LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA
ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
EVELINA BREDELYTĖ
LIETUVOJE IŠSKIRIAMŲ UROPATOGENIŠKŲ ESCHERICHIA COLI
PADERMIŲ SUKELTŲ INFEKCIJŲ ANTIMIKROBINIO ATSPARUMO
ĮVERTINIMAS BEI PATOGENIŠKUMĄ SĄLYGOJANČIŲ VEIKSNIŲ
CHARAKTERIZAVIMAS IN VITRO
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas Doc. Rita Plančiūnienė LSMU Mikrobiologijos ir virusologijos institutas Konsultantas Povilas Kavaliauskas Weill Cornell Medicinos Universitetas,
Infekcinių ligų skyrius, Niujorkas JAV
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 7 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1 Escherichia coli patotipai ir jų klinikinė svarba ... 13
1.2. Uropatogeniškų E. coli sukeltos šlapimo takų infekcijos ... 13
1.2.1. Šlapimo takų infekcijos laboratorinė diagnostika ... 15
1.2.2. E. coli sukeltų šlapimo takų infekcijų gydymas ... 17
1.3. Escherichia coli sukeltas naujagimių meningitas ... 18
1.4. Pagrindiniai Escherichia coli virulentiškumo veiksniai svarbūs uropatogenezės procesuose .... 20
1.4.1. Svarbiausi uropatogeniškų E. coli adhezijos procesuose dalyvaujantys veiksniai ... 20
1.4.2. Paviršinių E. coli antigenų vaidmuo patogenezės procesuose ... 21
1.4.3. Uropatogeniškų E. coli sekretuojami toksinai ir jų klinikinė svarba ... 22
1.4.4. Svarbiausi Escherichia coli virulentiškumo veiksniai, juos koduojantys genai bei jų valdymas ... 22
1.5. Escherichia coli sukeliamų infekcijų uropatogenezės mechanizmai ... 23
1.6. Filogenetinės Escherichia coli grupės ir jų pasiskirstymas ... 26
1.7. Antimikrobinis E. coli atsparumas ir tai sąlygojantys veiksniai ... 27
2. TYRIMO METODAI IR METODIKA ... 31
2.1. Tyrimo objektas bei magistrinio darbo metu atlikti tyrimai ... 31
2.2. Tyrimų metu naudotos medžiagos bei prietaisai ir priemonės ... 31
2.3. Tyrimų metodikos... 33
2.3.1. Antimikrobinio atsparumo įvertinimas diskų difuzijos metodu ... 33
2.3.2. E. coli išnašos siurblių aktyvumo vertinimas ... 34
2.3.3. Bioplėveles sudarančių E. coli atranka ... 34
2.3.3.1. Kokybinė bioplėveles formuojančių uropatogeniškų E. coli atranka naudojant Kongo raudonojo metodą ... 34
2.3.3.2. Kiekybinis E. coli bioplėvelių formavimo įvertinimas naudojant Kristalvioleto metodą ... 35
2.3.4. E. coli hemolizinų produkavimo vertinimas ... 35
3
2.3.5.1. Matricinės E. coli DNR ruošimas terminių lizatų metodu ... 36
2.3.5.2. Svarbiausių viruleniškumo genų nustatymas PGR metodu ... 36
2.3.5.3. DNR produktų frakcionavimas gelyje ... 37
2.3.6. E.coli filogenetinių grupių nustatymas ... 38
2.3.7. Statistinė duomenų analizė ... 39
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 40
3.1. Išskirtų E.coli padermių epidemiologinė analizė ... 40
3.2 Uropatogeniškų E. coli sukeltos infekcijos Lietuvoje ... 42
3.3. Antimikrobinio atsparumo pasiskirstymas tarp uropatogeniškų E. coli padermių ... 43
3.4. Vaistų išnašos siurblių aktyvumo dažnis tarp uropatogeniškų E. coli padermių ... 47
3.5. Svarbiausių virulentiškumo veiksnių pasiskirstymas tarp E. coli padermių ... 48
3.5.1 Citotoksinius hemolizinus produkuojančių padermių paplitimas tarp uropatogeniškų E. coli ... 48
3.5.2 Bioplėvelių formavimas tarp uropatogeniškų E. coli padermių ... 49
3.5.3. Svarbiausių E. coli virulentiškumą sąlygojančių genų paplitimas ... 52
3.6. Filogenetinių grupių pasiskirstymas tarp uropatogeniškų E. coli padermių ... 57
4. IŠVADOS ... 60
4
SANTRAUKA
Autorius: Evelina Bredelytė
Darbo pavadinimas: Lietuvoje išskiriamų uropatogeniškų Escherichia coli padermių sukeltų infekcijų antimikrobinio atsparumo įvertinimas bei patogeniškumą sąlygojančių veiksnių charakterizavimas in vitro.
Escherichia coli yra labiausiai paplitęs šlapimo takų infekcijos sukėlėjas. Viena svarbiausių problemų susijusių su uropatogeniškomis E. coli padermėmis yra antimikrobinio atsparumo augimas. Magistrinio darbo tikslas - molekuliniais ir klasikiniais epidemiologiniais metodais charakterizuoti Lietuvoje išskiriamas uropatogeniškas Escherichia coli padermes ir įvertinti virulentiškumą sąlygojančių veiksnių paplitimo dažnį bei antimikrobinio atsparumo tendencijas. Magistrinio darbo uždaviniai: įvertinti klinikiniame sektoriuje išskiriamų uropatogeniškų E. coli padermių epidemiologinį pasiskirstymą; nustatyti Lietuvoje išskirtų uropatogeniškų E. coli padermių antimikrobinį atsparumo lygį tarp tirtųjų padermių; molekuliniais ir klasikiniais metodais įvertinti svarbiausių E. coli virulentiškumo determinančių paplitimo dažnį tarp E. coli padermių; įvertinti Lietuvoje cirkuliuojančių invazyvių E. coli kapsulinio tipo K1 padermių paplitimo dažnį tarp Lietuvoje išskiriamų klinikinių E. coli. Tyrimo objektas yra 2016-2017 metais surinkta uropatogeniškų E. coli padermių kolekcija (n=149). 81,9 proc. uropatogeniškų E. coli padermių išskirta iš moterų ir 18,1 proc. iš vyrų. Šlapimo takų infekcijos dažniausiai diagnozuotos žmonėms, vyresniems nei 50 metų (51,6 proc.). Didžiausias kiekis (32,9 proc.) uropatogeniškų E. coli padermių išskirtas iš pacientų, sergančių viršutinėmis ŠTI.
Didžiausias UPEC padermių atsparumas nustatytas ampicilinui (49,7 proc.), tetraciklinui (32,2 proc.), trimetoprimui (29,5 proc.) ir trimetoprimui/sulfametoksazolui (28,2 proc.). 13,4 proc. visų tirtų E. coli padermių nustatytos kaip atsparios fluorochinolonų klasės antimikrobiniams preparatams. 69,1 proc. visos tirtos E. coli padermių imties nustatyta aktyvi išnašos siurblių veikla. 32,9 proc. visų tirtų UPEC padermių produkavo hemolizinus. Bioplėveles formavo 88,6 proc. E. coli padermių, iš jų 16,1 proc. stipriai formavo bioplėveles. Koduojantis aerobaktino sistemą genas iutA (85,2 proc.) ir I tipo piles koduojantis fimH genas (83,9 proc.) nustatyti dideliu dažniu (p<0,05). Kiti virulentiškumo veiksnius koduojantys genai uropatogeniškose E. coli padermėse nustatyti tokiu dažniu: atsparumą serumui sąlygojantis iss genas – 34,2 proc., vakuolizuojantį toksiną koduojantis genas vat – 32,9 proc., CNF1 toksiną koduojantis cnf1 genas – 18,8 proc., rečiausiai nustatytas citoskeleto pertvarkyme dalyvaujantis ibeA genas – 14,1 proc. Neuroinvazyvios E. coli kapsulinio tipo K1 padermės nustatytos 18,8 proc. visos tirtos E. coli imties. Tyrimo metu įvertinta, kad daugiausiai visų tirtų uropatogeniškų E. coli (UPEC) priklauso B2 filogenetinei grupei (57,7 proc.). Antra pagal dažnumą yra D filogenetinė grupė – 23,5 proc. Nustatyta, jog E. coli padermės priklausančios B2 ir D filogenetinėms grupėms
5 turėjo didesnį virulentiškumo veiksnių kiekį bei antimikrobinį atsparumą nei padermės priklausančios A ar B1 filogenetinėms grupėms.
6
SUMMARY
Author: Evelina Bredelytė
Title: Molecular characterization of virulence and antimicrobial susceptibility among uropatophogenic Escherichia coli strains isolated from patients in Lithuania.
Escherichia coli is the most common cause of urinary tract infections in Lithuania. One of the most vital problems with uropathogenic E. coli is its increasing resistance to antimicrobial drugs. The aim of master’s study: Using molecular and classic epidemiologic methods characterize uropathogenic E. coli strains in Lithuania and evaluate the virulence factors as well as antimicrobial resistance tendencies. Master’s tasks: 1. Evaluate the epidemiologic spread of uropathogenic E. coli strains. 2. Determine the resistance level in uropathogenic E. coli strains in Lithuania. 3. Via molecular and classical methods assess the most important virulence determining prevalence of E. coli strains. 4. Evaluate the invasive E. coli capsule type K1 strains prevalence between E. coli clinically strains distinguished in Lithuania. The subject was the uropathogenic E.coli strains (n=149) collected during 2016-2017. 81,9% of uropathogenic samples were taken from females, while 18,1% from males. Urinary tract infections were mostly diagnosed for people older than 50 years age (51,6%). Largest quantity (32,9%) of uropathogenic E.coli strains were determined in patients with upper urinary tract infections.
Highest UPEC strains resistance was found to ampicillin (49,7%), tetracycline (32,2%), trimethoprim (29,5%) and trimethoprim/sulfamethoxazole (28,2%). 13,4% of all E. coli strains were determined to be resistant to fluoroquinolone type antimicrobial drugs. 69,1% of tested strains of E. coli had active eflux pumps. 32,9% of all UPEC strains produced hemolysins. Biofilms were formed by 88,6% of all E. coli strains. Gene which coding aerobactin system iutA (85,2%) and I type piles coding fimH gene (83,9%) was most commonly. Other virulence coding gene in uropathogenic E. coli strains were assessed at this rate: resistance to blood serum regulating iss gene – 34,2%, vacuolating autotransporter toxin gene vat – 32,9%, CNF1 toxin coding cnfI gene – 18,8%, the least common, involved in the transformation of cytoskeleton, was ibeA gene – 14,1%. Neuroinvasive E. coli capsule type K1 strains were 18,8% out of all uropathogenic E. coli. During the work it was determined that the majority of uropathogenic E. coli (UPEC) belong to the B2 filogenetic group (57,7%). Second most common was D filogenetic group – 23,5%. It was determined that E. coli strains belonging to B2 and D filogenetic groups had a bigger amount of virulence factors as well as higher antimicrobial resistance than strains belonging to A and B2 filogenetic groups.
7
PADĖKA
Visų pirma noriu padėkoti savo magistrinio darbo vadovei Ritai Plančiūnienei už visą atsidavimą bei pagalbą magistrinio darbo metu. Taip pat noriu padėkoti magistrinio darbo konsultantui Povilui Kavaliauskui be kurio idėjų nebūtų pabaigtas šis tyrimas. Dėkoju už jo kantrybę. Už paaukotą vasarą dėkoju Mariui Virgailiui, kurio dėka laiku galėjau atlikti visus tyrimus. Taip pat dėkoju savo kolegoms už moralinį palaikymą. Dėkoju laboratorinės medicinos biologijos dėstytojams už suteiktą žinių bagažą. Galiausiai dėkoju savo šeimos nariams ir artimiausiems draugams, be kurių buvimo šalia ir manęs palaikymo, sunkiai būčiau pasiekusi užsibrėžtus tikslus.
8
INTERESŲ KONFLIKTAS
Atliekant mokslinį darbą autoriui interesų konflikto nebuvo. Magistrinis baigiamasis darbas finansuotas iš LSMU Medicinos fakulteto studijų fondo, dekano prof. Dr. Algimanto Tamelio paskyrimu.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Leidimą atlikti tyrimą išdavė LSMU Bioetikos Centras. Leidimo numeris: BEC-LMB(M)-310, išdavimo data: 2019-02-08 (1 priedas).
9
SANTRUMPOS
AC3 - adenililo ciklazė 3
AMP/ cAMP - ciklinis adenozino monofosfatas APEC - paukščiams patogeniškos E. coli ASB - asimptominė bakteriurija
BMEC - smegenų mikrovaskulinės epitelinės ląstelės
CLED – Cisteino laktozės ir elektrolitų neturintis agaras (angl. Cystine Lactose Electrolyte Deficient) CNS – centrinė nervų sistema
ECDC - Europos ligų prevencijos ir kontrolės centras (angl. European Centre for Disease Prevention and Control)
E.coli - Escherichia coli
EUCAST - Europos antimikrobinio jautrumo nustatymo komitetas (angl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
ESBL - plataus spektro β-laktamazės (angl. Extended spectrum β –lactamases) EtBr – etidžio bromidas
ExPEC - už-žarnyninės E.coli (angl. Extra-intestinal E. coli) HEB – hemoencefalinis barjeras
IBC - bioplėvelių viduląstelinės bakterijų sankaupos IPEC - žarnyno enteropatogeninės E. coli
KSV/ ml – Koloniją sudarantys vienetai/1 ml tiriamosios medžiagos LPS - lipopolisacharidas
MDR - dauginis atsparumas (angl. multidrug resistance) NBM - naujagimių bakterinis meningitas
NMEC - naujagimių meningitą sukeliančios E. coli PAI – patogeniškumo salos
PBS - fosfatinis buferinis druskos tirpalas (angl. phosphate-buffered saline) PGR – polimerazinė grandinės reakcija
QIR – neaktyvūs viduląsteliniai bakterijų rezervuarai ŠTI – šlapimo takų infekcija
TLR4 - Toll-tipo 4 receptorius TSA – Triptozės sojos agaras TSB – Triptozės sojos buljonas UPEC – uropatogeniškos E.coli
10
ĮVADAS
Escherichia coli (E. coli) yra vienas dažniausių infekcinės kilmės susirgimus sukeliančių mikroorganizmų (1). E. coli paprastai kolonizuoja žinduolių ir paukščių virškinimo traktą bei kitas gleivines. Nors daugelis šių padermių yra komensalinės, tam tikros padermės gali būti patogeniškos ir sukelti sunkias infekcijas (2). Skirtingus patogeniškumo profilius turinčios E. coli padermės gali sukelti gastroenteritą, šlapimo takų infekcijas, naujagimių meningitą bei kitas infekcijas.
Vienos dažniausių E. coli sukeliamų infekcijų yra šlapimo takų infekcijos (ŠTI), sukeltos uropatogeniškų E. coli padermių (UPEC) (3). UPEC sukelia apytiksliai 85 proc. bendruomenėse įgytų šlapimo takų infekcijų (4). Tarp skirtingų ŠTI, E. coli dažniausiai sukelia cistitus (apie 90 proc. atveju), kurie negydomi ar gydomi netinkamai gali komplikuotis į sunkias viršutinių šlapimo takų infekcijas – pielonefritus, kuriems būdinga sunki klinikinė eiga ir prasta prognozė.
Esant palankiai šeimininko predispozicijai (neštumas, anatominiai šlapimo takų sutrikimai, Toll tipo receptorių polimorfizmai), E. coli geba asimptomatiškai kolonizuoti šlapimo takusir dažnai sukelti besikartojančiais ŠTI. Asimptomatinė kolonizacija yra ypatingai pavojinga neštumo metu ir kelia didelę grėsmę gimdyvei ir vaisiui (5). Manoma, kad dauguma ŠTI atsiranda tada, kai uropatogenai, esantys išmatose, kolonizuoja makštį, pakyla į šlapimo pūslę ir prasideda šeimininko atsakas, pasireiškiantis citokinų, purinų gamyba ir uždegiminių simptomų atsiradimu (4).
Uropatogenezės procesų metu E. coli naudoja skirtingus virulentiškumo veiksnius, kurių dėka bakterija geba adhezuoti ir kolonizuoti šeimininko audinius, vykdyti invazijos į šeimininko urotelio ląsteles procesus ir moduliuoti tolimesnę patogenezės eigą. Adhezijos procesams užtikrinti, UPEC ekspresuojamos P tipo pilės panaudojamos bakterijos įsitvirtinimui gaubtinėje žarnoje, padeda kolonizuoti šlapimo takų epitelį ir adhezuoti prie jo (6). Geležies ciklai viduląstelinės patogenezės metu valdomi naudojant skirtingus UPEC ekspresuojamus sideroforus, o apsauga nuo komplemento vykdoma dalyvaujant somatiniams (O) ir kapsuliniams (K) antigenams (7).
E.coli padermės yra skiriamos į aštuonias filogenetines grupes: A, B1, B2, C, D, E, F E. coli sensu stricto, o aštunta yra Escherichia cryptic clade I (8). Nors yra išskiriamos aštuonios filogenetinės grupės, dažniausiai pasitaikančios yra tik keturios: A, B1, B2 ir D. Dauguma padermių, sukeliančių ŠTI, randamos B2 grupėje ir mažesniu dažniu D grupėje, o dauguma A ir B1 filogenetinėms grupėms priklausančių padermių turi mažą patogeniškumą ir retai sukelia ŠTI (9).
Amarsy ir kt. parodė B2 filogenetinės klinikinę svarbą (10). Padermės priskiriamos B2 filogenetinei grupei pasižymi didesniu suminiu virulentiškumo veiksnių kiekiu, leidžiančiu sėkmingai kolonizuoti šeimininko audinius ir persistuoti mikrobiotoje.
11 E. coli padermės, kurios ilgą laiką išlieka komensalioje mikrobiotoje, dažniau nei trumpalaikės padermės priklauso B2 filogenetinei grupei ir turi K antigenus, būdingus uropatogeniškoms padermėms (9).
E. coli yra dažnas hospitalinės kilmės infekcijų sukėlėjas. Hospitalines infekcijas dažniausiai sukelia dauginį atsparumą (MDR) turinčios padermės, dažnai produkuojančios skirtingas išplėsto spektro β-laktamazes.
Laikoma, kad storosios žarnos mikrobiota yra aplinka, skatinanti atsparumą antimikrobiniams preparatams sąlygojančių genų perdavimą (11). Atsparumą sąlygojantys genai dažniausiai koduojami plazmidėse ir yra lengvai perduodami kitoms padermėms. Tai kelia didelę pasaulinę problemą, nes bakterijos, kolonizuojančios šlapimo takus, gali greitai įgauti atsparumą iš komensalių padermių (12).
Europos ligų prevencijos ir kontrolės centro (ECDC) teigimu, Europos šalyse didėja atsparumas E. coli, o taip pat ir daugeliui antimikrobinių preparatų atsparių padermių atsiradimas (13). Lietuvoje atlikti tyrimai taip pat rodo vis didėjantį E.coli atsparumą antimikrobiniams preparatams, ypač β-laktaminiams antibiotikams (14).
Šiuo metu turima palyginti mažai žinių apie svarbiausių uropatogeniškumą sąlygojančių virulentiškumo veiksnių paplitimą tarp E. coli padermių, šių padermių antimikrobinio atsparumo tendencijas bei bioplėvelių produkavimo dažnį Lietuvoje. Šiame magistriniame darbe analizuojama 2016-2017 metais VšĮ Infekcinių ligų ir patogeninės mikrobiologijos institute surinkta uropatogeniškų E. coli padermių kolekcija. Magistrinio darbo metu siekiama geriau suprasti svarbiausių virulentiškumo veiksnių pasiskirstymo dažnius, filogenetinę įvairovę, antimikrobinio atsparumo lygį tarp Lietuvoje cirkuliuojančių uropatogeniškų E. coli padermių.
Gauti tyrimo rezultatai gali padėti gauti fundamentalias žinias, leidžiančias identifikuoti ir epidemiologiškai stebėti hipervirulentiškus E. coli klonus ir jų cirkuliaciją klinikiniame sektoriuje. Magistrinio darbo metu gauti rezultatai galės būti panaudoti koreguojant ir kuriant naujas šaliai savitas antimikrobinio gydymo gaires.
12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - molekuliniais ir klasikiniais epidemiologiniais metodais charakterizuoti Lietuvoje išskiriamas uropatogeniškas Escherichia coli padermes ir įvertinti virulentiškumą sąlygojančių veiksnių paplitimo dažnį bei antimikrobinio atsparumo tendencijas.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti klinikiniame sektoriuje išskiriamų uropatogeniškų E. coli padermių epidemiologinį pasiskirstymą.
2. Nustatyti Lietuvoje išskirtų uropatogeniškų E. coli padermių antimikrobinį atsparumo lygį tarp tirtųjų padermių.
3. Molekuliniais ir klasikiniais metodais įvertinti svarbiausių E. coli virulentiškumo determinančių paplitimo dažnį tarp E. coli padermių.
4. Įvertinti Lietuvoje cirkuliuojančių invazyvių E. coli kapsulinio tipo K1 padermių paplitimo dažnį tarp Lietuvoje išskiriamų klinikinių E. coli.
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Escherichia coli patotipai ir jų klinikinė svarba
Patotipas tai bet kuri mikroorganizmų grupė, pasižyminti tropizmu specifiniam šeimininkui ar jo audinių/organų sistemai. Už-žarnyninės patogeninės E. coli (ExPEC) yra vienas iš plačiausių E.coli patotipų, kurį sudarantys nariai geba sukelti įvairaus tipo infekcijas už žarnyno ribų (15). ExPEC būdingas platus rūšinis tropizmas, dėl kurio E. coli geba sukelti infekcijas tiek žmonėms, tiek ir gyvūnams (11).
Dėl plačios įvairovės ExPEC toliau gali būti skirstoma į kelis subpatotipus tokius kaip, uropatogeniškos E. coli (UPEC), naujagimių meningitą sukeliančia E. coli (NMEC) ir paukščiams patogeniškos E. coli (APEC) ir kitos (11).
UPEC dažniausiai sukelia šlapimo takų infekcijas. Šis subpatotipas apytiksliai sukelia 70-95 proc. visų ŠTI infekcijų (3; 16). ExPEC yra pagrindinis suaugusiųjų bakteriemijos sukėlėjas ir yra antras dažniausias naujagimių meningito sukėlėjas (5; 16). ExPEC padermėse yra įvairių virulentiškumo veiksnių, kurie lemia ExPEC padermės gebėjimą sukelti infekciją (3; 11). Didėjantis antimikrobinių preparatų atsparumas tarp ExPEC padermių yra opi problema, sąlygojanti didėjančių hospitalizacijų ir mirčių skaičių (17).
ExPEC apatinių šlapimo takų kolonizacija sukelia ūminę paviršinio šlapimo pūslės urotelio ląstelių infekciją, vadinamą cistitu. Jorgensen ir kt. nurodo, kad 50 proc. visų moterų per visą gyvenimą patirs bent vieną ŠTI atvejį, tai parodo didelį šių infekcijų dažnį ir klinikinę svarbą (18; 19; 20).
1.2. Uropatogeniškų E. coli sukeltos šlapimo takų infekcijos
Šlapimo takų infekcija – tai plati sąvoka, apimanti tiek dažniausiai pasitaikančias mikrobines inkstų ir šlapimo organų ligas (ūminį ir lėtinį pielonefritą, cistitą, uretritą ir kt.), tiek būkles, kai yra kliniškai reikšminga bakteriurija (>10⁵ /ml šlapime), bet nėra inkstų ar šlapimo organų infekcinės ligos požymių (vadinamoji besimptomė bakteriurija) (21). Kasmet apie 150 milijonų žmonių suserga šlapimo takų infekcijomis (20; 22). Šlapimo takų infekcijos yra viena iš dažniausių bakterinių infekcijų ir dažniausiai yra sukeliama uropatogeniškų Escherichia coli (17; 23; 24). UPEC sukelia apie 80-90 proc. bendruomenėje įgytų ŠTI ir iki 50 proc. hospitalinių ŠTI (3; 19; 23; 25; 26). Kiti dažni ŠTI sukėlėjai yra Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Enterobacter spp., Candida albicans ir Staphylococcus saprophyticus (25). Gydymo įstaigose įgytas,
14 hospitalines šlapimo takų infekcijas dažniausiai sukelia E.coli, Enterococcus spp., Pseudomonas aerugnosa ir Acinetobacter baumannii (27).
ŠTI dažniausiai nustatomos moterims, vaikams, pagyvenusiems žmonėms ir pacientams, kurių imuninė sistema yra nusilpusi (3; 20; 26). Suaugusių vyrų, jaunesnių nei 50 metų, ŠTI atvejų dažnis yra mažas, o suaugusioms moterims yra 30 kartų didesnė tikimybė susirgti ŠTI nei vyrams (20). Įvairių rizikos veiksnių derinys yra labiausiai tikėtina tokio reiškinio priežastis, įskaitant fiziologinius ir anatominius skirtumus, aktyvų lytinį gyvenimą, amžių ir trumpą šlaplę moterims (3; 28). Moterys, sirgusios ŠTI, turi 25 proc. tikimybę, kad infekcija pasikartos per šešis mėnesius ir 44 proc. pasikartojimo tikimybę - per metus, nepaisant tinkamo pradinės infekcijos gydymo ir neigiamos šlapimo kultūros baigus gydymą (18; 19; 20; 23).
Dažnai pasikartojančios ŠTI yra siejamos ir su E. coli gebėjimu sudaryti bioplėveles. Bioplėveles formuojančių E. coli padermių analizė parodė, jog 74 proc. uropatogeniškų E. coli padermių, išskirtų iš moterų, sergančių klinikiškai diagnozuotomis ŠTI, gebėjo sudaryti bioplėveles (29). Tai parodo, kad bioplėvelių formavimas tarp UPEC gali būti laikomas svarbiu patogeniškumo veiksniu.
Klinikiniu požiūriu ŠTI yra skirstomos į nekomplikuotas ir komplikuotas (20; 24). Nekomplikuotomis ŠTI paprastai serga asmenys, kurie kitais aspektais yra sveiki ir neturi struktūrinių ar neurologinių šlapimo takų sutrikimų (19). Šios infekcijos diferencijuojamos į apatines ŠTI (cistitas) ir viršutines ŠTI (pielonefritas) (18; 30). Su cistitu siejami keli pagrindiniai rizikos veiksniai: moterų lytis, ankstesnė ŠTI ir patogeniškų UPEC persistavimas, lytinis aktyvumas, makšties infekcija, diabetas, nutukimas ir predispozicija. Komplikuotos ŠTI yra apibrėžtos kaip ŠTI, susijusios su šlapimo takų obstrukcija, kitų ligų sukeltu šlapimo susilaikymu, imunosupresija, inkstų nepakankamumu, inkstų persodinimu, nėštumu ir svetimkūniais, pavyzdžiui kateteriais (6).
Jungtinėse Valstijose 70–80 proc. komplikuotų ŠTI yra priskiriamos kateterių sukeltoms infekcijoms, o tai sudaro 1 mln. atvejų per metus (3; 24). Apskaičiuota, kad su kateteriu susijusios ŠTI yra viena iš dažniausiai pasitaikančių hospitalinių infekcijų priežasčių, kurias dažnai sukelia multirezistentiškos ir bioplėveles formuojančios E. coli (24). Nustatyta, kad 10-15 proc. pacientų, kuriems atliekama trumpalaikė kateterizacija, išsivysto ŠTI (29). Su kateteriu susijusios ŠTI yra susiję su padidėjusiu sergamumu ir mirtingumu, ir kartu yra dažniausia antrinių kraujo infekcijų priežastis (30).
Neštumas yra vienas iš svarbių veiksnių sąlygojančių ŠTI. Šlapimo takų infekcijos išlieka viena iš dažniausių medicininių komplikacijų nėštumo metu,keliančių didelę grėsmę motinai ir vaisiui (5). Apskaičiuota, kad ASB dažnis neštumo metu siekia 13 proc., tačiau dėl besimptomės eigos, realus atvejų skaičius gali būti didesnis. Nors ASB dažnis tarp nėščiųjų yra tik ne ženkliai didesnis nei ASB dažnis tarp bendrosios moterų populiacijos, jos pasekmės motinai ir vaisiui yra kur kas didesnės.
15 Neštumo metu ASB gali (iki 40 proc.) progresuoti į pielonefritą, kuris sąlygoja padidėjusi preeklampsijos, ankstyvo gimdymo ir mažo naujagimio gimimo svorio riziką bei tiesioginį pavojų motinos ir vaisiaus gyvybėms (3; 5; 31).
Tai gali būti paaiškinama struktūriniais ir funkciniais šlapimo takų pokyčiais, atsirandančiais nėštumo metu, užtikrinančiais šlaplėje esančios infekcijos kilimą link viršutinių šlapimo takų organų. Nėštumo metu dažnai stebimas (80 proc.) šlapimo takų išsiplėtimas, lydimas nežymios hidronefrozės, kurie sukelia lygiųjų raumenų tono sumažėjimą, dėl kurio iš dalies atpalaiduojamos šlaplės raukas. Manoma, jog šie pokyčiai yra priklausomi nuo progesterono, kurio koncentracijos pokyčiai svyruoja nėštumo metu. Tuo pačiu metu padidėjusi gimda suspaudžia šlapimo pūslę, taip padidindama intravazalinį spaudimą, dėl kurio šlapimo pūslėje gali atsirasti ureterinio refliukso ir šlapimo susilaikymas, paprastai pastebimas nėščioms moterims. Šlapimo stazė ir fiziologinio anti-refliukso mechanizmo sutrikimas sukuria palankias sąlygas bakterijų kolonizacijai, dauginimuisi, viršutinių šlapimo takų organų kolonizacijai ir infekcijai (32).
Papildomi predisponuojantys veiksniai yra specifiniai nėštumo lydymi biocheminiai šlapimo pokyčiai, sąlygojantys didesnį gliukozės, amino rūgščių ir hormonų skilimo produktų kiekį, kurie padidina šlapimo pH (šlapimas šarmėja) ir sudaro palankias sąlygas bakterijų dauginimuisi (32).
Dėl didelio pavojaus gimdyvės ir vaisiaus sveikatai, nėščios moterys turi būti tiriamos dėl bakteriurijos, kuri nustatoma mikrobiologinės šlapimo analizės metu. Nustačius neščiųjų bakteriuriją, turi būti taikomas gydymas, siekiant išvengti pielonefrito ir kitų komplikuotų ŠTI (5).
ŠTI dažnai diagnozuojamos ir vaikams, ypatingai jaunesniems nei 2 metų. Diagnozuojamos infekcijos gali būti hospitalinės ar visuomenėje įgytos. Esant tinkamai parinktai antimikrobinei terapijai, vaikų ŠTI lengvai išgydomos. Komplikuotos ŠTI, išsivysčiusios ankstyvos kūdikystės laikotarpiu, gali progresuoti į inkstų audinio randėjimus, ypač esant įgimtomis šlapimo takų anomalijomis. Inkstų randai gali sukelti komplikacijas, įskaitant hipertenziją, proteinuriją, inkstų pažeidimą ir net lėtinį inkstų nepakankamumą, dėl kurių pacientams gali reikėti dializės (20; 28).
1.2.1. Šlapimo takų infekcijos laboratorinė diagnostika
Norint nustatyti ŠTI sukėlėją, tyrimui reikalingas šlapimo ėminys, kuris turi būti gaunamas iki pradedant vartoti antimikrobinius preparatus. Mėginiai turi būti imami į sterilius sandariai užsukamus indelius, ženklinami bei tinkamai užpildomas tyrimo siuntimo lapelis (33). Šlapimas gali būti surinktas pacientui pasišlapinus, kateterizavus ar punktuojant. Tyrimui tinkamiausia yra vidurinės srovės rytinio šlapimo ėminys, prieš tai būtina apsiplauti šlaplės sritį, kad nepatektų pašalinių artefaktų. Mikroorganizmai šlapime dauginasi labai greitai, todėl reikia kuo greičiau pristatyti į mikrobiologijos
16 laboratoriją – rekomenduojama per 30-60 min. po surinkimo. Jei to padaryti neįmanoma, laikoma šaldytuve (laikant +2 - +8oC temperatūroje) iki 8 h. Nesant galimybės greitai pristatyti šlapimą į laboratoriją, rekomenduojama naudoti specialius šlapimo transportavimo indus, turinčius mikroorganizmų dauginimosi stabilizatorius, kuriuos galima laikyti kambario temperatūroje iki 24 h (34).
Šlapimo mėginys pirma yra sėjamas į automatinę sistemą URO-QUATRO (arba kitų gamintojų automatinę sistemą). Automatine sistema atliekama mikrobiologinė šlapimo mėginių analizė (bakterijų skaičiaus nustatymas KSV/ml) šlapimo takų infekcijų diagnostikai. Lazerio spindulys prasiskverbia per stiklinius buteliukus su specialia URO - QUICK terpe, inokuliuota šlapimo mėginiu. Sistema pateikia šviesos sklaidos signalus, apskaičiuoja ir pateikia augimo kreives, kurios suteikia informaciją apie augantį bakterijų skaičių. Po inokuliacijos praėjus 4 valandoms, automatinė sistema nustato bakterijų augimo kinetiką. Toliau šie mėginiai išsėjami ant kietų terpių, identifikuojami ir nustatomas jautrumas antimikrobiniams preparatams. Mikrobiologinio tyrimo metu nustačius 10⁴ KSV/ml ar 10⁵ KSV/ml mikroorganizmų kultūros, atliekama mikroorganizmų identifikacija ir atsparumo antimikrobinėms medžiagoms įvertinimas.
Kietosios terpės naudojamos ŠTI sukėlėjų diagnostikai yra kraujo agaras, CLED, MacConkey bei Sabūro agarai (1). Taip pat galima naudoti ir chromogeninį agarą, skirtą išankstinei bakterijų diferenciacijai, nes bakterijos ant šio agaro auga skirtingų spalvų kolonijomis (E. coli dažniausiai auga violetinėmis kolonijomis) (2 priedas). Tačiau problema kylanti naudojant šį agarą yra tai, jog kolonijų nuo chromogeninio agaro negalima tirti automatinėmis sistemomis, pavyzdžiui MALDI-TOF. Kraujo agaro sudėtyje yra 5 proc. avies kraujo, todėl galima iš karto nustatyti ar bakterija produkuoja hemolizinus. CLED terpė naudojama izoliuoti ir atskirti šlapimo takų bakterijas (E.coli auga geltonomis kolonijomis). MacConkey yra selektyvi terpė Gram-neigiamoms bakterijoms (33).
E. coli gali būti identifikuojama remiantis fermentiniu aktyvumu skaidant skirtingus angliavandenius (35). Sėjant į mitybines terpes su 1μl sterilia kilpele, tiriamoji medžiaga užnešama ant agaro ir paskirstoma, išsklaidant per vidurį nubrėžtą brūkšnį (2 priedas). 5 proc. kraujo, CLED, MacConkey bei chromogeninis agarai inkubuojami 18-24 h 35ºC (+/- 1oC) temperatūros termostate. Sabūro agaras inkubuojamas +22 - +24oC temperatūroje 4 paras (1).
Izoliatai kultivuojami naudojant diferencines - diagnostines terpes, leidžiančias vertinti izoliato biocheminį aktyvumą (33; 36). Dauguma E. coli padermių yra biochemiškai aktyvios. Escherichieae šeimai priklausančios bakterijos turi jiems būdingą biocheminį aktyvumą: indolo produkavimas – teigiamas, citratų skaidymas – neigiamas, laktozės skaidymas – dažniausiai teigiamas (2 priedas). Tačiau platesnis jų identifikavimas, remiantis biocheminiu akyvumu, yra sudėtingas dėl mažo metabolinio aktyvumo (37).
17 Klinikiškai svarbius ŠTI sukėlėjus galima identifikuoti ir trumpais lazerio impulsais jonizuojamų mėginių masės spektrometrijos (MALDI-TOF MS) metodu. Šis metodas leidžia identifikuoti Gram-teigiamas ir Gram-neigiamas bakterijas, mikobakterijas bei grybus. Rezultatai gaunami per kelias minutes. Mėginio paruošimas: užauginta kultūra dedama ant specialios plokštelės ir padengiama matrikso tirpalu (tirpalas kristalizuojasi su mėginiu ir lizuoja mikroorganizmus). Plokštelė su mėginiais jonizuojama trumpais lazerio impulsais ir suformuojama dujinė fazė. Dalelės lekia pro elektrinį lauką (elektrodus) į vakuumą. Laikas per kurį kiekviena dalelė pasiekia detektorių priklauso nuo jos masės ir krūvio. Praskriejus visoms dalelėms, suformuojamas spektrinis antspaudas ir lyginamas su unikaliais mikroorganizmų profiliais referencinėje duomenų bazėje (38). Identifikuojama taikant patikimą teorinę koreliaciją tarp gautojo ir etaloninio spektro (39).
MALDI-TOF metodo privalumas yra tai, jog šis tyrimas nepaveikiamas net ir tada, jeigu pacientas jau vartoja antimikrobinius preparatus (40). Spartus tyrimo laikas ir minimalios sąnaudos, susijusios su eksploatacinėmis medžiagomis vienam bandiniui, palyginti su įprastais identifikavimo metodais, sąlygoja tai, jog visame pasaulyje vis dažniau klinikinėse laboratorijose naudojamas MALDI-TOF metodas (41).
1.2.2. E. coli sukeltų šlapimo takų infekcijų gydymas
Augantis antimikrobinis atsparumas yra viena iš pagrindinių grėsmių visuomenės sveikatai, kurią skatina pernelyg didelis antimikrobinių preparatų vartojimas (28). Didėjantis daugelio vaistų atsparumas tarp ExPEC padermių yra susijęs su augančiu hospitalizacijų ir mirčių skaičiumi, susijusių su ExPEC infekcijomis (17).
Pacientai, sergantys simptominėmis bakterijų sukeltomis ŠTI, gydomi tinkamai parinktais antimikrobiniais preparatais. Antimikrobinė terapija gali sukelti ilgalaikį makšties ir virškinamojo trakto mikrofloros pakitimą ir skatinti mikroorganizmų antimikrobinio atsparumo išsivystymą. Todėl antimikrobinė terapija turi būti parenkama atsižvelgiant į antimikrobinį poveikį, mikroorganizmų jautrumą, antimikrobinio veikimo pobūdį, farmakokinetiką ir saugumą.
Remiantis Lietuvos gydytojų asociacijos rekomendacijomis, esant diagnozuotam šlapimo takų uždegimui ir laboratoriškai nustačius E. coli sukėlėją, pirmo pasirinkimo antimikrobiniai preparatai yra cefalosporinai bei fluorochinolonai (ciprofloksacinas ar levofloksacinas). Antro pasirinkimo vaistų klasės yra penicilinai kartu su penicilinazės slopikliu arba aminoglikozidai. Trečias pasirinkimo antimikrobinis preparatas nitrofurantoinas, skiriamas tik nekomplikuotų ŠTI atveju (27; 32). Antimikrobiniai preparatai, rekomenduojami Kauno klinikų gydytojų, remiantis Europos antimikrobinio jautrumo nustatymo komiteto (EUCAST) rekomendacijomis, Enterobacterialis
18 kultūroms, išaugintoms iš šlapimo, yra ampicilinas, cefuroksimas, gentamicinas, nitrofurantoinas, trimetoprimas ir ciprofloksacinas (42).
Preišmikrobinis penicilino, kaip ir visų β-laktaminių antibiotikų, aktyvumas yra sąlygojamas bakterijų sienelės sintezės slopinimu. Penicilinai slopina fermentus, kurie katalizuoja paskutinį bakterijų sienelės formavimosi etapą, peptidoglikano tiltelio jungčių susidarymą, kuris suteikia struktūrinį vientisumą. Kiekvienas slopiklis yra naudojamas tik derinyje su kitu β-laktaminiu antibiotiku. β-laktamazių slopikliai slopina A β-laktamazes, koduojamas plazmidžių. Daugelis penicilinazių slopiklių turi aktyvumą slopinat išplėsto spektro β-laktamazes, kurios yra pakitusios A klasėsβ-laktamazės (14).
Trečios kartos cefalosporinai tai pirmo pasirinkimo antimikrobinių vaistų klasė gydant daugelį sunkių infekcijų. Jiems būdingas platus veikimo spektras, mažas toksiškumas ir palyginti gera CNS farmakokinetika. Cefotaksimas, ceftriaksonas, ceftazidimas yra parenteralinės formos antimikrobiniai preparatai, skirti gydyti daugelį hospitalinių infekcijų. Nuo 75 proc. iki 80 proc. E. coli, atsparių ceftazidimui, yra jautrios ketvirtos kartos cefalosporinams. Šios kartos cefalosporinai efektyvūs gydant bakteriemijas, pneumonijas, odos ir minkštųjų audinių infekcijas, komplikuotas šlapimo takų infekcijas.
Visi karbapenemai yra panašaus veikimo spektro, tačiau meropenemas geriau veikia daugelį enterobakterijų nei imipenemas. Karbapenemai skiriami gydant bakteriemijas, komplikuotas šlapimo takų infekcijas, pneumonijas bei kitas infekcijas, kuomet sukėlėjas atsparus daugeliui klinikoje naudojamų antimikrobinių preparatų. Aminoglikozidų poveikis yra sinergistinis juos skiriant su penicilinais ar cefalosporinais. Turi stiprų ototoksinį, nefrotoksinį šalutinį poveikį. Skiriami derinyje gydant endokarditą, meningitą, pneumoniją, baktieremiją, pielonefritą ir kt. Sulfonamidai gerai veikia Gram-teigiamas ir Gram-neigiamas bakterijas. Trimetoprimas naudojamas derinyje su sulfametoksazoliu. Skiriamas šlapimo takų infekcijų gydymui, virškinamojo trakto infekcijų gydymui, lytiškai plintančioms ligoms. Trimetoprimas nerekomenduojamas nėščioms, kadangi yra tyrimų rodančių, jog jis veikia teratogeniškai (27; 32).
Dėl padidėjusio bakterijų atsparumo antimikrobiniams preparatams būtina nuolat detaliai stebėti antimikrobinio atsparumo lygį, o pagal sudarytus epidemiologinės stebėsenos rezultatus, turi būti kuriamos ar modifikuojamos empirinės terapijos gairės.
1.3. Escherichia coli sukeltas naujagimių meningitas
Naujagimių bakterinis meningitas yra nedažna, bet sunki infekcija,kuriai būdinga prasta ligos prognozė (43). E. coli yra vienas dažniausių Gram-neigiamų naujagimių bakterinių meningitų sukėlėjų
19 (17; 44; 45; 46). Naujagimių meningitas 15 proc. atvejų kyla kaip sepsio ar bakteriemijos komplikacija (46). Neuroinvazyvios ir su naujagimių meningitais siejamos E.coli padermės kiekvienais metais sukelia apie 2 mln. mirčių jaunesniems, nei 5 mėnesių kūdikiams (47). Dažnai stebimas patogeninis ryšys tarp mirtino meningito naujagimiams ir neuroinvazyvių E.coli izoliatų (48). E.coli sukelto meningito mirtingumas siekia 15 - 40 proc., priklausomai nuo šalies ar regiono bei specifinių gydymo centrų taikomos terapijos (44; 46; 49).
Hematogeninės kilmės neuroinvazijos procesams užtikrinti yra būtina aukšto lygio bakteriemija (106 KSV/ml). Aukšto lygio bakteriemijos metu, kraujyje cirkuliuojančios neuropatogeninės E. coli geba kirsti HEB ir sukelti meningitą, lydimą neuronų žūties. Aukšto lygio bakteriemijos svarba meningito patogenezei buvo įrodyta ir gyvūniniuose modeliuose, kuomet naujagimių žiurkių meningito modeliuose, kraujyje cirkuliuojančios E. coli kirsdavo HEB tik aukštos bakteriemijos atvejais (50). Panašūs rezultatai gauti lyginant E. coli bakteriemija ar septicemija sergančių pacientų, kuriems išsivystė E. coli sukeltas meningitas, klinikinius duomenis. Kim parodė, kad bakterinis meningitas dažniau išsivysto pacientams, kuriems būdinga aukšto lygio bakteriemija (46).
Pažymėtina, kad didžioji dauguma neuroinvazivių E. coli produkuoja polisacharidinę kapsulę K1, kuri laikoma klasikiniu E. coli neurotropizmo ir neuroinvazyvumo veiksniu (44; 51; 52). Nustatyta, kad 80–85 proc. naujagimių bakterinio meningito (NBM) metu išaugintų E.coli izoliatų ekspresuoja K1 kapsulę (44; 46; 49).
Dažnai neuroinvazyvios kapsulinio tipo K1 padermės turi būdingas O serogrupes (pvz., O18, O7, O16, O1, O45), iš kurių E. coli O15:K1 yra laikoma klasikiniu neuroinvazyviu serotipu (46). Escherichia coli kapsulinio tipo K1 padermės yra suaugusiųjų virškinimo trakto mikrobiotos dalis, reziduojanti kaip komensalinis organizmas. Neuroinvazyvios E. coli gali būti perduodamos vaisiui vaginalinio gimdymo metu (esant makšties kolonizacijai) arba turint kontaktą su gimdyvės išmatomis (46; 49; 53). Neuroinvazyvių E. coli infekcijos stebimos ir pre-partum periode, kuomet dėl ankstyvo membranų plyšimo, mikroorganizmai iš apatinės lytinių organų dalies (makšties, gimdos kaklelio) patenka į amnioną ir užkrečia vaisių (5). Airijoje vaginalinė E. coli kolonizacija buvo nustatyta 7–13 proc. nėščių moterų, tačiau neuroinvazyvių padermių dažnis šioje E. coli populiacijoje tirtas nebuvo (48).
Ankstyvųjų patogenezės etapų metu, kraujyje cirkuliuojančios neuroinvazyvios E. coli geba prisitvirtinti prie BMEC ląstelių. Neuroinvazijos metu E. coli kerta HEB endocitozės būdu, vykdant invaziją į endotelio ląsteles, taip pat tarpląsteliniu mechanizmu, suardžiusios tarpląstelines jungtis arba per užkrėstas fagocitines ląsteles („Trojos arklio“ mechanizmas) (46; 54). Pastaruoju metu buvo identifikuoti keli kritiškai svarbūs E. coli veiksniai, būtini neuroinvazijos procesams. E. coli ekspresuojami Ibe, OmpA, AslA baltymai veikia kaip ligandai, atpažįstantys šeimininko smegenų
20 mikrovaskulinių epitelio ląstelių (BMEC) receptorius, ir K1 kapsulė, kuri yra ypatingai svarbi E coli invazijos ir translokacijos į BMEC procesuose vei viduląsteliniam išgyvenimumui (2). E. coli padermės, turinčios išveiklintus genus, koduojančius Ibe, OmpA, AslA baltymus, bakteriemijos metu negeba efektyviai kirsti HEB. Taip pat reikėtų pabrėžti, kad virulentiškumo veiksniai saviti E. coli padermėms, yra būdingi APEC ir NMEC padermėms, kas gali kelti hipotezę apie šių veiksnių zoonotinę kilmę.
Išsivysčiusiose šalyse mirtingumas nuo E. coli sukelto meningito sumažėjo iki maždaug 10 proc., nors sergamumo mastai per pastaruosius 30 metų iš esmės nepasikeitė (43; 52). Neurologinės pasekmės kūdikiams, sergantiems meningitu, atsiradusiu dėl Escherichia coli, kuri yra viena iš dviejų svarbiausių bakterijų, atsakingų už NBM, yra maždaug 60 proc. didesnės nei B grupės streptokokinio meningito atveju (48; 52). Pastaraisiais metais pastebėta, kad padidėjo daugeliui vaistų atsparių NMEC padermių kiekis (43). Lietuvoje 2012 metais atlikto tyrimo metu nustatyta, kad po vaginalinio gimdymo vaikų, kolonizuotų E.coli, didžiausias antimikrobinis atsparumas buvo nustatytas ampicilinui 22,7 proc. ir piperacilinui 9,2 proc. Taip pat nustatytas atsparumas ampicilinui/ sulbaktamui 4,2 proc. ir ciprofloksacinui – 1,7 proc. (48).
1.4. Pagrindiniai Escherichia coli virulentiškumo veiksniai svarbūs uropatogenezės
procesuose
Mikroorganizmo gebėjimas, esant tam tikroms sąlygoms, sukelti ligą šeimininko organizme vadinamas virulentiškumu, o procese dalyvaujantys patogeno veiksniai – virulentiškumo veiksniais. UPEC turi sukaupę eilę skirtingų virulentiškumo veiksnių, būtinų pradiniam gleivinės paviršiaus kolonizacijai, invazijai, šeimininkų gynybos mechanizmų įveikimui ir persistavimui. E. coli sukeltą ŠTI patogenezės eigą bei infekcijos komplikacijas lemia skirtingi bakterijos virulentiškumo veiksniai bei šeimininko predispozicija (3).
Pirminiai E. coli uropatogenezės procesai pradedami bakterijai prisitvirtinant prie uroepitelio. Vėliau dažnai stebimi internalizacijos procesai, kurie lydimi viduląstelinio persistavimo ar tolimesnio plitimo.
1.4.1. Svarbiausi uropatogeniškų E. coli adhezijos procesuose dalyvaujantys
veiksniai
Dauguma E.coli padermių ekspresuoja piles, padedančias prisitvirtinti prie urotelio. P tipo pilės, gebančios prisijungti manozilintus uroplakinus ekspresuojamus uroepitelio, yra svarbios šlapimo
21 pūslės kolonizacijos procesuose (1; 6). E.coli padermės, sukeliančios viršutinės šlapimo takų dalies infekcijas, turi P pilių antigenų, kurie dalyvauja adhezijoje prie inkstų taurelių ir surenkamojo latakėlio epitelio ląstelių, ir taip dalyvauja pielonefrito patogenezėje (6).
I tipo pilių sąlygotiems adhezijos procesams ypatingai svarbus fimH geno koduojamas FimH adhezinas (6; 55; 56). FimH pasižymi dideliu imunogeniškumu, todėl bakterijos, ekspresuojančios FimH geba, indukuoja priešuždegiminių citokinų IL-6 ir IL-8 raišką bei uždegiminį procesą. I tipo pilių ekspresija nėra statiška, o FimH raiška yra valdoma dalyvaujant fimA promotoriui ir gali būti valdoma skirtingais mechanizmais (57).
Skirtingi E. coli paviršiuje ekspresuojami kapsuliniai antigenai yra svarbūs uropatogenezės ir neuropatogenezės adhezijos procesuose (7). Neuroinvazyvių E.coli ekspresuojamas K1 antigenas svarbus adhezijos ir viduląstelinio išgyvenamumo procesuose (51).
1.4.2. Paviršinių E. coli antigenų vaidmuo patogenezės procesuose
E. coli gali ekspresuoti skirtingus O, H ir K antigenus, kurie yra svarbūs infekciniame procese ir jo valdyme. O antigenas yra temperatūrai atsparus Gram-neigiamų bakterijų sienelės dalis. Pagal O antigeną E. coli gali būti skirstomos į skirtingas serogrupes. Gao ir kt. pastebi ryšį tarp O antigeno ir sukeliamos infekcijos (58).
O antigenai yra svarbūs patogenezės procesuose, nes sąlygoja E.coli atsparumą kraujo serumui, moduliuoja šeimininko uždegiminį atsaką, saugo patogeną nuo fagocitozės bei turi įtaką bioplėvelių formavimui, o tai yra svarbus veiksnys kolonizuojant paviršius (59). Atsižvelgiant į O antigeną, E.coli yra skirstomos į serogrupes (1). O1, O2, O4, O6, O7, O16, O18, O75 yra E.coli serogrupės, kurios dažniausiai išskiriamos iš pacientų, sergančių ŠTI (58). Tyrimai parodė, jog tarp ŠTI pacientų dažniausiai vyrauja O1 (10,1 proc.) ir O75 (7,7 proc.) E. coli serogrupės. Neuroinvazyvioms E. coli būdingos O antigeno serogrupės: O1, O7, O12, O16, O18, ir O45, kurios taip pat būdingos uropatogeniškoms E.coli (60). O antigeno tipavimas gali būti pritaikytas kaip svarbus prognostinis žymuo, leidžiantis potencialiai nuspėti bakterijų patogeniškumo savybes.
E.coli padermės gali ekspresuoti kapsulę, kuri padeda išvengti fagocitozės (44). K1 kapsulė būdinga neutrotropizmu pasižyminčioms padermėms. Kaip jau buvo minėta anksčiau, E. coli kapsulinio tipo K1 padermės yra laikomos klasikiniu naujagimių meningito sukėlėju ir yra dažnai išskiriamos iš pacientų, sergančių hematogeninės kilmės meningitu.
Maždaug puse visų moterų lytinius organus kolonizuojančių E.coli padermių ekspresuoja K1 antigeną (61). Ši kolonizacija yra svarbus pirminis žingsnis naujagimių infekcijos pradžiai. Krishnan ir kt. nustatė, kad serotipas, dažniausiai nustatomas naujagimių meningitu, yra K1:O18 (62).
22 Be kapsulinio tipo K1, klinikinę svarbą turi ir kiti E. coli kapsuliniai tipai. E. coli kapsulinio tipo K2 ir K15 padermės dažnai išskiriamos iš pacientų, sergančių skirtingomis ŠTI (61).
Klinikiškai svarbaus E. coli kapsulinio tipo K1 nustatymas tarp nėščiąsias moteris kolonizuojančių padermių, galėtų padėti apsaugoti naujagimį nuo meningito, kurio dažna baigtis – mirtis (44).
1.4.3. Uropatogeniškų E. coli sekretuojami toksinai ir jų klinikinė svarba
Kai kurios E.coli padermės geba sekretuoti citotoksiniu poveikiu pasižyminčius egzotoksinus, kuriems būdingas hemolizinis aktyvumas (63). Uropatogeniškų E. coli sekretuojamus toksinus koduojantys genai yra pernešami profagų arba perduodami kartu su kojungacinėmis plazmidėmis. Kliniškai svarbūs ß-hemolizinai sąlygoja šlapimo takų epitelinio audinio destrukciją. UPEC padermių sekretuojami hemolizinai ardo šeimininko eritrocitus ir iš jų išsiskiria hemoglobinas, kuriame yra geležies, reikalingo mikroorganizmo išgyvenimui (56). Geležis yra būtinas elementas beveik visiems mikroorganizmams kaip kofaktorius fermentų gamybai (63).
1.4.4. Svarbiausi Escherichia coli virulentiškumo veiksniai, juos koduojantys genai
bei jų valdymas
UPEC padermės turi ne mažą kiekį virulentiškumo genų. Vieni svarbiausių genų yra ibeA,
fimH, neuC, iss, cnf1, vat ir iutA,koduojantys produktus svarbius šeiminko kolonizacijos, invazijos ir
persistavimo prcesams. Uropatogenezės ir neuroinvazijos procesuose dalyvaujančius veiksnius koduojantys genai gali būti lokalizuoti plazmidėse, chromosomose arba chromosomų patogeniškumo salose (64).
Palyginamosios skirtingų E. coli genomų analizės leido geriau suprasti visulentiškumui svarbių genų organizaciją E. coli genomuose. Virulentiškos uropatogeniškos Escherichia coli O6: K15: H31 padermės analizė parodė, kad šios serogrupės padermėms būdingi du nestabilūs genomo regionai, kurie yra svarbūs bakterijos virulentiškumo užtikrinimui. Šiuose regionuose (patogeniškumo salose), kuriuose dažnai lokalizuoti skirtingus hemolizinus koduojantys genai (hly) bei P-pilių biogenezei svarbūs genai (prf), dažnai laikomi savitais UPEC patotipo žymenimis (65).
Virulentiškumo veiksnių gausa lemia ExPEC padermės gebėjimą sukelti ligą. Atrastas svarbus infekcijos išsivystymui virulentinis genas iss, padidinantis išgyvenamumą šeimininko kraujo serume (11). Genas randamas 60 proc. UPEC ir NMEC padermių, tačiau būna išskiriamas ir iš
23 žmogaus išmatose esančių komensalių E. coli izoliatų (11; 66). iss genas prisideda prie dažno antrinės šlapimo takų infekcijos išsivystymo.
Kitas svarbus E. coli veiksnys ibe lokuse koduojamas ibeA, kuris lokalizuotas gimA, genominėje saloje tarp yjiD ir yjiE genų. gimA lokuse aptinkami virulentiškumo veiksniai yra siejami su neutropišku NMEC patotipu, o ibeA yra laikomas neuropatogeniškumo žymeniu (67). Patogenezės metu IbeA sąveikauja su žmogaus (45 kDa) ir galvijų (55 kDa) albumino-tipo receptoriais, lokalizuotais BMEC paviršiuje (2). Wang ir kt. parodė, kad delecijos, įvestos į ibeA geną, sąlygojo sumažėjusį E. coli invazijos į BMEC ląsteles efektyvumą, virulentiškumą in vivo ir mažesnį bioplėvelių susidarymą (2).
E coli sukelto meningito patogenezės etapams svarbus ir E. coli K1 kapsulinis antigenas. E. coli K1 kapsulinis antigenas yra vienas svarbiausių neuroinvazyvumą sąlygojančių veiksnių (44). Įžvalgos apie E. coli K1 ir kultivuotų smegenų mikrovaskulinių endotelinių ląstelių sąveiką rodo, kad poli-sialo rūgšties kapsulė atlieka ląstelių moduliavimą, leidžiantį ląstelėms pereiti HEB ir slopina endosomų brendimą bei virtimą fagolizosomomis (52). K1 kapsulė apsaugo E. coli nuo humoralinio ir ląstelinio imuninio atsako. Kapsulės praradimas ankstyvosiose sisteminės E. coli K1 infekcijos stadijose leidžia šeimininkui apsisaugoti nuo patogeno (52).
E. coli fimH geno koduojamos I tipo pilės svarbios bakterijos adhezijai prie šlapimo pūslės urotelio ir bakterijos viduląstelinės invazijos procesui bei bioplėvelių sudarymui (68). fimH dažniausiai aptinkamas visų 90-97 proc. UPEC išskiriamų padermių (58).
vat genas koduoja vakuolizuojantį toksiną, kuris glaudžiai siejamas su urosepsiu. 68 proc. uropatogeniškų E. coli padermių produkuoja šį geną (69). vat genas siejamas su bakterijos išgyvenamumo padidinimu infekcijos metu.
cnf1 genas koduoja citotoksinio nekrotizavimo veiksnį CNF. Dažnai cnf1 genas randamas šlapimo mėginiuose iš vaikų, kurie serga ŠTI. Didesinis geno aktyvumas pastebimas komplikuoto pielonefrito metu, esant sunkiems inkstų audinio pažeidimams (70). Taip pat geno koduojamas CNF toksinas skatina šlapimo pūslės epitelinių ląstelių degradaciją, o tai lengvina bakterijos invaziją į gilesnius audinio sluoksnius, užtikrinant sunkesnę infekcijos eigą. iutA genas atsakingas už aerobaktino sistemą, kuri reguliuoja geležies išgavimą, reikalingą bakterijai išgyventi (9).
1.5. Escherichia coli sukeliamų infekcijų uropatogenezės mechanizmai
Uropatogeniškos E. coli yra specifinis E. coli patotipas, galintis kolonizuoti šlapimo takus ir sukelti cistitą bei pielonefritą. UPEC sukeltas infekcijas galima suskirstyti į hospitalines, įgytas gydymo įstaigoje, ir visuomenėje įgytas. Visuomenėje įgytos infekcijos kyla, kai E.coli bakterijos iš
24 šeimininko žarnyno patenka ant išangės, kolonizuoja lytinius organus, patenka ant šlaplės, kuria galiausiai patenka į šlapimo pūslę ir ten sukelia infekciją (6; 22; 71). Hospitalinės infekcijos gali išsivystyti bakterijoms patekus ant organų, šlapimo organų patikrinimo metu, arba perduodamos pacientams per šlapimo kateterius (72).
Kadangi šlapimo takai yra unikali mitybinė niša, reikalingos nuo aerobaktino priklausomos geležies gavimo sistemos, skirtos UPEC išlikimui šioje geležies ribotoje aplinkoje, kurias koduoja iutA genas (56). Hagan ir kt. moksliniai duomenys rodo, kad šie patogenai metabolizuoja peptidus ir amino rūgštis kaip pirminį anglies šaltinį (58). Įvykus horizontaliam genų perdavimui, PAI dažnai koduoja baltymus ar genus, pvz., hemolizino gamybos genus (hly) ir P-piles (prf), kurie prisideda prie patogenezės (58; 65). Šių regionų praradimas gali susilpninti virulentiškumą.
I tipo pilės yra būtinos UPEC kolonizacijai, invazijai ir išsilaikymui šlapimo pūslėje. E. coli viduląstelinis ciklas leidžia UPEC apeiti šeimininko apsaugos priemones ir tapti nepalankiu gydymui antimikrobiniais preparatais (6; 64). Tačiau įgimtas imuninis atsakas saugo uroepitelį nuo UPEC invazijos (6). Urotelį kolonizuojančių E. coli pažinimas dažniausiai vyksta aktyvinant Toll-tipo 4 receptorius (TLR4). Lipopolisacharidui aktyvinant TLR4, signalas aktyvuoja adenililo ciklazę 3 (AC3), kurios aktyvumo metu sintetinamas ciklinis AMP, kuris sukelia internalizuotų UPEC egzocitozę iš skėtinių ląstelių vidaus į užląstelinę erdvę (3; 73). UPEC moduliuoja šeimininko ląstelinius procesus, geba slopinti bakterijų egzocitozę ir sudaro laikinas į bioplėveles panašias viduląstelines bakterijų sankaupas (IBC), kuriose vėliau bręsta (3; 74). Po brandinimo bakterijos išsilaisvina iš IBC, mechaniškai suardant ląstelę ir ciklas kartojamas toliau.
Po bakterijų kolonizacijos, atsisluoksniavusios šlapimo pūslės epitelio ląsteles pašalinamos su šlapimu (4) (1 pav.). Invazijos ir IBC formavimosi procesas suteikia UPEC galimybę išgyventi šlapimo takų epitelyje, net ir esant stipriam TLR4 aktyvumui, skėtinių ląstelių eksfoliacijai, gausiai šlapinimo srovei bei šeimininko imuninės sistemos sukeltiems uždegimo procesams (3; 71).
UPEC taip pat sudaro neaktyvius viduląstelinius bakterijų rezervuarus (QIR) urotelio ląstelėse. Skirtingai nuo aktyvių IBC, QIR paprastai turi nedidelį kiekį bakterijų, kurios gali ilgai išlikti gyvybingos ir inicijuoja pasikartojančią ŠTI (3; 4).
25 1 pav. UPEC IBC patogeninis kelias, stebėtas pelių cistito modelyje. Pagal Rosen et al, 2007.
Skirtingai nuo I tipo pilių, manozę prisijungiančio adhezino FimH, P pilės, PapG adhezinas prijungia globozidus, kuriuose yra glikolipidų, gausiai ekspresuojamų žmogaus inkstų ląstelėse (3; 56; 64). Be to, PapG moduliuoja vietinį imuninį atsaką, sąveikaujant su TLR4, kad sumažintų polimerinių imunoglobulino receptorių ekspresiją, taip sumažindamas imunoglobulinų A transportavimą į inkstų lumeną. Slopindamas imunoglobulino A transportavimą į šlapimo organus, UPEC išvengia pagrindinio šeimininko apsaugos mechanizmo, leidžiančio sukurti augančią infekciją.
Svarbu tai, kad pradinis įgimtas šeimininko atsakas į UPEC kolonizaciją ir invaziją ne tik diktuoja pradinės infekcijos rezultatą, bet taip pat yra labai svarbus vertinant šeimininko imlumą vėlesnėms infekcijoms. Padidėjęs jautrumas pasikartojantiems ŠTI gali atsirasti ne dėl nepakankamo šeimininko atsako į UPEC infekciją, kaip dažnai manoma, bet dėl neužsikrėtusių limfocitų priklausomos įgimtos uždegiminės reakcijos į ūminę infekciją, dėl kurios atsiranda sunkus gleivinės uroepitelio pažeidimas ir paskatinamos vėlesnės infekcijos (3).
Nors ExPEC ŠTI sukelia stiprų įgimtą imuninį atsaką šeimininko organizme, 25 proc. moterų, sergančių ūminiu cistitu, per 6 mėnesius patiria antrą ŠTI. Šis organizmo nesugebėjimas apsisaugoti nuo infekcijos naudojant imuninį atsaką gali atsirasti dėl šeimininko genetinių veiksnių, didelio antimikrobinių preparatų naudojimo, heterogeniškumo tarp ExPEC padermių, aktyvaus įgimto ir įgyto imuniteto slopinimo ExPEC padermių (18).
26 Atlikta nemažai tyrimų su E. coli padermėmis, išskirtomis iš pacientų, sergančių ŠTI. Kolonizacijos tyrimai, naudojant ne patogeninę asimptominį bakteriurijos padermę, paaiškino mechanizmus, skatinančius E. coli išgyvenamumą žmogaus šlapimo takuose, bet jis neatspindi ŠTI, sukeltos E. coli, turinčios pilną patogeninį potencialą (57). Jei norime užpildyti spragas mūsų supratime apie šį plačiai paplitusį žmogaus patogeną, labai svarbu sutelkti dėmesį į UPEC genų ekspresiją natūraliai atsirandančio žmogaus ŠTI metu.
1.6. Filogenetinės Escherichia coli grupės ir jų pasiskirstymas
Filogenetiškai E. coli padermės gali būti skirstomos į keturias pagrindines filogenetines grupes, vadinamas A, B1, B2 ir D (75). Dauguma padermių, sukeliančių ŠTI, filogenetiškai priskiriamos B2 grupei ir rečiau D grupei. Skirtingų autorių duomenys parodė, kad A ir B1 filogenetinėms grupėms būdingos mažą patogeniškumo potencialą turinčios, dažnai komensalinės E. coli (11). Tačiau šių grupių padermės dažnai pasižymi aukštesniu antimikrobinio atsparumo laipsniu (76; 77). Detalus molekulinis tai sąlygojantis mechanizmas nėra iki galo išaiškintas.
Detalios viso genomo sekoskaitos analizės leido padobulinti filogenetinę klasifikaciją, išplėsdama ją į papildomas 8 filogenetines grupes: A, B1, B2, C, D, E, F E. coli sensu stricto ir Escherichia cryptic clade I (8). Tačiau izoliatai, priklausantys filogenetinėms grupėms C, E, F ir clade I yra nustatomi gana retai - 12,8 proc. tiriamų padermių (8).
Išaiškinus E. coli kertinio genomo organizaciją, buvo suprasta, kad skirtingoms E. coli filogenetinėms grupėms priklausančios padermės nėra atsitiktinai pasiskirstę pagal jų išskyrimo šaltinį ir infekcijos vietą (78). Labiau tikėtina, kad išskirtos ExPEC padermės priklausys B2 arba D filogenetinei grupei nei A arba B1 grupėms, kurioms būdingas mažesnis patogeniškumo potencialas. Klinikinė šių stebėjimų reikšmė leidžia daryti prielaidą, kad filogenetinis tipavimas yra ypatingai reikšmingas epidemiologinis žymuo, leidžiantis daryti prielaidą apie E. coli virulentiškumo galimybes. Clermont ir kt. pasiūlytas filogenetinės grupės nustatymo algoritmas paremtas filogenetinei grupei savitų genų chuA, yjaA bei DNR fragmento TspE4.C2 nustatymu taikant dauginę PGR reakciją (75; 78). Remiantis šių trijų fragmentų buvimu/nebuvimu ir jų kombinacijomis bei taikant autorių pateiktą algoritmą, tiriamosios E. coli padermės gali būti priskirtos vienai iš pagrindinių filogenetinių grupių, A, B1, B2 arba D (76). Vėlesni darbai parodė, kad filogenetinė grupė dažnai turi sąsają su E. coli kolonizuojama ekologine niša bei patotipu (79).
Tolimesni skirtingų autorių gauti rezultatai parodė klasikinių E. coli filogenetinių grupių nehomogeniškumą. Palyginamosios genomų analizės leido geriau suprasti E. coli filogenetinę klasifikaciją, kuri leido sukurti pranašesnius metodus skirtus detalesniam E. coli filogenetinės grupės
27 nustatymui (8). Clermont ir kt. nurodo E. coli genomo plastiškumą kaip vieną iš svarbių veiksnių sąlygojančių E. coli filogenetinių grupių kintamumą. Todėl yra žinoma, kad kai kurios B1 grupės padermės geba prarasti TspE4.C2 fragmentą ir taip būti klaidingai identifikuojamos. Panašūs procesai stebimi ir analizuojant D grupei priklausančias E. coli padermes, kuomet stebimas arpA geno praradimas sudaro sąlygas klaidingai identifikuoti D grupės padermes (8). Klaidingai neigiami duomenys taip pat gaunami ir tiriant B2 grupę, kai tiriamai padermei nenustatomas chuA genas (8).
Dėl specifinių ligai savitų simptomų trūkumo, klinikinės asimptomatinės bakteriurijos ir ŠTI infekcijų diagnostika tarp geriatrinių pacientų yra ypatingai komplikuota. Amarsy ir kt. iškėlė hipotezę, jog E. coli B2 arba D filogenetinių grupių, pasižyminčiu dideliu virulentiškumu, nustatymas tarp šių pacientų galėtų potencialiai padėti diferencijuoti asimptomatines bakteriurijas nuo ŠTI (10). Amarsy ir kt. atlikto tyrimo metu buvo analizuojamos E. coli padermės, išskirtos iš hospitalizuotų, vyresnių nei 75 metų amžiaus pacientų šlapimo. Tyrimų metu autorių taikyta dauginė PGR buvo skirta nustatyti pagrindines filogenetines grupes bei buvo lyginamos ŠTI ir ASB atvejų charakteristikos, kurios įvertintos retrospektyviai pagal pacientų anamnezes. Iš tyrimo metu analizuotų 233 bakteriurijos atvejų 60 buvo vertinami kaip ŠTI ir 163 - ASB, 10 atvejų neklasifikuojami. E. coli padermės, priklausančios B2 ir D grupėms, buvo daug dažnesnės ŠTI (48/60, 80%) nei ASB (101/163, 62%) (10).
Šie rezultatai parodo, kad E. coli filogenetinių grupių nustatymas gali padėti atskirti ŠTI nuo ASB senyviems pacientams, turintiems bakteriuriją. Remiantis filogenetinėmis grupėmis, kurių pagalba dažniau nustatoma tikslesnė ASB diagnozė, gali būti sumažintas netinkamas antimikrobinių preparatų koncentracijos vartojimas ir taip mažinamas antimikrobinis atsparių padermių formavimasis.
1.7. Antimikrobinis E. coli atsparumas ir tai sąlygojantys veiksniai
Antimikrobiniai preparatai, tokie kaip trimetoprimo /sulfametoksazolas, ciprofloksacinas ir ampicilinas, yra dažniausiai rekomenduojami vaistai, skiriami ŠTI gydymui (32). Tačiau didėjantis atsparumas antimikrobiniams preparatams kelia didelę problemą visuomenei (3; 80). Ligų kontrolės ir prevencijos centrai apskaičiavo, kad kasmet JAV miršta ne mažiau kaip 23 000 žmonių dėl infekcijos, sukeltų antimikrobiniams preparatams atsparių bakterijų. Be to apskaičiuota, kad atsparumas antimikrobiniams preparatams iki 2050 m. sukels apie 300 milijonų ankstyvų mirčių. Tokią padėtį blogina didelis naujų antimikrobinių medžiagų trūkumas (81).
Pagrindiniai atsparumo antimikrobiniams preparatams mechanizmai yra: mutacijos tiksliniuose genuose (pvz. gyrA, parC , rpoB), didelė išnašos siurblių išraiška, išorinės ląstelės membranos modifikuotas lipopolisacharidas bei plazmidės, koduojančius atsparumą sąlygojančius
28 genus (82). Be to, prisitaikymas prie aplinkos, pavyzdžiui, bioplėvelių susidarymas, taip pat gali prisidėti prie didesnio mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms.
Europoje gauti duomenys rodo didelį atsparumą tarp E. coli izoliatų penicilinams ir fluorochinolonų grupės antimikrobiniams preparatams, bet mažą atsparumą aminoglikozidams. Terlizzi ir kolegų 2017 metais atlikto tyrimo rezultatai rodo didelio lygio atsparumą antimikrobiniams preparatams Europoje tarp iš hospitalizuotų pacientų išskirtų UPEC. Maždaug 11,8 proc. visų uropatogeniškų E. coli yra atsparios trečios kartos cefalosporinams ir 22,3 proc. pasižymi atsparumu fluorochinolonų klasės antimikrobiniams preparatams (68). ECDC duomenimis Lietuvoje 2017 metais didžiausias E.coli atsparumas buvo aminopenicilinams 57,8 proc. ir fluorochinolonams 25,2 proc. Karbapenemų klasės antimikrobinis atsparumas nenustatytas (83).
Karami ir kiti nurodo, kad labiausiai paplitęs atsparumas tarp E.coli padermių yra ampicilinui, tetraciklinui ir trimetoprimui (9). Daugiametė Kamari ir kt. autorių analizė parodė, kad atsparumas gali būti reikšmingai siejamas su filogenetine D grupe (9). Žinoma, kad tam tikri uropatogeniški E. coli klonų kompleksai turi antimikrobinio atsparumo genus, pavyzdžiui, O25b klonas: H4-B2-ST131. Šis klonas dažnai turi genus, koduojančius CTX-M-15 išplėstinio spektro β-laktamazės (ESBL) tipą. Kitas svarbus E. coli klonas CGA-D-ST69 dažnai turi genus, sąlygojančius atsparumą ampicilinui, streptomicinui, tetraciklinui ir trimetoprimui (11).
Antimikrobiniai preparatai dažnai naudojami ne tik klinikiniame, tačiau ir veterinariniame bei maisto sektoriuose (12). Merkevičienės L. (2018 m.) disertacijoje pateikiama iš maisto produktų išskirtų E. coli antimikrobinio atsparumo tendencijos. Lietuvoje gamintų paukštienos produktų išskirtų E.coli antimikrobinis atsparumas ampicilinui buvo 98,2 proc., tetraciklinui – 49,7 proc., ciprofloksacinui – 44,9 proc., cefoksitinui – 32,4 proc. Kiek mažesnis atsparumas nustatytas gentamicinui -22,7 proc. ir imipenemui – 17,3 proc. (84). Šiek tiek žemesni atsparumo rodikliai buvo pateikti Europos maisto saugos tarnybos 2012 metų duomenimis, kai iš naminių paukščių išskirtų E. coli atsparumas tetraciklinui ir ampicilinui buvo 40 proc. ir 42 proc., o ciprofloksacinui ir cefotaksimui – 45 proc. ir 9 proc.
Dėl plačiai paplitusių antimikrobinį atsparumą sąlygojančių veiksnių tarp enterobakterijų, šlapimo takų infekcijų, sukeltų E. coli, gydymas tampa sudėtingas. Ypač didelį susirūpinimą kelia E. coli produkuojančios išplėsto spektro β-laktamazes (ESBL) (1; 14; 85). Šias laktamazes koduojančios plazmidės sąlygoja E. coli atsparumą trečiosios kartos cefalosporinams bei kitiems antimikrobiniams preparatams (3; 12; 86). Kipre atlikto tyrimo metu ESBL produkuojančios E. coli buvo nustatytos 53 proc. hospitalizuotiems ir 44 proc. ne hospitaliniams pacientams. Studijos metu visi ESBL produkuojantys E. coli izoliatai pasižymėjo jautrumu amikacinui ir karbapenemams.
29 ESBL produkuojančių E. coli atsparumas dažniausiai sąlygotas TEM, SHV ir CTX-M šeimų laktamazių (85). Didelę grėsmę Lietuvos klinikiniam sektoriui kelia CTX-M šeimai priklausančių β-laktamazių paplitimas (14).
Enterobacterialis šeimos nariai taip pat gali produkuoti chromosomoje ir/ar plazmidėse koduojamas C klasės laktamazes (AmpC), kurios yra aktyvios prieš cefamiciną ir yra nejautrios β-laktamazės slopikliams (klavulano r. ir kitiems) (85). AmpC ekspresija taip pat susijusi su atsparumu karbapenemams (3). ampC genas yra indukuojamas, todėl bakterija gali turėti šį geną, bet atsparumas stebimas tik antimikrobinės medžiagos ekspozicijos metu.
Niki ir kt. kėlė hipotezę, jog ESBL/AmpC produkuojančių bakterijų šaltinis gali būti veterinarinis ir maisto sektorių (87). Broileriuose ir broilerių mėsoje buvo aptikti izoliatai, turintys ESBL koduojančius genus (daugiausia bla CTX-M-1 ir bla TEM-52). Šio tipo laktamazės taip pat yra dažnos tarp padermių, išskiriamų iš klinikinio sektoriaus. Tai rodo, kad ESBL/AmpC kilmė galėtų būti zoonotinė (87).
Atvejai, kai taškinės mutacijos sukelia atsparumą antimikrobiniams preparatams, yra gana reti. E. coli atsparumas fluorochinolonams įgijamas įvykus bent septynių aminorūgščių pokyčiams tikslinėse gyrA geno arba trims aminorūgščių pokyčiams parC geno vietose arba taškinei mutacijai rpoB gene (88).
Atsparumas fluorochinolonams gali būti lemiamas QepA, QpxAB vaistų išnašos siurblių veiklos (angl. efflux pumps), kurie sumažina viduląstelinę hidrofilinių chinolonų koncentraciją (27). Išnašos siurblių viršekspresija, pvz. AcrAB-TolC ir MexAB-OprM, sąlygoja dauginį bakterijų atsparumą skirtingų klasių antimikrobiniams vaistams, kurie gali būti panaudoti kaip šių išnašos pompų substratai (89).
Bioplėvelių formavimas yra svarbus toleranciją antimikrobiniams preparatams sąlygojantis veiksnys. Bioplėvelių formavimą galima laikyti virulentiškumo veiksniu, užtikrinančiu ilgalaikį bakterijų persistavimą urogenitaliniame trakte, žarnyne, aplinkoje (26). Biolėvelių formavimas gausiai paplitęs tarp uropatogeniškų E. coli. (90; 91). Lewis ir kt. nurodo, kad daugiau kaip 60 proc. visų mikrobinių infekcijų sukelia bioplėveles formuojančios padermės (92).
Bioplėvelė susideda iš paviršiumi surištų mikrobų, uždarytų amorfinėje ekstraląstelinėje matricoje, dažnai susidedančioje iš egzopolisacharido, baltymų ir nukleino rūgščių (2; 92). Iš Mittal ir kt. tirtų bioplėveles produkuojančių izoliatų 88 proc. produkavo ESBL, o AmpC nustatytas tarp 22 proc. tirtųjų izoliatų (90). Tai parodo, kad ypatingai rezistentiškos bakterijos geba sudaryti bioplėveles, kurios infekcijos metu sąlygotų žymiai prastesnį terapinį atsaką. Taip pat buvo nustatyta, kad bioplėveles formuojančioms E. coli padermėms būdinga žymiai didesnė I tipo pilių ekspresija nei bioplėvelių neturinčioms padermėms (90). Pastebėta, kad ibeA dažniau pasitaiko bioplėveles formuojančiuose padermėse (2).
