LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA
Sigita Ramonait÷
BROILERIŲ SPARNELIŲ IR BLAUZDELIŲ UŽKRöSTUMAS
KAMPILOBAKTERIJOMIS
Magistro darbas
Darbo vadovas:
E. doc. p., dr. Alvydas Malakauskas
2 Magistro darbas atliktas 2008 – 2010 metais bendradarbiaujant su Lietuvos veterinarijos akademijos Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedros doktorant÷mis.
Magistro darbą paruoš÷: Sigita Ramonait÷ ... (parašas)
Magistro darbo vadovas: E. doc. p., dr. Alvydas Malakauskas ...
(LVA Užkrečiamųjų ligų katedra)
(parašas)Recenzentas: ...
3 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8 1.1 Kampilobakterijų įvairov÷ ... 8 1.2 Kampilobakterioz÷s epidemiologija ... 9 1.2.1 Žmonių susirgimai... 9 1.2.2 Infekcijos šaltiniai ... 12
1.2.3 Kampilobakterijų kontrol÷ ir profilaktika... 14
1.2.4 Kampilobakterijų patekimas į maistą ... 16
1.3 Identifikavimo metodai... 18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 21
2.1 M÷ginių rinkimas ir kampilobakterijų išskyrimas ... 21
2.2 DNR išskyrimas ir daugin÷ PGR ... 22
2.3 Matematin÷ duomenų analiz÷ ... 23
3. TYRIMO REZULTATAI... 24
3.1 Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis ... 24
3.2 Kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų paviršiaus ... 27
3.3 Identifikuotos kampilobakterijų rūšys daugin÷s PGR metodu ... 30
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33
IŠVADOS... 38
REKOMENDACIJOS ... 39
4 SANTRAUKA
Sigita Ramonait÷
BROILERIŲ SPARNELIŲ IR BLAUZDELIŲ UŽKRöSTUMAS KAMPILOBAKTERIJOMIS
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas: e. doc. p. dr. A. Malakauskas Lietuvos veterinarijos akademija
Veterinarijos fakultetas Užkrečiamųjų ligų katedra Kaunas, 2010
Darbo apimtis: 46 puslapiai, 7 lentel÷s, 6 paveikslų.
Mūsų tyrimo tikslas - įvertinti atšaldytų broilerių produktų (sparnelių ir blauzdelių) užkr÷stumą kampilobakterijomis. Tyrimo metu buvo pasirinkti trys paukštienos gamintojai Lietuvoje, kurių gaminiai t.y. broilerių sparneliai bei blauzdel÷s, jų neįsp÷jant, buvo perkami parduotuv÷se vieną kartą per savaitę, 2009 m. kovo - rugs÷jo m÷nesių laikotarpyje. Iš viso buvo ištirti 174 paukštienos produktai, iš jų 87 broilerių sparneliai bei 87 blauzdel÷s. Kiekviename m÷ginyje termofilinių kampilobakterijų aptikimas buvo atliekamas išskiriant jas tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro bei atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kampilobakterijų padermių identifikavimas iki rūšies atliktas daugin÷s polimeraz÷s grandinin÷s reakcijos metodu.
Atlikus tyrimą nustatyta, kad termofilin÷mis kampilobakterijomis buvo užkr÷sti 46,6 % visų tirtų broilerių produktų. Identifikuojant išskirtas kampilobakterijų rūšis, C. jejuni buvo nustatyta 69,12 %, C. coli - 13,23 %, o abi paderm÷s kartu 17,65 % užkr÷stų m÷ginių. Kiekybinio broilerių produktų tyrimo rezultatai parod÷, kad vidutinis Campylobacter spp. skaičius tiriant broilerių sparnelius bei blauzdeles buvo 1,56 log10 ksv/g ir 1,53 log10 ksv/g atitinkamai.
Šio tyrimo metu nustatytas sąlyginai didelis broilerių produktų užkr÷stumas termofilin÷mis kampilobakterijomis rodo, kad Lietuvoje parduodami žali broilerių produktai gali sudaryti riziką žmon÷ms užsikr÷sti kampilobakterioze. Tod÷l siekiant sumažinti vartotojų riziką užsikr÷sti kampilobakterioze per broilerių produktus būtina siekti sumažinti kampilobakterijų paplitimą broilerių pulkuose ir tokiu būdu skatinti neužkr÷stos paukštienos gamybą.
5 SUMMARY
Sigita Ramonait÷
CONTAMINATION OF BROILER CHICKEN WINGS AND DRUMSTICKS WITH CAMPYLOBACTER SPP.
Master thesis
Work instructor: e. doc. p. dr. A. Malakauskas Lithuanian Veterinary Academy
Faculty of Veterinary Medicine Department of Infectious Diseases Kaunas, 2010
The coverage of the work 46 pages, 7 tables and 6 pictures.
The present study was designed to investigate the occurrence and numbers of
Campylobacter spp. on broiler chicken wings and drumsticks at the retails level of the three main
poultry meat producers in Lithuania. Samples of chicken wings and drumsticks were collected of each poultry meat producer by visiting randomly selected retail shops once a week from March till October, in 2009. A total of 87 chicken wings and 87 drumsticks samples were collected and tested for Campylobacter spp. contamination. Thermophilic Campylobacter spp. were isolated by both direct inoculation on mCCDA selective medium and by selective enrichment in Bolton enrichment broth. Multiplex-PCR method was used for detection and identification of thermophilic Campylobacter species.
Our findings showed that overall 46.6 % (81 out of 174) of the collected samples were contaminated with campylobacters. C. jejuni has been found in 69.12 % of the tested samples C.
coli in 13.23 % and both species together in 17.65 % respectively. The mean number of
Campylobacter bacteria detected on wings at the retail was 1.53 log10 CFU/g and on drumsticks
1.56 log10 CFU/g.
This study showed high occurrence of broiler meat contamination with Campylobacter spp. at a retail level in Lithuania. Therefore the risk for consumers should be evaluated and an improvement of control measures at poultry production and retail level should be considered to reduce the risk for consumer’s infection with Campylobacter spp.
6 SANTRUMPOS
µl – mikrolitrai µm – mikrometrai
ANOVA - dispersin÷ analiz÷ bp - bazių pora
DNR - deoksiribonukleorūgštis
EFSA – Europos maisto saugos tarnyba ELISA – imunofermentinis metodas ksv – kolonijas sudarantys vienetai PGR - polimerazin÷ grandinin÷ reakcija PSO – Pasaulio sveikatos organizacija rRNR – ribosomin÷ ribonukleino rūgštis
7
ĮVADAS
Kaip ir pastaruosius ketverius metus, kampilobakterijos 2008 m. Europos Sąjungoje (ES) ir toliau išlieka dažniausiai žarnyno uždegimą sukeliančios bakterijos. Tačiau, užregistruotų kampilobaterioz÷s atvejų skaičių 2008 m. palyginus su 2007 m. sumaž÷jo 5 %. Dažniausiai kampilobakterioz÷ buvo siejama su broilerių m÷sa arba kitais nepatikslintais m÷sos produktais. ES bendras kampilobakterioz÷s atvejų skaičius 2008 m. buvo 40,7/100000 (susirgimai/gyventojų skaičiui), tačiau skirtingose šalyse svyruoja nuo <0,1/100000 Rumunijoje iki 193,3/100000 Čekijos Respublikoje, o Lietuvoje buvo nustatyta 22,6/100000 (EFSA, 2010).
Žmon÷ms kampilobakteriozę sukelia termofilin÷s kampilobakterijos. Dažniausiai tai būna
Campylobacter jejuni, C. coli ir C. laris rūšys, tačiau yra ir kitų kampilobakterijų rūšių galinčių
sukelti infekcijas žmon÷ms (EFSA, 2009). Klinikinius virškinamojo trakto sutrikimus gali sukelti ir labai nedideli kiekiai šių bakterijų iki 500 ksv/g, tačiau tai priklauso nuo amžiaus bendros fizin÷s būkl÷s, vaikams ši doz÷ gali būti žymiai mažesn÷ (Kothary ir Buba, 2001). Pagrindinis kampilobakterijų šaltinis žmon÷ms yra žalia ar nepakankamai gerai termiškai apdorota broilerių m÷sa, arba jau po terminio apdorojimo bakterijomis užteršti maisto produktai (Cools ir kt., 2005). Luber ir kt., 2005 metais tyrin÷jo šviežios paukštienos kulšeles ir pri÷jo išvados, kad kampilobakterijos ant paukštienos produktų yra pasiskirsčiusios netolygiai. Daugiausia kampilobakterijų yra ant produktų paviršiaus, tuo tarpu produkto gilesniuose audiniuose jų pasitaiko rečiau. Kadangi Lietuvoje n÷ra pakankamai duomenų apie kampilobakterijų paplitimą ant broilerių produktų mažmenin÷je prekyboje, mes tyrin÷jome atv÷sintus broilerių sparnelius ir blauzdeles. Buvo siekiama kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti kampilobakterijas esančias ant tiriamųjų produktų paviršiaus.
Darbo tikslas: Įvertinti atšaldytų broilerių produktų (sparnelių ir blauzdelių) užkr÷stumą kampilobakterijomis.
Darbo uždaviniai:
• Išskirti kampilobakterijas klasikiniu metodu nuo atv÷sintų sparnelių ir blauzdelių • Nustatyti tiriamųjų produktų bendrą užkr÷stumą kampilobakterijomis
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Kampilobakterijų įvairov÷
Kampilobakterijos yra mažos (0,2-0,9 µm pločio ir 0,2-5,0 µm ilgio), sporų neformuojančios, spiral÷s, žuv÷dros ar S formos, Gram-neigiamos, termofilin÷s bakterijos. Šios bakterijos yra judrios, juda greitai ir charakteringai sukdamosis spirale žiuželių pagalba. Kampilobakterijomis gali užsikr÷sti ir žmon÷s, tod÷l jos laikomos zoonotiniais patogenais (Park, 2002). Campylobacteriaceae šeimai priklauso 18 rūšių, šeši porūšiai ir du biovariantai. Dažniausiai žmon÷ms infekcijas sukelia Campylobacter jejuni (1 pav.) ir C. coli, o besivystančiose šalyse svarbios yra ir C. upsaliensis (Dingle ir kt., 2002; Gurtler ir kt., 2005). Žmon÷ms patogeniškų rūšių augimo temperatūros diapazonas gana siauras, nuo 30 °C iki 46 °C.
Campylobacter spp. palyginti l÷tai augančios, jautrios aplinkos veiksniams bakterijos, kurioms
reikalingos specifin÷s augimo sąlygos. Geriausiai jos auga mitybin÷je terp÷je praturtintoje 5-10% krauju, prie mažo deguonies kiekio. Šios bakterijos labai skiriasi nuo kitų per maistą plintančių bakterinių patogenų, nes jos yra mikroaerofilai, geriausiai auga atmosferoje, kur yra apie 10% CO2 ir maždaug 5% O2 (Humphrey ir kt., 2007).
1 pav. C. jejuni (Humphrey ir kt., 2007)
Kampilobakterijos yra labai nestabilios, ypatingai greitai genetiškai kinta C. jejuni rūšis, tod÷l greitai prisitaiko prie nepalankių sąlygų (Murphy ir kt., 2006). Tai lemia, kad kampilobakterijos turi labai didelę genetinę įvairovę. Tyrimai atskleidžia daug didesnį
9 kampilobakterijų genetinį kintamumą, lyginant su kitomis žarnyno bakterijomis. Šie skirtumai n÷ra tik labai dideli DNR pakitimai, daug dažniau pasitaiko maži pakitimai (Park, 2005).
Campylobacter gentis, kartu su Arcobacter ir Sulfurospirillum priklauso
Campylobacteriaceae šeimai (Vandamme, 2000 ). Sistematin÷ klasifikacija:
Karalyst÷: Bacteria Tipas: Proteobacteria Klas÷: Epsilonproteobacteria Būrys: Campylobacterales Šeima: Campylobacteraceae Gentis: Campylobacter
C. concisus C. curvus C. hominis, C. sputorum, C. rectus, C. showae ir C. gracilis yra
glaudžiai susiję filogenetiškai. Dauguma šių rūšių rasta žmogaus burnos ertm÷je, C. hominis išskirta tik iš žmogaus žarnyno, o C. sputorum, kuri turi du porūšius buvo rasta žarnyne ir lytiniuose takuose tokių gyvūnų kaip avys ir galvijai (On ir kt., 1998). Filogenetin÷s analiz÷s būdu nustatyta, kad C. hyointestinalis subsp. lawsonii C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis C.
laninae C. fetus subsp. veneralis ir C. fetus subsp. fetus taip pat yra glaudžiai susiję. C. fetus
subsp. veneralis dažniausiai randama galvijų dauginimosi organuose ir yra susijusi su galvijų genitalijų kampilobakterioze (galvijų nevaisingumu). Pagrindinis C. fetus subsp. fetus šeimininkas yra avys ir galvijai, šis porūšis sukelia savaiminį galvijų ir avių persileidimą. C.
jejuni turi du porūšius, C. jejuni subsp. jejuni, kuri yra dažniausia ūmaus enterito priežastis
žmon÷ms, ir C. jejuni subsp. doylei, kuri daugiausia susijusi su vaikų viduriavimu besivystančiose šalyse (Fernandez ir kt., 1997).
1.2 Kampilobakterioz÷s epidemiologija 1.2.1 Žmonių susirgimai
Kampilobakterijos yra viena iš pagrindinių žmonių bakterin÷s kilm÷s diar÷jos priežasčių pasaulyje. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) apskaičiavo, kad kampilobakterijomis kasmet užsikrečia ~ 1% Vakarų Europos gyventojų (Humphrey ir kt., 2007).
10 Pasaulyje žmonių bakterinę diar÷ją dažniausiai sukelia C. jejuni subsp. jejuni. Šios bakterijos paprastai randamos įvairių gyvūnų žarnyne, bet pagrindinis šaltinis yra naminiai paukščiai (Broman ir kt., 2000). Kampilobakteriozei būdingas sezoniškumas (2 pav.).
2 pav. Patvirtintų kampilobakterioz÷s atvejų skaičius 100000 gyventojų, per m÷nesį 2008 m. EFSA duomenimis (EFSA, 2010)
Campylobacter spp. gali būti perduodamos žmon÷ms tiesiogiai po sąlyčio su gyvūnais ar
vartojant bei tvarkant užterštus maisto produktus. Apie kai kurių šalių broilerių fermų, produktų užkr÷stumą kampilobaterijomis, taip pat kampilobakterioz÷s atvejus pateikti duomenys 1 lentel÷je. Išsivysčiusiose šalyse, visų amžiaus grupių žmon÷s yra vienodai imlūs kampilobakterijoms, tačiau besivystančiose šalyse kampilobakterioz÷ yra tokia dažna vaikyst÷je, kad vaikams susidaro imunitetas, tod÷l retai serga vyresni vaikai ir suaugę žmon÷s (Skirrow, 1994). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M÷nesiai 1 0 0 0 0 0 g y v en to jų
11 1 lentel÷ Broilerių fermų, skerdenų užkr÷stumas kampilobakterijomis ir kampilobakterioz÷s atvejų skaičius 100000 gyventojų 2008 metais (EFSA, 2010)
Šalis Broilerių fermų užkr÷timas % Broilerių skerdenų mažmenin÷je prekyboje užkr÷stumas % Kampilobakterioz÷s atvejai 100000 gyventojų Austrija 60,0* 8,0 51,4 Danija 25,9 36,6 63,4 Vokietija 32,2 36,4 78,7 Latvija 37,0* 9,8 0,0 Liuksemburgas - 49,2 90,7 Olandija - 14,1 39,2 Slov÷nija 75,3* 74,6 4,3 Ispanija 46,1* 13,3 11,4 Lietuva 42,0 - 22,6 *
pažym÷ti 2007 metų duomenys; - duomenų n÷ra.
Kampilobakterioz÷s inkubacinis periodas gali trukti 1-10 dienų, tačiau daugeliui žmonių klinikiniai simptomai pasireiškia per 4 dienas. Ligos patogenezę nulemia didelis kampilobakterijų adhezinis ir invazinis aktyvumas. Jų prisitvirtinimą prie gleivin÷s lemia paviršiniai saviti adhezijai ir žiuželiai. Jos lengvai prasiskverbia pro gleives, epitelinių ląstelių membranas ir greitai kolonizuoja plonąją žarną, sukeldamos gleivin÷s pokyčius ir paburkimą, pasireiškiantį enterokolitu. Patogeniškumui svarbūs ir gaminami termolabilūs bei termostabilūs enterotoksinai. Termolabilaus enterotoksino veikimas panašus į viduriavimą sukeliančius ešerichijų ir choleros viriono toksinus. Termostabilus enterotoksinas (endotoksinas) išsilaisvina žuvus kampilobakterijoms ir turi gramneigiamų bakterijų endotoksinų savybes. Sergantiems kampilobakterioze būdingas gausus, dažnai su krauju viduriavimas, ūmūs pilvo skausmai ir karščiavimas. Daugumą sergančių gali pykinti (Adak ir kt., 2002).
Kampilobakterioz÷ dažniausiai per savaitę praeina savaime, tačiau maždaug 20% pacientų simptomai gali tęstis nuo 1 iki 3 savaičių (Allos ir Blaser, 1995). Komplikacijos pasitaiko retai. Kai kuriems žmon÷ms kampilobakterioz÷ gali komplikuotis artritais (sąnarių uždegimais), kitiems išsivysto reta liga Miller Fisher sindromas ar Guillain-Barre sindromas, kuris prasideda pra÷jus keletui savaičių po viduriavimo, ir veikia nervų sistemą. Šis sindromas išsivysto tuomet, kai ligonio imunin÷ sistema ima atakuoti savo paties nervus, d÷l to jie kelioms savait÷ms paralyžiuojami. Tuomet ligonį reikia intensyviai gydyti. Guillain-Barre ir Miller Fisher
12 sindromus dažniausiai lemia C. jejuni bakterijos. Tačiau ne visos C. jejuni paderm÷s gali sukelti šias komplikacijas (Takahashi ir kt., 2005).
1.2.2 Infekcijos šaltiniai
Kampilobakterijų šaltiniais gali būti visi gyvūnai naudojami maistui, o taip pat ir naminiai gyvūn÷liai (2 lentel÷). Natūralioje aplinkoje, pavyzdžiui, gruntiniame vandenyje, taip pat dažnai yra šios ligos suk÷l÷jų (Schaffner ir kt., 2004).
2 lentel÷ Kampilobakterijų rūšių šaltiniai (Humphrey ir kt., 2007)
Nr. Rūšis Šaltiniai
1. C. coli Kiaul÷s, naminiai paukščiai, galvijai, avys, laukiniai paukščiai
2. C. concisus Žmon÷s
3. C. curvus Žmon÷s
4. C. fetus subsp. fetus Galvijai, avys 5. C. fetus subsp. venerealis Galvijai
6. C. gracilis Žmon÷s
7. C. helveticus Kat÷s, šunys
8. C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis Kiaul÷s, galvijai, žiurk÷nai, elniai 9. C. hyointestinalis subsp. lawsonii Kiaul÷s
10. C. hyoilei Kiaul÷s
11. C. jejuni subsp. doylei Žmon÷s
12. C. jejuni subsp. jejuni Naminiai ir laukiniai paukščiai, kiaul÷s, galvijai, avys, šunys, kat÷s, vanduo, pienas, triušiai, vabzdžiai 13. C. lari Laukiniai ir naminiai paukščiai, vanduo, šunys, kat÷s, beždžion÷s, arkliai, ruoniai
14. C. mucosalis Kiaul÷s
15. C. rectus Žmon÷s
16. C. showae Žmon÷s
17. C. sputorum bv. Sputorum Žmon÷s, galvijai, kiaul÷s 18. C. sputorum bv. Faecalis Avys, jaučiai
19. C. upsaliensis Šunys, kat÷s
20. C. insulaenigrae Ruoniai, delfinai
21. C. lanienae Galvijai, kiaul÷s, žmon÷s
13 Naminiai paukščiai yra pagrindinis termofilinių kampilobakterijų šaltinis (Jørgensen ir kt., 2002). Tikriausiai tai įtakoja aukšta paukščių kūno temperatūra, kuri ypač palanki šioms bakterijoms. Broileriams užsikr÷tusiems kampilobakterijomis n÷ra ligos simptomų, jie dideliais kiekiais išskiria šias bakterijas su išmatomis, paprastai 108 ksv grame išmatų. Paukščių pulke bakterijos gali plisti nuo viščiuko viščiukui koprofagijos būdu, taip pat per orą, užterštą pašarą ar vandenį (Stern ir kt., 1995).
Tiriant Kanadines žąsis, migruojančias antis ir kopines gerves, visose šiose rūšyse rastas didelis kiekis C. jejuni (Pacha ir kt. 1998), tod÷l manoma, kad laukiniai paukščiai turi svarbų vaidmenį platinant bakterijas aplinkoje. Tačiau Broman ir kt. (2004) teigia, kad laukinių paukščių štamai labai skiriasi nuo patogeniškų žmon÷ms.
Evans (1993) teigia, kad sezoninei žmonių kampilobakteriozei gali tur÷ti įtakos šuniukų gimimas ir tai, kad jie auginami kambaryje. Jeigu šuniukai užsikr÷tę kampilobakterijomis, jos išplatinamos žmonių gyvenamojoje aplinkoje.
Galvijai, avys ir kiaul÷s paprastai būna užsikr÷tę C. jejuni ir C. coli. Manoma, kad šie gyvūnai kampilobakterijomis užsikrečia iš užkr÷stos aplinkos (Humphrey ir kt., 2007). Humphrey ir Beckett (1987) atskleid÷ ryšį tarp vandens iš gamtinių šaltinių vartojimo ir melžiamų karvių užsikr÷timo kampilobakterijomis. Didžioji bandos dalis būna užsikr÷tusi šiomis bakterijomis. Tačiau skirtingų gyvūnų organizmuose būna skirtingas kampilobakterijų kiekis, tai priklauso nuo individualių savybių, kai kurie bandos gyvūnai būna iš viso neužsikr÷tę. Bendras bandos individų užsikr÷timas atspindi aplinkos užkr÷stumą.
Jeigu pieninių galvijų žarnyne yra kampilobakterijų, dažnai melžimo metu šiomis bakterijomis užteršiamas pienas. Tinkama higiena melžimo metu gali sumažinti užsikr÷timo lygį, tačiau tai n÷ra visiškai veiksminga kontrol÷s priemon÷. Vienintelis būdas užtikrinti, kad žmon÷s būtų apsaugoti nuo užsikr÷timo kampilobakterijomis per pieną yra pieno pasterizacija. Yra buvę protrūkių, kuriuos suk÷l÷ pasterizuotas pienas, tačiau tai yra susiję su pieno užteršimu po pasterizacijos arba nesilaikant technologinių reikalavimų pasterizacijos metu (Humphrey ir kt., 2007).
14 1.2.3 Kampilobakterijų kontrol÷ ir profilaktika
Gyvūnai, kurie yra auginami ganyklose, dažniau užsikrečia kampilobakterijomis, negu tie, kurie auginami uždarose patalpose (Heuer ir kt., 2001). Kampilobakterijos paprastai randamos natūralioje aplinkoje, tod÷l dažniau užsikrečia gyvūnai, kurie turi tiesioginį kontaktą su jomis (Humphrey ir kt., 2007).
Ūkyje turi būti kontroliuojamas horizontalus kampilobakterijų perdavimas. Kampilobakterijos patekusios į naminių paukščių pulką labai greitai išplinta ir tuo metu jų neįmanoma kontroliuoti. Kampilobakterijos į paukštyną patenka iš išorin÷s aplinkos, tod÷l svarbiausia kontrol÷s priemon÷ yra neleisti ar apriboti kontaktą su išorine aplinka. Taigi, tinkama biosauga uždarame paukščių ūkyje yra pagrindin÷ prevencijos priemon÷. Ūkininkai ir veterinarai lankosi broilerių pulkuose per visą jų auginimo ciklą. Kiekvienas vizitas padidina infekcijos riziką, tod÷l apsilankymai broilerių pulkuose tur÷tų būti ribojami. Labai svarbu laikytis higienos reikalavimų. Tinkamas kojų dezinfekavimas dezinfekavimo skystyje gali apsaugoti pulką nuo infekcijos, dar geresn÷ apsaugos priemon÷ yra higieniniai barjerai atskiriantys naminius paukščius nuo kitų paukščių. Išoriniai rūbai ir avalyn÷ turi būti išversti į vidinę pusę ir naudojami kiekvieną kartą einant į paukščių pulką. Skandinavijos šalys abejoja ilgalaikiu šio metodo veiksmingumu, tačiau tyrimais Jungtin÷je Karalyst÷je nustatyta, kad Norvegijoje taikant panašias priemones infekcija sumaž÷jo 67%. Kampilobakterijų infekcija buvo sumažinta 50% kai dažnai buvo keičiamas batų dezinfekavimo skystis (Anonymous, 2005). Ūkių higieną galima pagerinti daugiau naudojant betonuotus ar kitus gerai valomus paviršius, nes juos lengviau išlaikyti švarius ir sausus nei žolę ar dirvožemį. Taip pat labai svarbu bendroji ūkio higiena, tyrimai įvairiose šalyse parod÷, kad ūkiuose su nepakankamai gera higiena daugiau infekuotų pulkų. Tai gal÷tų būti susiję su dideliu kampilobakterijų kiekiu aplinkoje (Humphrey ir kt., 2007). Egzistuoja daug papildomų kontrol÷s priemonių galinčių kontroliuoti kampilobakterijas broilerių pulkuose:
• Konkurencinis pašalinimas: Sveika, subalansuota žarnyno mikroflora yra gyvybiškai svarbi visų gyvūnų imunin÷s sistemos vystymuisi, o imunin÷ sistema ir žarnyno komensalai apsaugo gyvūnus nuo žarnyno ligų suk÷l÷jų. Komerciniai viščiukai paprastai auginami sąlygose, kur jų žarnyno mikroflora negali vystytis natūraliu būdu. Siekiant viščiukuose
15 kontroliuoti salmoneles, gali būti naudojamas mišinys su nepatogeniškomis žarnyno bakterijomis, kurios atlieka konkurencinį salmonelių pašalinimą. Šis metodas iki šiol nebuvo s÷kminga kontrol÷s priemon÷ kampilobakterijoms. Komensalinę žarnyno mikroflorą galima valdyti keičiant gyvūnų mitybą, kai kurių mokslininkų tyrimai parod÷, kad viščiukai gavę tam tikrą pašarą yra labiau atsparūs kampilobakterijoms.
• Skiepai ir motininių antikūnių vaidmuo: Įvairiose šalyse atliekami tyrimai, kurių metu siekiama nustatyti, kurie kampilobakterijų genai yra svarbūs kolonijų susidarymui paukščių žarnyne. Šie tyrimai gal÷tų duoti pradžią vakcinai, prieš tam tikrus kampilobakterijų ląstelių taikinius. Viščiukai gali iššaukti antikūnių padaug÷jimą, kai yra užsikr÷tę kampilobakterijomis. Be to, didel÷ antikūnių koncentracija buvo rasta per÷jimo pulke ir jų kiaušinių trynyje (Sahin ir kt., 2001). Viščiukai iš tokių pulkų taip pat gali būti su teigiamais antikūniais. Tačiau duomenys apie antikūnių atsaką į kampilobakterijų infekciją yra neaiškūs ir reikia daugiau tyrimų, kad būtų taikoma tokia kontrol÷s priemon÷. Taip pat yra svarbu užtikrinti prieinamą vakcinos kainą.
• Gydymas bakteriofagais: Vištų žarnyne natūraliai yra virusų žinomų kaip bakteriofagai, kurie gali atakuoti kampilobakterijas (Anonymous, 2005). Tai gali būti kontrol÷s priemon÷. Naudojant bakteriofagų preparatus galima sunaikinti daugelį kampilobakterijų ląstelių esančių viščiukų žarnyne. Galima gydyti kampilobakterijomis užkr÷stus pulkus likus keletui dienų iki skerdimo siekiant sumažinti bakterijų platinimą. Tačiau šios kontrol÷s priemon÷s trūkumas yra tas, kad gali atsirasti bakteriofagams atsparių kampilobakterijų štamų (Humphrey ir kt., 2007).
Kaip kontrol÷s priemon÷ buvo pasiūlyta vakcinacija ir vaistų terapija, nors antibiotikų vartojimas lemia, kad visame pasaulyje atsiranda antibiotikams atsparios kampilobakterijos (Allos, 2001).
Paukštiena kampilobakterijomis gali būti užkr÷sta skerdenų tvarkymo metu, nuo kitų infekuotų paukščių. Tod÷l perdirbimo įmon÷se siekiant sumažinti produktų užterštumą, būtina taikyti RVASVT principų (Humphrey ir kt., 2007).
16 1.2.4 Kampilobakterijų patekimas į maistą
Saugius maisto produktus galima pagaminti termiškai apdorojant ir/arba slopinant patogenų dauginimąsi, kad jų kiekis nepasiektų kenksmingo lygio. Kampilobakterijos yra jautrios aukštai temperatūrai taikomai terminio apdorojimo metu, tačiau šios bakterijos labai kintančios, tod÷l į tai reikia atsižvelgti taikant kontrol÷s priemones (Humphrey ir kt., 2007).
Kärenlampi ir Hänninen (2004) įrod÷, kad C. jejuni šviežiuose maisto produktuose laikomuose žemoje temperatūroje gali išgyventi pakankamai ilgai ir sukelti pavojų vartotojui. Šių patogenų išgyvenimo laikas priklauso nuo sąlygų kuriose maistas laikomas. Tačiau duomenys rodo, kad kampilobakterijų skaičius užšaldytoje paukštienos skerdenoje gali likti iš esm÷s nepakitęs net 7 dienas (Jørgensen ir kt., 2002). Nepaisant ilgo išgyvenimo laiko, beveik visais žmonių užsikr÷timo kampilobakterijomis atvejais maistas nebuvo apdorotas pakankamai aukštoje ir/arba žemoje temperatūroje prieš vartojant. Nepaisant to, kad kampilobakterijos yra pavojingi patogenai žmon÷ms, mažai yra žinoma kaip kampilobakterijos reaguoja į nepalankias sąlygas perdavimo grandin÷je nuo gyvūnų žmon÷ms ir kaip šios bakterijos išgyvena maiste ar ne maisto aplinkoje. Taip pat yra mažai informacijos apie molekulinius mechanizmus, kurie padeda kampilobakterijoms išgyventi stresin÷je aplinkoje susijusioje su maisto gamyba. Kampilobakterijos yra daug jautresn÷s šilumai ir rūgštims, negu salmonel÷s arba E. coli. Kampilobakterijos gali reaguoti į pH, temperatūros ir prieinamo deguonies pokyčius, tačiau vis dar tiriama, ar tai gal÷tų būti tinkama kontrol÷s priemon÷, kad maistas taptų saugus. Svarbu atminti, kad kampilobakterijos neišgyvena po pasterizacijos ir tinkamai išvirus maistą. Kampilobakterijų tyrimai atskleid÷ jų jautrumą oksidacijos stresui. Oksidacinis stresas svarbų vaidmenį vaidina nužudant kampilobakterijas užšaldymo-atšildymo metu. Kampilobakterijos yra ypač jautrios osmosiniui šokui ir džiovinimui. Tai gali būti d÷l to, kad jos neturi sintez÷s ir transporto sistemų (Gaynor ir kt., 2005).
Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) yra nustačiusi penkis punktus, kad maistas būtų saugesnis. Tai yra:
• Laikytis švaros;
17 • Kruopščiai virti;
• Maistą laikyti saugioje temperatūroje; • Naudoti saugų vandenį ir žaliavas.
Maisto žaliavos, tokios kaip paukštiena gali sukelti riziką užsikr÷sti kampilobakterijomis jeigu nebus pakankamai gerai apdorota termiškai arba jeigu užkr÷sta paukštiena liesis su paruoštais vartojimui maisto produktais. Taip pat reik÷tų prisiminti, kad raudona m÷sa atsitiktinai gali užsikr÷sti kampilobakterijomis nuo išorin÷s paukštienos pakuot÷s (Burgess ir kt., 2005; Harrison ir kt., 2001). Maždaug apie 30 % kampilobakterioz÷s atvejų pasitaiko d÷l kryžminio užterštumo. Svarbiausia kryžminio užterštumo priežastis yra maisto žaliavų kontaktas su paruoštais maisto produktais. Tyrimai parod÷, kad ruošiant maistą iš labai kampilobakterijomis užterštų žaliavų pvz. paukštienos, kampilobakterijos gali būti plačiai paskleistos maisto ruošimo aplinkoje (Cogan ir kt., 1999). Taigi, darbo paviršius, durys ir spintelių rankenos, pjaustymo lentel÷s, pašluost÷s ir t. t. po gaminimo iš užkr÷stų žaliavų, kartais net po valymo gali būti užkr÷sti šiais patogenais. Labai svarbu, kad virtuv÷ po maisto gaminimo būtų išvaloma. Virtuv÷je gaminant maistą labai svarbu laikytis tinkamos higienos, nes užteršti darbo paviršiai arba pašluost÷s gali kelti riziką. Tiek viešojo maitinimo virtuv÷se, tiek namų virtuv÷se labai svarbu, kad kampilobakterijomis užterštos žaliavos būtų tinkamai apdorotos termiškai. Po terminio apdorojimo maistas turi būti saugomas, kad neužsikr÷stų pakartotinai. Yra daug būdų, kuriais išvirti maisto produktai gali būti iš naujo užkr÷sti kampilobakterijomis. Kaip min÷ta anksčiau, kampilobakterijos virtuv÷je plinta maisto ruošimo metu. Išnagrin÷jus vartotojų įpročius tvarkant maistą paaišk÷jo, kad 50% vartotojų nenusiplauna rankų po žalios paukštienos ar kitos m÷sos apdorojimo. Atsižvelgiant į aukštą paukštienos užkr÷stumą kampilobakterijomis lygį, natūralu, kad vartotojai ir maisto tiek÷jai tur÷tų plauti skerdenas. Maistas gali būti nesaugus, jeigu verdant maistą nepasiekiama pakankamai aukšta temperatūra. Kaip ir kitų zoonozinių patogenų, taip ir kampilobakterijų užterštumo lygį ant virtuv÷s paviršių veiksmingai galima sumažinti valant su valikliais, karštu vandeniu ir dezinfekavimo priemon÷mis. Tačiau vartotojai ne visada valo teisingai, kad pašalintų kampilobakterijas nuo virtuv÷s paviršių. Tinkamas rankų plovimas diar÷jos riziką gali sumažinti 50 % (Cogan ir kt., 1999).
18 1.3 Identifikavimo metodai
Boltonas ir kt. (1997), paskelb÷ daug metodų ir įrod÷, kad naudojant mikroaerobinę aplinką sudarančias sistemas, galima išskirti kampilobakterijas iš klinikinių m÷ginių. Identifikavimui paprastai reikalingas bakterijų pagausinimas. Kampilobakterijų patvirtinimas iš maisto ir aplinkos m÷ginių gali užtrukti 5 dienas, tai sukelia sunkumų protrūkių metu. Naudojant įvairius reikmenis galima sutrumpinti išskyrimo ir patvirtinimo laika.
Imunologiniai metodai:
Kampilobakterijos sukelia užkr÷stų šeimininkų antikūnių atsaką ir šitie baltymai gali būti naudojami greitam patogenų išaiškinimui ir/arba patvirtinimui maiste. Grup÷ Airijoje (Grennan ir kt., 2001) apibūdino PGR – ELISA metodą, kampilobakterijų aptikimui ir išskyr÷ C. jejuni ir C.
coli iš paukštienos m÷ginių. PGR tyrimų taikinys yra kampilobakterijų DNR oligonukleotidų
zondų 16S/23S rRNR tarpgenin÷s sritys. Jų tyrimai parod÷, kad PGR – ELISA metodo pagalba galima aptikti kampilobakterijas ir iki galo identifikuoti C. jejuni ir C. coli pagausintuose paukštienos m÷sos m÷giniuose.
Fenotipinis metodas:
Dažniausiai kampilobakterijos nustatomos remiantis klasikin÷mis fenotipin÷mis savyb÷mis, įskaitant kolonijų morfologiją, judrumą, katalaz÷s, oksidaz÷s, hipurato hidroliz÷s testais, H2S
gamyba, jautrumas antibiotikams cefalotinui ir nalidikso rūgščiai (Nachamkin, 2003). Klasikinio fenotipinio identifikavimo metodo trūkumas yra tas, kad rūšių išskyrimas dažnai remiasi viena ar dviem skirtingomis charakteristikomis pavyzdžiui, hidrolaz÷s ir ureaz÷s aktyvumu. Hipurato hidroliz÷s aktyvumo testas atskiria daugelį C. jejuni padermių nuo kitų kampilobakterijų rūšių. Tačiau pasteb÷ta, kad 5 – 8 % C. jejuni nepasireiškia hipurato aktyvumas ir yra klaidingai neigiamas hipurato hidroliz÷s testas. Be to, daugelyje šalių padid÷jo C. jejuni ir C. coli atsparumas chinolonams (Engberg ir kt., 2005). Tai sukelia problemų identifikuojant rūšis, kai išimtinai taikomas tik fenotipinis tyrimas, tačiau šis metodas dažniausiai naudojamas išskirti
Campylobacter spp. įprastose laboratorijose. Nor÷dami tiksliai nustatyti netipišką C. jejuni ir
kitas kampilobakterijas reikia atlikti papildomus biocheminius testus ir/arba molekulinius metodus jeigu yra reikalinga (On, 1996). N÷ra nustatyta, kad kampilobakterijų identifikavimui naudojamos komercin÷s sistemos yra tikslesn÷s negu tradiciniai metodai. Pavyzdžiui,
19 kampilobakterijų identifikavimo komercinis rinkinys API Campy (API Biomériux Ltd., Marcy l’Etoile, France) klaidingai identifikuoja kai kurias rūšis, jo d÷ka negalime atskirti C. concisus nuo C. mucosalis, taip pat reikia būti labai atidiems identifikuojant tam tikras C. coli ir C. lari padermes (Reina ir kt., 1995; On, 1996).
Molekuliniai metodai:
DNR paremti aptikimo metodai, tokie kaip PGR yra naudojami kampilobakterijoms identifikuoti. Priešingai nei klasikiniais metodais, kai nustatomos tik gyvos bakterijos galinčios augti, genomu paremti metodai aptinka DNR tiek iš gyvų, tiek mirusių bakterijų. Tai nesudaro problemų, kada m÷giniai yra šviežių išmatų arba iš aklosios žarnos su dideliu skaičiumi gyvybingų kampilobakterijų, tačiau yra rimtų sunkumų, kada tiriami aplinkos ar maisto m÷giniai, kuriuose yra ir gyvų ir mirusių bakterijų. Pavyzdžiui, virtoje paukštienoje bus didelis skaičius žuvusių kampilobakterijų. Šis molekulinių metodų trūkumas yra susijęs ne tik su kampilobakterijomis, bet ir su kitais mikroorganizmais. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija (PGR) tai nebrangus ir greitas specifinių DNR atkarpų pagausinimo (amplifikacijos) metodas, galintis per keliolika minučių pagaminti tūkstančius specifinių DNR fragmentų iš nedidelio kiekio DNR. PGR ciklas susideda iš 3 etapų:
• DNR išvyniojimas: aukštoje temperatūroje dviguba DNR grandin÷ išsivynioja ir tampa prieinama jungčiai su vienos DNR grandin÷s specialiai tam pagamintais 2 pradmenimis; • Pradmenų prijungimas: sumažinus temperatūrą, DNR pradai prisijungia prie bandomos
DNR molekul÷s atkarpose, kurių sekos sutampa su prado sekomis;
• DNR sintez÷: pak÷lus temperatūrą, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR grandin÷ DNR polimeraz÷s enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotidų sekas. Ciklas kartojamas kelis kartus, kuo daugiau ciklų tuo daugiau pagaminama DNR fragmentų. Pagausinti fragmentai matomai elektroforez÷s gelyje.
Siekiant aptikti kampilobakterijų genties bakterijas naudojamas 16S rRNR regionas, jis yra PGR taikinys, tuo tarpu mažiau specifiniai lokusai yra skirti nustatyti konkrečias rūšis. Vienas iš pavyzdžių yra hipO genas pas C. jejuni (Bang ir kt., 2002). Tradicinis PGR aptikimas gali reikalauti daug pastangų d÷l techninių darbuotojų patirties, kurios reikia siekiant išvengti kryžmin÷s amplifikuotos DNR taršos. D÷l šios ir kitų priežasčių buvo sukurta tikro laiko PGR (Yang ir kt., 2005). Šis metodas reikalauja mažiau pastangų iš techninio personalo, tod÷l jį gali
20 atlikti žmon÷s turintys mažiau patirties. Be to, šis metodas papildo kiekybinius aptikimo aspektus, kai ciklų skaičius pasiekia ribinę vertę, tai ši reikšm÷ yra tiesiogiai susijusi su pradiniu kampilobakterijų skaičiumi m÷ginyje, jeigu m÷ginys n÷ra iš anksto pagausintas. PGR metodų trūkumas, tačiau šis trūkumas bendras ir kitiems metodams, yra tas, kad daugelis laboratorijų yra susikūrę protokolus pagal kuriuos dirba, tačiau rezultatų negalima palyginti su kitomis laboratorijomis, nes jos naudoja skirtingus protokolus (Wang, 2002).
21
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS
2.1 M÷ginių rinkimas ir kampilobakterijų išskyrimas
Tyrimams buvo pasirinkti trys didžiausi paukštienos produktų gamintojai Lietuvoje, kurių gaminiai buvo perkami jų neįsp÷jant. Iš įvairių Lietuvos prekybos centrų nuo 2009 metų kovo m÷nesio iki 2009 metų spalio m÷nesio, kas savaitę buvo perkami įmonių A, B ir C (kodinis žym÷jimas) atv÷sinti broilerių sparneliai ir blauzdel÷s. Iš viso buvo ištirti 174 m÷giniai, iš jų 87 broilerių sparneliai ir 87 blauzdel÷s.
Kiekvieną savaitę paimti m÷giniai buvo tiriami kampilobakterijų atžvilgiu. Iš kiekvieno m÷ginio bakterijos buvo išskiriamos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kampilobakterijų kiekybin÷je analiz÷je naudojami tik tie m÷giniai, kur bakterijos buvo išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro.
Kampilobakterijos buvo tiriamos nuo produktų paviršiaus, tod÷l m÷ginys buvo skalaujamas buferiniame peptono vandenyje ir daromi dešimtkarčiai praskiedimai. Kiekvienas produktas buvo įdedamas į sterilų vienkartinį maišelį ir užpilamas 100ml buferiniu peptono vandeniu (BPW; Oxoid Ltd., Basingstoke, UK), taip paruoštas m÷ginys rankiniu būdu buvo maišomas 1min. Po to, buvo atlikti 5 dešimtkarčiai praskiedimai su buferiniu peptono vandeniu. Į sterilias vienkartines l÷kšteles paruoštas su selektyvia mCCDA terpe buvo pas÷ta po 0,1 ml m÷ginio iš atitinkamų praskiedimų. Pas÷tos l÷kštel÷s su mCCDA terpe buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 48 val., mikroaerofilin÷mis sąlygomis (85% azoto, 10% anglies dioksido ir 5% deguonies, Campygen CN25; Oxoid Ltd, Anglija). Po inkubacijos l÷kštel÷se su mCCDA buvo skaičiuojamos kampilobakterijoms būdingos kolonijos, kurios v÷liau buvo patikrinamos fazinio kontrasto mikroskopu, vertinant jų morfologiją ir judrumą. Po to, iš kiekvienos l÷kšteles buvo atrenkama iki 5 kolonijų ir kiekviena kolonija pas÷jama į l÷kšteles su kraujo agaru (Blood Agar Base No. 2 (Liolfilchem, Italy)), praturtintu 7 % arklių krauju ir inkubuojama 37 °C, 48 val. Po inkubavimo gryna kultūra buvo saugoma – 70 °C, BHI sultinyje (BHI; Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) turinčiame 20 % glicerolio (glycerol; "Stanlab" Poland).
22 Kiekvienas m÷ginys atitinkamai buvo pagausinamas Bolton sultinyje. Ir tuo atveju jeigu kampilobakterijos nebuvo išskiriamos iš tiesioginio s÷jimo ant mCCDA agaro, buvo atliekami s÷jimai iš pagausinimo. Į m÷gintuv÷lį su selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu (CM0983; Oxoid Ltd., England), selektyviu Bolton sultinio priedu (SR0183E; Oxoid Ltd., England) ir 5 % arklio krauju (SR0048; OxoidLtd., England) buvo s÷jama 0,1ml pradinio skiedimo m÷ginio. Pagausinimo m÷gintuv÷liai buvo inkubuojami mikroaerofilin÷mis sąlygomis, 42 °C, 24h. Po inkubacijos 10 µl sultinio buvo s÷jama į l÷kšteles su mCCDA agaru. Kampilobakterijų nustatymas ir išgryninimas atliekamas taip pat kaip buvo aprašyta anksčiau.
2.2 DNR išskyrimas ir daugin÷ PGR
DNR išskyrimas: Nuo l÷kštel÷s su kraujo agaru surenkama pilna kilpel÷ grynos kampilobakterijų kultūros ir perkeliama į m÷gintuv÷lį su 500 µl distiliuoto vandens. Taip paruoštas tirpalas yra kaitinamas termomikseryje 100 °C, 10 min., po to 5min. centrifuguojama 14 000 aps/min. Supernantas perkeliamas į naują m÷gintuv÷lį, o išskirta DNR iškarto naudojama PGR, arba užšaldoma -20 °C iki tyrimo.
Kampilobakterijų aptikimas ir atskyrimas naudojant daugine PGR: Kampilobakterijos buvo identifikuojamas iki rūšies naudojant šiek tiek pakeistą Wang ir kt. (2002) aprašytą metodą ir pradmenis. Naudojant pradmenis 23SF ir 23SR susidar÷ 650 bp fragmentai, kurie pasireiškia visose kampilobakterijose. C. jejuni amplifikuoto fragmento ilgis 323 bp, o C. coli – 126 bp, tyrimams buvo naudojamas pradmenų oligonukleotidų mišinys hibridizuojantis su C. jejuni hipO genu (pradmenys CJF ir CJR) ir su C. coli glyA genu (pradmenys CCF ir CCR).
Bendras PGR reakcijos mišinio kiekis vienam m÷giniui buvo 25 µl. Kiekvienas PGR mišinys buvo ruošiamas iš 2 µl 2 mM deoksinukleozido trifosfato mišinio, 2,5 µl 10X reakcijos buferio, 2,5 µl 25 mM MgCl2, 0.25 µl HotStart Taq DNR polimeraz÷s (MBI, Fermentas), 0,75 µl
100 µM pradmenų mišinio, kuris sudarytas iš 23S rRNR C. jejuni ir C. coli pradmenų, 2,5 µl chromosomų DNR ir distiliuoto H2O iki 25 µl. PGR produktai buvo analizuojami elektroforez÷s
gelyje. Po 11 µl kiekvieno PGR produkto buvo pakraunama į 1,3 % TopVision™ LM GQ agaroz÷s gelį (MBI, Fermentas), kuriam buvo 0,05 µl/ml etidžio bromido tirpalo. PGR rezultatai
23 atlikus elektroforezę buvo vertinami padarius nuotraukas UV spindulių šviesoje. Buvo naudojami GeneRulerTM100 bp DNA Ladder (MBI, Fermentas) molekuliniai žymenys.
2.3 Matematin÷ duomenų analiz÷
Matematiškai duomenys apdorojami statistiniais, Microsoft Office Excel 2007, SPSS 16.0 programiniais paketais.
Ryšiui tarp kintamųjų įvertinti buvo skaičiuojami Pirsono ir Spirmeno koreliacijos koeficientai. Siekiant išsiaiškinti veiksnių įtaką priklausomam kintamajam buvo taikoma daugiafaktorin÷ dispersin÷ analiz÷ (ANOVA). Vertinant skirtumus tarp nepriklausomų, neparametrinius duomenis turinčių imčių buvo skaičiuojamas chi-kvadratas. Skirtumai tarp imčių besiskiriančių pagal vieną požymį buvo vertinami skaičiuojant vienfaktorinę ANOVA.
24
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis
Užkr÷stumo tyrimai parod÷, kad 46,6 % visų tirtų broilerių produktų buvo užkr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis, o iš jų 16,7 % bakterijos buvo išskirtos tik po pagausinimo Bolton sultinyje (3 lentel÷).
Broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis tarp įmonių A, B ir C buvo reikšmingai skirtingas (χ2=15,52; df=2; p=0,001). Daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų buvo įmon÷je A, - 67,2 %, iš jų 50,0 % išskirta tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir 17,2 % po pagausinimo Bolton sultinyje. Įmon÷je C buvo užkr÷sta 39,7 % broilerių produktų, 13,8 % išskirta tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, ir 25,9 % po pagausinimo. Mažiausia kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų buvo įmon÷je B, 32,8 %, iš jų 25,9 % išskirta tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir tik 6,9 % po pagausinimo. Gamintojo A broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis yra reikšmingai didesnis negu gamintojo B (χ2=13,79; df=1; p=0,00) ir C (χ2=8,87; df=1; p=0,00). Broilerių produktų užk÷stumas kampilobakterijomis tarp gamintojų B ir C reikšmingai nesiskyr÷ (χ2=0,6; df=2; p=0,44).
3 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis
Gamintojai M÷ginių sk. Teigiamų m÷ginių sk. išskirtų tiesiogiai % Teigiamų m÷ginių sk. po pagausinimo % Viso teigiamų m÷ginių sk. % A 58 29 50,0 10 17,2 39 67,2 B 58 15 25,9 4 6,9 19 32,8 C 58 8 13,8 15 25,9 23 39,7 Viso: 174 52 29,9 29 16,7 81 46,6
Kampilobakterijomis buvo užkr÷sta 44,9 % blauzdelių, iš jų 31,0 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, o 13,9 % po pagausinimo Bolton sultinyje (4 lentel÷). Sparnelių užkr÷stumas buvo panašus kaip ir blauzdelių, kampilobakterijomis užkr÷sta 48,1 % sparnelių, iš jų 28,7 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir
25 19,4 % po pagausinimo Bolton sultinyje. Reikšmingo skirtumo tarp užkr÷stų sparnelių ir blauzdelių n÷ra (χ2=0,21; df=1; p=0,65). Visi sparneliai ir blauzdel÷s vienodai užkr÷sti kampilobakterijomis.
Paskaičiavus neparametrinį rangų koreliacijos koeficientą, buvo nustatyta, kad yra vidutinio stiprumo teigiamas ryšys tarp kampilobakterijomis užk÷stų ir neužkr÷stų sparnelių ir blauzdelių (r=0,56, p=0,0000).
Nustatytas reikšmingas skirtumas tarp gamintojų A, B ir C blauzdelių užkr÷stumo kampilobakterijomis (χ2=12,43; df=2; p=0,002). Daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų blauzdelių buvo įmon÷je A 69,0 %, iš jų 51,7 % išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, ir 17,3 % po pagausinimo Bolton sultinyje. Įmon÷je C buvo 37,9 % užkr÷stų broilerių blauzdelių iš jų 17,2 % išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir 20,7 % po pagausinimo. Mažiausia užkr÷stų blauzdelių buvo įmon÷je B 24,1 %, visos kampilobakterijos išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, po pagausinimo nebuvo nei vieno teigiamo m÷ginio. Reikšmingas skirtumas buvo tarp gamintojų A ir B (χ2=11,71; df=1; p=0,000) bei A ir C (χ2=5,61; df=1; p=0,02) blauzdelių užkr÷stumo. Reikšmingo skirtumo nebuvo tarp gamintojų B ir C blauzdelių (χ2=1,29; df=1; p=0,26).
Daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų sparnelių buvo įmon÷je A 62,2 %, iš jų 48,3 % išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro, ir 13,9 % po pagausinimo Bolton sultinyje, tačiau skirtumas tarp skirtingų gamintojų sparnelių užkr÷stumo kampilobakterijomis nebuvo reikšmingas (χ2=3,31; df=2; p=0,19). Įmon÷se B ir C buvo vienodas užkr÷stų sparnelių skaičius po 41,4 %. Tačiau įmon÷je C 10,3 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir 31,1 % po pagausinimo, o įmon÷je B 27,6 % kampilobakterijų išskirtos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir 13,8 % po pagausinimo Bolton sultinyje.
26 4 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis Gamintojai Broilerių produktai M÷ginių sk. Teigiamų m÷ginių sk. išskirtų tiesiogiai % Teigiamų m÷ginių sk. po pagausinimo % Viso teigiamų m÷ginių sk. % Sparneliai 29 14 48,3 4 13,9 18 62,2 A Blauzdel÷s 29 15 51,7 5 17,3 20 69,0 Sparneliai 29 8 27,6 4 13,8 12 41,4 B Blauzdel÷s 29 7 24,1 0 0 7 24,1 Sparneliai 29 3 10,3 9 31,1 12 41,4 C Blauzdel÷s 29 5 17,2 6 20,7 11 37,9 Sparneliai 87 25 28,7 17 19,4 42 48,1 Viso: Blauzdel÷s 87 27 31,0 12 13,9 39 44,9
Broilerių produktų užkr÷stumo kampilobakterijomis dinamika priklausomai nuo m÷nesio pateikta 3 pav. Tyrimo duomenimis, mažiausiai kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų buvo kovo m÷nesį, o daugiausiai - buvo liepos m÷nesį. Nustatytas reikšmingas skirtumas tarp skirtingų m÷nesių broilerių produktų užkr÷stumo kampilobakterijomis (χ2=24,65; df=6; p=0,000). Reikšmingas skirtumas buvo tarp kovo ir geguž÷s, kovo ir birželio, kovo ir liepos, kovo ir rugpjūčio, kovo ir rugs÷jo, balandžio ir liepos, balandžio ir rugs÷jo, geguž÷s ir liepos, geguž÷s ir rugs÷jo, birželio ir liepos bei birželio ir rugs÷jo broilerių produktų užkr÷stumo (p<0,05).
27 3 pav. Paukštienos produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis kovo - rugs÷jo m÷nesiais (N – bendras tirtas m÷ginių skaičius)
3.2 Kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų paviršiaus
Tyrimo metu buvo ne tik išskiriamos kampilobakterijos, bet taip pat buvo skaičiuojami kolonijas sudarantys vienetai (ksv) ir išreiškiami dešimtainiu logaritmu. Didžiausias kampilobakterijų skaičius buvo nustatytas įmon÷je A, 1,76 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis
±0,67 (5 lentel÷). Įmon÷se B ir C kampilobakterijų skaičius atitinkamai buvo, 1,39 log10 ksv/g,
standartinis nuokrypis ± 0,44 ir 1,49 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ± 0,56, tačiau skirtumas
kampilobakterijų kiekio tarp visų įmonių n÷ra reikšmingas (p˃0,05).
Siekiant išsiaiškinti, kurie veiksniai turi įtakos kampilobakterijų kiekiui ant broilerių produktų buvo atliekama daugiafaktorin÷ dispersin÷ analiz÷. Išskirti tokie faktoriai: broilerių produktai (sparnelis, blauzdel÷), gamintojai (A, B ir C) ir m÷ginių rinkimo laikas (kovas, balandis, geguž÷, birželis, liepa, rugpjūtis ir rugs÷jis). Nustatyta, kad kampilobakterijų skaičiui ant broilerių produktų statistiškai reikšmingos įtakos turi m÷ginių rinkimo laikas (F=3,7; df=6; p=0,0048). Gamintojai (F=0,96; df=2; p=0,39) ir broilerių produktai (F=0,59; df=1; p=0,45) reikšmingos įtakos kampilobakterijų kiekiui ant paukštienos paviršiaus neturi.
28 5 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis ir kolonijas sudarančių vienetų skaičius g
Produktų vidurkis log10 ksv/g
Gamintojas Vidurkis
log10 ksv/g Sparneliai Blauzdel÷s
A 1,76 1,62 1,90
B 1,39 1,31 1,47
C 1,49 1,74 1,23
Viso: 1,55 1,56 1,53
Buvo paskaičiuotas koreliacijos koeficientas (r=0,06; p=0,58) ir nustatyta, kad n÷ra patikimo ryšio tarp kampilobakterijų kiekio ant sparnelių ir blauzdelių.
Tyrimo duomenimis, didžiausias kampilobakterijų skaičius buvo nustatytas ant įmon÷s A blauzdelių 1,90 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,78. Mažiausias kampilobakterijų skaičius
buvo ant įmon÷s C blauzdelių 1,23 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,33. Ant įmon÷s B
blauzdelių buvo nustatytas 1,47 log10 ksv/g kampilobakterijų skaičius, standartinis nuokrypis
±0,46. Tačiau skirtumas tarp atskirų gamintojų blauzdelių kampilobakterijų kiekio n÷ra reikšmingas p˃0,05.
Įmonių A ir C kampilobakterijų skaičius ant sparnelių buvo panašus, atitinkamai 1,62 log10
ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,56 ir 1,74 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis ±0,80. Mažiausias
kampilobakterijų skaičius buvo ant įmon÷s B sparnelių 1,31 log10 ksv/g, standartinis nuokrypis
±0,45. Skirtumas tarp atskirų gamintojų sparnelių kampilobakterijų kiekio n÷ra reikšmingas p˃0,05.
29 4 pav. Kampilobakterijų kolonijas sudarančių vienetų skaičiaus vidurkis log10 ksv/g
skirtingais tyrimo m÷nesiais (N – bendras tirtas m÷ginių skaičius)
Atlikus tyrimą nustatyta, kad didžiausias kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų buvo geguž÷s m÷nesį - 2,44 log10 ksv/g (4 pav.). Mažiausias kampilobakterijų kiekis buvo liepos
ir rugs÷jo m÷nesiais, 1,45 log10 ksv/g ir 1,43 log10 ksv/g. Kovo m÷nesį kampilobakterijos buvo
išskirtos tik iš dviejų m÷ginių, tačiau tik vieno m÷ginio duomenys įtraukti į kiekybinę duomenų analizę, nes iš antro m÷ginio kampilobakterijos buvo išskirtos tik po pagausinimo. Nustatyta, kad kovo m÷nesio teigiamas m÷ginys buvo užkr÷stas kampilobakterijomis 2,4 log10 ksv/g, kadangi
sunku lyginti šio m÷nesio duomenis su kitų m÷nesių kiekybiniais kampilobakterijų užkr÷stumo vidurkio duomenimis, 4 pav. n÷ra įtraukta šio m÷nesio duomenų. Reikšmingas kampilobakterijų kiekio skirtumas yra tarp balandžio ir geguž÷s, geguž÷s ir birželio, geguž÷s ir liepos, geguž÷s ir rugpjūčio bei geguž÷s ir rugs÷jo m÷nesių (p<0,05).
30 3.3 Identifikuotos kampilobakterijų rūšys daugin÷s PGR metodu
Naudojant dauginį PGR metodą, kampilobakterijos buvo identifikuojamos iki rūšies. PGR rezultatai atlikus elektroforezę buvo vertinami padarius nuotraukas UV spindulių šviesoje (5 pav.).
5 pav. Polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos rezultatų atlikus elektroforezę nuotrauka: 11 - DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1000 bp (MBI, Fermentas); 1, 4, 5, 7, 16 ir 18 - C. jejuni; 2, 3, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21 ir 22 - C. coli.
Nuo 2009 m. kovo m÷n. iki 2009 m. spalio m÷n. buvo užšaldyti 263 grynųjų kampilobakterijų kultūrų m÷giniai. Iš įmon÷s A buvo užšaldyti 146 grynųjų kultūrų m÷giniai, B – 57 m÷giniai, o C – 60. Remiantis tyrimo duomenimis nustatyta, kad 69,12 % broilerių sparnelių ir blauzdelių buvo užkr÷sti C. jejuni, 13,23 % produktų užkr÷sti C. coli ir 17,65 % broilerių produktų užkr÷sti abiem kampilobakterijų rūšimis (C. jejuni ir C. coli) (6 lentel÷).
Daugiausia C. jejuni buvo identifikuota įmon÷s B m÷giniuose – 78,57 %, o mažiausia įmon÷s C m÷giniuose – 50 %. Daugiausia C. coli bakterijų buvo identifikuota įmon÷s C m÷giniuose – 30 %, o mažiausia įmon÷s A m÷giniuose – 2,94 %. Skirtingas kampilobakterijų rūšių santykis yra reikšmingas tarp gamintojų A ir C (χ2=8,44; df=2; p=0,01). Tarp kitų gamintojų kampilobakterijų rūšių santykio reikšmingo skirtumo n÷ra (p˃0,05).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 650 bp
323 bp 126 bp
31 6 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių produktų užkr÷stumas C. jejuni ir C. coli rūšimis
Gamintojai M÷ginių sk. C. jejuni % C. coli % C. jejuni ir C. coli % A 34 26 76,47 1 2,94 7 20,59 B 14 11 78,57 2 14,29 1 7,14 C 20 10 50 6 30 4 20 Viso: 68 47 69,12 9 13,23 12 17,65
Atlikus tyrimą daugin÷s PGR metodu buvo identifikuotos termofilin÷s kampilobakterijų rūšys. Nustatyta, kad broilerių blauzdel÷s ir sparneliai buvo panašiai užkr÷sti C. jejuni kampilobakterijomis, atitinkamai 68,75 % ir 69,44 %. Taip pat panašiai blauzdel÷s ir sparneliai buvo užkr÷sti C. coli kampilobakterijomis, atitinkamai 12,5 % ir 13,89 % (7 lentel÷). Kampilobakterijų rūšių pasiskirstymas ant visų gamintojų sparnelių ir blauzdelių n÷ra reikšmingas (χ2=13,5; df=10; p=0,2).
C. jejuni kampilobakterijomis dažniausiai buvo užkr÷stos įmonių A ir B blauzdel÷s,
atitinkamai 70,59 % ir 80 %. Rečiausiai, C. jejuni kampilobakterijos buvo identifikuotos nuo įmon÷s C sparnelių paviršiaus 40 %. Dažniausiai C. coli bakterijos buvo identifikuota nuo įmon÷s C broilerių sparnelių ir blauzdelių paviršiaus po 30 %. O nuo įmon÷s A broilerių sparnelių ir B broilerių blauzdelių paviršiaus iš viso nebuvo identifikuota vien C. coli. Reikšmingas skirtumas nerastas tarp kampilobakterijų rūšių pasiskirstymo ant atskirų gamintojų sparnelių ir blauzdelių (p˃0,05). Visų gamintojų broilerių sparneliai ir blauzdel÷s buvo daugiau užkr÷sti C. jejuni kampilobakterijomis, negu C. coli.
7 lentel÷ Įmonių A, B ir C broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas C. jejuni ir C. coli rūšimis Gamintojai Broilerių produktai M÷ginių sk. C. jejuni % C. coli % C. jejuni ir C. coli % Sparneliai 17 14 82,35 0 0 3 17,65 A Blauzdel÷s 17 12 70,59 1 5,88 4 23,53 Sparneliai 9 7 77,78 2 22,22 0 0 B Blauzdel÷s 5 4 80 0 0 1 20 Sparneliai 10 4 40 3 30 3 30 C Blauzdel÷s 10 6 60 3 30 1 10 Sparneliai 36 25 69,44 5 13,89 6 16,67 Viso: Blauzdel÷s 32 22 68,75 4 12,5 6 18,75
32 Identifikavus broilerių produktų kampilobakterijas nustatyta, kad daugiausia C. jejuni kampilobakterijų buvo kovo m÷nesį 100 % (6 pav.). Tačiau kovo m÷n. buvo tik 2 teigiami m÷giniai, tod÷l šio m÷nesio rezultatus sunku lyginti su kitais m÷nesiais. Mažiausiai m÷ginių užkr÷stų C. jejuni buvo identifikuota geguž÷s 33,34 % ir birželio 50 % m÷nesiais. Tyrimo duomenimis, kovo ir rugpjūčio m÷nesiais iš viso nebuvo užkr÷stų produktų vien C. coli bakterijomis. Mažiausias C. coli kampilobakterijų santykis buvo liepos m÷nesį – 5,88 %. Geguž÷s m÷nesį C. coli buvo identifikuota daugiausia - 44,44 %. Skirtingi kampilobakterijų rūšių santykių pasiskirstymai lyginant visus m÷nesius n÷ra reikšmingi (χ2=16,83; df=10; p=0,08). Reikšmingas skirtumas buvo tik tarp geguž÷s ir liepos (χ2=5,97; df=2; p=0,05) bei geguž÷s ir rugs÷jo (χ2=6,75; df=2; p=0,03).
6 pav. C. jejuni ir C. coli rūšių pasiskirstymas broilerių produktuose skirtingais m÷nesiais
33
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio tyrimo metu buvo ištirtas trijų Lietuvos paukštienos gamintojų broilerių produktų (sparnelių ir blauzdelių) mažmenin÷je prekyboje užkr÷stumas kampilobakterijomis nustatytas kampilobakterijų kiekis ant produktų ir identifikuotos kampilobakterijų rūšys. Tokių tyrimų rezultatai Lietuvoje dar nebuvo iki šiol paskelbti ir tai yra pirmas kartas. Tyrimo rezultatai parod÷, kad beveik pus÷ (46,6 %) pagrindinių broilerių produktų gamintojų į rinką tiekiamų sparnelių ir blauzdelių yra užkr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis. Mažmenin÷je rinkoje parduodamų paukštienos produktų tyrimai buvo atlikti ir kitose šalyse, ir gauti panašūs rezultatai: Ispanijoje Campylobacter spp. užkr÷sti 49,5 % m÷ginių (Dominguez ir kt., 2002), Vokietijoje 45,9 % (Atanassova ir Ring, 1999) ir Belgijoje 49,4 % (2002 m.) bei 44,9 % (2003 m.) (Ghafir ir kt., 2007). Skirtingai nei Lietuvoje, kai kuriose šalyse broilerių produktai mažmenin÷je prekyboje kampilobakterijomis užkr÷sti daug dažniau: Jungtin÷je Karalyst÷je atliktų tyrimų metu nustatyta, kad paukštiena kampilobakterijomis užkr÷sta nuo 68 % iki 87 % (Harrison ir kt., 2001; Kramer ir kt., 2000; Meldrum ir kt., 2004), Šiaur÷s Airijoje - 94 % (Moore ir kt., 2002), Kroatijoje - 66,6 % (Granić ir kt., 2009). Taip pat didelis paukštienos produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis mažmenin÷je prekyboje nustatytas Italijoje – 81,3 % ir Prancūzijoje – 75,7 % (Denis ir kt., 2001; Pezzotti ir kt., 2003).
EFSA duomenimis 2008 metais Lietuvoje sergamumo kampilobakterioze indeksas buvo 22,6/100000 ir tai nebuvo labai aukštas kampilobakterioz÷s susirgimų rodiklis lyginat su kitomis šalimis (1 lentel÷) (EFSA, 2010). Mūsų atlikto tyrimo duomenys patvirtina tai, kad kampilobakterioz÷ glaudžiai susijusi su broilerių produktų užkr÷stumu ir kampilobakterijų kiekiu ant produktų. Lietuvos mažmenin÷je rinkoje parduodami broilerių produktai n÷ra užkr÷sti dideliu kiekiu kampilobakterijų, tai gali tur÷ti įtakos, sąlyginai neaukštam patvirtintų kampilobakterioz÷s atvejų skaičiui Lietuvoje. Be to, neaukštas kampilobakterioz÷s indeksas gali būti susijęs su tuo, kad sergantys nesikreikia į gydymo įstaigas, o jeigu kreipiasi, tai dažniausiai suk÷l÷jo patvirtinimo tyrimas neatliekamas ir tik esant sunkiems susirgimams, su būdingais kampilobakteriozei simptomais nustatomas suk÷l÷jas. Kitose šalyse, kur nustatytas labai aukštas broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis arba produktai užkr÷sti dideliu bakterijų
34 kiekiu, d÷l nepakankamai gero terminio apdorojimo ar higienos taisyklių nesilaikymo, padid÷ja kryžminio užkr÷stumo rizika, kas gali įtakoti didesnį užregistruojamų patvirtintų kampilobakterioz÷s atvejų skaičių.
Pagal maisto saugos reikalavimus žmonių maistui skirtų produktų kokyb÷ ir sauga tur÷tų būti užtikrinama „nuo lauko iki stalo“. Teis÷s aktai, kaip pavyzdžiui reglamentai 852/2004 „D÷l maisto produktų higienos“, 853/2004 „Nustatantis konkrečius gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktų higienos reikalavimus“, direktyva 207/43/EB nustatanti būtiniausias broilerių apsaugos taisykles, higienos normos ir kt. turi užtikrinti, kad žmon÷ms tiekiamas maistas būtų saugus ir nekeltų rizikos jų sveikatai. Higienos normos 15:2005 „Maisto higiena“ laikymasis turi užtikrinti, kad būtų vykdoma griežta maisto produktų skirtų žmonių maistui kontrol÷ kiekviename gamybos, perdirbimo, transportavimo bei pardavimo etape. Mūsų tyrimo metu buvo nustatyta, kad broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis tarp įmonių A, B ir C skiriasi reikšmingai. Kampilobakterijų paplitimui ūkiuose labai svarbu bendroji higiena ir taikomos biosaugos priemon÷s. Tyrimai įvairiose šalyse parod÷, kad ūkiuose kur nesilaikoma higienos bei biosaugos reikalavimų yra daugiau kampilobakterijomis užsikr÷tusių broilerių pulkų. Tai gal÷tų būti susiję su dideliu kampilobakterijų kiekiu aplinkoje (Humphrey ir kt., 2007). Atsižvelgiant, į tai, kad daugiausia kampilobakterijomis užkr÷stų broilerių produktų buvo įmon÷je A, galime manyti, kad šis gamintojas prasčiau laikosi higienos reikalavimų, nei B ir C. Visos šios įmon÷s yra sertifikuotos pagal maisto produktų saugos standartą (BRC Food), tačiau gamintojai B ir C papildomai yra sertifikuoti pagal Maisto saugos vadybos sistemą (ISO 22000:2005). Tod÷l sugriežtinta kokyb÷s kontrol÷ gal÷jo įtakoti, kad gamintojų B ir C broilerių produktai rečiau užkr÷sti kampilobakterijomis palyginus su A.
Broilerių skerdena labiausiai kampilobakterijomis užteršiama skerdimo proceso metu (Berndtson ir kt., 1992; Norman ir kt., 2008). Belgijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad broilerių sparneliai yra dažniau užkr÷sti kampilobakterijomis negu kulšel÷s, atitinkamai 75 % ir 59,71 % (Habib ir kt., 2008). Mūsų tyrimų metu nebuvo reikšmingo skirtumo tarp sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumo kampilobakterijomis. Nustat÷me, kad jeigu yra užkr÷sti sparneliai, taip pat būna užkr÷stos ir blauzdel÷s. Galime manyti, kad skirtingos broilerių skerdenų dalys bakterijomis užteršiamos kryžminiu būdu vienos nuo kitų, nes buvo nustatyta, kad n÷ra ryšio tarp kampilobakterijų kiekio ant sparnelių ir blauzdelių, tod÷l galime teigti, kad jeigu sparneliai
35 užkr÷sti dideliu kampilobakterijų kiekiu tos pačios partijos blauzdel÷s nebūtinai bus užkr÷stos dideliu bakterijų kiekiu ir atvirkščiai.
Šio tyrimo metu buvo pasteb÷ta sezonin÷ kampilobakterijų dinamika. Didžiausias kampilobakterijomis užkr÷stų produktų skaičius buvo nuo liepos iki rugs÷jo, o mažiausias - kovo m÷nesį. Tokie sezoniniai skirtumai gali būti susiję su žema temperatūra spalio – kovo laikotarpiu, nes kampilobakterijos yra jautrios žemai temperatūrai. Kampilobakterioz÷s sezoniškumo dinamikai įtakos gali tur÷ti fermose įvairių mechanizmų įdiegimas vasaros metu. Naujausi duomenys rodo, kad šiltuoju metų laiku mus÷s yra svarbios kampilobakterijų platintojos paukščių pulkuose. Vabzdžiai šiltuoju metų laiku į fermas gali patekti per ventiliacijos angas su oro srautu (Hald ir kt., 2004, Nichols, 2005, Ekdahl ir kt., 2005). Manoma, kad išorin÷ aplinka yra pagrindinis kampilobakterijų šaltinis. Įrodyta, kad tie patys šių bakterijų tipai identifikuoti tiek iš naminių, tiek iš laukinių paukščių. Kadangi broilerių pulkai dažniausia užsikrečia nuo gamtoje paplitusių kampilobakterijų padermių, tokiu būdu šaltuoju metų laiku broilerių pulkai yra rečiau užkr÷sti kampilobakterijomis ir skerdimo metu skerden÷l÷s lieka neužkr÷stos. Kampilobakterijų paplitimas ir kiekis ant skerdenų gali būti paremtas sezoniniais pokyčiais broilerių gyvenamojoje aplinkoje (Stern ir Robach, 2003). Sezoninius kampilobakterijų pokyčius pasteb÷jo ir kiti autoriai, Willis ir Murray (1997) praneš÷, kad didžiausias broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis yra nuo geguž÷s iki spalio, o mažiausias gruodžio ir sausio m÷nesiais. Panašūs rezultatai buvo ir Olandijoje atlikto tyrimo metu, kur didžiausias izoliatų kiekis buvo nuo birželio iki rugs÷jo, o mažiausias kovo m÷nesį (Jacobs-Reitsma ir Mulder, 1994). Sezonin÷ kampilobakterijų dinamika ant broilerių produktų sutampa su kampilobakterioz÷s atvejų svyravimais žmonių populiacijoje. EFSA duomenimis (EFSA, 2010), pastebimas patvirtintų kampilobakterioz÷s atvejų pikas nuo birželio iki rugs÷jo (2 pav.). Reikšmingas C. jejuni, C. coli ir mišrus abejų kampilobakterijų kartu santykių pasiskirstymas buvo tik tarp geguž÷s ir liepos bei geguž÷s ir rugs÷jo m÷nesių (p<0,05).
Stern ir Robach (2003) nustat÷, kad kampilobakterijų kiekis randamas ant skerdenos yra svarbus rodiklis, kuris gali padidinti riziką vartotojams užsikr÷sti kampilobakterioze. D÷l skirtingų naudojamų metodikų kampilobakterijų skaičiavimui nuo broilerių m÷sos paviršiaus sud÷tinga palyginti skirtingų tyrimų rezultatus. Habib ir kt. (2008), atliko paukštienos produktų užkr÷stumo kampilobakterijomis analizę Belgijoje ir nustat÷, kad visi tirti produktai vidutiniškai
36 1,68 log10 ksv/g buvo užkr÷sti kampilobakterijomis. Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyta, kad
vidutinis kampilobakterijų kiekis ant užkr÷stų sparnelių ir blauzdelių buvo 1,55 log10 ksv/g.
Reikšmingo kampilobakterijų kiekio skirtumo nebuvo tarp skirtingų broilerių produktų gamintojų. Luber ir kt. (2004) atliko tyrimą, kai buvo skaičiuojamos kampilobakterijos ant vištienos kulšelių, tačiau šio tyrimo metu buvo nustatytas didesnis kampilobakterijų skaičius - 4,01 log10 ksv/g, ir tai yra 2,48 log10 ksv/g didesnis užkr÷stumas nei nustatytas mūsų atlikto
tyrimo metu. Belgijoje atlikti tyrimai parod÷, kad broilerių sparneliai kampilobakterijomis vidutiniškai užkr÷sti 2,21 log10 ksv/g (Habib ir kt., 2008). Tuo tarpu mes nustat÷me, kad tirtų
broilerių sparnelių m÷giniai kampilobakterijomis vidutiniškai užkr÷sti 1,56 log10 ksv/g. Mūsų
tyrimo metu nustatyta, kad kampilobakterijų kiekiui ant produktų paviršiaus įtakos neturi produkto rūšis (sparnelis, blauzdel÷), gamintojas (A, B ir C), tačiau kampilobakterijų kiekiui reikšmingos įtakos turi m÷ginių rinkimo laikas. Didžiausias kampilobakterijų kiekis buvo nustatytas geguž÷s m÷nesį 2,44 log10 ksv/g, o mažiausias liepos rugs÷jo m÷nesiais nuo 1,4 iki 1,6
log10 ksv/g.
C. coli ir C. jejuni yra glaudžiai susijusios kampilobakterijų rūšys, kurios sukelia daug
klinikinių gastroenterito atvejų visame pasaulyje (Dingle ir kt., 2002). Identifikavus kampilobakterijų rūšis buvo nustatyka, kad 69,12 % teigiamų m÷ginių yra užkr÷sti C. jejuni , 13,23 % produktų užkr÷sti C. coli ir 17,65 % broilerių produktų užkr÷sti abiem kampilobakterijų rūšimis (C. jejuni ir C. coli). C. jejuni buvo identifikuota dažniau negu C. coli. Suzuki ir Yamamoto (2009) atliko įvairių pasaulio šalių literatūros analizę, kur išanalizavo paukštienos produktų užkr÷stumą kampilobakterijomis. Jie nustat÷, kad C. jejuni dažniausiai būdavo dominuojanti rūšis, tačiau įvairiose šalyse C. jejuni ir C.coli santykis yra skirtingas. Tailande (Padungtod ir Kaneene, 2005) ir Pietų Afrikoje (Van Nierop ir kt., 2005) mažmenin÷s prekybos broilerių produktų dominuojanti kampilobakterijų rūšis yra C. coli. Panašus kampilobakterijų C.
jejuni ir C.coli santykis kaip ir mūsų atlikto tyrimo metu buvo gautas ir kitose šalyse, tokiose kaip
Vokietijoje (71 % ir 18,6 %), Jungtin÷je Karalyst÷je (73,8 % ir 26,2 %) bei Ispanijoje (72,5 % ir 27,5 %) (Alter ir kt., 2004; Bolton ir kt., 2002; Mateo ir kt., 2005).
Mūsų žiniomis, tai yra pirmas tyrimas Lietuvoje nustatant mažmenin÷je prekyboje esančių broilerių produktų užkr÷stumą kampilobakterijomis. Atlikti tyrimai parod÷, kad svarbu kontroliuoti paukštynus ir skerdyklas, o mažmenin÷je prekyboje turi būti griežtai laikomasi
37 higienos reikalavimų siekiant sumažinti riziką vartotojams užsikr÷sti kampilobakterioze. Taip pat, vartotojų švietimas, kaip tinkamai apdoroti ir virti paukštienos produktus, gali pad÷ti sumažinti užsikr÷timo kampilobakterijomis riziką.
38
IŠVADOS
• Lietuvos mažmenin÷je prekyboje esantys pagrindinių gamintojų broilerių sparneliai ir blauzdel÷s yra dažnai (46,6 %) užkr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis ir gali būti svarbus žmonių užsikr÷timo šaltinis, ypač nesilaikant terminio apdorojimo reikalavimų bei higienos taisyklių.
• Gamintojo A broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis yra reikšmingai didesnis negu gamintojo B ir C (p<0,05). Broilerių produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis tarp gamintojų B ir C reikšmingai nesiskyr÷ (p˃0,05).
• Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkr÷stumas kampilobakterijomis did÷ja prasidedant šiltajam metų laikui (liepa-rugs÷jis), bet maž÷ja atšalus orams.
• Mūsų tyrimo metu nustatyta, kad kampilobakterijų kiekiui ant produktų paviršiaus įtakos neturi produkto rūšis (sparnelis, blauzdel÷) (p˃0,05).
• Kampilobakterijų kiekis ant broilerių produktų pagamintų skirtingų gamintojų reikšmingai nesiskiria (nuo 1,39 log10 ksv/g iki 1,76 log10 ksv/g).
• Dažniausiai broilerių produktai užkr÷sti C. jejuni 69,12 %, rečiau C. coli 13,23 %, tačiau pasitaiko ir mišrus užkr÷timas abejomis rūšimis 17,65 %.
39
REKOMENDACIJOS
• Tolimesniems tyrimams: panagrin÷ti rizikos veiksnius įtakojančius broilerių produktų skirtingą užkr÷stumą.
• Kadangi šie ir kiti tyrimai parod÷, kad broilerių produktai dažnai užkr÷sti Campylobacter spp. naudojant šiuos produktus reikia ypatingą d÷mesį skirti terminiam apdorojimui bei higienos laikymuisi.
