LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Rokas Gervinskas
Kiaulių proliferacinės enteropatijos epizootinės situacijos
tyrimai ir vertinimas
Investigation and evalutaion of epizootic situation of
porcine proliferative enteropathy
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
DARBAS ATLIKTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kiaulių proliferacinės enteropatijos epizootinės situacijos tyrimai ir vertinimas“.
1. Yra atliktas mano paties
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Kiaulių proliferacinė enteropatija...9
1.1.1. Etiologija, epidemiologija ir patogenezė...10
1.1.2. Klinikiniai požymiai...11
1.1.3. Patologiniai anatominiai pokyčiai...12
1.1.4. Diagnostikos metodai...13
1.1.5. Gydymas ir profilaktika...14
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA……….16
2.1. Retrospektyvinė analizė...16
2.2. Epidemiologiniai ir klinikiniai tyrimai...17
2.3. Patologiniai anatominiai tyrimai...18
2.4. Molekulinės biologijos metodai...18
2.4.1. DNR išskyrimas, naudojant Genomic DNA Purification rinkinį...18
2.4.2. DNR išskyrimas, naudojant GeneJET Genomic DNA Purification rinkinį...19
2.4.3. Lizdinė PGR...20
2.4.4. DNR produktų elektroforezė...21
2.5. Statistinis duomenų apdorojimas...22
3. TYRIMŲ REZULATAI ... 23
3.1. Retrospektyvinės analizės rezultatai...23
3.2. Epidemiologinių tyrimų rezultatai...32
3.3. Klinikinių tyrimų rezultatai...33
3.4. Patologinių anatominių tyrimų rezultatai...35
4. REZULTATŲ APTARIMAS... ... ....36
IŠVADOS. ... 39
PADĖKA ... 40
SANTRAUKA
Kiaulių proliferacinės enteropatijos epizootinės situacijos tyrimai ir vertinimas Rokas Gervinskas
Magistro baigiamasis darbas
Kiaulių proliferacinė enteropatija (PE) – tai atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinamojo trakto liga, paplitusi visose pasaulio šalyse. Ją sukelia intraląstelinė bakterija L. intracellularis ir ši liga pasireiškia įvairaus laipsnio viduriavimu, plonųjų žarnų pakitimais ir pažeidimais, dideliu sergamumu ir gaištamumu, kas sukelia didelius ekonominius nuostolius. Todėl šio darbo tikslas nustatyti kiaulių proliferacinės enteropatijos sukeltos L. intracellularis epizootinę situaciją atjunkytų ir penimų amžiaus grupių kiaulėse, palyginant etiologiją kliniškai sveikų, sergančių ir nugaišusių kiaulių tarpe.
Darbas buvo atliktas LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute 2014-2017 metais. Retrospektyvinės analizės metu įvertinti 53 atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinimo trakto susirgimų atvejai (357 mėginiai), nustatyti 2003-2012 metais. Tyrimai Lawsonia intracellularis atžvilgiu buvo atlikti naudojant lizdinės PGR metodą.
Atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinamojo trakto susirgimai buvo analizuoti tiriant apkrėstumą lavsonijomis tarp šių kiaulių grupių: sergančių ir nugaišusių. Nustatyta, kad virškinamojo trakto susirgimų atvejais nugaišusios atjunkytos kiaulės net 53,8 proc. atvejų yra užsikrėtusios L. intracellularis, kai tuo tarpu penimos nugaišusios apsikrėtusios 19,3 proc. atvejų. Sergančių atjunkytų kiaulių mėginiuose L. intracellularis randama 16,2 proc. atvejų, o sergančių penimų 14,1 proc. atvejų. Analogiški duomenys gauti tiriant tas pačias kiaulių grupes PE protrūkių atvejais. Atjunkytų nugaišusių kiaulių grupėje L. intracellularis teigiami buvo 77,8 proc. atvejų, penimų nugaišusių kiaulių grupėje 47,8 proc. atvejų. Sergančių atjunkytų kiaulių grupėje teigiami buvo 57,1 proc. atvejų, penimų – 43,5 proc.
Analizuojant kliniškai sveikų kiaulių apkrėstumą lavsonijomis, buvo tirti 138 fekalijų mėginiai, Tyrimai parodė, kad nustatytas apkrėstumas buvo nuo 4,7 proc. iki 50 proc.
Analizuojant iš užsienio įvežamų atjunkytų kiaulių apkrėstumą, tirtos Danijoje ir Estijoje gimusios kiaulės (n=40). Nustatyta, kad viena Danijoje gimusi kiaulė buvo apsikrėtusi L. intracellularis.
SUMMARY
Investigation and evaluation of epizootic situation of porcine proliferative enteropathy Rokas Gervinskas
Master‘s Thesis
Porcine proliferative enteropathy (PE) is a common cause of digestive tract disease of weaned piglets and fattening pigs in all parts of the world. It is caused by intracellular bacteria L. intracellularis, and this disease manifests by varying degrees of diarrhea, small bowel lesions and alterations, high morbidity and mortality, which causes significant economic losses. Therefore, the aim of this work is to determine the epizootic situation of pig proliferative enteropathy caused by L. intracellularis in piglets of weaned and fattening age groups, to compare the etiology of clinically healthy, diseased and dead pigs.
The research was carried out in Lithuanian University of Health Sciences, Microbiology and Virology during 2014-2017. From 2003 to 2012 fifty three cases of digestive tract disorders were analyzed (357 faeces samples were tested). The studies were carried using nested PCR method to identify L.intracellularis.
It has been determined that, 53.8 % dead weaned pigs and 19.3 % fattening ones were infected with L. intracellularis in the cases of gastrointestinal diseases. In samples of sick weaned and fattening pigs L. intracellularis was found in 16.2 % and 14.1 % respectively. Analogous data were obtained from the same groups of pigs in the case of PE outbreaks. In dead weaned and fattening pig groups positive samples were in 77.8% and 47.8% of cases respectively. In sick weaned and fattening pig group positive samples were in 57.1% and 43.5% cases respectively. L. intracellularis was more prevalent in weaned piglets than the fattening pig group.
Investigation of clinically healthy Lithuanian pigs showed that the prevalence of L. intracellularis ranged from 4.7 % to 50.0 % in different pig farm groups.
Investigation of imported Danish and Estonian pigs (n=40) showed that one Danish pig was infected with L. intracellularis.
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
DNR - deoksiribonukleorūgštis; PE - kiaulių proliferacinė enteropatija; PIA - kiaulių žarnyno adenomatozė;
PHE - proliferacinė hemoraginė enteropatija; NE – nekrotinis enteritas;
PGR - polimerazės grandininė reakcija; bp – nukleotidų bazinės poros;
UV – ultravioletiniai spinduliai;
ĮVADAS
Proliferacinė enteropatija yra kiaulių enterinė liga, kurią sukelia viduląstelinė bakterija Lawsonia intracellularis (9). Lavsonijos sukelia viduriavimą, apsunkintą augimą, retais atvejais staigią kiaulių mirtį ir yra svarbi kiaulininkystei visame pasaulyje (8).
Kiaulių auginimas yra viena reikšmingiausių ne tik Lietuvoje, bet visame pasaulyje gyvylininkystės šakų. Kiaulininkystės rentabilumas pastaruosius metus svyruoja ir tai ženkliai įtakoja kiaulių ligos. Infekcinės kilmės susirgimai sudaro virš 50% kiaulių ligų ir tai be abejo kenkia ūkių ekonomikai (1).
Kiaulių proliferacinė enteropatija (PE) nustatoma daugumoje Lietuvos ūkių (1), o jos identifikavimą apsunkina tai, kad tai yra parazitinė viduląstelinė bakterija (Lawsonija intracellularis). Ji plinta per kontaktą su užkrėstomis kiaulėmis ar per jų fekalijas, o šio užkrato inkubacinis periodas trunka 2-3 savaites (2, 21).
PE liga serga kiaulės ir arkliai, o sukėlėjų nešiotojais būna šunys, žiurkės, avys bei kai kurie laukiniai gyvūnai (3, 8). Sukėlėjas prasiskverbia į jautraus gyvūno epitelinių žarnyno ląstelių citoplazmą, ten dauginasi ir keliauja į naujas ląsteles bei su fekalijomis išeina į išorę ir ieško kitų šeimininkų. Kiaulėms (jautriausi 2-5 mėnesių amžiaus) žarnyne susidaro negyvų enterocitų proliferacija, gyvūnai viduriuoja, pasireiškia žarnų sustorėjimai, apatija, sumažėja apetitas ir svorio prieaugis, nekrozuoja gleivinė, būklė blogėja (4, 21). Liga daugiausia kontroliuojama antibiotikų gydymu ir vakcinacija bandoje.
Lietuvoje tyrimai proliferacinės enteropatijos sukėlėjo atžvilgiu molekulinės diagnostikos metodais atliekami tik LSMU VA Mikrobiologijos ir Virusologijos Institute. Ligos sukėlėjas diagnozuojamas taikant lizdinės PGR metodiką, kurios metu nedidelis L.intracellularis DNR kiekis padauginamas daugybę kartų .Tai leidžia greitai ir nenaudojant ląstelių kultūrų metodo identifikuoti sukėlėją ir diagnozuoti ligą tiriamoje medžiagoje, net jei joje yra tik sukėlėjo pėdsakų. Darbas aktualus tuo, kad Lietuvoje iki šiol nebuvo atliekama retrospektyvinė kiaulių sergamumo analizė ir netirtos kliniškai sveikos ir iš užsienio į Lietuvos ūkius atvežamos kiaulės.
Darbo tikslas: Atlikti kiaulių proliferacinės enteropatijos epizootinės situacijos tyrimus ir vertinimą.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti retrospektyvinę analizę įvertinant sergančių ir nugaišusių, atjunkytų ir penimų kiaulių apkrėstumą L. intracellularis;
2. Įvertinti kiaulių proliferacinės enteropatijos epizootinę situaciją kliniškai sveikų penimų kiaulių populiacijose;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
KIAULIŲ PROLIFERACINĖ ENTEROPATIJA
Proliferacinė enteropatija (PE) yra kiaulių enterinė liga, kurią sukelia intraląstelinė bakterija Lawsonia intracellularis (9). Lawsonia intracellularis sukelia PE daugelyje žinduolių rūšių, bet dažniausiai pastebima kiaulėse. Infekcija sukelia viduriavimą, lėtą augimą ir, retais atvejais, staigią kiaulių mirtį. Tai yra viena iš ekonomiškai svarbiausių kiaulių ligų pasaulyje. Liga pasižymi plonųjų žarnų, o kartais ir storosios žarnos gleivinės audinio sustorėjimu. Kiti skiriamieji požymiai apima žarnyno kriptų nesubrendusių epitelio ląstelių proliferaciją, sudarant hiperplazinę į adenoma panašią gleivinę. Histologiniai pažeidimai gali būti patvirtinti kaip lavsonijoms specifiniai, vizualizuojant mažas, vibrioidinės formos bakterijas, randamas enterocituose distaliniam klubinės žarnos gale, aklojoje ir gaubtinėje žarnoje, taip pat makrofaguose, esančiuose lamina propria tarp žarnyno kriptų ir mezenterinės limfos mazgo (8).
Yra keletas skirtingų PE sindromų, priklausomai nuo dominuojančių požymių. Kiaulių žarnyno adenomatozė (PIA) laikoma lėtine PE forma, daugiausiai veikiančia jaunesnes, augančias kiaules. Proliferacinė hemoraginė enteropatija (PHE) dažnai pasireiškia suaugusioms kiaulėms ir yra klasifikuojama kaip ūminė PE, dėl kurios atsiranda kraujingas viduriavimas, kraujo krešuliai ir staigi mirtis. Nekrotinis enteritas (NE) yra mažiau paplitęs nei PIA ir PHE ir pasireiškia kiaulėms, kurių gleivinės yra stipriai sustorėjusios su rusvai geltonais nekroziniais pažeidimais ant apatinio paviršiaus. Buvo aprašyta dar viena PE forma kiaulėms, kuriose L. intracellularis infekcija yra subklininė (nėra ligos požymių) ir kiaulės išlieka nešiotojo būsenos, pastebimas sumažėjęs svorio priaugimas (12).
PE dažniausiai pasireiškia kiaulėms; tačiau ji taip pat buvo aprašyta žiurkėnuose, šeškuose, triušiuose, lapėse, šunyse, žiurkėse, arkliuose, avyse, elniuose, emuose, stručiuose, primatuose ir jūrų kiaulytėse. Žarnyno pažeidimai yra panašūs visose minėtose rūšyse, o intraląstelinių bakterijų, identifikuotų kaip L. intracellularis proliferaciniam epitelyje. Nepaisant visur esančio panašumo, L. intracellularis niekada nebuvo identifikuotas žmonėms su enterine liga, net ir tiems, kurie serga Krono ar kitomis susijusiomis ligomis, pvz., gaubtinės žarnos vėžiu. Todėl lavsonijom specifinė PE nėra laikoma zoonozine liga (8).
1.1.1. Etiologija, epidemiologija ir patogenezė
Pagrindinis veiksnys, kuris sukelia proliferacinę enteropatiją, yra intraląstelinės bakterijos L. intracellularis (6, 9). Ligą makroskopiškai apibūdina žarnyno gleivinės sustorėjimas dėl enterocitų proliferacijos. Dėl to lengvas ar sunkus viduriavimas yra pagrindinis klinikinis simptomas, apibūdintas paveiktuose gyvūnuose (7,12).
Apie PE pirmą kartą buvo pranešta 1931 m., kaip kiaulių žarnyno adenomą. Vėliau paskelbtos ataskaitos buvo skirtos tik laboratoriniams žiurkėnams, kuriuose PE buvo vadinamas „šlapia uodega“ (angl. wet-tail disease), remiantis paveiktų gyvūnų perianalinio regiono išvaizda. Buvo manoma, kad bakterijos ar virusai yra priežastiniai veiksniai dėl enzootinės charakteristikos, pastebėtos PE protrūkių metu. 1970-ųjų pradžioje Jungtinėje Karalystėje G. H. K. Lawson'o grupė tyrė lauko PE protrūkius kiaulėse, o po to proliferacinių pažeidimų metu buvo pastebėta, kad intraląstelinės bakterijos yra paveiktose kiaulėse. Tik 1993 m. ši intraląstelinė bakterija buvo izoliuota ląstelių kultūroje iš užkrėstų kiaulių, naudojant Lawson grupės žiurkių enterocitų ląstelių liniją, ir liga buvo atkurta, tenkinant Kocho postulatus. Po sėkmingo išauginimo ir palaikymo in vitro, nustatyta nauja gentis ir rūšis, o organizmas buvo pavadintas Dr. Lawsono garbei Lawsonia intracellularis vardu (6, 7).
L. intracellularis auga žarnyno epitelio ląstelėse ir kol kas jų nepavyko išauginti mitybiniuose terpių agaruose, kaip daugumą kitų bakterijų. Jos morfologija ir patekimo procesai į šeiminko epitelio ląsteles yra panaši į kai kurias kitas intraląstelines bakterijas, kaip tarkim Rickettsia rūšies bakterijos. Lavsonijos bakterijų augimas priklauso nuo šeiminko ląstelių, greičiausiai del iš anksto paruoštų trifosfatų ar kito enegerijai reikalingo šaltinio, tai yra lengvai pastebima, kai natūraliuose pažeidimuose pastebimos bakterijos (3, 4, 6).
L. intracellularis priklauso Desulfovibrionaceae šeimai. L. intracellularis yra klasifikuojama kaip gram neigiamos, sporų neformuojanti, mikroaerofilinė, lenktos formos lazdelė ir yra privalomai intraląstelinė bakterija (7, 11). Bakterija yra 1.25 - 1.75 µm ilgio ir 0.25 to 0.43 µm pločio, pasižymi trilaminariniu išoriniu dangalu (7, 10). In vitro buvo įrodyta, kad turi vieną unipolinį žiuželį (4, 19). Privalomai intraląstelinių mikroaerofilinių bakterijų auginimas yra sudėtingas ir šiuo metu jį atlieka tik kelios laboratorijos visame pasaulyje (19). Bakterijos yra randamos užkrėstų enterocitų viršutinėje membranoje ir paprastai yra asocijuojamos su laisvomis ribosomomis ir išsibarsčiusiomis mitochondrijomis (7).
Lawsonia intracellularis, kiaulių proliferacinės enteropatijos sukėlėjas, yra plačiai paplitęs kiaulių populiacijose visame pasaulyje. Nustatyta, kad serologinis paplitimas tarp galvijų yra nuo 57
proc. iki 100 proc. L. intracellularis, gali atsirasti su įprastais ligos požymiais, tačiau dažniausiai vyrauja infekcija be klinikinių simptomų (12). Nustatomas ligos paplitimas ir infekcija L. intracellularis priklauso nuo naudojamo diagnostikos metodo. Skerdimo patikrinimai, grindžiami bendra patologija, parodė, kad apie 5 - 20 proc. kiaulių persirgę PE (22, 23). Tačiau atliekant nugaišusių kiaulių skrodimą nepakankamai įvertinamas PE, nes ligos sukeliami patologiniai anatominiai pokyčiai pastebimi po dviejų – keturių savaičių nuo klinikinių požymių atsiradimo (24). Jungtinėje Karalystėje ir Australijoje ūkininkų ir veterinarijos gydytojų apklausa parodė, kad klinikinė liga paplitusi tarp 30 ir 56 proc. bandų. Nevakcinuotų kiaulių bandų serologiniai tyrimai parodė, kad 80 - 100 proc. kiaulių turi antikūnus prieš L. intracellularis. Tuo tarpu, kiaulių bandų tyrimai naudojant polimerazės grandininę reakciją parodė, kad nuo 4,5 proc. iki 45 proc. bandų buvo infekuotos L. intracellularis, o užkrėstų gyvūnų paplitimas svyravo nuo 3,3 proc. iki 12 proc. Diagnostiniai tyrimai taip pat skiriasi jų gebėjimu diagnozuoti klinikinę ligą, subklinikinę ligą ar kitokią L.intracellularis infekciją. Gebėjimas interpretuoti infekcijos paplitimo tyrimus bandose padės gamintojams nukreipti ligos kontrolės strategijas į tinkamą kiaulių amžių grupę ir sumažinti nereikalingą antibiotikų vartojimą (21).
Apsikrėtus L. intracellularis prasideda plonosios klubinės žarnos dalies epitelio kolonizacija, vystosi adenomatinis gleivinės sustorėjimas, po kurio vėlesnis uždegimas apima akląją ir gaubtinę žarnas. Mikroskopiškai pasikeitęs epitelis labai koreliuoja su L.intracellularis buvimu ir yra hipotezė, kad šios bakterijos užkrečia mitotiškai aktyvias žarnyno kriptų ląsteles ir dauginasi jose. Infekcija sukelia kriptinių epitelio ląstelių proliferaciją ir slopina jų diferencijavimą į subrendusius enterocitus. Užkrėstos ląstelės atsiskiria savo migracijos į gaurelių paviršių metu ir tada jos su žarnyno gleivėmis ir kitu turiniu yra pernešamos tolyn, ir tai sudaro pagrindą naujų kriptinių epitelio ląstelių infekcijai (2).
1.1.2. Klinikiniai požymiai
Klinikiniai PIA atvejai dažniausiai stebimi 6-20 savaičių nujunkytiems paršeliams (15). Pagrindiniai PIA požymiai yra anoreksija, viduriavimas ir prastas augimas, kuris išlieka kelias savaites (14). PE forma dažnai pasireiškia viduriavimu, kuris atsiranda dėl didelių patologinių žarnyno pažeidimų. Toks viduriavimas kliniškai nepasižymi patognostiniais požymiais. PIA endeminėse bandose kiaulės suvartoja normalų kiekį pašaro, tačiau priesvoriai ir pašarų įsisavinamumas būna mažesni. Labai užkrėstos kiaulės dažnai siejamos su skirtingo lygmens gleivinės sustorėjimais arba plonosios žarnos nekroziniais pažeidimais (8).
PHE atvejai dažniausiai pasitaiko jaunoms nuo 4 iki 12 mėnesių amžiaus suaugusioms kiaulėms. Juodos dervos spalvos išmatos yra pirmasis pastebimas klinikinis požymis, po kurio seka rausvo atspalvio, vandeningos išmatos. Tačiau, kai kurios kiaulės miršta be išmatų pakitimų pasireiškimo. Apskaičiuota, kad pusė kiaulių, kurios paveiktos PHE, miršta, o kita pusė atsigauna per trumpą laiką be matomų sumažėjusio svorio ar pablogėjusios būklės požymių (8).
Subklinikinė PE galimai labiausiai paplitusi kiaulių liga tarp augančių kiaulių, tačiau ši būklė retai atpažinama, nes apsikrėtusioms kiaulėms nepastebimi klinikiniai požymiai. Ši PE forma, labai panaši į PIA, yra apibrėžiama kaip aktyvi L. intracellularis infekcija, esant mikroskopiniams ir (arba) dideliems pažeidimams, dėl kurių sumažėja produktyvumas (vidutinis paros prieaugis ir pašaro efektyvumas), nes nėra pastebimų klinikinių ligos požymių kaip su PE susijęs mirštamumas, viduriavimas ar kiti simptomai, atitinkantys PE sergamumą (12). Subklinikinės L. intracellularis infekcijos gali arba negali būti nustatytos serologinių arba polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodais, nes kiaulės gali būti užsikrėtusios, bet nepakankamai, kad paskatintų išskyrimą ar serokonversiją.
Yra įvairių žarnyno ligų, kurios turi panašių klinikinių simptomų kaip PE formos. Tai apima hemolizinio žarnyno sindromą (HBS), kolibakteriozę, kiaulių cirkovirusų PCV-2 ligas, kiaulių transmisinį virusinį gastroenteritą, rotavirusinę infekciją, salmoneliozę ir kiaulių dizenteriją. Todėl svarbu atskirti visus bendruosius veiksnius atliekant išsamų post mortem tyrimą ir atliekant tinkamus diagnostinius įvertinimus (7).
1.1.3. Patologiniai anatominiai pokyčiai
Visoms PE formoms būdingi histopatologiniai pažeidimai apibūdinami adenomatine epitelio proliferacija plonųjų žarnų ir storųjų žarnų gleivinės kriptose, taip pat lavsonijų buvimu šiuose enterocituose (14). Kriptos yra pailgos, išsiplėtusios ir išklotos su perpildytomis nesubrendusiomis epitelio ląstelėmis su mitoziniais pokyčiais. Taurinių ląstelių nėra paveiktam epitelyje, o uždegiminių ląstelių infiltracija nėra įprasta PE charakteristikai. Proliferuojančiuose epitelio ląstelėse yra intracitoplazminės, lieknos, kreivos lazdelės formos bakterijos (8, 15).
Visoms jautrioms gyvūnų rūšims būdingas patologinis požymis yra nesubrendusių epitelio ląstelių proliferacija klubinės ar gaubtinės žarnos kriptose, dėl ko atsiranda kriptų sustorėjimas ir šakojimasis, bei didelis gleivinės sustorėjimas. Bakterijos visada yra proliferacinių enterocitų citoplazmoje (15). Dideli pažeidimai nuolat stebimi klubinės žarnos gale, tačiau pasitaiko ir distalinėje
tuščiosios žarnos dalyje, proksimalinėje spiralinėje gaubtinės žarnos dalyje ir aklojoje žarnoje. Labiausiai būdingas sunkus pažeidimas yra gleivinės sustorėjimas su netaisyklingo mazgo ar sulankstytos formos išvaizda. Labiausiai pavojingais atvejais gleivinė gali būti iškraipytos granuliuotos išvaizdos su prilipusiomis fibrino nuosėdomis. Proliferaciniai pažeidimai būdingi visom ligos formoms, tačiau PHE formoje stebimas didelis kraujosrūvų kiekis su opomis ir žarnų turinys su kraujo krešuliais.
1.1.4. Diagnostikos metodai
Daugelį metų PE buvo diagnozuojama tik remiantis klinikiniais ir patologiniais anatominiais tyrimų metodais, nes viduriavimas ar makroskopinis ir mikroskopinis žarnų tyrimas, buvo vienintelis būdas nustatyti, ar kiaulės buvo paveiktos ligos, deja neleidžiantis diferencijuoti infekcinio ir neinfekcinio PE. Atsižvelgiant į jautrių ir specifinių diagnostinių metodų atsiradimą, buvo imtasi naujų žingsnių siekiant nustatyti L. intracellularis infekcijas ir PE paplitimą kiaulių bandose. Šie metodai padėjo veterinarams ir kiaulių augintojams geriau nustatyti, kada įgyvendinti kontrolės ir prevencijos priemones bandose, kuriose PE yra endeminis (8).
Histopatologija ir audinių pjūvių dažymas buvo naudojami kaip labiausiai paplitę diagnozavimo metodai mikroskopinių pažeidimų nustatymui ir L. intracellularis infekcijų morfologiniams ypatumams nustatyti. Nuo tada yra atsiradę, jautresni ir specifiškesni aptikimo būdai, tokie kaip polimerazės grandininė reakcija (PGR), imunohistocheminė imunofluorescencijos metodai (11, 12, 14). Be to, PE gali būti diagnozuotas molekuliniais metodais, tokiais kaip in situ hibridizacija (ISH) su lavsonia specifiniais oligonukleotidiniais zondais. Immunohistochemija (IHC) ir ISH abu gali susieti pažeidimus su sukeliamųjų bakterijų buvimu (5).
PGR yra jautri, molekuliniu pagrindu sukurta DNR nustatymo metodika, leidžianti aptikti infekciją esant mažai mikrobinių patogenų koncentracijai, ypač intraląstelinių organizmų tarpe (16). PGR buvo aprašytas kaip patogenui būdingas ir jautrus metodas L. intracellularis aptikimui išmatose ir audinių mėginiuose. Tačiau reikia nepamiršti, kad PGR nustato lavsonijas ir sveikstančių kiaulių fekalijų mėginiuose. Tačiau epidemiologiniams tyrimams PGR yra pagrindinis diagnostinis metodas, galintis aptikti subklinikinę infekciją (5).
PGR metodo esmė:
2. PGR pagalba net ir mažiausias sukėlėjo DNR kiekis padauginamas milijonus kartų, panaudojant sintetinių oligonukleotitų pradmenų rinkinius.
3. Galima detalizuoti kaip tai vyksta: reakcijos tirpale esanti dvigrandė DNR grandinė specialių fermentų pagalba aukštoje temperatūroje atsiskiria į viengrandines DNR, tada polimerazių pagalba žemesnėje temperatūroje ant šių DNR molekulių panaudojant tirpale esančius pradmenis vėl sintetinamos dvigubos DNR molekulės (amplifikacija). Procesas tame pat reakcijos mišinyje keičiant temperatūrinius režimus (prietaisas taip ir vadinasi – Termocikleris) kartojamas keliasdešimt kartų, atitinkamai iš vienos DNR molekulės kopijos galima gauti iki 10 (n laipsnyje) DNR kopijų. Už PGR metodo išradimą, 1993 metais Kary B. Mullis buvo apdovanotas Nobelio premija.
4. Ši padauginta sukėlėjo DNR perkeliama į elektroforezės gelį kur pagal analogiją su turimu standartu labai dideliu tikslumu identifikuojamas/fiksuojamas L.intracellularis DNR buvimas/nebuvimas tiriamame mėginyje.
5. Realaus laiko PGR metodo atveju elekroforezės nebeatliekamos, tikslinė DNR bei jos koncentracija nustatoma iškart reakcijos mišinyje specialaus prietaiso pagalba (real time PGR).
1.1.5. Gydymas ir profilaktika
L. intracellularis gali išgyventi įprastuose garduose bent dvi savaites esant 9 - 18 °C temperatūrai (25). Liga daugiausia kontroliuojama gydymu antibiotikais ir vakcinacija. Kuriant veiksmingas priemones, skirtas užkirsti kelią infekcijos sukėlėjų plitimui, labai svarbu susipažinti su mikroorganizmo pernaša ir išlikimu (18).
Gydymas: klinikinių kiaulių PE gydymas dažnai būna sėkmingas nuo ligos vidurio iki vėlyvos pabaigos stadijų. Gyvūnų, kuriems yra pasireiškę klinikiniai požymiai, gydymas turi būti vykdomas nedelsiant ir agresyvus. Tylosino ir linomicino injekciniai tirpalai yra dažniausiai naudojami antibiotikai, kai kiaulių sergamumas nedidelis. Kai kiaulių sergamumas didelis, antibiotikai suduodami su pašaru ar vandeniu gydymo/profilaktikos tikslais (pvz. chlortetraciklinas C su pašaru) (7, 9, 21). Tylanas (tylosinas), Denagardas (tiamulinas), Lincomixas (linkomicinas) ir KMT plus aureomicinas yra dažniausiai naudojami antibiotikai visame pasaulyje. Naudojant anksčiau aprašytus diagnostinius tyrimus apkrėstoms kiaulėms nustatyti, yra lengviau tinkamai parinkti geriamuosius antibiotikus ir sumažinti ekonominį ligos poveikį (7, 9, 21).
Profilaktika: prevencinės priemonės, kuriomis siekiama sumažinti kiaulių PE paplitimą kiaulių bandose, yra tinkamas sanitarijos, dezinfekcijos ir skiepijimo protokolų įgyvendinimas. Šiuo metu yra
vis plačiau naudojama gyva avirulentiškų lavsonijų vakcina Enterisol Ileitis, kuri vartojama su vandeniu. Norint, kad kiaulės įgytų imunitetą, vakcina turi būti skiriama keliomis savaitėmis anksčiau iki tikėtino apsikrėtimo lavsonijomis. Be to, keletui dienų prieš ir po skiepijimo antibiotikai neturi būti dedami į pašarus ar vandenį (8, 9).
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA
Darbas atliktas 2014-2017 metais.
Kiaulių proliferacinės enteropatijos epizootinės situacijos retrospektyvinė analizė, tyrimai ir vertinimas atliktas remiantis 2003-2012 metų laboratorinių (lizdinės PGR metodas) tyrimų duomenimis, o kliniškai sveikų kiaulių tyrimų analizė atlikta remiantis 2013-2015 metų klinikinių, epidemiologinių, patologinių anatominių ir laboratorinių tyrimų duomenimis. Laboratoriniai tyrimai buvo atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute, o L. intracellularis paplitimą kiaulių populiacijose įvertinti buvo naudojamas lizdinės PGR metodas.
2.1. Retrospektyvinė analizė
Retrospektyvinė analizė atlikta vertinant situaciją 26 kiaulininkystės ūkiuose, remiantis PGR tyrimų, atliktų 2003-2012 metais LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje, duomenimis.
Tyrimai atlikti kiaulių ūkiuose, auginančiuose įvairaus amžiaus kiaules, įtariant kiaulių proliferacinę enteropatiją. Gyvų sergančių atjunkytų paršelių (1-3 mėnesių amžiaus) ir penimų paršų (3-6 mėnesių amžiaus) patologinės medžiagos (fekalijų) mėginiai molekulinės biologijos tyrimams buvo paimti klinikinių tyrimų metu, o nugaišusių plonosios klubinės žarnos su specifine ar nespecifine patologija – patologinių anatominių tyrimų metu.
Iš viso tyrimams buvo analizuoti 357 skirtingi mėginiai. Tyrimai ligos atžvilgiu atlikti vieną arba daugiau kartų, priklausomai nuo to kiek ūkis kreipėsi. Iš viso mėginiai tirti 53 sergančių ir nugaišusių kiaulių virškinimo trakto susirgimo atvejais, pasitaikę atjunkytiems paršeliams ir penimoms kiaulėms. Mėginiai imti iš įvairaus amžiaus kliniškai sveikų kiaulių, siekiant nustatyti padidėjusio kiaulių sergamumo ir gaištamumo priežastis.
Retrospektyvinės analizės metu pirmu etapu įvertintas lavsonijų etiologinis vaidmuo ir palygintas paplitimas sergančių ir nugaišusių, atjunkytų paršelių ir penimų paršų grupėse visais virškinamojo trakto susirgimų atvejais.
Antro etapo metu analizuotas teigiamų L. intracellularis atžvilgiu mėginių pasiskirstymas sergančių ir nugaišusių, atjunkytų paršelių ir penimų paršų grupėse visais virškinamojo trakto susirgimų atvejais.
Trečiu etapu analizuotas teigiamų L. intracellularis atžvilgiu mėginių pasiskirstymas sergančių ir nugaišusių, atjunkytų paršelių ir penimų paršų grupėse PE atvejais.
2.2. Epidemiologiniai ir klinikiniai tyrimai
Darbo metu įvertinta situacija einamuoju laikotarpiu remiantis PGR tyrimų rezultatais 2013-2015m.
Analizuojant duomenis vertintas L. intracellularis teigiamų mėginių skaičius skirtingo amžiaus kiaulių grupėse bei sergančių ar užsikrėtusių individų skaičius bendroje kliniškai sveikų gyvulių grupėje.
Gyvų kliniškai sveikų/sveikų atjunkytų paršelių (1-3 mėnesių amžiaus) ir penimų kiaulių (3-6 mėnesių amžiaus) patologinės medžiagos (fekalijų) mėginiai molekulinės biologijos tyrimams buvo paimti klinikinių tyrimų metu.
Atliekant epidemiologinius tyrimus buvo kreipiamas dėmesys į tiriamų kiaulių klinikinę būseną, ligų požymius ir simptomus būdingus PE susirgimams – viduriavimą, nepakankamą ar lėtą svorio prieaugį, gaištamumą, ūkiuose dirbančio personalo atsiliepimus apie virškinamojo trakto susirgimus ir jų dažnį.
Tyrimų metu išanalizuota atskirų amžiaus grupių (atjunkytų ir penimų) kiaulių sergamumas ir gaištamumas. Aiškintasi, kokios profilaktikos, sanitarinės ir terapijos priemonės taikytos pastarųjų metų laikotarpyje. Domėtasi, ar buvo į bandą įvedami nauji gyvuliai, iš kur, ar buvo domimasi infekcine situacija jų kilmės vietoje. Atsižvelgiant į tai buvo vertinami gauti rezultatai. Tiriamuose ūkiuose kiaulių grupėse susirgdavo iki 100 procentų bandos ir pastoviai gaišdavo 10-15 procentų atjunkytų ir penimų kiaulių.
Klinikinių tyrimų metu buvo imami kliniškai sveikų ir sergančių kiaulių fekalijų mėginiai, siekiant įvertinti PE užkrato dažnį ūkyje, infekcijos plitimą ir jos užkrečiamumą. Fekalijų mėginiai buvo imami tuose pačiuose garduose tą pačią dieną iš kartu laikomų kliniškai sveikų ir sergančių kiaulių ir taip pat iš transporto priemonių įvežamų kiaulių atveju. Mėginiai buvo paimami iš tų gardų, kuriuose infekcijos klinikiniai požymiai nustatyti tiriamojoje kiaulių amžiaus grupėje anksčiausiai.
2.3. Patologiniai anatominiai tyrimai
Patologinių anatominių tyrimų atvejais buvo imami mėginiai iš nugaišusių atjunkytų (1-3 mėnesių amžiaus) paršelių ir penimų (3-6 mėnesių amžiaus) kiaulių, kurioms buvo įtariama L. intracellularis infekcija. Tyrimų metu buvo atkreipiamas dėmesys į PE būdingus pakitimus. Buvo tiriami patologiniai mėginiai iš plonųjų žarnų (klubinės žarnos gleivinė). Iš viso buvo ištirti 70 nugaišusių įvairaus amžiaus kiaulių (kiaulių amžius 1-6 mėnesiai) plonųjų žarnų mėginiai.
2.4. Molekulinės biologijos metodai
Buvo tirti mėginiai iš 357 sergančių ir nugaišusių kiaulių 26 kiaulininkystės ūkiuose ir buvo tirti 138 mėginiai kliniškai sveikų kiaulių 3 skirtinguose ūkiuose ir įvežamose kiaulėse į Lietuvą skirtingu laikotarpiu ir skirtingo amžiaus grupėse.
Iš viso buvo ištirti ir įvertinti 357 mėginiai 53 skirtingų ligų protrūkio atvejais ieškant PE infekcijos sukėlėjo ir 138 mėginiai kliniškai sveikų ir įvežamų kiaulių. Remiantis gautais duomenimis buvo vertinama L. intracellularis paplitimo kiaulių ūkiuose statistika.
Kiaulių proliferacinės enteropatijos sukėlėjo Lawsonia intracellularis identifikavimui tiriamuose mėginiuose buvo naudojamas lizdinės PGR metodas.
DNR išskyrimui naudoti keli skirtingi metodai.
2.4.1. DNR išskyrimas, naudojant Genomic DNA Purification rinkinį
Pradiniuose tyrimuose DNR išskyrimas buvo atliekamas naudojant UAB Thermo Fisher Scientific Baltics rinkinį.
Į eppendorfo mėgintuvėlį įlašinama 0,2 ml tiriamojo DNR mėginio ir įlašinama 0,4 ml lizuojančio buferio. Mėgintuvėlis patalpinamas į termomikserį ir mišinys inkubuojamas 65 ºC 5 min. Po to į reakcijos mišinį įdedama 0,6 ml chloroformo ir reakcijos mišinys maišomas vartant mėgintuvėlį 3-5 kartus.
Toliau mėgintuvėlis su reakcijos mišiniu centrifuguojamas 2 min. 12000 x g. Susidariusi viršutinė skysta reakcijos fazė, kurios sudėtyje yra DNR, pernešama į naują mėgintuvėlį. Naujasis reakcijos mišinys atskiedžiamas praskiestu šviežiai pagamintu precipitacijos tirpalu: 0,72 ml vandens be nukleazių sumaišoma su 0,08 ml koncentruoto precipitacijos tirpalo. Taip gaunamas darbinis precipitacijos tirpalas.
Į tiriamą mėgintuvėlį įdedama 0,8 ml darbinio precipitacijos tirpalo ir maišoma 1-2 min. Mėgintuvėliai centrifuguojami 2 min. 12000x g.
Reakcijos skystis iš mėgintuvėlių išpilamas. Mėgintuvėlio dugne nusėdusi po centrifugavimo tiriamoji DNR atskiedžiama su 0,1 ml NaCl tirpalo. Įdedama 0,3 ml atvėsinto etanolio ir paleidžiama DNR precipitacijos reakcija (10 min. -20ºC).
Toliau mėgintuvėliai centrifuguojami 4 min. 12000x g. Tirpalas iš mėgintuvėlių vėl nupilamas, o susidariusios nuosėdos plaunamos su 70% šaltu etanoliu tirpalu.
DNR ištirpinama įlašinant 0,1 ml vandens be nukleazių. Surinkta išgryninta DNR naudojama PGR tyrimui.
2.4.2. DNR išskyrimas, naudojant GeneJET Genomic DNA Purification rinkinį
Tiriamosios DNR išskyrimas iš tiriamų patologinių mėginių buvo atliekamas naudojant GeneJET Genomic DNA Purification Kit DNR gryninimo rinkinį (kat. nr. K0721, Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Lietuva). Atsižvelgiant į gamintojo rekomendacijas buvo naudojamas DNR išskyrimo A protokolas.
Į GeneJET 1,5 ml mėgintuvėlį įpilama 20 mg tiriamojo mėginio, užpilama 0,18 ml specialaus virškinamojo tirpalo ir 0,02 ml proteinazės K tirpalo. Reakcijos mišinys sumaišomas iki vienalytės masės ir mėgintuvėliai perkeliami į termokratyklę 15‘ai min 56 °C temperatūroje.
Praėjus šiam laikui reakcijos mėginiai išimami ir į jį įdedama 20 μl RNase A tirpalo, viskas išmaišoma ir 10 min. palaikoma kambario temperatūroje.
Tada į mišinį pridedama 0,2 ml lizavimo tirpalo, maišoma dar 15s iki homogeninės konsistencijos susidarymo.
Į tiriamąjį mėgintuvėlį įpilama 0,4 ml 50 proc. etilo alkoholio ir vėl maišoma.
Gautas mišinys perkeliamas į specialius „GeneJET Genomic DNA purification“ rinkinio mėgintuvėlius, sudarytus iš dviejų atskirų mėgintuvėlių, kuriuos skiria specialus filtras. Mėgintuvėliai centrifuguojami 1 min. 6000x g.
Nufiltruotas mišinys išmetamas su apatine mėgintuvėlio dalimi, o viršutinė dalis su filtru patalpinama į naują 2 ml surenkamąjį mėgintuvėlį. Ant viršaus užpilama 0,5 ml plovimo buferio ir centrifuguojama 1 min 8000x g.
Nufiltruotas mišinys su surenkamuoju mėgintuvėliu išmetamas, ant viršutinės mėgintuvėlio dalies užpilama 0,5 ml antrojam plovimui skirto buferinio tirpalo bei centrifuguojama 3 min. 12000x g.
Po to viršutinė mėgintuvėlio dalis perkeliama į naują 1,5 ml mėgintuvėlį, į mėgintuvėlį lašinama 0,2 ml specialaus DNR išplovimui iš filtro reikalingo buferio. Paruošti mėgintuvėliai laikomi 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojami 1 min 8000x g.
Po šios procedūros viršutinė mėgintuvėlio dalis išmetama, o apatinėje dalyje surinktas išskirta DNR naudojama PGR tyrimams arba užšaldoma –20°C temperatūroje.
2.4.3. Lizdinė PGR
L. intracellularis infekcijoms diagnozuoti taikytas vieno mėgintuvėlio lizdinės PGR metodas. PGR panaudoti pradmenys iš L. intracellularis genomo p78 fragmento.
Pirmiausia paruoštas mišinys su lizdinės PGR pradmenimis ir perkeltas į PGR mėgintuvėlius, bei paliktas išdžiūti per naktį. Šis mišinys paruoštas pridedant:
- 5 μl 22 proc. trechalozės (D-(+)-Trehalose dihydrate kat. nr.T9531, Sigma-Aldrich, JAV), - 1 μl C pradmuo (20pmol/1,0 μl) 5’-TTACAGGTGAAGTTATTGGG-3’
- 1 μl D pradmuo (20pmol/1,0 μl) 5’-CTTTCTCATGTCCCATAAGC-3’
- 1 μl dNTPs mišinio (dNTP Mix (10 mM each), kat.nr. R0192, Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva)
- 0,25 μl Taq DNR polimerazė (Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U/μL), kat. Nr EP0402, Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Lietuva).
Kitame etape ruošiamas lizdinei PGR reikalingas reakcijos mišinys (47 μl/ vienam mėginiui): - 26 μl vandens be nukleazių (water, nuclease-free, kat. nr. R0581, Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Lietuva),
- 5 μl PGR buferinio tirpalo (10 Mm Tris- HCl [Ph 8,3] 50 Mm KCl, 1,5 Mm MgCl2, UAB
Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva)
- 12 μl MgCl2 (25 Mm), (UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva) - 0,25 μl Ajon pradmuo (20pmol/1,0 μl) 5’TATGGCTGTCAAACACTCCG-3’ - 0,25 μl Bujon pradmuo (20pmol/1,0 μl) 5’TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3’
- 0,5μl dATP (10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva)
- 0,5 μl dGTP (10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB Thermo Fisher Scientific Baltics , Lietuva)
- 0,5 μl dCTP (10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva)
- 0,5 μl dTTP(10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva)
- 1 μl 10 proc. tritono (Triton™ X-100 for molecular laboratory grade, kat. nr. T8787, Sigma-Aldrich, JAV)
- 0,5 μl Taq DNR polimerazė (Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U/μL), kat. Nr EP0402, UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva).
Į paruoštus mėgintuvėlius lašinamas PGR mišinys, o ant jo viršaus – 1 ar 2 lašai aliejaus (Mineral oil – PCR Reagent, kat. nr. M8662, Sigma – Aldrich, JAV), kad reakcijos mišinys neišgaruotų. Tada pridedama po 3 μl DNR išskirtos iš tiriamųjų mėginių.
Lizdinės PGR reakcijos atlikimui naudotas Eppendorf Mastercycler termocikleris, užprogramuotas nustatytais laiko intervalais keisti reikiamus temperatūros režimus. PGR metu buvo atlikta pirminė denatūracija (5 min. 94°C), po to sekė pasikartotiniai 35 ciklai su 94°C 40 s intervalu-55°C 40 s intervalu ir 72°C 40 s intervalu, galutinė ekstensija 72°C ciklas, trunkantis 7 min. bei atvėsinimas iki 21°C. Po pirmos PGR reakcijos mėgintuvėliai pakaitinami 2 min. 65°C, po to apversčiami ir palaikomi 2 min. Po to centrifuguojam ir vėl sudedami į termociklerį tolimesnei reakcijai su tokia pačia temperatūrinių režimų programa.
Etapas Temperatūra, ºC Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 94 ºC 300 s 1 ciklas
Denatūracija 94 ºC 40 s
35 ciklų
Hibridizacija 55 ºC 40 s
Ekstensija 72 ºC 40 s
Galutinė ekstensija 72 ºC 420 s 1 ciklas
Atvėsinimas 21 ºC - -
Lentelė: PGR ciklų temperatūriniai režimai ir trukmė
2.4.4. DNR produktų elektroforezė
PGR DNR produktų elektroforezė buvo atliekama 2,0 proc. agarozės gelyje (TopVision Agarose, kat. Nr. R0491, UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva). Agarozės gelis ištirpintas TAE 1X tirpale (Tris-acetate-EDTA) (50X), kat. nr. B49, TFSB UAB, Lietuva) mikrobangų krosnelėje, o po to
pridedama etidžio bromido 1 µl/10 ml agarozės gelio (Ethidium bromide solution 1 %, 2218.1, kat. Nr. 2218.1, Carl Roth, Vokietija).
Sustingus agarozės geliui, po 1 val. 10 µl PGR DNR produktai buvo sumaišomi su 2 µl dažais (DNA Gel Loading Dye (6X), Kat. nr. R0611,UAB Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva) ir lašinami į agarozės duobutes.
Agarozės gelis su tiriamaisiais ir standartiniais mėginiais dedamas į vonelę su TAE 1X tirpalu., leidžiama elektros srovė.
Elektroforezė atliekama 35-40 min. Tada UV spektre stebimi tyrimų rezultatai.
Teigiamais atvejais gaunamas produktas yra 270 bazių porų (bp) L. intracellularis DNR seka, kuri yra matoma atlikus elektroforezę agarozės gelyje pastarąjį apšvietus UV spinduliais.
2.5. Statistinis duomenų apdorojimas
Retrospektyvinės analizės duomenys buvo apdorojami naudojantis internetinėje erdvėje esančia statistine programa EpiTools epidemiological calculators (http://epitools.ausvet.com.au/content.php?page=z-test-2) ir MEDCALC easy to use software (https://www.medcalc.org/calc/comparison_of_proportions.php). Tyrimo vertinimui buvo naudojamas Z-testas siekant palyginti apkrėstumą tarp atjunkytų ir penimų, sveikų, kliniškai, sergančių ir nugaišusių kiaulių.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Retrospektyvinės analizės rezultatai
Retrospektyvinė analizė atlikta remiantis Mikrobiologijos ir virusologijos instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje PGR tyrimų rezultatais 2003-2012 m.
Lizdinės PGR metodu buvo tirti atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinamojo trakto susirgimų 53 atvejai, pasireiškę ženkliai padidėjusiu sergamumu ir gaištamumu. Lawsonia intracellularis buvo aptiktos 17 (32,1 proc.) tirtų atvejų (1 lentelė).
Kiaulių amžiaus grupės
Kiaulių virškinamojo trakto susirgimų atvejai tirti lizdinės PGR metodu
Tirta, n PE atvejai
n %
Atjunkyti 17 6 35,3
Penimi 36 11 30,6
Iš viso: 53 17 32,1
1 lentelė. Lawsonia intracellularis etiologinio vaidmens nustatymas atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinamojo trakto susirgimų atvejais lizdinės PGR metodu.
Lawsonia intracellularis bakterijos nustatytos 6 virškinamojo trakto susirgimų atvejais atjunkytų grupėje ir 11 atvejų penimų paršų grupėje (1 lentelė, 1 pav.). Matome, kad Lawsonia intracellularis etiologinis vaidmuo atjunkytų paršelių virškinamojo trakto susirgimų metu nustatytas 35,3 proc. atvejų. Tuo tarpu penimų paršų grupėje Lawsonia intracellularis nustatytos 30,6 proc. virškinamojo trakto susirgimų atvejais.
Lyginant Lawsonia intracellularis paplitimą atjunkytų ir penimų kiaulių virškinamojo trakto susirgimų atvejais statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (P>0,05).
1 paveiksle pateiktos diagramos rodo kad, ištyrus kiaulių virškinamojo trakto susirgimų atvejus (n=53), L. intracellulatis buvo nustatyta 17-oje atvejų, o nenustatyta 36 atvejais. Virškinamojo trakto susirgimų atvejai tirti atjunkytų paršelių (n=17) ir penimų paršų grupėse (n=36).
1 pav. Lavsonijų nustatymas atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinamojo trakto susirgimų atvejais lizdinės PGR metodu
Iš 2 paveikslo matome, kad iš 32,1 proc. kiaulių virškinamojo trakto susirgimų atvejais buvo nustatytas PE, o 67,9 proc. atvejų – nenustatytas.
2 pav. Lavsonijų nustatymas kiaulių virškinamojo trakto susirgimų atvejais lizdinės PGR metodu (procentinis pasiskirtymas)
3 paveiksle pateikti duomenys rodo, kad 35,0 procentuose atjunkytų paršelių virškinamojo trakto susirgimų atvejais PE buvo nustatytas, o 65,0 procentais atvejų – PE nustatytas nebuvo.
3 pav. Lavsonijų nustatymas atjunkytų paršelių virškinamojo trakto susirgimų atvejais lizdinės PGR metodu (procentinis pasiskirtymas)
4 paveiksle pateikti duomenys rodo, kad iš 30,6 procentų atjunkytų paršelių grupės virškinamojo trakto susirgimų atvejais buvo nustatytas PE sukėlėjas, o 69,4 procentais šių atvejų – PE sukėlėjas nustatytas nebuvo.
4 pav. Lavsonijų nustatymas penimų paršų virškinamojo trakto susirgimų atvejais lizdinės PGR metodu (procentinis pasiskirtymas)
Lyginant atjunkytų paršelių ir penimų paršų apkrėstumą lavsonijomis virškinamojo trakto susirgimų metu (3 pav ir 4 pav.) matome, kad skirtumas (35,3 proc. vs 30,6 proc.) nėra statistiškai patikimas (p>0,05).
Iš viso buvo ištirta 287 sergančių kiaulių fekalijų mėginiai ir 70 nugaišusių kiaulių plonosios žarnos mėginiai. 2 lentelėje matome, 74 fekalijų mėginiai buvo paimti iš sergančių atjunkytų paršelių ir 13 nugaišusių. Tuo tarpu penimų paršų grupėje paimti 213 sergančių kiaulių fekalijų mėginių ir 57 nugaišusiųjų plonosios žarnos mėginių (2 lentelės duomenys).
Kiaulių amžiaus grupės
Patologinės medžiagos mėginių tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu L.
intracellularis atžvilgiu
Tirta mėginių, n Teigiamų mėginių
n %
Sergan -čios
Nugai-šusios Iš viso
Serga nčios
Nugai
šusios Iš viso
Serga nčios
Nugai
šusios Iš viso
Atjunkyti 74 13 87 12 7 19 16,2 53,8 21,8
Penimi 213 57 270 30 11 41 14,1 19,3 15,2
Iš viso 287 70 357 42 18 60 14,6 25,7 16,8
2 lentelė. Kiaulių patologinės medžiagos mėginių, paimtų virškinamojo trakto susirgimų metu, tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu
Nustatyta, kad sergančių atjunkytų paršelių grupėje 12 (16,2 proc.) fekalijų mėginių rasta L. intracelluris, o tuo tarpu nugaišusių atjunkytų paršelių – 7 plonosios žarnos mėginių (53,8 proc.). Penimų paršų mėginiuose L.intracellularis nustatyta 30 (14,1 proc) sergančiųjų mėginių ir 11 (19,3 proc) nugaišusiųjų.
Iš tirtų 87 atjunkytų kiaulių mėginių, L. intracellularis teigiamų mėginių yra 19, kas sudaro 21,8 proc. Tuo metu iš tirtų 270 penimų kiaulių mėginių, L. intracellularis teigiamų yra 41 mėginys, kas sudaro 15,2 proc.. Lyginant šių grupių procentų išraiškas matome, skirtumas tarp užsikrėtusių paršelių ir penimų paršų nėra statistiškai patikimas, nes p>0,05.
5 paveiksle pateikti duomenys apie ištirtus 357 mėginius iš sergančių ir nugaišusių kiaulių patologinės medžiagos nustatant L. intracellularis. Buvo ištirti 287 mėginiai iš sergančių kiaulių ir 70 mėginių iš nugaišusių kiaulių. Iš pateiktų diagramų matome, kad tarp tirtų 74 sergančių atjunkytų paršelių fekalijų mėginių 12 (16,2 proc.) buvo teigiami L. intracellularis atvejai, o tarp 13 nugaišusių atjunkytų paršelių plonosios žarnos mėginių nustatyta 7 (53,8 proc.) teigiami L. intracellularis atvejai.
5 pav. Sergančių ir nugaišusių kiaulių patologinės medžiagos mėginių tyrimų lizdinės PGR metodu rezultatų analizė.`
Pateikiamuose 5 pav. duomenyse matome, kad sergančių atjunkytų paršelių grupėje L. intracellularis nustatyta 12 fekalijų mėginių iš tirtų 74 mėginių. Atitinkamai sergančių penimų kiaulių grupėje L. intracellularis nustatyta 30 fekalijų mėginių iš tirtų 213 mėginių. Nugaišusių atjunkytų paršelių atveju iš tirtų 13 plonosios žarnos mėginių, L.intracellularis nustatytas 7 mėginiuose, o tarp 57 penimų nugaišusių kiaulių L. intracellularis nustatytas 11 kartų.
Lyginant procentus matome, kad nugaišę atjunkyti paršeliai buvo užsikrėtę 37,6 proc daugiau nei sergantys ir šis skirtumas yra statistiškai patikimas (p<0,05).
Tiriant penimus paršus, buvo ištirta iš viso 270 patologinės medžiagos mėginių – 213 sergančių kiaulių fekalijų mėginių ir 57 nugaišusių kialių plonosios žarnos mėginių. Nustatyta, kad sergančių penimų kiaulių grupėje teigiamų L. intracellularis atžvilgiu buvo 30 (14,1 proc.) mėginių, o tarp nugaišusių kiaulių– 11 (19,3 proc.).
Lyginant procentines jų išraiškas matome, kad užsikrėtusių nugaišusių ir sergančių penimų kiaulių kiekis skyrėsi 5,2 procentais, bet toks skirtumas nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05).
Sergančių atjunkytų teigiamų fekalijų mėginių buvo 12 iš 74 (16,2 proc.), o sergančių penimų 30 iš 213 (14,1 proc.).
Lyginant šių duomenų procentines išraiškas matome, kad užsikrėtusių sergančių atjunkytų paršelių ir sergančių penimų kiaulių kiekis skyrėsi 2,1 procentais, bet šis skirtumas nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05).
Iš tirtų nugaišusių atjunkytų paršelių teigiamų L. intracellularis atžvilgiu plonosios žarnos mėginių buvo 7 (53,8 proc.), o iš nugaišusių penimų L. intracellularis teigiamų mėginių buvo 11 (19,3 proc.).
Lyginant šiuos procentinius duomenis matome, kad užsikrėtusių lavsonijomis nugaišusių atjunkytų paršelių buvo 34,5 procentais daugiau, nei nugaišusių penimų kiaulių ir šis skirtumas statistiškai yra patikimas (p<0,05).
6 pav. Sergančių ir nugaišusių, atjunkytų paršelių ir penimų kiaulių teigiamų ir neigiamų
L.intracellularis atžvilgiu patologinės medžiagos mėginių pasiskirstymas procentais.
Buvo tirta 122 skirtingi patologinės medžiagos mėginiai 17 protrūkių atvejais, kuriuose nustatyta 60 L. intracellularis teigiamų mėginių (49,2%). Šiame protrūkių skaičiuje 6 atvejai buvo iš atjunkytų kiaulių grupės, 11 atvejų iš penimų kiaulių grupės (3 lentelė).
Kiaulių amžiaus grupės PE atveja i
Patologinės medžiagos mėginių tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu L. intracellularis atžvilgiu PE atvejais
Sergančios kiaulės Nugaišusios kiaulės Iš viso T Tirta, n Teigiami T Tirta, n Teigiami T Tirta, n Teigiami n % n % n % Atjunkyti 6 21 12 57,1 9 7 77,8 30 19 63.3 Penimi 11 69 30 43,5 23 11 47,8 92 41 44,6 Iš viso 17 90 42 46,7 32 18 56,3 122 60 49,2 3 lentelė. L. intracellularis nustatymas naudojant lizdinės PGR metodą PE atvejais.
Atjunkytų paršelių grupėje ištirti 21 sergančiųjų kiaulių fekalijų mėginys ir 9 nugaišusiųjų kiaulių plonosios žarnos mėginiai. L. intracellularis atžvilgiu teigiami mėginiai buvo 12 sergančių paršelių mėginiuose (57,1%) ir 7 nugaišusiųjų paršelių mėginiuose (77,8%).
Iš viso 30-je atjunkytų paršelių grupės mėginiųose L. intracellularis rasta 19 kartų (63,3%). Penimų kiaulių grupėje ištirti 69 sergančiųjų kiaulių fekalijų mėginiai ir 23 nugaišusių kiaulių plonosios žarnos mėginiai. L. intracellularis teigiami buvo 30 sergančių penimų kiaulių fekalijų mėginiai (43,5%) ir 11 nugaišusiųjų penimų kiaulių plonosios žarnos mėginių (47,8%).
Iš viso 92-juose penimų kiaulių grupės mėginiuose rasta 41 (44,6%) teigiamų L. intracellularis patologinės medžiagos mėginių.
Lyginant procentines išraiškas matome, kad užsikrėtusių atjunkytų paršelių ir penimų kiaulių kiekis skyrėsi 18,7 procentais, bet šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05).
7 pav L. intracellularis pasiskirstymas PE protrūkių atvejais pagal kiaulių amžiaus grupes.
7 paveiksle matome, kad iš 30 atjunkytų kiaulių mėginių (sergančių ir nugaišusių bendrai) 19 atvejų (63,3%) buvo nustatytas teigiamas L. intracellularis testas.
Iš 92 penimų kiaulių (taip pat bendrai tarp sergančių ir nugaišusių) mėginių L. intracellularis nustatytas 41 atveju (44,6 proc.). Lyginant procentines išraiškas tarp užsikrėtusių atjunkytų ir penimų kiaulių, matome, kad užsikrėtusių atjunkyto amžiaus paršelių 18,7 procentais daugiau, bet šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05).
Iš 7 pav. diagramos matome, kad atjunkytų kiaulių grupėje sergamumas L. intracellularis siekia 63,3%, o penimų kiaulių grupėje sergamumas yra 44.6%. Bendras užsikrėtusių L. intracellularis kiaulių procentas tarp sergančių ir nugaišusių kiaulių abejose amžiaus grupėse sudaro 49,2%, tai yra beveik pusę tirtų kiaulių kiekio.
8 pav. Kiaulių sergamumas L. intracellularis priklausomai nuo amžiaus grupės.
Iš 8 pav. pateiktos diagramos matome sergančių atjunkytų teigiami mėginiai sudaro 57,1 proc., o atjunkytų nugaišusių teigiami mėginiai sudaro 77,8 procentus, tuo tarpu sergančių penimų teigiami mėginiai sudaro 43,5 proc. ir nugaišusių teigiami mėginiai 47,8 procentus.
9 pav. Skirtingų kiaulių amžiaus grupių užsikrėtimas L. intracellularis, procentais.
9 pav. Palyginami skirtingų kiaulių amžiaus grupių užsikrėtimo L. intracellularis procentiniai duomenys. Nustatyta, kad sergančių atjunkytų kiaulių grupėje teigiami L. intracellaris atvejai sudaro
57,1 proc., o atjunkytų nugaišusių kiaulių grupėje šie mėginiai sudaro 77,8 procentus, tai yra 20,7 procentais daugiau.
Penimų nugaišusių kiaulių grupėje L. intracellularis aptinkama 47,8 proc. atvejų, o sergančių tarpe 43,5 procentais atvejų.
3.2. Epidemiologinių tyrimų rezultatai
Visada buvo didelis poreikis atlikti palyginamąją analizę kiaulių populiacijos sergamumo L. intracellularis Lietuvos ūkiuose ir gretimose Europos šalyse.
Tuo tikslu buvo ištirtos dvi atskiros kiaulių grupės viename Lietuvos ūkyje ir tiesiai vežėjo transporte iš užsienio šalių atvežtos kiaulės.
Tyrimų rezultatai pateikiami 4 ir 5 lentelėse.
Lietuviškame ūkyje (4 lentelė) buvo ištirtos dviejų atskirų kiaulių grupių užsikrėtimas L. intracellularis, tiriant jų fekalijų mėginius, viso 36 kliniškai sveikos kiaulės.
Eil. nr. Sveikos / kliniškai sveikos kiaulės
Tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu
Lawsonia intracellularis atžvilgiu
Tirta, n Teigiami
n %
1. Pirma tirtų kiaulių grupė 21 3 14%
2. Antra tirtų kiaulių grupė 15 2 13%
3. Iš viso tirta kiaulių 36 5 13,9%
4 lentelė. Kliniškai sveikų penimų kiaulių fekalijų mėginių tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu pirmame ūkyje.
Pirmoje grupėje tarp 21 tirtos kiaulės nustatyti 3 L. intracellularis atvejai, tai sudaro 14 proc. tirtų kiaulių.
Antroje grupėje tirta 15 kliniškai sveikų kiaulių ir jų tarpe rasta L. intracellularis 2 mėginiuose, kas sudaro 13 proc. tirtos kiaulių grupės.
Lyginant procentines išraiškas iš karto galima teigti, kad šis skirtumas nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05).
Kiaulių amžius Tirtų mėginių skaičius Teigiamų mėginių skaičius Danijos Latvijos Estijos Danijos Latvijos Estijos
1-2 mėnesių kiaulės n.d. 5 5 n.d. 0 0
2-3 mėnesių kiaulės n.d. 5 5 n.d. 0 0
3-4 mėnesių kiaulės 7 5 5 0 n.d. n.d.
5-6 mėnesių kiaulės 5 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. Ką tik įvežtos į Lietuvą 30 10 n.d. 1 0 n.d.
5 lentelė. Iš kitų šalių atvežtų kiaulių užkrėstumo L. intracellularis tyrimai lizdinės PGR metodu
Buvo ištirtos 4 skirtingų amžiaus grupių įvežamos kiaulės į Lietuvos ūkius. Kiaulės buvo vežamos iš Danijos, Latvijos ir Estijos ir atliekami jų PGR tyrimai, siekiant nustatyti ar yra užsikrėtimas L. intracellularis. Taip pat ištirta 30 kiaulių iš Danijos ir 10 kiaulių iš Latvijos vežimo metu. Pastarasis tyrimas mum leidžia sužinoti užkrato paplitimą tų šalių ūkiuose.
Buvo ištirta 42 skirtingo amžiaus kiaulės Lietuvos ūkiuose atvežtos iš Danijos, Latvijos ir Estijos. Nebuvo nustatyta nei vieno teigiamo atvejo L. intracellularis.
Tiriant 30 kiaulių iš Danijos ir 10 kiaulių iš Latvijos tiesiai iš transporto priemonės nustatytas vienas teigiamas atvejis iš Danijos kiaulių grupės.
3.3. Klinikinių tyrimų rezultatai
6 lentelėje pateikiame vieno lietuviško ūkio penimų kliniškai sveikų paršelių fekalinių mėginių tyrimus Lawsonia intracellularis atžvilgiu, paimtus skirtingais metų laikais. .
40 fekalijų mėginių buvo paimti viduryje žiemos, 21 mėginys buvo paimtas vasarą ir dar 21 mėginys tą patį rudenį. Iš viso buvo ištirti 82 kliniškai sveikų kiaulių fekalijų mėginiai viename ūkyje.
Iš 4 lentėles duomenų matome, kad žiemą buvo nustatyta 16 kliniškai sveikų kiaulių užsikrėtusių L. intracellularis, tai sudaro 40 proc. iš žiemą tirtų kiaulių grupės.
Vasaros ir rudenio mėginiuose rasta tik po 1 kiaulę užsikrėtusią L. intracellularis, tai sudaro 4,7 proc. vasarą ir rudenį tirtų fekalijų mėginių.
Eil. nr.
Tirtos kliniškai sveikos penimos
kiaulės
Tyrimų rezultatas lizdinės PGR metodu
Lawsonia intracellularis atžvilgiu
Tirta, n Teigiami
n %
1. Žiemą tirtos kiaulės 40 16 40,0
2. Vasarą tirtos kiaulės 21 1 4,7
3. Rudenį tirtos kiaulės 21 1 4,7
4. Bendras tirtų kiaulių
skaičius 82 18 21,9
6 lentelė. Kliniškai sveikų penimų kiaulių fekalijų mėginių tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu antrame ūkyje
7 lentelėje pateikiami 20 įvairaus amžiaus kliniškai sveikų kiaulų tyrimų duomenys.
Tirta 2-3 mėn kiaulės (6 vnt), dvi 3-4 mėn kiaulių grupės (6 vnt ir 2 vnt) ir 4-5 mėn kiaulių grupė (6vnt).
2-3 mėn. grupėje nustatyti 2 teigiami L. intracellularis mėginiai, 33 proc. tirtų kiaulių.
3-4 mėn. kiaulių grupėse užkrėstumas L. intracellularis skyrėsi: vienoje grupėje rastos 3 (50 proc) užsikrėtusios kiaulės, o kitoje užsikrėtusių kiaulių nerasta.
4-5 mėn. kiaulių grupėje tarp 6 tirtų kiaulių nustatyti 2 teigiami L. intracellularis mėginiai t.y. 33,3 proc. tirtų kiaulių.
Viso šiame ūkyje tarp 20 tirtų kliniškai sveikų kiaulių nustatyta 7 (35,0 proc.) teigiami L. intracellularis atvejai.
Eil. nr. Sveikos / kliniskai sveikos kiaulės
Tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu
Lawsonia intracellularis atžvilgiu
Tirta, n Teigiami n % 1. 2-3 men kiaules 6 2 33,3 2. 3-4 mėn kiaules 6 3 50,0 3. 3-4 mėn kiaules 2 0 0 4. 4-5 mėn kiaulės 6 2 33,3 Iš viso 20 7 35,0
7 lentelė. Kliniškai sveikų atjunkytų paršelių ir penimų paršų fekalijų mėginių tyrimų rezultatai lizdinės PGR metodu trečiame ūkyje.
3.4. Patologinių anatominių tyrimų rezultatai
Patologiniams anatominiams tyrimams tiriamos nugaišusių 13 atjunkytų (1-3 mėnesių amžiaus) ir 57 penimų (3-6 mėnesių amžiaus) kiaulių klubinės žarnos gleivinės skutenos., kurioms buvo pasireiškęs enteritas. Buvo stebimi patologiniai anatominiai pakyčiai plonosiose žarnose, nors ūkiuose dirbantys veterinarijos gydytojai teigė, kad nebuvo pastebėja specifinių PE požymių.
4.
REZULTATŲ APTARIMAS
PE yra visose šalyse paplitusi kiaulių liga. Šios sukelėjas L. intracellularis yra viduląstelinis parazitas, todėl jis nenustatomas auginant įprastais bakterijų kultivavimo metodais, o išskiriamas ląstelių kultūrose. L. intracellularis dažnai sukelia PE atjunkytiems paršeliams ir penimiems paršams, todėl ši bakterija laikoma viena svarbiausių žarnyno patogenų (18). Labai paplitusi subklinikinė L. intracellularis forma gali būti diagnozuojama tik PGR tyrimais (18, 19). Europos Sąjungoje mažinant antibiotikų naudojimą kiaulininkystėje PE yra vis dažniau nustatoma kiaulių ūkiuose, todėl turi didelę įtaką ekonominiu aspektu (16,18,19). 2015 metais britai nustatė antikūnus prieš lavsonijas net 95 proc. kiaulių ūkių. Kitose šalyse atlikti serologiniai tyrimai parodė, kad Lawsonia intracellularis atžvilgiu teigiamos buvo net 92 proc. kiaulės (17, 20). Šie tyrimai rodo, kad lavsonijos paplitę daugumoje kiaulių ūkių ir pasireiškia endemiškai.
Visa tai rodo, kad lavsonijos yra plačiai paplitę ir vežant į Lietuvą penėjimui kiaules gali patekti lavsonijos. Todėl norėdami įvertinti dabartinę situaciją atlikome retrospektyvinę analizę, remiantis 2003-2012 metais Mikrobiologijos ir virusologijos instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje atliktų kiaulininkystės ūkių molekulinės biologijos tyrimų lavsonijų atžvilgiu duomenimis
Iš viso buvo analizuoti atjunkytų paršelių ir penimų paršų virškinamojo trakto susirgimų 53 atvejai, pasireiškę ženkliai padidėjusiu sergamumu ir gaištamumu. L.intracellularis buvo aptiktos 17 (32,1 proc.) tirtų atvejų. Šie tyrimai parodo, kad kitą dalį protrūkių, kuriuose nenustatyta L. intracellularis galėjo sukelti kiti žarnyno patogenai asocijuoti su Escherichia coli, Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae, Salmonella spp. (18).
Lawsonia intracellularis bakterijos nustatytos 6 iš 17 virškinamojo trakto susirgimų atvejais atjunkytų kiaulių grupėje ir 11 atvejų iš 36 penimų paršų grupėje. Virškinamojo trakto susirgimų atvejais lavsonijos nustatymo dažnumas nesiskyrė lyginant atjunkytų ir penimų kiaulių grupes (p>0,05).
Atliekant detalesnę analizę buvo įvertintas L. intracellularis teigiamų patologinės medžiagos mėginių (n=357) pasiskirstymas visais kiaulių virškinamojo trakto susirgimų atvejais. Šiame skaičiuje buvo ištirta 287 sergančių kiaulių fekalijų mėginiai ir 70 nugaišusių kiaulių plonosios žarnos mėginių. Iš viso iš atjunkytų paršelių buvo paimti 74 fekalijų (sergančiųjų) mėginiai ir 13 (nugaišusiųjų) plonosios žarnos mėginių. PGR tyrimai, kad L. intracellularis atžvilgiu 12 (16,2 proc.) teigiamų mėginių buvo sergančių atjunkytų grupėje ir 7 (53,8 proc.) – nugaišusių grupėje. Skirtumas tarp šių
grupių buvo 37,6 proc. ir statistikai buvo reikšmingas (p<0,05). Tai patvirtina ir užsienyje atliktas tyrimas su nugaišusių kiaulių žarnų patologine medžiaga (18), kur buvo nustatyta, kad nugaišusių ir turinčių žarnų patologijas 84,6 proc kiaulės. buvo teigiamos L. intracellularis atžvilgiu tiriant PGR metodu, o be patologinių pakitimų teigiamų mėginių buvo mažiau – 20,3 proc. (P<0,001) (18).
Penimų paršų grupėje ištirti 213 sergančių kiaulių fekalijų mėginių ir 57 nugaišusiųjų plonosios žarnos mėginių. Nustatyta, kad 30 (14,1 proc.). sergančių ir 11 (19,3 proc.). Šių grupių apkrėstumas skyrėsi 5,2 proc., bet skirtumas buvo statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
Toliau buvo analizuota patologinės medžiagos mėginių tyrimų rezultatai 17 PE protrūkių atvejais, kuriuose nustatyta 60 iš 122 L. intracellularis teigiamų mėginių (49,2 proc.). Šiame protrūkių skaičiuje 6 atvejai buvo iš atjunkytų kiaulių grupės, 11 atvejų iš penimų kiaulių grupės.
Tyrimai parodė, kad 57,1 proc. (12 iš 21) atjunkytų paršelių buvo nustatyta L. intracellularis, o tuo tarpu penimų paršelių – 43,5 proc. (30 iš 69).
Sergančių atjunkytų kiaulių grupėje teigiami L. intracellularis atvejai sudarė 57,1 proc., o atjunkytų nugaišusių kiaulių grupėje – 77,8 procentus, tai yra 20,7 procentais daugiau. Tarp nugaišusių penimų kiaulių teigiamų mėginių nustatyta 47,8 procentų t.y. 30 procentų mažiau nei tarp nugaišusių atjunkytų kiaulių. Tai patvirtina literatūros duomenis, kad penimos kiaulės pastebimai atsparesnės šiam ligos sukėlėjui už atjunkytas kiaules. Kiti autoriai iš Danijos atlikdami tyrimus keturiose skirtinguose kiaulių grupėse nustatė, kad teigiamų L. intracellularis mėginių kiekis mažėjo su kiaulių amžiumi (20).
Lyginant bendras procentines ką tik aptartų rezultatų išraiškas atkreipiame dėmesį į nustatytą faktą, kad visuose mėginiuose užsikrėtusių L. intracellularis atjunkytų paršelių ir penimų kiaulių kiekis skyrėsi 18,7 procentais, bet šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05).
Kadangi vienas iš tikslų buvo atlikti palyginamąją analizę kiaulių populiacijos sergamumo L. intracellularis Lietuvos ūkiuose ir gretimose Europos šalyse, buvo ištirtos dvi atskiros lietuviškos kilmės kiaulių grupės viename Lietuvos ūkyje, iš užsienio gautos kiaulės (iš Danijos, Latvijos ir Estijos) bei tiesiai vežėjo transporte iš užsienio šalių (Danijos ir Latvijos) atvežtų kiaulių fekalijų mėginiai.
Abejose lietuviškų kiaulių grupėse (tirtos kliniškai sveikos kiaulės) tarp 21 kiaulės buvo nustatyta 3 L. intracellularis teigiami atvejai ir 15 kiaulių grupėje nustatyti 2 L. intracellularis teigiami atvejai, tai reiškia 14 proc. kliniškai sveikų kiaulių buvo apsikrėtę L. intracellularis.
Tiriant 12 skirtingo amžiaus (3-6 mėnesių) kiaulių, atvežtų iš Danijos, 15 kiaulių (1-4 mėnesių) iš Latvijos ir tokią pat grupę iš Estijos, L. intracellularis teigiamų mėginių nenustatyta.
Galima daryti prielaidą, kad sergamumui PE gali daryti daug veiksnių. Atskiros kiaulių populiacijos gali būti atsparesnės lavsonijoms, arba apsikrėtę mažiau patogeniškomis ar virulentiškomis bakterijomis. Tam įtakos gali turėti šėrimas, higienos reikalavimų laikymąsis Europos kiaulininkystės ūkiuose.
Ištyrus suviduriavusių atvežtų iš Danijos (30 kiaulių) ir iš Latvijos (10 kiaulių) fekalijų mėginius, paimtus tiesiai vežėjo transporte nustatytas vienas teigiamas mėginys vienai iš Danijos atvežtai kiaulei. Galima teigti, L. intracellularis iš Danijos kiaulininkystės ūkio pateko Lietuvoje.
Taip pat reikėtų paminėti ir antibiotikų naudojimą su maistu ir vandeniu L. intracellularis profilaktikai ir gydymui. Antibiotikai tokiais atvejais suduodami su pašarais ir vandeniu, siekiant sumažinti kiaulių sergamumą ir gaištamumą. Vakcinos gali būti sėkmingai naudojamos profilaktiškai, taip sumažinant antibiotikų naudojimą (9). Literatūroje jau nuo 2010 metų galima rasti informacijos apie vakcinų taikymą kaip prevenciją nuo PE užsienio kiaulininkystės ūkiuose (19).
Vieno ūkio kliniškai sveikų kiaulių populiacijos fekalijų mėginių (n=82) tyrimai atlikti skirtingais metų laikais – žiemą (n=40), vasarą (n=21) ir rudenį (n=21). Žieną nustatyta 40proc. (n=16) teigiamų L.intracellularis atžvilgiu mėginių, o rudenį 4,7 proc (n=1).
Taip pat buvo atlikti tyrimai L. intracellularis sergamumui skirtingo amžiaus kiaulių grupėse nustatyti ir pabandyti atsekti L.intracellularis sergamumo priklausomybę nuo kiaulių amžiaus. Tam buvo ištirti 20 kiaulių mėginiai iš 4 skirtingų kiaulių amžiaus grupių nuo 2 iki 5 mėnesių, tačiau
duomenys labai išsibarstę (sergamumas nuo 0 iki 50 proc.), statistiškai nepatikimi ir jokių išvadų šiame tyrime nedarome.
