždegimo persistavimą. Šie duomenys gali būti panaudojami kaip papildomi argumentai prielaidai, kad rūkymo poveikis imuniniam atsakui išlieka net ir metus rūkyti.
Šiame darbe nauja ir tai, kad vertinant kv÷pavimo takų sekreto limfocitų potipius buvo taikyti tiek invaziniai, tiek ir neinvaziniai tyrimo metodai. Nustatytas reikšmingas ryšys tarp indukuotų skreplių ir BAL skysčio T limfocitų potipių rodo, kad vertinant su T limfocitais susijusį vietinį imuninį atsaką yra tinkamas ir neinvazinis indukuotų skreplių tyrimo metodas, kuris gali būti pritaikomas klinikin÷je praktikoje.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1 LOPL ir astmos samprata 2.1.1 Apibr÷žimaiLOPL ir astma − tai obstrukcin÷s plaučių ligos, kurioms yra būdinga kv÷-pavimo takų obstrukcija, o jų patogenez÷s pagrindą sudaro l÷tinis neinfek-cinis uždegimas.
Šios ligos apibr÷žiamos klinikiniais, fiziologiniais ir patomorfologiniais požymiais, o diagnozuojamos remiantis išsamia pacientų ligos anamneze, fizinio ir plaučių funkcijos tyrimų rezultatais [59, 66].
Astma − tai l÷tin÷ uždegimin÷ kv÷pavimo takų liga, kurios patogenez÷je dalyvauja daug įvairių ląstelių ir jų elementų. L÷tinis uždegimas sąlygoja padid÷jusį kv÷pavimo takų reaktyvumą, kuris veda prie periodiškai pasireiš-kiančio dusulio, krūtin÷s užgulimo, kosulio, pasireišpasireiš-kiančio dažniausiai nakties metu ar anksti ryte. Šie epizodai yra susiję su išplitusia kv÷pavimo takų obstrukcija, dažnai grįžtama savaime ar gydymo pas÷koje [66].
L÷tin÷ obstrukcin÷ plaučių liga yra apibr÷žiama kaip liga, pasireiškianti nevisiškai išnykstančia kv÷pavimo takų obstrukcija, kuri yra progresuo-jančio pobūdžio ir susijusi su pakitusia plaučių uždegimine reakcija į įkvepiamas kenksmingas daleles ar dujas. Tai liga, kurios galima išvengti ir kurią būtina gydyti. Ši liga pasireiškia ir kitų organų ar audinių pažeidimu, galinčiu kai kuriems ligoniams ją pasunkinti [59].
Visgi, nežiūrint į tai, kad LOPL ir astma turi bendrų požymių, pripažįstama, kad šios ligos skiriasi viena nuo kitos klinikine eiga, gydymo taktika, o svarbiausia, etiopatogenez÷s, patomorfologiniais ir patofiziolo-giniais mechanizmais [16].
2.1.2 Epidemiologija, ekonominiai aspektai
Obstrukcinių plaučių ligų paplitimo, sergamumo ir mirtingumo rodiklių vertinimą sunkina skirtingi, neunifikuoti ir nuolat peržiūrimi šių ligų diagnostikos kriterijai [59, 66]. Nors išsamių šių ligų epidemiologijos duomenų n÷ra, turimi tyrimų duomenys rodo, kad šiandienin÷ situacija yra rimta ir turinti tendenciją blog÷ti.
apie 3 proc. gyventojų [109]. Šiuo metu tai ketvirtoji mirtingumo priežastis pasaulyje. Nuo LOPL pasaulyje kasmet miršta apie 3 milijonus, Europoje – apie 300 tūkstančių žmonių [59, 178], Lietuvoje – apie 1 tūkstantį [109]. Prognozuojama, kad 2020 m. ši liga taps trečiąja tarp mirties priežasčių, o pagal sąlygotą invalidumą užims penktąją vietą [59, 178].
Daugiau kaip 300 milijonų pasaulio gyventojų serga astma [31, 66, 178]. Įvairiose šalyse astma serga 1–18 proc. [34], o Lietuvoje – apie 2,5 proc. gyventojų [109]. Mirtingumas, palyginus su LOPL, gerokai mažesnis – nuo astmos pasaulyje kasmet miršta apie 250 tūkstančių žmonių [31, 66, 178]. Tačiau pasaulio mastu d÷l astmos kasmet prarandama beveik 15 milijonų metų būsimojo gyvenimo trukm÷s, įvertinus neįgalumo sunkumą
(Disabi-lity-adjusted life year) [110]. Numatoma, kad 2025 m. sergančiųjų šia liga padaug÷s ir sieks iki 400 milijonų [31, 110, 178].
Blog÷jant epidemiologinei situacijai, did÷ja poreikis l÷šų, šiomis ligomis sergantiems pacientams gydyti ir prižiūr÷ti. Europos Sąjungoje tiesiogin÷s išlaidos kv÷pavimo sistemos ligoms sudaro apie 6 proc. viso sveikatos apsaugai skiriamo biudžeto, iš kurio 56 proc., t. y. 38,6 milijardo eurų, atitenka LOPL [59]. JAV-se LOPL gydymo tiesiogin÷s išlaidos (2002 m. duomenimis) siekia apie 18 milijardų JAV dolerių, o netiesiogin÷s – apie 14,1 milijardo JAV dolerių [59].
Europoje su astma susijusios išlaidos siekia apie 17,7 milijardus eurų, o JAV – apie 13 milijardų JAV dolerių [110].
2.1.3 Rizikos veiksniai
Riziką susirgti obstrukcin÷mis plaučių ligomis − LOPL ir astma lemia individo ir aplinkos veiksnių sąveika.
LOPL rizikos veiksniai
Svarbiausiais LOPL rizikos veiksniais yra laikomi individo genetin÷ pre-dispozicija, rūkymas, profesin÷s dulk÷s ir oro teršalai.
Manoma, kad predispoziciją susirgti LOPL lemia įvairūs genai. Geriau-siai įrodytas paveldimas veiksnys − įgimta AAT-1, proteazių inhibitoriaus, stoka [47]. Trūkstant proteazių inhibitorių, did÷ja proteolizinių fermentų koncentracija, ardomas plaučių jungiamasis audinys, vyksta plaučių paren-chimos destrukcija, vystosi emfizema. Įgimtai AAT-1 stokai būdinga anks-tyva emfizema. Riziką susirgti LOPL taip pat didina genų, reguliuojančių uždegimo raišką, proteazių−antiproteazių, oksidantų ir antioksidantų pusiau-svyrą, mutacijos [3, 43, 59, 166].
priklauso nuo rūkymo intensyvumo, panašus ir pasyvaus rūkymo poveikis. 20–50 proc. rūkorių suserga LOPL, o LOPL sergančiųjų tarpe rūkoriai sudaro 80–90 proc. [103, 124]. Rūkymas sukelia kv÷pavimo takų ir plaučių parenchimos neinfekcinį uždegimą, oksidacinį stresą, kv÷pavimo takų ir plaučių struktūros pokyčius (virpamojo epitelio metaplaziją į daugiasluoksnį plokščią ir kt.), slopina mukociliarinį klirensą, keičia imuninį atsaką [3, 18, 43, 148, 166, 171]. Riziką susirgti LOPL didina profesin÷s dulk÷s ir oro teršalai, t. y. medviln÷s, medienos, grūdų, anglies, silicio, kadmio, geležies ir kt. dulk÷s, su kuriomis susiduriama dirbant bei įvairūs oro teršalai, tokie, kaip automobilių kuro, anglies ir medienos degimo produktai ir kt. [59]
Plaučių raidos ir augimo nukrypimai, trikdantys plaučių augimą (n÷štumo metu ar vaikyst÷je) [59], o taip pat ir infekcin÷s ligos, skatindamos kv÷-pavimo takų uždegimą ir LOPL progresavimą [48, 59] taip pat didina riziką susirgti LOPL.
Blogos socialin÷s ir ekonomin÷s sąlygos taip pat priskiriamos LOPL rizikos veiksniams, tačiau nežinomi konkretūs jų faktoriai [59]. Vienu iš jų yra įvardijama nevisavert÷ mityba. Ir nors jos reikšm÷ n÷ra aiški, manoma, kad nevisavert÷ mityba gali būti siejama su kūno svorio ir kv÷pavimo raumenų mas÷s maž÷jimu [166].
Astmos rizikos veiksniai
Svarbią astmos rizikos veiksnių grupę sudaro predisponuojantys veiks-niai. Pastariesiems, galintiems tur÷ti įtaką astmai išsivystyti ar jos paū-m÷jimui, priskiriamas genetinis polinkis, atopija, lytis (dešimties metų amžiaus astma dažnesn÷ berniukų tarpe, o v÷liau skirtumo tarp lyčių nestebima) [30, 66].
Svarbiausiais astmos priežastiniais veiksniais laikomi patalpų (namų dulkių erk÷s, gyvūnų alergenai, grybeliai ir kt.) ir išoriniai (žiedadulk÷s, grybeliai) alergenai, profesiniai veiksniai, aktyvus ir pasyvus rūkymas, oro teršalai, kv÷pavimo takų infekcin÷s ligos, socialin÷s ir ekonomin÷s sąlygos, mitybos ypatumai, nutukimas ir kt. [30, 66, 111, 139].
Astmą provokuojančių veiksnių grupei priskiriami alergenai, oro teršalai, kv÷pavimo takų infekcin÷s ligos, fizinis krūvis, hiperventiliacija, oro po-kyčiai, maisto produktai, emocinis krūvis, rūkymas, profesiniai ir buitiniai veiksniai (dažai, aerozoliai ir kt.) [30, 66, 139].
Rūkymas − bendras LOPL ir astmos rizikos veiksnys
pakankamai aiškūs, manoma, kad jie, sergant šiomis ligomis, gali būti skirtingi [78, 79, 164, 181, 183].
Tai, kad tik apie 20–50 proc. rūkorių suserga LOPL, o apie 90 proc. LOPL sergančiųjų yra rūkoriai arba buvę rūkoriai [103, 124], rodo, kad LOPL išsivystymui reikšminga rūkymo sąveika su kitais veiksniais, ypač genetiniais [43]. Kol kas LOPL vienintelis patvirtintas genetinis veiksnys yra AAT-1 stoka [59]. Atliekant epidemiologinius tyrimus yra identifikuoti genai, kuriems esant kartu su pasyviu rūkymu ankstyvame gyvenimo laikotarpyje, predisponuojamas astmos išsivystymas [40, 114, 180]. Tačiau pripažįstama, kad rūkymo sukeliami kv÷pavimo takų ir plaučių parenchimos pokyčiai tiesiogiai priklauso nuo rūkymo intensyvumo, įtakos turi ir pa-syvus rūkymas [65, 164, 175, 177, 181].
Rūkymo poveikio efektai išskiriami į dvi grupes, tai yra sisteminius ir vietinius efektus [78, 181]. Rūkymo sisteminio poveikio mechanizmai n÷ra aiškūs, bet gali būti siejami su CRB koncentracijos padid÷jimu, o taip pat ir autoantikūnų dažniu LOPL, astmos metu [4, 64, 142, 152]. Padid÷jusios CRB koncentracijos aptiktos metusiems rūkyti sergantiesiems LOPL [51], jos yra laikomos paūm÷jimų prognostiniu veiksniu [77]. Stabilios eigos ligų metu CRB padid÷jimas yra grindžiamas genetine determinacija, atsaku į infekcijas, pažeistą plaučių audinį, endogeninių ligandų gamybą, bei to pas÷koje provokuojamu uždegimu [7, 179]. Nurodoma, kad sisteminio veikimo gliukokortikosteriodai mažina CRB koncentracijas bei citokinų kiekius [150], tačiau nepakanka duomenų, kad šis gydymas ir CRB sumaž÷jimas pagerintų ligos išeitis. Panašūs duomenys pateikiami ir tyrimų, atliktų širdies−kraujagyslių ligomis sergantiems asmenims [8, 19]. Šie prieštaringi duomenys duoda pagrindą manyti, kad etiopatogeneziniai me-chanizmai yra sud÷tingi, esama sąsajų tarp obstrukcinių plaučių ir šir-dies−kraujagyslių bei autoimuninių ligų [4, 7, 47, 59, 78, 104, 142, 152].
Rūkorių, sergančių LOPL, o taip pat ir nesergančių ja, kv÷pavimo takuose aptinkami pakitimai, susiję su uždegimu ir fibroze [18, 46, 75]. Šie pokyčiai, siejami su plaučių funkcijos pokyčiais, yra netgi labiau susiję su rūkymu nei dokumentuoti uždegiminių ląstelių kiekių pokyčiai [75].
Rūkoriams, sergantiems astma, nustatyta didesn÷ mirties rizika, sunkesn÷ ligos eiga, greitesni plaučių funkcijos pokyčiai nei nerūkantiems sergan-tiems astma [16, 37, 66, 78, 152, 164]. Lyginant rūkorių ir metusiųjų rūkyti kv÷pavimo takuose randamų uždegiminių ląstelių sud÷tį taip pat randami skirtumai [16, 37, 78]. Nurodoma, kad rūkymas turi įtakos ir atsakui į gydymą, ypač gydymui atsparių astmos formų metu [35, 164].
asmenims, sergantiems obstrukcin÷mis plaučių ligomis. Atsakymai į šiuos klausimus leistų išspręsti LOPL ir astmos prevencijos bei gydymo prob-lemas.
2.2 LOPL ir astmos patogenez÷
Žinoma, kad sergant obstrukcin÷mis plaučių ligomis yra pažeidžiamos kv÷pavimo takų, epitelio, raumenų, plaučių audinio alveolių ląstel÷s [16]. Šie pažeidimai veda prie kv÷pavimo takų obstrukcijos. Tačiau be šio, žinomo plaučių pažeidimo, yra visa eil÷ ekstrapulmoninių pažeidimo reiškinių, įvardinamų kaip sisteminiai obstrukcinių plaučių ligų efektai [3, 7, 16, 63, 82, 168, 171]. M÷ginama išsiaiškinti šių pokyčių mechanizmus. Požiūris į šias ligas, kaip į sistemines ligas, palyginus naujas, keliantis daug klausimų. Be to iki šiol išlieka neatsakytų klausimų, susijusių ir su vietinio imuninio atsako patogenez÷s mechanizmais.
2.2.1 Vietinis ir sisteminis imuninis atsakas
LOPL ir astmai yra būdingas l÷tinis persistuojantis uždegimas [59, 66]. Atliktų tyrimų duomenimis, imuniniai uždegimo mechanizmai sergant LOPL ir astma skiriasi [16, 173]. Abi ligos yra uždegimin÷s kilm÷s, bet joms būdinga infiltracija skirtingomis ląstel÷mis, skirtingų mediatorių dalyvavimas patogenez÷je. Klinikinių tyrimų duomenys rodo, kad, sergant šiomis ligomis, imuninis uždegimas n÷ra tik lokaliai kv÷pavimo takuose vykstantis procesas, bet pasižymi ir sisteminiu pobūdžiu [79, 173].
Uždegimo mechanizmuose be įvairių ląstelių, dalyvauja gausyb÷ jų produkuojamų medžiagų (citokinų, chemokinų, ūmios faz÷s baltymų, komplemento komponentų, antikūnų ir eil÷ kt.), įvardijamų bendru pava-dinimu − humoralin÷s medžiagos arba kitaip − imuninio atsako humoraliniai žymenys, turinčių reikšm÷s tiek įgimtiems, tiek ir įgytiems imuninio atsako mechanizmams [56, 138].
Vietinis imuninis atsakas
įvairove, išlieka imunin÷ atmintis [16, 47, 75, 138, 173]. Ne tik apsauginiai, bet ir pažeistų audinių atsistatymo, gijimo procesai vyksta dalyvaujant įgimto bei įgyto imuninio atsako mechanizmams [16, 24, 75]. Svarbu tai, kad LOPL ir astmos metu imuninio atsako mechanizmai būna pakitę, sutrikus apsaugin÷ms ir atsistatymo reakcijoms, imuninis atsakas pereina į l÷tinį persistuojantį uždegimą [59, 66, 173].
2.2.1.1 pav. Uždegimo mechanizmo ląstel÷s ir mediatoriai, sergant astma ir LOPL (modifikuota pagal [21])
ECP – eozinofilų katijoninis baltymas; GM-CSF – granuliocitus stimuliuojantis faktorius; IFN-γ – interferonas gama; IL – interleukinas; LT – leukotrienas; MMP – matrikso
metaloproteinaz÷; NE – neutrofilų elastaz÷; PGE2 – prostaglandinas E2; TNF-α – tumoro nekroz÷s faktorius alfa.
Sergant astma, būdingoje audinių infiltracijoje dominuoja eozinofilai, mastocitai, T limfocitai pagalbininkai (CD4+) Th2 sekrecinio tipo. Jie susitelkia alveoliniuose kapiliaruose, intersticiume, alveol÷se. Min÷tų ląs-telių išskiriami mediatoriai skiriasi nuo LOPL metu išskiriamų mediatorių: vyrauja IL-4, IL-5, IL-13, kurie skatina IgE gamybą, T limfocitų diferen-ciaciją, eozinofilų aktyvaciją (2.2.1.1 pav.), o to pas÷koje aktyvinamas kv÷pavimo takų reaktyvumas. Besitęsiantis uždegimas sukelia epitelio pažeidimus, bronchų lygiųjų raumenų išveš÷jimą, bazin÷s membranos su-stor÷jimą, gleivių hipersekreciją [30, 66, 79, 143, 164, 173].
Astma LOPL Neutrofilai IL-6; IL-8; GM-CSF; TNF-α; PGE2; NE; katepsinai; MMP Mastocitai IL-4; TNF-α; IL-5; histaminas; LT; triptaz÷ chimaz÷ Eozinofilai 3; 5;
IL-6; IL-13; TNF-α; ECP GM-CSF CD8+T limf. (Tc) perforinai, granzimai Cys-LT CD4+T limf. (Th2) GM-CSF 4; 5; 9;
Vietinio imuninio atsako ypatumams vertinti gali būti naudojami audinių bioptatų bei kv÷pavimo takų sekreto, t. y bronchoalveolinio lavažo (BAL) skysčio ir indukuotų skreplių (IS) tyrimai, kurie pastaruoju metu vis plačiau taikomi, dedamos pastangos juos standartizuoti [108, 115, 162]. Fibrobron-choskopijos metu gaunamas BAL skystis, kaip manoma, atspindi procesus, vykstančius distaliniuose kv÷pavimo takuose [13, 116, 128, 145, 162]. Tuo tarpu IS atspindi imuninio atsako procesus, vykstančius proksimaliniuose kv÷pavimo takuose [13, 99, 106, 128, 144]. Taigi, BAL skysčio ir IS tyrimai suteikia informaciją apie skirtinguose kv÷pavimo takų lygmenyse vyks-tančius procesus. Pateikiami tyrimų duomenys, nurodantys, kad ląstelių sud÷tis šiuose skysčiuose skiriasi − BAL skystyje sveikiems asmenims ir sergantiems LOPL aptinkamas didesnis kiekis makrofagų, o IS-se – neutrofilų [13, 18, 144]. Sergant astma, priklausomai nuo klinikinio feno-tipo, IS-se aptinkamas eozinofilų ar neutrofilų dominavimas [44, 99, 106, 128] Tuo tarpu yra tik pavieniai duomenys apie limfocitų populiacijos sud÷ties ypatumus ir skirtumus skirtinguose kv÷pavimo takų lygmenyse [117, 128, 144].
Sisteminis imuninis atsakas
Remiantis naujausiais klinikinių tyrimų duomenimis, manoma, kad, sergant LOPL ir astma, uždegiminis procesas vyksta ne tik kv÷pavimo takuose, bet gali būti sisteminio pobūdžio [3, 7, 34, 47, 63, 82, 143, 163, 171, 181]. Šiuo metu vyrauja nuomon÷, kad LOPL yra multiorganin÷ liga. Nors, sergant LOPL, dominuoja plaučių pažeidimas, tačiau randama ir reikšmingų sisteminių pokyčių, pvz., kūno mas÷s maž÷jimas, skeleto rau-menų atrofija ir disfunkcija, osteoporoz÷, širdies−kraujagyslių sistemos pažeidimas, depresija ir kt. [3, 7, 82, 150]. LOPL ir astmos metu randami sisteminiai pokyčiai yra siejami su galimu persistuojančiu sisteminiu užde-gimu [5, 150]. Tam prielaidą sudaro įvairių sisteminio uždegimo žymenų TNF-α, IL-6, IL-8, fibrinogeno, LSB, sTNF-R75, serumo amiloido A bei kitų radimas sergančiųjų LOPL kraujyje [52, 63, 122]. Tyrimų duomenimis, sergantiesiems astma aptikti serumo amiloido A, plazmos fibrinogeno bei kitų uždegimo žymenų pokyčiai, kurie taip pat gali būti siejami su sisteminiu uždegimu [82, 122, 125].
įvairius degeneracinius procesus, gali būti sintetinami tiek vietiškai (kv÷-pavimo takų ląstel÷se), tiek sistemiškai (kraujo ląstel÷se) [16, 24, 63, 138].
Nors didžiausias d÷mesys tyrin÷jant sisteminį imuninį atsaką yra skiriamas įvairiems citokinams bei ūmios faz÷s uždegimo baltymams, pastaraisiais metais vis dažniau minima potenciali autoantikūnų reikšm÷ sisteminio imuninio atsako grandyje [4, 104, 142, 149]. Sisteminiai auto-antikūnai, kaip parod÷ tyrimai, gana dažnai randami pacientų serume sergant obstrukcin÷mis uždegimin÷mis plaučių ligomis [61, 113, 157]. Autoimuninio ir uždegiminio atsako grandys tarpusavyje glaudžiai susiju-sios: uždegimas gali inicijuoti autoimuninio atsako aktyvaciją ar atvirkščiai − autoimuninis atsakas gali būti veiksniu, palaikančiu uždegimo persista-vimą [104, 142]. Uždegimo žymenų koncentracijos kraujyje padid÷jimas ir autoantikūnų įvertinimas kaip sisteminio uždegimo rodikliai gali būti naudojami sisteminiam imuniniam atsakui įvertinti [24, 56, 104, 142, 149].
Sisteminio imuninio atsako mechanizmuose dalyvauja ląstelinis komponentas, kurio svarbią dalį sudaro mechanizmai, susiję su limfocitais [138]. LOPL ir astmos metu tyrin÷ti periferinio kraujo limfocitų populiacija ir jos potipiai, manant, kad šių ląstelių pokyčiai gali būti išreikšti ne tik kv÷pavimo takuose, bet sistemin÷je kraujotakoje. Tokioms prielaidoms pagrindą sudaro bazin÷s imuninio atsako fiziologijos žinios, kurios nurodo, kad limfocitų brendimas ir diferenciacija vyksta imunin÷s sistemos organuose esant antigeninei stimuliacijai, o diferencijuoti efektoriniai ir reguliaciniai limfocitai „keliauja“ į pažeistus organus – taikinius [118, 138]. Tačiau iki šiol atliktų tyrimų duomenys pakankamai prieštaringi, leidžiantys daryti prielaidas, kad LOPL ir astmos patogenez÷ yra gerokai sud÷tingesn÷.
2.2.2 Limfocitų potipiai
Limfocitai yra imunin÷s sistemos ląstel÷s, dalyvaujančios ląstelinio imu-ninio atsako į svetimus antigenus mechanizmuose [138]. Didžiausias jų kiekis cirkuliuoja kraujotakoje. Tačiau nurodoma, kad kv÷pavimo takų epitelyje, sud÷tingame audinyje, anatominiame ir funkciniame barjere, saugančiame nuo mechanin÷s, infekcin÷s, chemin÷s ir kitokios kilm÷s pažeidimų [118] yra gausu limfocitų, ypač T limfocitų, bet esama ir NK ląstelių, B limfocitų [16, 72, 91, 94, 98, 118, 133, 138].
Limfocitų ląstelių membranose yra įvairių transmembraninių baltymų − CD molekulių (diferenciacijos grupių molekulių), kurios rodo ląstel÷s diferenciaciją, funkcinę paskirtį [138]. Šių molekulių raiška leidžia klasifikuoti limfocitus į atskiras grupes – populiacijas (T limfocitus, B limfocitus, NK ląsteles) ir jų potipius.
molekulių, T limfocitai paviršiuje turi kitus būdingus transmembraninius baltymus, vadinamus T limfocitų receptoriais (TCR), susijusius su skirtin-gomis T limfocitų savyb÷mis bei funkcijomis [138].
Pagal TCR sudarančių polipeptidinių grandinių sud÷tį T limfocitai skiriami į dvi grupes: αβ T limfocitus ir γδ T limfocitus [138]. αβ T lim-focitai sudaro apie 95 proc. kraujotakoje cirkuliuojančių T limfocitų, likusią, gerokai mažesnę dalį – apie 1−5 proc. cirkuliuojančių limfocitų sudaro γδ T limfocitų populiacija [41, 86, 91, 112, 133]. Skirtingai nei kraujo-takoje, epitelyje ir gleivin÷se, virškinamajame trakte, urogenitaliniame trakte, odoje, plaučių audinyje γδ T limfocitų kiekis ženkliai didesnis, ir gali siekti net iki 50 proc. [10, 41, 53, 112, 133, 169].
2.2.2.1 lentel÷. Vγ ir Vδ genų klasifikacija (žym÷jimas) [162]
Žmogaus Vγ geno segmentai Žmogaus Vδ geno segmentai PSO oficialus
žym÷jimas Ankstesnis žym÷jimas PSO oficialus žym÷jimas Ankstesnis žym÷jimas
GV1S1P Vγ1 DV101S1 Vδ1 GV1S2A1T Vγ2 Vγ1.9 DV102S1A1T DV103S1A1T Vδ2 GV1S2A2T Vγ1.9 DV102S1A2T Vδ2’ GV1S3A1N1T Vγ3 Vγ1.3 DV103S1A1T Vδ3 GV1S3A1N2T Vγ1.1 ADV6S1A1N2T Vδ4 GV1S4A1N1T Vγ4 ADV21S1A1N2 Vδ5 GV1S4A1N2T Vγ4 ADV17S1A1T Vδ6 GV1S5 Vγ5 DV28S1A3T Vδ7 GV1S5P Vγ5P ADV14S1 Vδ8 GV1S6P Vγ6 GV1S7P Vγ7 GV1S8 Vγ8 GV2S1A1 Vγ2.2 Vγ9 GV2S1A2 Vγ9 GV3S1P Vγ10 Vγ3.1 GV4S1P Vγ11 GV5S1P ψVA GV6S1P ψVA
PSO − Pasaulio sveikatos organizacija.
2.2.2.1 pav. Žmogaus γδT limfocitų potipiai ir jų lokalizacija (modifikuota pagal [94])
PK – periferinis kraujas.
Visgi, funkcin÷s γδ T limfocitų savyb÷s iki n÷ra detaliai ištirtos. Nors nesama patikimų įrodymų, turimi eksperimentiniai duomenys leidžia ma-nyti, kad tai daugialyp÷mis funkcijomis pasižyminčios ląstel÷s, o d÷l ypatyb÷s lokalizuotis gleivin÷se ir epitelyje joms yra priskirtinas dalyva-vimas tiek įgimto, tiek įgyto imuninio atsako reakcijose [25, 27, 28, 62, 74, 76, 81, 82, 91].
γδ T limfocitai pasižymi efektoriniu ir imunoreguliaciniu poveikiu [28]. Apsauginiuose mechanizmuose γδ T limfocitai dalyvauja slopindami su infekciniu ir neinfekciniu uždegimu susijusius plaučių audinio pažeidimus arba aktyvindami pažeistų audinių atsistatymą [27, 28, 91, 118].
Naudojant pelių modelius nustatyta, kad γδ T limfocitų dalyvavimas apsauginiuose mechanizmuose yra būtinas. Pel÷ms, nesant γδ T limfocitų,
Nocardia asteroides sukelta kv÷pavimo takų infekcija yra lydima gausios neutrofilų infiltracijos bei išreikštų plaučių audinio pažeidimų [91]. Panašūs pokyčiai steb÷ti ir ozonu paveikus peles, neturinčias γδ T limfocitų. Palyginus šiuos, γδ T limfocitų stoką turinčius, gyvūnus su kontroliniais, konstatuota, kad γδ T limfocitai geba slopinti neutrofilų infiltraciją bei neutrofilų sukeliamus kv÷pavimo takų ir plaučių audinių pažeidimus [91].
Nurodoma, kad γδ T limfocitai geba produkuoti aktyvų fibroblastų augimo faktorių VII (FGFVII), kuris skatina epitelinių ląstelių augimą ir diferenciaciją [62]. Veikiant šiam faktoriui yra skatinamas epitelio atsi-statymas po įvairių pažeidimų [74]. Analogiški mechanizmai, kaip manoma, gal÷tų būti ir LOPL metu, kai audinių pažeidimą sąlygoja rūkymas bei oro teršalai.
Skirtingai nei αβ T limfocitai, γδ T limfocitai ligandus atpažįsta savaran-kiškai, nedalyvaujant didžiojo audinių suderinamumo komplekso (MHC) molekul÷ms [68, 76, 83]. N÷ra aišku kokios rūšies ligandus ir kokiu būdu „pamato“ γδ T limfocitai [25]. Manoma, kad γδ T limfocitų atsaką aktyvuoja taip vadinami „pavojaus signalai“, išsiskiriantys vykstant ląstelių ir audinių pažeidimui [75, 94, 138]. Tod÷l, nesant γδ T limfocitų ar esant nepakankamam jų kiekiui, adekvatus apsauginis šių ląstelių poveikis tampa neįmanomas.
Eksperimentiniai tyrimai sukelia ir priešingų minčių, nes yra paradok-salių duomenų, kad γδ T limfocitai gali produkuoti granuliziną, pasižymintį citolitiniu poveikiu epitelio ląstel÷ms [28]. Taigi, galima būtų manyti, kad γδ T limfocitai gali pasižym÷ti žalojančiu poveikiu. Tyrimai parod÷, kad γδ T limfocitai (tik÷tina, kad kiti jų potipiai) gali skatinti uždegimines imuninio atsako reakcijas [28]. Priklausomai nuo antigeninio stimulo ir aplinkos, γδ T limfocitai geba diferencijuotis į Th1, arba priešingai, į Th2 tipo efektorines ląsteles, pasižyminčias skirtingų citokinų sekrecija [9, 27, 38, 74, 83, 85, 91, 92, 94, 96].
γδ T limfocitai ir jų skatinantis poveikis gali būti realizuojamas tiek lokaliai kv÷pavimo takuose, tiek sistemiškai [184]. Remiantis šių eksperimentų rezultatais, manoma, kad γδ T limfocitai gali būti reikšmingi astmos patogenezei, o jų poveikis, didinantis kv÷pavimo takų reaktyvumą, gali būti vienu iš svarbiausių mechanizmų sergant astma. Paradoksalu tai, kad eksperimentiniais tyrimais buvo nustatyta, kad γδ T limfocitai gali sąlygoti priešingus efektus, t. y. gali slopinti kv÷pavimo takų hiperreaktyvumą, nedalyvaujant αβ T limfocitams [95]. Šie duomenys leidžia manyti, kad šių ląstelių vaidmuo astmos patogenez÷je n÷ra vienpusiškas.
Visuotinai sutampa nuomon÷s, kad γδ T limfocitai neatsitiktinai gausiai lokalizuojasi gleivin÷se. Jie gali būti tiriami audiniuose bei kv÷pavimo takų sekrete. Telieka išsiaiškinti jų paskirtį, lokalizacijos kv÷pavimo takuose ypatumus, panašumus ir skirtumus, lyginant su periferiniame kraujuje cir-kuliuojančiais potipiais, kurių pagrindinis vaidmuo, kaip nustatyta tyrimais, yra dalyvavimas infekcinio uždegimo reakcijose, sergant tuberkulioze, salmonelioze, brucelioze, toksoplazmoze ir kt. infekcin÷mis ligomis [88, 138]. Tik÷tina, kad galimi γδ T limfocitų kiekio pokyčiai, kokie jie bebūtų, gal÷tų tur÷ti poveikį neadekvačiam imuniniam atsakui vykti obstrukcinių plaučių ligų metu.
Pagrindin÷s αβ T limfocitams priklausančios ląstel÷s yra citotoksniai T limfocitai (CD8+) bei T limfocitai pagalbininkai (CD4+), besiskiriantys fenotipin÷mis bei funkcin÷mis savyb÷mis [138]. Citotoksiniai T limfocitai (CD8+) sudaro mažesnę bendros T limfocitų populiacijos dalį. Citotoksiniai T limfocitai (CD8+), veikdami kartu su MHC I klas÷s molekul÷mis, pasižymi citolitiniu aktyvumu, kuris gali būti svarbus tiek apsaugin÷ms, tiek autoagresin÷ms reakcijoms [138, 155, 156].
pakmečiais [47, 59, 107]. Dalis tyrimų rodo, kad šių ląstelių kiekis nesiskiria lyginant aktyvius rūkorius su buvusiais rūkoriais [54, 55, 146, 147]. Tačiau esama ir priešingų rezultatų [165, 183]. Dauguma tyrimų atlikti tiriant citotoksinius T limfocitus (CD8+) bioptatuose bei BAL skystyje [146−148, 175, 177, 183]. Skirtingai, PK citotoksinių T limfocitų (CD8+) kiekio skirtumų neaptinkama [129], nors esama ir priešingų duomenų, nurodančių šių ląstelių kiekio padid÷jimą sergant LOPL [90].
Sergant LOPL kv÷pavimo takuose aptinkami dideli kiekiai T limfocitų pagalbininkų (CD4+), priskiriamų Th1 efektoriniam tipui, pasižyminčių Th1 citokinų sekrecija, aktyvuojančia uždegiminių ląstelių migraciją į pažeidimo vietą [47, 75]. Šie limfocitai pasižymi STAT4 ir gama interferono raiška, koreliuoja su kv÷pavimo takų obstrukcijos išreikštumu [55, 59]. Šie duomenys leidžia manyti, kad ne tik citotoksiniai T limfocitai (CD8+), bet ir T limfocitai pagalbininkai (CD4+) dalyvauja sud÷tinguose LOPL patoge-nez÷s mechanizmuose [47].
B limfocitų kiekio kitimai LOPL sergantiesiems n÷ra pakankamai tyrin÷ti. Jų pokyčiai nustatyti bronchų sienel÷s ir limfoidiniuose folikuluose pacientams su sunkesne LOPL [144]. Manoma, kad B limfocitai gali būti reikšmingi autoimuninio atsako, susijusio su antikūnų sinteze mechaniz-muose, tačiau jų pagaus÷jimas plaučių struktūrose stebimas progresuojant LOPL [43, 47].
Astmos patogenezei ypač svarbūs T limfocitai pagalbininkai (CD4+) [66, 171, 173]. Bronchų epitelio, lygiųjų raumenų, kraujagyslių bei nervinių skaidulų tarpusavio sąveika su įkv÷ptais alergenais ar oro teršalais užveda l÷tinio uždegimo kaskadą [28]. Kv÷pavimo takų įsijautrinimas alergenams prasideda, kai gleivin÷s dendritin÷s ląstel÷s apdoroja patekusį alergeną ir, kartu su MHC II klas÷s molekul÷mis, pateikia specifinius alergeno peptidų epitopus naiviems T limfocitams. Tokiu būdu aktyvuojami T limfocitai pagalbininkai (CD4+), aktyvuojama jų diferenciacija į skirtingo efektorinio tipo (Th1, Th2, Th3 ir kt.) T limfocitus pagalbininkus, besiskiriančius sekrecin÷mis savyb÷mis. Naivių T limfocitų aktyvinimas priklauso nuo patekusio alergeno savybių. Th2 tipo T limfocitai pagalbininkai sekretuoja
IL-4, IL-5, IL-13, aktyvuoja putliąsias ląsteles, B limfocitus ir eozinofilus,
tokiu būdu aktyvuojama IgE sintez÷ bei sukeliamas kv÷pavimo takų
reaktyvumas, l÷tinis uždegimas [30, 173].
vertinamas kv÷pavimo takų ir periferinio kraujo limfocitų kiekybiniais ir funkciniais pokyčiais, lyginant juos tarpusavyje, skiriasi [155, 156].
B limfocitų ir NK ląstelių svarba vietin÷se ir sistemin÷se imuninio atsako reakcijose yra nurodoma, tačiau n÷ra pakankamai aiški. Tyrimų duome-nimis, T limfocitų pagalbininkų aktyvuojami B limfocitai yra gausios IgE produkcijos šaltinis, sukeliantis kv÷pavimo takų reaktyvumo padid÷jimą, aktyvias l÷tinio uždegimo reakcijas, susijusias su autoimuniniu atsaku [30, 173, 184]. NK ląstel÷s siejamos su autoagresiniais mechanizmais, sukelian-čiais plaučių audinio pakenkimą. Šių ląstelių kiekio pokyčiai labiau išreikšti asmenims, sergantiems sunkiomis astmos formomis [16, 29, 30, 70].
Remiantis publikuotų tyrimų duomenimis matyti, kad limfocitų pokyčiai ir reikšm÷ l÷tinių obstrukcinių ligų metu n÷ra pakankami aiški, reikalingi detalesni tyrimai, pad÷siantys išsiaiškinti galimus panašumus ir sirtumus vietinio ir sisteminio pobūdžio mechanizmuose. Tam gal÷tų būti pritaikyti IS tyrimai, galintys suteikti informacijos apie imuninį atsaką proksimalin÷se kv÷pavimo takų dalyse, tuo labiau, kad pakitimai šių ligų metu n÷ra izoliuoti [16, 47].
2.2.3 C reaktyvusis baltymas
LOPL ir astmos metu randant reikšmingų sisteminių pokyčių, manoma, kad jie gali būti susiję su galimu persistuojančiu sisteminiu uždegimu [5, 7, 63, 82, 150, 168]. Šiam patogeneziniam mechanizmui patvirtinti galimi sisteminių uždegimo žymenų tyrimai.
C reaktyvusis baltymas (CRB) – vienas informatyviausių uždegiminio proceso baltymų, kurio koncentracijos matavimas leidžia įvertinti sisteminio uždegimo aktyvumą. Šio baltymo sintez÷ vyksta kepenyse kaip atsakas į citokinų (IL-6, IL-1 ir TNF-α) stimuliaciją uždegimo, audinių pažeidimo ar infekcijos metu [24]. Ekstrahepatin÷ jo sintez÷ aptikta neuronuose, mo-nocituose, aterosklerozin÷se plokštel÷se, limfocituose, įvairiuose pažeis-tuose audiniuose [24, 56]. CRB koncentracijos pokyčiai aptinkami kraujyje. Šio baltymo koncentracija padid÷ja žymiai ir per trumpą laiką (8−10 val. nuo pažeidimo pradžios) [93]. Jo pusinis eliminacijos periodas trunka apie 19 val. ir nepriklauso nuo koncentracijos lygio plazmoje [110, 135].
Kaip ir daugelis uždegimo mediatorių, CRB pasižymi pleotropin÷mis savyb÷mis, gali veikti kaip ir uždegimą skatinantis „pro-uždegiminis“, ir kaip jį slopinantis − „prieš-uždegiminis“ veiksnys.
apsauginis CRB poveikis neapsiriboja vien tik priešbakteriniu veikimu. Fosfocholino ir fosfotidilcholino molekulių esama eukariotinių ląstelių membranų sud÷tyje. Sveikose ląstel÷se jos CRB-ui yra neprieinamos, tačiau su pažeistų ar apoptotinių ląstelių min÷tomis molekul÷mis CRB gali jungtis [24, 56, 123]. Svarbu, kad CRB sugeba jungtis ir su kitais ligandais, tokiais kaip fosfoetanolaminas, chromatinas, histonai, fibronektinas, smulkūs ribonukleinai, lamininai ir polikatijonai [24, 56, 123]. Susijungęs su ligandais, CRB sąveikauja su komplemento komponentu C1q ir taip klasikiniu keliu aktyvuoja komplemento sistemą. Yra duomenų, kad CRB gali jungtis ir su Ig receptoriais (FcγRI ir FcγRII) taip sukeldamas fagocitų atsaką, būtiną pirmin÷s grandies apsaugai. Pažymima, kad CRB indukuoja IL-1 receptorių antagonistų ekspresiją, padidina priešuždegiminio citokino IL-10 išsiskyrimą, slopina γ-interferono sintezę [24].
Eksperimentiniuose tyrimuose buvo demonstruotas CRB apsauginis poveikis atitolinant ir susilpninant eksperimeninio alerginio encefalomielito išsivystymą [24]. Pel÷ms chemotaksio faktoriais indukavus alveolitą, buvo aptiktas CRB geb÷jimas inhibuoti neutrofilų ir ląstelių baltymų pliūpsnį į plaučius [24]. Šių eksperimentų, nurodančių priešuždegiminius CRB efektus, duomenys leidžia daryti prielaidas apie priešuždegiminį CRB poveikį.
Tačiau dauguma CRB funkcijų yra priskiriamos pro-uždegimin÷ms: CRB aktyvuoja komplemento sistemą ir aktyvina fagocitozę, skatina endotelinių ląstelių adhezijos molekulių ekspresiją, inhibuoja endotelinę NO sintetaz÷s ekspresiją ant aortos endotelinių ląstelių, stimuliuoja IL-8 išsiskyrimą iš ląstelių, didina audinių plazminogeno aktyvacijos inhibitoriaus-1 ekspresiją ir aktyvumą, didina IL-1, IL-6, IL-18, TNF-α išsiskyrimą [24, 93].
Nurodoma, kad dviems trečdaliams asmenų nustatoma nepakitusi CRB koncentracija, tačiau CRB koncentracija neretai koreliuoja su įvairių ligų simptomatika, jų eiga ir prognoze, net jei CRB kiekiai „telpa“ į referentines normos ribas [24]. Buvo iškelta hipotez÷, kad perisistuojantis nedidelio aktyvumo sisteminis uždegimas, kurį rodo maži CRB koncentracijos pokyčiai, taip pat gali būti reikšmingas daugelio ligų patogenezei bei sukelti reikšmingų sisteminių pokyčių [32, 33, 57, 93, 123, 134]. D÷l min÷tų ypatybių šis uždegimo žymuo pastaraisiais metais įgyja vis didesnę reikšmę ir dažnai taikomas moksliniuose tyrimuose sisteminiam uždegimui įvertinti, taip pat ir ligos prognozei numatyti [32, 33, 57, 123, 134, 151].
duomenys prieštaringi. Pastaraisiais metais skelbiami mokslinių publikacijų duomenys apie įvairių uždegimo žymenų kiekio padid÷jimą kraujotakoje tiek sergant LOPL [7, 63], tiek ir astma [7, 24, 82, 125], sudar÷ prielaidą hipotezei, kad, sergant šiomis ligomis, uždegimas gali būti sisteminio pobūdžio [63].
Įvertinus tai, kad daugeliu atveju CRB yra pripažįstamas, kaip apsaugines funkcijas užtikrinantis baltymas, kurio sintez÷ vyksta kaip atsakas į uždegimą ar pažeidimą, kyla klausimas, kokie veiksniai LOPL ir astmos metu stimuliuoja jo sintezę, ypač esant stabiliai šių ligų eigai. Vienas iš galimų provokuojančių veiksnių yra rūkymas, kurio žalojantis poveikis audiniams šių ligų metu yra visuotinai pripažįstamas [59, 66, 29, 65, 164, 181, 183]. Veikiant rūkymui, CRB kiekio pokyčiai gali būti įtakojami suaktyv÷jusio endogeninių ligandų, tokių fibronektinas, karščio šoko baltymai, išskyrimo, kaip atsako į rūkymo poveikį. Taip pat nustatyta, kad rūkymas sukelia kv÷pavimo takuose pro-uždegiminių mediatorių (6, IL-1β, IL-4, IL-8, TNF-α ir kt.) aktyvią sekreciją ir, priešingai, užslopina priešuždegiminių citokinų (IL-10, IL-18 ir kt.) sekreciją [18, 104, 126, 164]. Pro-uždegiminiai mediatoriai − IL-6, IL-1β yra randami tiek LOPL, tiek ir astma sergantiems pacientams ir laikomi vienais svarbiausių ir aktyviausių uždegimą skatinančių mediatorių [7].
Tod÷l manome, kad yra svarbu ištirti ir įvertinti CRB, kaip sisteminio uždegimo žymens, galimus kiekio pokyčius bei jų ryšį su plaučių funkcija pacientams, sergantiems l÷tin÷mis uždegimin÷mis obstrukcin÷mis ligomis – LOPL ir astma. Ne mažiau svarbu išsiaiškinti, ar l÷tinis sisteminis už-degimas rimsta metus rūkyti, kai nebelieka veiksnio, žalojančio audinius ir indukuojančio uždegimo mediatorių sintezę.
2.2.4 Antikūnai prieš branduolio antigenus
Imuninio atsako biologin÷ reikšm÷ − organizmo apsauga nuo genetiškai svetimų medžiagų (molekulių, ląstelių ir kitų struktūrų), struktūrin÷s organizmo homeostaz÷s išsaugojimas [138]. Tačiau ne visuomet imuninio atsako mechanizmai užtikrina tik apsaugines funkcijas. Kai sutrinka atpažinimo mechanizmai, ir imunin÷ sistema pradeda reaguoti į savas struktūras, kaip į svetimas, arba, sutrikus efektorin÷ms funkcijoms, imuninis atsakas pereina į l÷tinį uždegiminį atsaką, imunin÷s reakcijos tampa patologin÷mis, sukelia organų ir audinių pažeidimus bei klinikinius simptomus [138]. Manoma, kad LOPL ir astmos patogenez÷s svarbiausia grandis yra pakitęs (sutrikęs) imuninis atsakas [16, 47].
pvz. I tipo cukriniu diabetu, kepenų, uždegimin÷mis žarnyno ligomis, skydliauk÷s ir kitų endokrininių liaukų, onkologin÷mis ligomis, esant paraneoplastiniams neurologiniams sindromams bei kt. [1, 49, 101, 174]. Pastaraisiais metais atkreiptas d÷mesys, kad asmenims, sergantiems sistemi-n÷mis ir organui specifisistemi-n÷mis ligomis, dažniau pasireiškia respiraciniai simptomai, kv÷pavimo takų obstrukcijos reiškiniai [23]. Ir priešingai, obstrukcinių plaučių ligų metu esama sisteminio uždegimo komponentų [7, 63, 82, 168], o sergant alergin÷mis ligomis, neretai sergama ir auto-imunin÷mis ligomis [142].
Neinfekcinis l÷tinis uždegimas, pakitęs imuninis atsakas yra reikšmingi obstrukcinių plaučių ligų patogenez÷s komponentai [59, 66]. Imuninio atsako pakitimai yra ir alerginių, bei autoimuninių ligų pagrindas [6, 50, 104, 142]. Autoimunin÷s ligos, kaip parod÷ eksperimentiniai tyrimai, gali išsivystyti spontaniškai arba būti indukuotos uždegimo [6, 50, 104, 142]. Ląstel÷s pažeidimas, „pavojaus“ signalai, uždegimas sukelia organizmo atsaką, dalyvaujant įgimtam ir igytam imuniniam atsakui (visa tai yra stebima LOPL ir astmos metu). Neretai autoimuninis atsakas lydi audinių pažeidimą, bet ne visuomet pereina į autoimuninę ligą [6, 59, 104, 142]. Ryšys tarp uždegimo ir autoimuninio atsako yra nepaprastai glaudus, tačiau uždegimo vaidmuo autoimuninių ligų išsivystymui n÷ra pakankamai aiškus [12, 104].
Imuninio atsako pakitimai, lydintys rūkymo bei kitų žalojančių veiksnių sąlygotus ląstelių pažeidimus, sisteminio uždegimo požymiai, ligos eigos panašumas su autoimunin÷mis sistemin÷mis ligomis, ligos tąsa (uždegimo rusenimas), net ir metus rūkyti (pašalinus žalojantį veiksnį) ir kt. duomenys, sudar÷ prielaidas iškelti hipotezę, kad obstrukcinių plaučių ligų patogenez÷je gali būti ir autoimuninio atsako komponentas [4, 12, 50, 143].
Nemažas d÷mesys buvo skiriamas obstrukcinių plaučių ligų ląstelinio autoimuninio atsako tyrimams (autoreaktyviems CD8+T limfocitams, CD4+T limfocitams Th1 tipo, NK ląstel÷ms ir kt.), tačiau nesant viena-reikšmių duomenų, pastaraisiais metais tapo aktualūs humoraliniai speci-finio imuninio atsako mechanizmų tyrimai (vieni iš jų – autoantikūnų tyrimai), orientuoti į sisteminio pobūdžio mechanizmus. Keliamos hipote-z÷s, kad humoralinio atsako mechanizmų aktyvacija gali būti ekstrapul-monin÷s kilm÷s, o mechanizmai ir pokyčiai plaučiuose − tik tolimesn÷ sisteminių mechanizmų išdava [149].
leidžianti ne tik aptikti autoantikūnus kraujotakoje (tiriami kraujo serume), bet ir įvertinti švyt÷jimo tipą, turintį sąsajas su autoantikūnų rūšimis [88].
Klinikin÷je praktikoje autoantikūnų tyrimai naudojami esant klinikiniam pagrindui įtarti autoimuninių ligų buvimą. Nustatyta, kad autontikūnų dažnis priklauso nuo tokių fiziologinių veiksnių, kaip amžius, lytis, o taip pat įtakos gali tur÷ti gretutin÷s ligos, vartojami medikamentai [159]. Tod÷l teigiami ANA tyrimų rezultatai turi būti interpretuojami kritiškai, atsižvelgiant į klinikinių, instrumentinių bei laboratorinių tyrimų rezultatų visumą. Nustatyta, kad taikant atrankinius serumo titrus, daliai visiškai sveikų asmenų galimi teigiami ANA rezultatai [159]. Nurodoma, kad taikant titrą 1:40, klaidingai teigiami rezultatai sudaro 31,7 proc., o jei titras − 1:80, klaidingai teigiamų rezultatų sumaž÷ja beveik trigubai, t. y. siekia 10−12 proc. [159]. D÷l tos priežasties yra rekomendacijų tyrimus atlikti, taikant didesnius serumo praskiedimus ir, tokiu būdu, sumažinti klaidingai teigiamų rezultatų dažnį [49]. Tačiau žemi titrai nereiškia, kad ANA tyrimo rezultatai n÷ra reikšmingi. Jie naudotini ir informatyvūs diagnozuojant ir diferencijuojant autoimunines ligas, o hiperdiagnostika galima, jeigu, interpretuojant šių tyrimų rezultatus, n÷ra atsižvelgiama į klinikinių veiksnių visumą [160].
Mokslin÷je praktikoje autoantikūnų tyrimai yra naudojami ne diag-nostikos tikslais, bet patogeneziniams mechanizmams įvertinti, charak-terizuoti sergančiuosius, suprasti įvairius ligos simptomus [49, 100, 104, 157, 182]. M÷ginama šiuos tyrimus taikyti prognostiniams tikslams [1, 160]. Ne išimtis ir obstrukcin÷s plaučių ligos. Autoimuninių mechanizmų išaiškinimas ir patvirtinimas leistų suprasti ir paaiškinti šių ligų kilmę, eigos ypatumus, neefektyvaus gydymo gliukokortikosteroidais priežastis. Obst-rukcinių plaučių ligų ir autoimuninio atsako priežastinio ryšio nustatymas išlieka svarbiu tyrimų tikslu.
3. TYRIMO METODIKA
Tyrimai atlikti Kauno medicinos universiteto (KMU) Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje bei Kauno medicinos universiteto klinikų (KMUK) Imunologijos ir genetikos laboratorijoje, gavus Kauno regioninio Biome-dicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (leidimas atlikti biomedicinį tyrimą 2005−02−08 Nr. P1−48/2004). Visi tiriamieji susipažino su tyrimo proto-kolu ir pasiraš÷ informuoto asmens sutikimo formą.
Tyrimą sudar÷ 2 dalys:
I dalis. Limfocitų potipių tyrimas.
Atlikti kv÷pavimo takų sekreto, t. y. indukuotų skreplių (IS) ir bronchoal-veolinio lavažo (BAL) skysčio, o taip pat periferinio kraujo (PK) limfocitų potipių tyrimai (limfocitų imunofenotipavimas) vietiniam ir sisteminiam ląsteliniam (su limfocitais susijusiam) imuniniam atsakui įvertinti. Ištirti 52 pacientai: 20 sergančiųjų LOPL, 18 sergančiųjų astma ir 14 sveikų (kontrolin÷s grup÷s) asmenų.
II dalis. C reaktyviojo baltymo ir antikūnų prieš branduolio antigenus tyrimas.
Atlikti imuninio atsako humoralinių žymenų − CRB koncentracijos plaz-moje ir ANA serume tyrimai sisteminiam imuniniam atsakui įvertinti. Ištirti 127 pacientai: 57 sergantieji LOPL, 40 sergančiųjų astma ir 30 sveikų (kontrolin÷s grup÷s) asmenų.
3.1 Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga
Abiejų tyrimo dalių tiriamiesiems taikyti vienodi atrankos kriterijai.
3.1.1 Bendrieji tiriamųjų atrankos kriterijai
Visų trijų grupių tiriamieji asmenys atitiko bendruosius atrankos kri-terijus.
Bendrieji tiriamųjų įtraukimo kriterijai:
1. Vyrai ir moterys*; 2. 40−80 metų amžius.
* Moterys: premenopauzinio amžiaus, jei n÷štumo testas neigiamas ir jos sutinka tyrimo metu naudoti efektyvias apsisaugojimo priemones bei pome-nopauzinio amžiaus.
Bendrieji tiriamųjų neįtraukimo kriterijai:
2. Hemoragin÷s diatez÷s; 3. Plaučių operacijos;
4. Sunkios, nekontroliuojamos ligos (įskaitant psichikos sutrikimus); 5. Priklausomyb÷ nuo alkoholio ar narkotikų;
6. Infekcin÷s ligos 4 savaites iki tyrimo.
3.1.2 L÷tine obstrukcine plaučių liga sergančiųjų atrankos kriterijai
Į LOPL sergančių tiriamųjų grupę įtraukti asmenys, atitinkantys specialiuosius LOPL sergančiųjų bei bendruosius tiriamųjų asmenų atrankos kriterijus.
LOPL sergančiųjų įtraukimo kriterijai:
1. Stabilios eigos vidutinio sunkumo ar sunki LOPL, diagnozuota remiantis Pasaulin÷s l÷tin÷s obstrukcin÷s plaučių ligos iniciatyvos (GOLD − angl. Global Initiative for Chronic Obstructive
Pulmo-nary Disease) kriterijais [59];
2. Podilatacinis FEV1 30−80 proc. b.d. (FEV1 − forsuoto iškv÷pimo tūris per pirmąją sekundę (angl. forced expiratory volume in
1 sec.)), o FEV1/FVC≤0,70 (FVC − forsuota gyvybin÷ plaučių talpa (angl. forced vital capacity)), stabili ar iš dalies išnykstanti bronchų obstrukcija;
3. Rūkymo intensyvumas ≥10 pakmečių*; 4. N÷ra alfa-1 antitripsino (AAT-1) stokos**;
5. Netaikomas gydymas inhaliuojamaisiais ar sisteminio poveikio gliukokortikosteroidais 6 savaites ir/ar ilgo poveikio bronchų plečiamaisiais vaistais 4 savaites iki tyrimo.
* Rūkymo intensyvumas apskaičiuotas pakmečiais, padalinus skaičių cigarečių, surūkytų per dieną, iš 20 ir padauginus iš rūkymo trukm÷s, išreikštos metais.
** Visiems LOPL sergantiems pacientams buvo atliktas AAT-1 Z alelio, sąlygojančio AAT-1 stoką, atrankinis tyrimas (PIZ 210 ELISA kit, Wieslab; Lundas, Švedija). Nei vienam iš tirtų pacientų AAT-1 Z alelis nebuvo nusta-tytas.
3.1.3 Astma sergančiųjų atrankos kriterijai
Astma sergančiųjų įtraukimo kriterijai:
1. Persistuojanti lengva ar vidutinio sunkumo astma, diagnozuota re-miantis Pasaulin÷s astmos iniciatyvos (GINA − angl. Global
Initiative for Asthma) kriterijais [66];
2. Podilatacinis FEV1≥60−80 proc. b.d., o FEV1/FVC>0,75−0,80. Bronchų obstrukcijos kintamumas nuo 20 iki ≥30 proc. (bronchų dilatacijos m÷ginio metu);
3. Astmos simptomai vargina ne mažiau kaip 12 m÷nesių, bet ne ilgiau kaip ketverius metus;
4. Netaikytas gydymas inhaliuojamaisiais ar sisteminio poveikio gliukokortikosteroidais;
5. Netaikomas gydymas ilgo poveikio bronchų plečiamaisiais vaistais 4 savaites iki tyrimo.
3.1.4 Kontrolin÷s grup÷s asmenų atrankos kriterijai
Į kontrolinę grupę įtraukti sveiki asmenys, atitinkantys kontrolin÷s grup÷s asmenų specialiuosius bei tiriamųjų asmenų bendruosius atrankos kriterijus.
Kontrolin÷s grup÷s asmenų įtraukimo kriterijai:
1. L÷tinių plaučių ligų nebuvimas;
2. FEV1≥80 proc. b.d., o FEV1/FVC≥88 proc. b.d. vyrams ir FEV1/FVC≥89 proc. b.d. moterims [131].
3.1.5 Tyrimo dizainas
Tyrimui atrinkti asmenys buvo kviečiami atvykti į KMU Pulmonologijos ir imunologijos kliniką. Tiriamieji klinikoje lank÷si tris kartus.
Pirmojo vizito metu buvo surinkta anamnez÷, atlikti klinikiniai, rentge-nologiniai ir plaučių funkcijos tyrimai, įvertintas atitikimas įtraukimo/ neįtraukimo kriterijams, apskaičiuotas pacientų kūno mas÷s indeksas (KMI) kūno masę (kg) padalijus iš ūgio kvadratu (m2).
Antrojo vizito metu, t. y. 7 dieną, skaičiuojant nuo pirmojo vizito dienos, paimtas kraujas, surinkti indukuoti skrepliai, atlikti indukuotų skreplių (IS) ir periferinio kraujo (PK) citomorfologiniai tyrimai, limfocitų imunofeno-tipavimas, o taip pat apruoštas kraujas CRB koncentracijos kraujo plazmoje ir autoantikūnų (ANA) kraujo serume tyrimams.
Tirtųjų grupių asmenys pagal rūkymo įpročius suskirstyti į nerūkančių, metusių rūkyti ir rūkorių tiriamųjų pogrupius:
1. Nerūkantieji − nerūkantys ir niekuomet nerūkę tiriamieji;
2. Metusieji rūkyti − tiriamieji, kurie nerūk÷ ne mažiau nei 2 pasku-tiniuosius metus iki tyrimo;
3. Rūkoriai − tiriamieji, kurie rūk÷ iki tyrimo ir tyrimo metu.
Rūkorių ir metusiųjų rūkyti tiriamųjų rūkymo intensyvumas apskai-čiuotas pakmečiais, padalinus skaičių cigarečių, surūkytų per dieną, iš 20 ir padauginus iš rūkymo trukm÷s, išreikštos metais.
3.2 Tyrimo metodai 3.2.1 Plaučių funkcijos tyrimai
Prieš įtraukiant į tyrimą, kiekvienam tiriamajam buvo ištirta plaučių funkcija taikant spirometrijos metodą, o kiekvienam LOPL ar astma sergančiam pacientui buvo atliktas bronchų dilatacijos m÷ginys − diagnozei patikslinti.
Plaučių funkcija tirta pneumotachometriniu spirometru „CustoVitM“ (Custo Med; Miunchenas, Vokietija). Mažiausiai 8 val. iki tyrimo pacientai nenaudojo trumpo poveikio bronchų plečiamųjų vaistų. Pagal visuotinai priimtą metodiką kiekvienas tiriamasis atliko ne mažiau kaip tris kokybiškus forsuoto iškv÷pimo veiksmus [116]. Vertinti plaučių ventiliacijos rodikliai – FEV1 ir FVC. Skirtumas tarp dviejų didžiausių FEV1 ir FVC rodiklių nebuvo didesnis nei 150 ml. Iš trijų kokybiškai atliktų forsuoto iškv÷pimo veiksmų buvo atrinkti didžiausi FEV1 ir FVC rezultatai, kurie buvo išreikšti absoliučiais dydžiais (l) ir b.d. proc.. Išvestas FEV1/FVC santykio absoliutus dydis ir b.d. proc. Remtasi pamatin÷mis būtinų dydžių vert÷mis nusta-tytomis Quanjer ir kt. [130]. Plaučių funkcija laikyta normalia, jei FEV1 buvo ≥80 proc. b.d., o FEV1/FVC ≥88 proc. b.d. vyrams ir FEV1/FVC ≥89 proc. b.d. moterims.
Bronchų obstrukcijos išnykstamumas vertintas pagal trumpo poveikio bronchų plečiamojo preparato (beta-2 agonisto) poveikį, atliekant bronchų dilatacijos m÷ginį [108]. Naudotas salbutamolis (Ventolin ®; Glaxo
3.2.2 Skreplių indukcijos metodika
Tiriamųjų paruošimas skreplių indukcijai ir procedūros eiga
Skreplių atkos÷jimui paskatinti vartotas skirtingų koncentracijų (3, 4 ir 5 proc.) sterilus hipertoninis NaCl tirpalas (Ivex Pharmaceuticals; JAV), inha-liuotas per ultragarsinį purkštuvą Ultraneb 2000 (DeVilbiss Health Care, Somersetas, JAV) pagal Chanez ir bendraautorių aprašytą metodiką [36].
Prieš skreplių indukciją tiriamiesiems skirta 200 µg salbutamolio
(Vento-lin ®; Glaxo Wellcome), galimam bronchų lygiųjų raumenų susitraukimui išvengti. Pra÷jus 15 min., nustatytas pradinis FEV1. Tyrimo metu kas penkias minutes kartoti FEV1 matavimai, vertinant FEV1 kitimus lyginant su pradiniu dydžiu. FEV1 sumaž÷jus daugiau nei 20 proc. palyginus su pradiniais rodmenimis, tyrimas buvo nutraukiamas.
Skreplių indukcijai ultragarsinio purkštuvo talpa užpildyta 7 ml 3 proc. NaCl tirpalu, nustatyta purkštuvo galia 3 ml/min., inhaliacijos etapo trukm÷ − 7 min. Po kiekvieno inhaliacijos etapo paciento buvo prašoma atkos÷ti skreplių į sterilų indelį. Nepavykus atkos÷ti skreplių, sekančias 7 min. procedūra kartota skiriant 4 proc. NaCl tirpalą, v÷liau − 5 proc. NaCl tirpalą. Atkos÷ti indukuoti skrepliai surinkti į sterilią Petri l÷kštelę, laikomą ant ledo, ir nedelsiant gabenti tolimesniam paruošimui ir tyrimui.
3.2.3 Fibrobronchoskopijos ir bronchoalveolinio lavažo metodika
FBS ir BAL atlikti asmenims, kuriems nustatytas podilatacinis FEV1 ≥30 proc. b.d. bei netur÷jusiems kontraindikacijų FBS atlikti.
Tiriamųjų paruošimas FBS ir BAL, procedūrų eiga
Procedūra atlikta pagal standartinį protokolą, adaptuotą tyrimui [11, 162]. Tiriamiesiems prieš FBS atlikti visi privalomi tyrimai. Tiriamieji nerūk÷ ne mažiau nei 10 val. ir nevalg÷ ne mažiau nei 6 val. iki FBS procedūros. Iki tyrimo pradžios likus 30 minučių, tiriamieji įkv÷p÷ 400 µg salbutamolio (Ventolin ®; Glaxo Wellcome). Tiriamiesiems prieš FBS skirta premedikacija: 0,5−1,0 mg atropino sulfato (Sanitas; Kaunas, Lietuva) į/v, 2,5−7,5 mg midazolamo (Dormicum ®; Roche) į/v. FBS atlikta vietin÷je 2 proc. lidokaino tirpalo (Grindex; Riga, Latvija) nejautroje, pacientui pusiau s÷dint. Tyrimo metu sekti gyvybinių funkcijų rodikliai: širdies susitraukimų dažnis ir SaO2. FBS metu SaO2 sumaž÷jus <90 proc., skirtas deguonis per nosinį kateterį, siekiant atstatyti SaO2. Tai padaryti nepavykus, tyrimas buvo nutraukiamas.
(viso 140 ml) sterilaus 0,9 proc. NaCl tirpalo. Kiekviena NaCl tirpalo porcija nedelsiant buvo atsiurbta atgal į švirkštą. Atsiurbtas BAL skystis surinktas į 50 ml polipropileno m÷gintuv÷lius, laikomus ant ledo, ir nedelsiant gabentas tolimesniam paruošimui ir tyrimui.
3.2.4 Limfocitų potipių tyrimas
Tirta IS, BAL skysčio ir PK limfocitų populiacijų sud÷tis − limfocitų po-tipiai.
Limfocitų potipių tyrimo etapai:
1. Bendro limfocitų populiacijos kiekio tyrimas (IS ir BAL skystyje tirtas taikant citomorfologinį metodą, o PK-je − atliekant hematologinį pilno kraujo vaizdo tyrimą);
2. Limfocitų potipių sud÷ties tyrimas (įvertinimas procentais nuo bendro limfocitų populiacijos kiekio, taikant imunofenotipavimą t÷km÷s citometrijos metodu);
3. Limfocitų potipių absoliučių dydžių apskaičiavimas.
3.2.4.1 Indukuotų skreplių limfocitų potipių tyrimas IS pa÷mimas
Skrepliai tyrimui surinkti skreplių indukcijos procedūros metu. Detalus aprašymas pateiktas 3.2.2 skyriuje.
IS paruošimas
Skrepliai atskirti nuo seilių priemaišų ir sumaišyti su 0,1 proc. ditiotreitolio tirpalu (DTT; Sigma-Aldrich, Vokietija). Įpylus 4 kartus didesnį kiekį nei skreplių svoris, maišyta 15 min. kambario temperatūroje. Po maišymo įpilta fosfatinio buferio tirpalo (PBS; Sigma-Aldrich, Vokietija), kurio kiekis buvo toks pats, kaip prieš tai naudoto DDT tirpalo. Sumaišyta suspensija filtruota per 40 µm nailoninį filtrą (Milipore; North
Ryde, Australija). Naudojant Neubauerio hemocitometrą ir mikroskopą B5
Professional (Motic; Kinija) Nustatytas ląstelių gyvybingumas (Trypano
tyrimui), o kita dalis − limfocitų potipiams įvertinti (limfocitų imuno-fenotipavimui).
IS citomorfologinis tyrimas (metodas ir vertinimas)
Citomorfologiniam tyrimui ląstelių preparatai (citospinai) ruošti naudojant citocentrifugą Cytospin 2 (Shandon Scientific; Sewickley, JAV). Ląstelių preparatai dažyti standartizuotu May-Grünvald-Giemsa metodu. Analiz÷ atlikta atsitiktinai pasirinktame lauke mikroskopuojant ląsteles šviesiniu mikroskopu B5 Professional (Motic; Kinija), naudojant ×10 objektyvą lauko pasirinkimui ir ×100 aliejaus imersinį objektyvą objektyviai ląstelių morfologijai ir sud÷čiai vertinti. Ląstel÷s vertintos pagal standar-tinius morfologinius kriterijus, branduolio ir citoplazmos granulių morfo-logines savybes [102]. Ląstelių sud÷tis vertinta skaičiuojant apie 400 ląstelių, į skaičiuojamą ląstelių kiekį neįskaičiuojant plokščiojo epitelio ląstelių. Citomorfologinio tyrimo metu vertintos visos ląstelių populiacijos (neutrofilų, eozinofilų, bazofilų, makrofagų ir limfocitų), tačiau šio tyrimo metu naudoti tik limfocitų populiacijos rezultatai. Tyrimo rezultatai reikšti, nurodant limfocitų populiacijų dydį procentais nuo bendro ląstelių skaičiaus bei absoliučius dydžius (n ląstelių/ml). Absoliutus IS limfocitų skaičius buvo naudotas IS limfocitų potipių absoliutiems dydžiams įvertinti.
IS limfocitų imunofenotipavimas: t÷km÷s citometrija (metodas ir vertinimas)
IS limfocitų imunofenotipavimas atliktas t÷km÷s citometrijos metodu, taikant tiesioginio dažymo metodiką (3.2.4.1.1 lentel÷) ir trispalvę cito-metrinę analizę FacsCanto t÷km÷s citometru (BD Immunocytometry
