LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Karolina Rilskytė
Aβ1-42 PEPTIDO POVEIKIO GLIJOS LĄSTELIŲ KULTŪRAI TYRIMAS Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas dr. Aistė Jekabsone
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA... 12
1.1 Mikroglijos ląstelės ... 12
1.2 Mikroglijos vaidmuo AL metu ... 14
1.3 Astrocitai ... 14
1.4 Astrocitų vaidmuo AL metu ... 15
1.5 NMDA receptorius glijos ląstelėse ... 16
1.6 Aβ formų susidarymas ir funkcijos ... 17
1.7 Alzheimerio liga ir Aβ ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1 Pirminės glijos ląstelių kultūros ruošimas ... 22
2.2 Glijos kultūros ląstelių ir grynos mikroglijos sėjimas eksperimentui ... 23
2.3 Ląstelių tankio ir gyvybingumo nustatymas Tripano mėliu ... 23
2.4 Aβ1-42 peptidų paruošimas ... 24
2.4.1 Aβ1-42 mažų peptido oligomerų paruošimas ... 24
2.4.2 Aβ1-42 didelių peptido oligomerų paruošimas ... 24
2.4.3 Aβ1-42 fibrilių paruošimas ... 25
2.4.4 HFIP tirpalo paruošimas ... 25
2.5 Glijos ląstelių identifikavimas pagal specifinius žymenis ... 25
2.6 Glijos ląstelių gyvybingumo įvertinimas... 26
2.7 Uždegiminio citokino IL-6 matavimas ... 26
2.8 Statistinė duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI ... 27
3.1 Glijos kultūrų sudėties ir ląstelių gyvybingumo vertinimas... 27
3.2 Įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-42 įtaka mikroglijos ir astrocitų ląstelių gyvybingumui glijos ir grynoje mikroglijos kultūrose ... 29
3.3 Mažų Aβ1-42 poveikio mikroglijos ir astrocitų gyvybingumui grynoje mikroglijos ir glijos kultūrose ryšys su NMDA receptoriaus aktyvumu ... 33
3.4 Uždegiminio citokino IL-6 matavimas glijos ląstelių terpėje ... 36
REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
Praktinės rekomendacijos ... 39
IŠVADOS ... 40
3
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius: Karolina Rilskytė
Magistro darbo pavadinimas: Aβ1-42 peptido poveikio glijos ląstelių kultūrai tyrimas
Darbo tikslas: nustatyti Aβ1-42 peptido įvairaus dydžio oligomerų poveikį mikroglijos ir astrocitų
ląstelių gyvybingumui bei ištirti šio poveikio mechanizmą. Uždaviniai:
1. Įvertinti mažų (1-3 nm dydžio) Aβ1-42 oligomerų, didelių (virš 5 nm dydžio) oligomerų bei fibrilių
poveikį grynos mikroglijos ir glijos kultūros gyvybingumui ir ištirti, kaip šis poveikis priklauso nuo veikimo trukmės;
2. Nustatyti, ar mažų Aβ1-42 poveikis grynos mikroglijos ir glijos kultūros gyvybingumui susijęs su
NMDA receptoriaus aktyvumu;
3. Nustatyti, ar maži Aβ1-42 sukelia interleukino-6 (IL-6) išskyrimą iš glijos ląstelių.
Darbo objektas: Pirminė glijos ir gryna mikroglijos ląstelių kultūra
Metodai: Glijos ir mikroglijos ląstelių kultūros buvo ruošiamos iš 5-7 dienų amžiaus Wistar veislės žiurkių smegenų didžiųjų pusrutulių. Kultūros buvo veikiamos 0,5 ir 1 μM Aβ1-42 peptido mažais (1-3
nm dydžio) ir dideliais (virš 5 nm dydžio) oligomerais bei fibrilėmis. Ląstelių kultūros sudėtis buvo nustatoma identifikuojant ląsteles imunocitocheminiu žymėjimu. Mikroglijos ir astrocitų ląstelių gyvybingumas buvo vertinamas fluorescencinės mikroskopijos metodu, naudojant Hoechst 33342 ir propidžio jodido dažus. Vaizdai apdorojami programa ImageJ. IL-6 koncentracija terpėje nustatyta ELISA metodu naudojant komercinį rinkinį Rat IL-6 ELISA Kit. Gauti duomenys buvo analizuojami programų paketu Sigma Plot 13.0. Statistinei analizei buvo taikomas Vienakryptės ANOVOS testas (ONE-WAY ANOVA). Skirtumai tarp vidurkių buvo laikomi patikimais, jei p<0,05.
Rezultatai: Maži Aβ1-42 oligomerai yra toksiški mikroglijos ląstelėms grynoje mikroglijos ir glijos
kultūrose. Žūčiai sukelti pakako 0,5 µM koncentracijos. Maži Aβ1-42 oligomerai turėjo nedidelį poveikį
astrocitų gyvybingumui: veikiant 0,5 µM koncentracijos mažais oligomerais po 270 min. žūva iki 7 proc. ląstelių, o 1 µM koncentracijos ‒ iki 9 proc. Dideli Aβ1-42 oligomerai ir fibrilės nėra toksiški glijos
ląstelėms. NMDA blokatorių poveikis mikroglijos ląstelėms grynoje kultūroje išsiskyrė: D-AP5 neturėjo apsauginio poveikio, MK 801 ir memantinas apsaugojo mikroglijos ląsteles nuo mažų Aβ1-42 sukeliamos
žūties: po 90 min. inkubacijos nekrozinių branduolių skaičius sumažėjo 9 proc. lyginant su tiriamuoju mažų Aβ1-42 poveikiu. Naudoti blokatoriai glijos kultūroje neturėjo apsauginio poveikio mikroglijos
4 branduolių skaičius sumažėjo 6,11 proc. (MK 801), 5,48 proc. (D-AP5), 4,6 proc. (memantinas) lyginant su pavyzdžiais be blokatorių. 0,5 µM koncentracijos maži Aβ1-42 nesukėlė glijos ląstelių aktyvacijos.
Išvados: Aβ1-42 maži oligomerai sukelia astrocitų ir mikroglijos žūtį, kurios intensyvumas priklauso nuo
koncentracijos ir poveikio laiko. 1 µM dideli Aβ1-42 oligomerai bei fibrilės neturi toksinio poveikio glijos
ląstelėms. Aβ1-42 mažų oligomerų sukeliama mikroglijos ląstelių žūtis nepriklauso nuo NMDA
receptorių, tačiau naudoti NMDA receptorių blokatoriai apsaugojo astrocitų ląsteles. 0,5 µM koncentracijos Aβ1-42 maži oligomerai per 24 valandas nesukelia uždegiminio citokino IL-6 išsiskyrimo
5
SUMMARY
Author of Master Thesis: Karolina Rilskytė
Full title of Master Thesis: Investigation of the effect of Aβ1-42 peptide on glial culture
The aim of the study: to determine the Aβ1-42 peptide oligomers of different size effect on microglia
and astrocytes cell viability and to investigate the mechanism. Objectives:
1. Rate of small (1-3 nm in size) Aβ1-42 oligomers, large (more than 5 nm) in size oligomers and
fibrils effects of pure microglia and glial cultural viability and to investigate how these impacts depends on the duration of exposure;
2. Determine whether small Aβ1-42 effects of pure microglia and glial culture viability depends on
NMDA receptor activity;
3. To determine whether small Aβ1-42 caused by interleukin ‒ 6 (IL-6) from the glial cells.
The object of investigation: Primary pure microglia cell culture and glial culture
Methods: Glial culture and primary pure microglia cell culture were prepared from 5-7 days old Wistar rat brain hemispheres. The cultures were treated with 0.5 µM and 1 µM small Aβ1-42 (1-3 nm size), large
Aβ1-42 (more than 5 nm size) oligomers and fibrils. Immunocytochemistry was used to determine cell
culture composition. Viability of microglial and astrocyte cells were assessed by Hoechst 33342 and propidium iodide staining using a fluorescence microscopy. Images were processed by ImageJ software. IL-6 concentration in the medium determined by ELISA using a commercially available kit Rat IL-6 ELISA. The data obtained were analyzed by software package Sigma Plot 13.0. The One-way ANOVA test used for statistical analysis. Differences between means were considered statistically significant if p<0,05.
Results: Small Aβ1-42 oligomers are toxic to pure microglia and glial cultures. 0.5 µM concentration was
sufficient to significantly decrease cell viability. Small Aβ1-42 oligomers had little effect on the viability
of astrocytes: 0,5 µM small oligomers after 270 minutes induced 7 percent of dead cells. 1 µM – up to 9 percent. Large Aβ1-42 oligomers and fibrils are not toxic to glial cells. The effect of NMDA antagonists
on microglial cells in pure culture varied: D-AP5 did not have the protective effect of MK 801 and memantine prevented microglia cells from small Aβ1-42-induced death: after 90 min incubation the
number of necrotic cells decreased by 9 percent compared to the effect of small Aβ1-42 oligomers. NMDA
antagonists had not a protective effect on microglia cells in glial culture, but astrocytes were protected from small Aβ1-42-induced death: after 270 min necrotic cell numbers dropped by 6.11 percent with MK
6 801, 5.48 percent with D-AP5, 4.6 percent with memantine, compared with the small Aβ1-42
oligomer-treated samples without NMDAR antagonits. 0.5 µM small Aβ1-42 oligomer did not induce glial cell
activation.
Conclusions: Aβ1-42 small oligomers cause necrotic death of astrocytes and microglia, intensity of which
depends on the concentration and exposure time. 1 µM large oligomers and fibrils did not affect glial cells. Aβ1-42 small oligomer-induced glial cell death is not NMDAR-dependent however astrocytes were
protected from small Aβ1-42-induced death. 0.5 µM concentration small Aβ1-42 oligomers within 24 hours
7 Padėka. Nuoširdžiai dėkoju LSMU Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijos vedėjai prof. dr. Vilmantei Borutaitei už suteiktą galimybę atlikti savo magistrinį darbą šioje laboratorijoje. Labai dėkoju savo darbo vadovei dr. Aistei Jekabsonei už kantrybę bei pagalbą dirbant laboratorijoje, įsisavinant sudėtingas metodikas ir viso eksperimentinio darbo metu, taip pat už nuoširdų bendradarbiavimą, konsultacijas ir pagalbą rašant baigiamąjį magistro darbą.
Interesų konfliktas. Pažymiu, kad interesų konflikto nebuvo.
Etikos komiteto leidimas. Valstybinės Veterinarijos tarnybos leidimas atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr. 0217 ir Nr. 0228
8
SANTRUMPOS
AFM ‒ atominės jėgos mikroskopas AL – Alzheimerio liga
ApoE ‒ apolipoproteinas-E
APP (angl. Amyloid Precursor Protein) – Aβ pirmtako baltymas Aβ – amiloido-β peptidas
Aβ1-40 – 1-40 aminorūgšties amiloido-β peptidas Aβ1-42 – 1-42 aminorūgšties amiloido-β peptidas CNS – centrinė nervų sistema
DMEM (angl. Dulbecco‘s modified eagle‘s medium) – ląstelių auginimo terpė fAD (angl. familial Alzheimer‘s disease) – šeiminė Alzheimerio ligos forma FBS (angl. fetal bovine serum) – fetalinis veršelio serumas
GABA – γ-aminobutano rūgštis
GFAP (angl. glial fibrillary acidic protein) ‒ glijos fibrilinis rūgštusis baltymas HFIP ‒ heksafluorizopropanolis
IFN-γ ‒interferonas - γ IL-1β – interleukinas-1β IL-6 – interleukinas-6 LPS ‒ lipopolisacharidas
NFT (angl. Neurofibrillary tangles) – neurofibriliniai raizginiai NMDA – N-metil D-aspartato receptorius
PAMPs (angl. pathogen-associated molecular patterns) – mikroglijos ekspresuojami receptoriai, kurie atpažįsta su patogenu susijusias struktūras
PBS (angl. phosphate buffered saline) – fosfatinis buferis PSEN1 ‒ presenilinas 1
PSEN2 ‒ presenilinas 2
ROS (angl. reactive oxygen species ) – reaktyvios deguonies formos
sAD (angl. sporadic Alzheimer‘s disease) –sporadinė, atsitiktinė ligos forma TCR (angl. T-cell receptor) ‒ T limfocitų receptorius
9
ĮVADAS
Alzheimerio liga (AL) yra progresuojanti neurodegeneracinė liga, kuriai būdinga demencija. Dėl vis labiau senstančios visuomenės, AL tampa didele visuomenės sveikatos problema, turinti svarbų ekonominį ir socialinį poveikį visame pasaulyje (1). AL patogenezės bruožai yra amiloido-β peptido (Aβ) kaupimas, neurofibriliniai raizginiai ir neurouždegimas. Geriausiai ištirtas Aβ poveikis neuronams. Naujausi duomenys rodo, kad Aβ kaupimasis yra pagrindinis ligos bruožas, tačiau tikslus mechanizmas, kuriuo šis peptidas skatina neurotoksiškumą, lieka nežinomas (1,2). Gali būti, kad Aβ įtaka neuronų gyvybingumui yra susijusi su poveikiu glijos ląstelėms, tačiau tai mažai ištirta.
Gausausia glijos ląstelių populiacija smegenyse yra astrocitai. Jie atsakingi už smegenų homeostazės palaikymą, reguliuoja smegenų vystymąsi, neuroninių kamieninių ląstelių diferenciaciją. Šios ląstelės yra svarbios sinaptogenezėje, sinapsių perdavime ir sinapsių priežiūroje. Taip pat astrocitai kontroliuoja pagrindinių neuromediatorių, glutamato, γ-aminobutano rūgšties (GABA) ir ATP/adenozino homeostazę (3). Mikroglijos populiacija nėra gausi (vidutiniškai suaugusio žmogaus smegenyse šių ląstelių būna apie 5 proc.), tačiau jos smegenyse atlieka labai svarbias apsaugines ir atrankines funkcijas. Tai centrinės nervų sistemos nespecifinio imuninio atsako ląstelės, apsaugančios smegenis nuo patogenų, tačiau jų vaidmuo svarbus ir fiziologinių neuronų funkcijų palaikyme. Jos dalyvauja embriono sinaptogenezėje, taip pat sinapsių formavime ar jų panaikinime, yra svarbios formuojant neuronų tinklus per sinapsių genėjimą ir apoptozinių neuronų fagocitozę (4). Tai pat mikroglijos ląstelės kontroliuoja neuronų pirmtakų proliferaciją ir diferenciaciją, prisideda formuojant neuronų grandines po gimimo (5).
AL metu besikaupiantis Aβ lengvai oligomerizuojasi ir tarpląstelinėje aplinkoje sudaro agregatus (6). Yra žinoma, kad įvairaus dydžio Aβ kompleksai gali aktyvuoti mikrogliją ir astrocitus veikdami per specifinius receptorius ir inicijuoti imuninį atsaką. Šis procesas apima prouždegiminių citokinų, chemokinų sekreciją ir reaktyviųjų deguonies formų gamybą. Per didelis šių junginių kiekis sukelia imuninio atsako disreguliaciją, kuri prisideda prie neurodegeneracijos (5). Ankstyvose AL stadijose mikroglija mažina Aβ kaupimąsi vykdydama fagocitozę (6), tačiau AL progresavimas sukelia mikroglijos disfunkciją. Literatūros duomenys rodo, kad mikroglijos gebėjimo šalinti Aβ praradimas yra tiesiogiai susijęs su šio peptido sukeliamu uždegiminiu atsaku, taip pat sumažėja trijų pagrindinių Aβ skaidymo fermentų – insulisino, neprilisino ir MMP-9 raiška. Visa tai didina Aβ kaupimąsi (7). Ankstyvose neurodegeneracinių susirgimų stadijose yra paveikiami astrocitai, o tai lemia ligos progresavimą ir pasekmes (8). Verkhratsky ir kt. (8) tvirtina, kad astrocitų atrofija sąlygoja sinapsių funkcinius sutrikimus, netekimą ir pažinimo funkcijos praradimą.
10 Pirminės AL sukeliančios priežastys ir ankstyvieji pokyčiai yra mažiau ištirti, negu vėlyvosios stadijos AL, tačiau vėlyvose stadijose liga yra labai stipriai progresuojanti ir gydymas neefektyvus. Vėlesnėse AL stadijose glijos ląstelių patofiziologija yra labiau antrinis procesas, prisidedantis prie neurologinių sutrikimų eigos. Tačiau ankstyvieji mikroglijos ir astrocitų pokyčiai AL metu yra labai mažai ištirti, įvairaus dydžio Aβ1-42 oligomerų poveikis mikroglijos ir astrocitų gyvybingumui nėra
žinomas. Šių ląstelių reakcijos į Aβ tyrimai galėtų padėti išsiaiškinti ankstyvuosius AL patogenezės mechanizmus ir prisidėti prie ankstyvųjų AL stadijų žymenų atradimo savalaikei diagnostikai ir sukurti efektyvesnes gydymo strategijas (9).
Šio darbo tikslas yra nustatyti Aβ1-42 peptido įvairaus dydžio oligomerų poveikį mikroglijos ir
11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti Aβ1-42 įvairaus dydžio oligomerų poveikį mikroglijos ir astrocitų ląstelių
gyvybingumui bei ištirti šio poveikio mechanizmą. Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti mažų (1-3 nm dydžio) Aβ1-42 oligomerų, didelių (virš 5 nm dydžio) oligomerų bei fibrilių
poveikį grynos mikroglijos ir glijos kultūros gyvybingumui ir ištirti, kaip šis poveikis priklauso nuo veikimo trukmės;
2. Nustatyti, ar mažų Aβ1-42 poveikis grynos mikroglijos ir glijos kultūros gyvybingumui susijęs su
NMDA receptoriaus aktyvumu;
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Mikroglijos ląstelės
Mikroglija – tai centrinės nervų sistemos nespecifinio imuninio atsako ląstelės, kurios atlieka svarbų vaidmenį palaikant homeostazę (10). Mikroglijos ląstelės yra pirmoji gynybos linija prieš patogeninius mikroorganizmus, taip pat jos geba aptikti pavojingus neuronų aktyvumo pokyčius. Subrendusiose smegenyse jos gali kontroliuoti tarpląstelinę aplinką, pašalinti negyvas ar pažeistas ląsteles (11). Pastaruoju metu išaugo domėjimasis mikroglijos vaidmeniu fiziologinėms nervų sistemos funkcijoms. Atliktų tyrimų duomenys atskleidžia, kad mikroglijos ląstelės yra svarbios neuronų pirmtakų proliferacijai ir diferenciacijos kontrolei, taip pat sinapsinių jungčių formavimui ar jų panaikinimui. Jos taip pat prisideda formuojant neuronų grandines po gimimo (12,13).
Mikroglijos gebėjimas greitai reaguoti į smegenų mikroaplinkos pokyčius susijęs su šių ląstelių savybe keisti morfologines formas (14). Pagal morfologiją ir funkciją mikroglija yra klasifikuojama į pagrindinius tipus:
1. Ramybės būsenos (angl. „ramified“) 2. Aktyvuota
3. Amebinė/fagocituojanti
4. Distrofinė/ degeneruojanti (angl. dystrophic/degenerating)
Mikroglija randama visuose pagrindiniuose subrendusių smegenų regionuose. Ramybės būsenos mikroglijos ląstelės pasižymi smulkiu ląstelės kūnu (diametras ‒ 4‒6 µm), yra labai išsišakojusios su mažu kiekiu perinuklearinės citoplazmos ir nedideliu tankiu, heterochromatiniu branduoliu (11). In vivo vaizdinimo eksperimentai naudojant peles su EGFP (angl. enhanced green fluorescent protein, padidintos raiškos žaliai fluorescuojantis baltymas) ekspresija parodė, kad mikroglijos ląstelių išsišakojusios ataugos nuolat juda (14).
Mikroglijos ląstelės nuolat stebi nervų sistemos tarpląstelinę erdvę ir bet koks sutrikimas ar CNS homeostazės praradimas (infekcija, traumos, išemija, neurodegeneracinė liga ar neuronų veiklos pokyčiai) sukelia mikroglijos morfologinius pokyčius, keičia genų ekspresiją ir tai sąlygoja struktūros pokyčius – mikroglija aktyvuojasi (15). Aktyvuota mikroglija išskiria prouždegiminius mediatorius, pavyzdžiui, citokinus: navikų nekrozės faktorius α (TNF-α), interleukiną-1β (IL-1β) ir IL-6, chemokinus, reaktyvias deguonies formas (ROS) ir azoto oksidą (NO) (16). Taip pat reguliuoja II klasės
13 MHC molekulių ekspresiją tam, kad antigenai galėtų būti pristatyti T limfocitams per TCR receptorius (17).
Fagocituojančios morfologijos mikroglijos ląstelių atsiranda dėl CNS audinių pažeidimų, taip pat jos paplitusios besivystančiose smegenyse, geba pašalinti nefunkcionuojančius neuronus ir sinapses. Šios ląstelės yra rutulio formos, be ataugų ir turi daug fagocituojančių vakuolių bei geba judėti (18). Yra nustatyta, kad senstančiose smegenyse mikroglijos morfologinė būsena iš ramios (ramifikuotos) keičiasi į fagocituojančią ir yra lengvai aktyvuojama prouždegiminių signalų. Grynos mikroglijos kultūros stimuliacija interferonu – γ (IFN-γ) ar lipopolisacharidu (LPS) skatina mikroglijos fagocitinę transformaciją ir prouždegiminių faktorių (IL-1β, IL-6, TNF-α), kurių kiekis su amžiumi didėja gamybą. Esama įrodymų, kad komplemento baltymų dalyvavimas taip pat skatina mikroglijos aktyvaciją ir morfologinę transformaciją (19).
Distrofinės mikroglijos skaičius didėja senstant. Kiekvienoje ląstelėje distrofija gali vystytis palaipsniui: ankstyvose stadijose mikroglijos ląstelės tampa sferinės formos, pabrinksta, prasideda citoplazmos fragmentacija. Priklausomai nuo degeneracijos progresavimo mikroglijos citoplazma gali būti suskaldyta dalinai arba visa, paliekant kelis fragmentus, kurie gali sudaryti išsibarsčiusį ląstelės kontūrą. Struktūrinius pokyčius patiria ir mikroglijos ląstelės branduolys. Taip pat pasireiškia mikroglijos atrofijos forma, ataugos sutrūkinėjusios, panašu į tai, kas stebima senstančiuose neuronuose (20).
1 pav. Mikroglijos ląstelių raidos schema
Ramybės būsenos ląstelės (1), vystosi sferoidiniai pabrinkimai (2), prasideda dalinė ataugų fragmentacija (3), kuri progresuoja, bet yra išlaikomas ląstelės kontūras (4), įvyksta visiška fragmentacija – mikroglijos atrofijos forma (5). Ląstelės branduolys išlieka nepakitęs. Adaptuota pagal Streit WJ et al., 2014 (20).
14 1.2 Mikroglijos vaidmuo AL metu
Daugelyje neurodegeneracijos ir neurotoksiškumo modelių, sinapsių nykimas ir neuronų praradimas veda prie uždegiminio atsako, t.y. mikroglijos aktyvacijos, priekraujagyslinių monocitų ir sisteminių makrofagų telkimo (migracijos) (21). Daugėja įrodymų, kad AL progresavimas yra susijęs su neurouždegimu smegenyse. Mikroglijos ląstelės reaguoja į įvairius impulsus, pavyzdžiui, Aβ, jo pirmtako baltymą (angl. Amyloid Precursor Protein, APP) ir neurofibrilinius raizginius. Aβ prisijungimas prie mikroglijos paviršiaus indukuoja prouždegiminių citokinų (TNF-α, IFN-γ ir IL-1β, IL-6) sintezę, kurie skatina Tau baltymo hiperfosforilinimą ir neuronų praradimą (22,23).
Ankstyvose AL stadijose, mikroglija mažina Aβ kaupimąsi vykdydama fagocitozę. Aβ fibrilės fagocituojamos endolizosominiu keliu, o tirpūs Aβ gali būti skaidomi ekstraląstelinių proteazių (6). Tačiau nuolatinė Aβ stimuliacija sutrikdo mikroglijos funkcijas (24). Atlikti tyrimai su transgeninėmis PS1-APP AL modelio pelėmis parodė, kad AL progresavimas sukelia mikroglijos disfunkciją. Duomenys rodo, kad mikroglijos gebėjimo šalinti Aβ praradimas yra tiesiogiai susijęs su šio peptido sukeliamu uždegiminiu atsaku - TNF-α sumažina SRA ir CD36 receptorių raišką. Taip pat nustatyta, kad AL patologiją turinčiose transgeninėse PS1-APP pelėse trijų pagrindinių Aβ skaidymo fermentų – insulisino, neprilisino ir MMP-9 raiška sumažėjusi. Visa tai didina Aβ kaupimąsi (7).
Ligos eigoje, kaip ir normaliai senstančiose smegenyse, mikroglijos ląstelės iš neuroprotekcinio pereina į klasikinės aktyvacijos fenotipą, t. y. gamina citokinus (IFN-γ, TNF-α ir IL-1β), kurie leidžia reaguoti į mikroglijos ekspresuojamus receptorius, kurie atpažįsta su patogenu susijusias struktūras (angl. pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Dėl jų aktyvavimo, mikroglijos ląstelės išskiria prouždegiminius citokinus (TNF-α, IL-6, IL-1β), NO sintazes, NADPH oksidazes, reaktyvias deguonies ir azoto formas (25).
1.3 Astrocitai
Astrocitai sudaro daugiau nei 25 proc. viso smegenų tūrio, tai pačios didžiausios ir labiausiai paplitusios iš visų glijos ląstelių centrinėje nervų sistemoje (26). Būdingi morfologiniai bruožai: žvaigždinė forma ir nevienodo ilgio ataugos (27). Susipynę savo ataugomis, astrocitai suteikia atraminę struktūrą neuronų tinklų palaikymui. Šios ląstelės yra svarbios išlaikant stiprias jungtis, kurios formuoja neurovaskulinį vienetą ir kraujo‒smegenų barjerą, sintetina molekules, pavyzdžiui, prostaglandinus, NO ir arachidono rūgštį, kurios padidina arba sumažina CNS kraujagyslių skersmenį taip reguliuodamos
15 smegenų kraujotaką, susijusią su neuronų aktyvumu (28). Astrocitai taip pat yra reikalingi užtikrinant veiksmingą nervinio signalo perdavimą, yra svarbūs sinapsių plastiškumo reguliavimui (29).
Kita svarbi astrocitų funkcija – homeostazės palaikymas smegenyse. Neuronai yra labai jautrūs mikroaplinkos pokyčiams, todėl smegenų funkcijos palaikymui yra reikalinga griežta tarpląstelinėje aplinkoje esančių medžiagų, t.y. jonų, metabolitų ir neuroaktyvių molekulių koncentracijos kontrolė (30). Pavyzdžiui, tarpląstelinei jonų homeostazei yra ypač svarbūs K+ jonai, kurie yra sukaupiami
neuronų aktyvumo metu dėl pakartotinio neuronų K+ kanalų atsidarymo ir vėlesnio K+ ištekėjimo, o
tarpląstelinio K+ koncentracijos padidėjimas depoliarizuoja neuronų membranas, taip pakeisdamas jų
aktyvumą ir pažeisdamas CNS (31). Astrocitai geba pašalinti neląstelinį K+ jonų perteklių dviem
mechanizmais. Pirmas, koncentracijos palaikymas aplinkoje yra pasyvus mechanizmas, kai naudojant į vidų K+ jonus pernešančius kanalus, astrocitai įsisavina K+ perteklių ir atpalaiduoja ten, kur jų mažiau.
Antra, neląstelinis K+ gali būti pašalinamas aktyvuojant Na+/K+‒ATP-azės siurblius, taip padidinant
ląstelinio K+ ir vandens koncentraciją. Glijos ląstelės, susijungusios citoplazmomis į tinklinę struktūrą
ir akvaporinų kanalai, esantys astrocituose taip pat atlieka svarbų vaidmenį palaikant vandens homeostazę smegenyse (32).
1.4 Astrocitų vaidmuo AL metu
Ankstyvose neurodegeneracinių susirgimų stadijose yra paveikiami astrocitai ir tai lemia ligos progresavimą ir pasekmes (8). Atlikti eksperimentai su transgeninėmis pelėmis (3xTg-AD), turinčiomis mutacijas amiloido pirmtako baltymo (APP) presenilino 1PS1M146V ir TauP301L baltymų genuose parodė,
kad CA1 (lot. Cornu Ammonis) ir dantytojo vingio zonose nuo 6 mėnesių amžiaus astrocituose pastebimi atrofiniai morfologiniai pokyčiai, t.y. sumažėja ląstelės kūno dydis, ataugų skaičius ir glijos fibrilinių rūgščiųjų baltymų (angl. glial fibrillary acidic protein, GFAP) dažymosi intensyvumas (33). Naujausi tyrimai, atliekant astrocitų 3D GFAP rekonstrukciją, parodė reikšmingą GFAP paviršiaus ploto ir tūrio sumažėjimą pacientų, sergančių sporadine Alzheimerio liga (angl. sporadic Alzheimer's disease, sAD) ir šeimine (angl. familial Alzheimer disease, fAD) astrocituose, lyginant su sveikais astrocitais (34).
Viena iš pagrindinių astrocitų funkcijų yra smegenų kraujotakos ir normalios hiperemijos valdymas, tad atrofiniai astrocitų pažeidimai galimai prisideda prie nervų‒kraujagyslių sąveikos disfunkcijos (8). Aβ sankaupos dažnai išsidėsto greta smegenų kapiliarų, tokiu būdu sutrikdydamos mikrocirkuliaciją ir Aβ pašalinimą (35).
16 Astrocitai yra svarbūs sinaptogenezėje ir sinapsių priežiūroje, todėl jų funkcijų sutrikimai gali turėti reikšmės neuronų funkcijai ir įtakos sinapsinių praradimui bei neurodegeneraciniams procesams (33). Verkhratsky ir kt. (8) tvirtina, kad astrocitų atrofija sąlygoja sinapsių funkcinius sutrikimus, netekimą ir pažinimo funkcijos praradimą.
AL ligos progresavimas yra susijęs su astrocitų hipertrofija. Žmogaus audinių ir eksperimentiniuose AL gyvūnų modelių autopsijų mėginiuose rasti reaktyvūs astrocitai, išsidėstę aplink senatvines plokšteles. Tokie astrocitai pasižymi morfologine hipertrofija ir padidėjusia GFAP ir S100B ekspresija (36). Tai galimai inicijuoja signalai iš pažeistų neuronų ar glijos ląstelių (8). Taip pat įrodyta, kad tarpląstelinės Aβ sankaupos sukelia astrogliolizę in vitro ir turi įtakos astrocitų fiziologijai. Nustatyta, kad astrocitų kultūroje Aβ indukuoja spontaninius Ca2+ signalus, kurie prisideda prie astrocitų
sukeliamo neurotoksiškumo (37).
Pakitę astrocitai siejami su neurouždegimu ir amiloidogeneze. Aktyvuotos glijos ląstelės išskiria neurotoksines molekules, pavyzdžiui, ROS, NO ir prouždegiminius chemokinus ir citokinus ‒ IL-1β bei IFN-γ. Pernelyg didelis šių mediatorių kiekis gali sukelti neuronų pažeidimus, siejamus su Alzheimerio ligos mechanizmais (38). Zhao J. su bendraautoriais (39) nustatė, kad veikiant pirminę astrocitų kultūrą citokinų deriniais, po 48 val. ir 96 val. BACE 1 (vienas pagrindinių fermentų, atsakingų už Aβ gamybą) kiekis padidėjo vidutiniškai ir stipriai, atitinkamai, lyginant su kontrole. Tai rodo, kad AL metu gali būti sukeliama BACE 1 ekspresija ir padidėti amiloidogeninio APP gamyba astrocituose.
1.5 NMDA receptorius glijos ląstelėse
Mikroglijos ląstelės dėl savo mieloidinės prigimties ekspresuoja pagrindinius imuninio atsako receptorius, kurie dalyvauja imuninėse reakcijose, įskaitant įvairių citokinų apdorojimą ir atpalaidavimą (15). Tačiau, priešingai negu makrofagai, mikroglijos ląstelės ekspresuoja neurotransmiterių ir neuromoduliatorių receptorius (15).
Ypatingai svarbus ląstelių pažeidimo požiūriu yra N-metil D-aspartato receptorius (NMDA). Ilgą laiką buvo manoma, kad šis receptorius yra tik neuronuose, tačiau prieš keletą metų jis nustatytas mikroglijoje, o dar vėliau ir astrocituose (40). Yra žinoma, kad padidėjęs glutamato kiekis užląstelinėje aplinkoje yra toksiškas neuronams, sukelia ląstelių žūtį apoptozės ar nekrozės būdu (40). Nustatyta, kad Aβ oligomerai aktyvuoja NMDA receptorius ir taip sutrikdo Ca2+ homeostazę. NMDA receptorius taip
pat susijęs su kitais oligomerų sukeltais neuronų patologiniais procesais, pavyzdžiui, tau baltymo hiperfosforilinimu, sinapsių nykimu ir greitu organelių transportavimo aksonų pagalba sutrikdymu (41).
17 Kaindl ir kitų mokslininkų eksperimentai (42) patvirtino, kad NMDA receptoriai yra ekspresuojami bręstančioje ir subrendusioje žiurkių ir žmogaus centrinės nervų sistemos mikroglijos ląstelėse, tačiau raiška yra mažesnė lyginant su NMDA receptorių kiekiu žiurkių smegenų žievės neuronų kultūroje. Siekiant ištirti NMDA receptorių raišką mikroglijos ląstelėse, pirmiausia buvo orientuojamasi į pagrindinį NMDA receptorių subvienetą NR1. NR1 iRNR buvo aptikta žiurkių smegenų žievės mikroglijos ląstelių kultūroje taikant realaus laiko PGR. iRNR kiekis buvo mažesnis negu žiurkių smegenų žievės neuronų kultūroje. Gautus rezultatus patvirtino NR1 subvieneto baltymų koncentracijos nustatymas Western bloto metodu – NR1 juostos intensyvumas buvo apie 42 proc. nuo matomo neuronuose (42).
Astrocitų ekspresuojami NMDA receptoriai funkciškai ir struktūriškai skiriasi nuo neuronų receptorių (40). Jie pasižymi silpnesniu jautrumu kanalų blokavimui Mg2+ net esant neigiamam ramybės
būsenos membranos potencialui, ir mažesniu pralaidumu Ca2+ (43). Astrocitų NMDA receptoriai taip
pat gali būti susiję su neurouždegiminiu procesu. Astrogliolizė pasižymi ląstelių proliferacija, susijusią su glutamato išskyrimu, citokinų gamyba ir ROS susidarymu (44).
1.6 Aβ formų susidarymas ir funkcijos
Amiloido-β plokštelės – tai ekstraląstelinės įvairių heterogeniškų medžiagų sankaupos, kurių pagrindiniai komponentai yra 40-42 aminorūgščių peptidai, vadinami amiloido-β peptidais, gaunami proteolitinio skilimo metu iš Aβ pirmtako baltymo APP (45).
APP priklauso konservatyvių I tipo transmembraninių baltymų šeimai, kurią sudaro: APL-1 randamas C.elegans, APPL esantis Drosophila bei APP, APLP1 ir APLP2 randamas žinduoliuose. Šie baltymai turi keletą konservatyvių motyvų, įskaitant E1 ir E2 domenų ekstraląstelines sekas ir viduląstelinį domeną, kuris pasižymi didžiausiu sekos tapatumu (46). APP genas, kurį sudaro 18 egzonų ir apima virš 170 kbp yra 21 chromosomoje, dėl alternatyvaus splaisingo, jo izoformos svyruoja nuo 365 iki 770 aminorūgščių (47). Pagrindinės izoformos yra 695, 751 ir 770 aminorūgščių (APP695, APP751 ir APP750 atitinkamai). APP751 ir APP770 turi Kunitz proteazės inhibitoriaus domeną (KPI) ir yra ekspresuojamos daugelyje audinių. Trumpiausia iš pagrindinių izoformų APP695 dominuoja centrinėje nervų sistemoje (47).
APP baltymas pasižymi šiomis funkcijomis: palengvina ląstelių sukibimą, veikia kaip ląstelių paviršiaus receptorius, reguliuoja sinapsių išsidėstymą ir ląstelių dalijimąsi (47).
18 Yra skiriami du APP proteolizės keliai: α-sekretazės (neamiloidogeninis) ir β-sekretazės (amiloidogeninis) (2 pav.) (48).
Fiziologinėmis sąlygomis vyksta neamiloidogeninė APP proteolizė veikiant α-sekretazei, ADAM10 (angl. a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10), kuri kerpa tarp 687 ir 688 aminorūgšties sudarydama tirpų N-galo APP domeną sAPPα. Tai neleidžia susidaryti Aβ, nes α sritis lieka tarp Aβ domeno (49). Manoma, kad sAPPα pasižymi neurotropinėmis ir neuroprotekcinėmis savybėmis, aktyvuoja išgyvenamumo ir streso signalinius kelius ir atlieka svarbų vaidmenį neuronų plastiškumui ir ankstyvam smegenų vystymuisi. Membranoje lieka C-galo fragmentas (αCTF) (50,51).
Aβ susidarymo pirmasis žingsnis ‒ APP skėlimas tarp 671 ir 672 aminorūgšties veikiant β-sekretazei (BACE 1) (52). Tai transmembraninis baltymas, klasifikuojamas kaip aspartilproteazė, kuri svarbi proteolitinei veiklai (53). Tokiu būdu suformuojamas sAPPβ ir su membrana susijęs C-galo fragmentas (βCTF) (52).
Abu C-galo fragmentai transmembraninėje srityje yra skaidomi veikiant γ-sekretazei, atsipalaiduoja viduląstelinis domenas AICD, kuris toliau modifikuojamas. AICD gali reguliuoti genų transkripciją, įsiterpdamas į reguliacinius regionus, taip pat reguliuoti Aβ gamybos lygį (54). P3 produktas greitai skyla ir jo funkcija yra neaiški. Du pagrindiniai βCTF skilimo produktai – Aβ1-40 ir
Aβ1-42 peptidai, turintys skirtingo ilgio hidrofobinį C-galo domeną, kurie skiriasi tik dvejomis
aminorūgščių liekanomis, yra svarbūs AL patogenezėje (52).
2 pav. Neamiloidogeninio (A) ir amiloidogeninio (B) kelio APP metabolizmo schema
19 Sveikose smegenyse beveik 80 proc. randamo Aβ yra Aβ1-40, tuo tarpu ligos atveju daugiau
produkuojama Aβ1-42, kuris yra linkęs agreguotis ir kauptis amiloido plokštelėse (55).
Amiloido kaskados hipotezė teigia, kad APP ir/ar Aβ homeostazės pokyčiai skatina Aβ agregaciją ir sankaupų susidarymą, o tai inicijuoja patologinius sutrikimus (56). Agregacija vyksta spontaniškai ir prasideda nuo amiloidogeninės proteolizės metu susidariusių monomerų. Monomerai gali kauptis, suformuodami protofibriles ir galiausiai subrendusias fibriles (57). Oligomerų formavimasis yra tarpinis etapas, kuris priklauso nuo Aβ monomerų ir fibrilių koncentracijos. Iš pradžių vyksta pirminė nukleacija, o pasiekus tam tikrą fibrilių koncentraciją (10 nM) yra vykdoma antrinė nukleacija ir oligomerai formuojasi ant fibrilių paviršiaus (58). Nustatyta, kad Aβ peptidai gali savarankiškai jungtis ir formuoti stabilius oligomerinius agregatus. Šie oligomerai gali veikti kaip nukleacijos centrai smegenyse ir inicijuoti didesnių agregatų formavimąsi (59). Metalo, pavyzdžiui, Cu2+ sujungimas su Aβ stabilizuoja oligomerinę sandarą, didina agregacijos lygį ir ROS susidarymą
(60).
Literatūroje aprašomos svarbios Aβ atliekamos fiziologinės funkcijos centrinėje nervų sistemoje:
Neurogenezė – įrodyta, kad Aβ1-40 skatina neuroninių kamieninių ląstelių proliferaciją ir
neurogenezę, o Aβ1-42 – diferenciaciją į glijos ląsteles (mikrogliją ir astrocitus) (61). Taip pat
nustatyta, kad neurogenezė, inicijuota Aβ, yra susijusi su autofagija. Nedideli kiekiai tirpaus Aβ didina autofagiją neuroninių kamieninių ląstelių diferenciacijos procese nuo ROS nepriklausomu būdu (62).
Apsauginis poveikis neuronams ‒ teigiamu Aβ poveikiu yra laikoma sąveika su α7 nikotino cholinerginiais receptoriais (α7nACh) neuronuose. Fiziologinėmis sąlygomis, esant mažos koncentracijos (pM) Aβ monomerams ir tirpioms formoms, pasireiškia apsauginis poveikis neuronams per Aβ monomerų prisijungimą prie α7nACh. Tai inicijuoja vidinius apsauginius signalinius kelius, pavyzdžiui, užląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (angl. exctracellular signal-regulated kinase, ERK), mitogeno-aktyvinto proteino kinazės (MAPK) ir fosfatidilserino inositol-3- kinazės (PI-3-K) (63).
Metalų izoliavimas ir antioksidacinis aktyvumas ‒ Zou su kolegomis (64) parodė, kad Aβ1-40
apsaugo neuronus nuo pereinamųjų metalų (vario, cinko, geležies) sukeliamo oksidacinio pažeidimo. Taip pat mažos koncentracijos Aβ1-42 monomerų pasižymi antioksidaciniu ir
20 1.7 Alzheimerio liga ir Aβ
Baltymai, kurie normaliomis sąlygomis yra tirpūs, o sutrikus jų susilankstymui (angl. protein misfolding) gali formuoti agregatus su specifinėmis β-klostėmis, vadinami amiloidu, o jų sankaupos, randamos ląstelės išorėje ir viduje – amiloidoze. Tokios sankaupos gali atsirasti daugelyje organų (sisteminė amiloidozė) arba būti lokalizuotos tam tikrame audinyje ar organe. Amiloido depozitai sukelia audinių architektūros pakitimus, pažeidžia jų funkcijas. Šie ląsteliniai ir užląsteliniai netirpūs agregatai (skaidulos ir plokštelės) yra daugelio neurodegeneracinių ligų, tokių kaip Alzheimerio, Huntingtono, Parkinsono ir priono, požymiai (66).
Senėjimas ‒ vienas svarbiausių neurodegeneracinių ligų, susijusių su amiloidu, rizikos veiksnių. Daugelis dabar gyvena ilgiau ir sveikiau, todėl pasaulio gyventojų populiacija turi didesnę vyresnio amžiaus žmonių dalį. 2015 metų duomenimis, pasaulyje yra 46,8 mln. žmonių, gyvenančių su demencija (67). Alzheimerio liga yra labiausiai paplitusi demencijos forma, kuriai būdinga laipsniškas atminties praradimas ir pažinimo funkcijos blogėjimas bei smegenų autopsijos metu randami pakitimai: neuritinės plokštelės, kurių sudėtyje yra Aβ ir neurofibriliniai raizginiai (angl. neurofibrillary tangles, NFT), turintys hiperfosforilintų Tau baltymų (68).
Alzheimerio ligos priežastis nėra nulemta vieno ar dviejų faktorių, tad etiologija nėra iki galo suprasta ir ištirta. Manoma, kad tiek aplinkos, tiek genetiniai veiksniai prisideda prie ligos patogenezės ir progresavimo (69). Skiriami pagrindiniai rizikos veiksniai:
Amžius. Tai vienas geriausiai žinomų ir pirminių Alzheimerio ligos rizikos veiksnių.
Šeiminė anamnezė.
Smegenų kraujagyslių pažeidimai. Smegenų kraujotakos pokyčiai, pavyzdžiui, insultas sukelia tiesioginius smegenų regionų pažeidimus, kurie yra svarbūs atminčiai (70).
Galvos smegenų trauma. Retrospektyviniai tyrimai parodė, kad asmenims, turėjusiems galvos smegenų traumą, buvo didesnė demensijos rizika (69).
Genetiniai rizikos veiksniai. Kliniškai Alzheimerio liga yra skirstoma į ankstyvos pradžios (pacientai, kurių amžius iki 65 metų) ir vėlyvos pradžios (pacientai vyresni negu 65 metai). Abi šios formos turi genetinių veiksnių (71). Ankstyvos pradžios AL yra laikoma autosominiu dominantiniu būdu paveldima šeimine ligos forma (angl. familial Alzheimer‘s disease, fAD), kuri susijusi su trimis genais: APP, presenilinu 1 (PSEN1) ir presenilinu 2 (PSEN2) (71). Mutacijos šiuose genuose keičia Aβ gamybą, Aβ1-40 ir Aβ1-42 santykį, skatina fibrilių formavimąsi (72).
Vėlyvos pradžios, dar vadinamos sporadine AL (angl. sporadic, sAD), svarbiausias genetinis rizikos veiksnys yra apoE alelių variacijos (73). Nustatyta, kad dviejų kopijų apoE ε4 alelių paveldėjimas 10 kartų padidina AL riziką, lyginant su labiausiai paplitusiu genotipu apoE ε3/ε3. Esama įrodymų, kad
21 apoE ε4 palengvina amiloido fibrilių nusėdimą, todėl apoE ε4/ε4 pacientų smegenyse randamų senatvinių plokštelių tankis yra didesnis (74). Ilgalaikiai epidemiologiniai tyrimai nustatė, kad hipercholesterolemija, 2 tipo cukrinis diabetas, hiperhomocisteinemija, vitamino D trūkumas yra susiję su sporadine AL ir didina jos išsivystymo riziką (75).
Ligos patogenezės mechanizmų tyrimai remiasi Aβ hipoteze, kuri teigia, kad per didelė Aβ gamyba, agregacija ir nusėdimas smegenyse sudarant neuritines plokšteles yra pagrindinė AL priežastis (56). Aβ pažeidžia plazminės membranos vientisumą tiesiogiai įsiterpdamas į fosfolipidų bisluoksnį. Tai sukelia ląstelės jonų homeostazės pokyčius (76). Žinoma, kad Aβ toksiškumas priklauso nuo oligomerų dydžio. Atlikus Aβ1-42 tyrimus su skirtingomis in vitro oligomerizacijos sąlygomis ir įvertinus
susidariusių peptidų agregatų dydžius atominės jėgos mikroskopu (AFM) nustatyta, kad submikromolinės koncentracijos maži tirpūs Aβ1-42, kurių vidutinis dalelių z‒aukštis 1‒3 nm jungėsi
prie fosfolipidinių pūslelių, sukėlė neuronų pažeidimus ir nekrozę, o didesni agregatai ‒ virš 4–5 nm z‒ aukščio nebuvo surišti pūslelių ir toksiški neuronams (76).
Aβ sąlygojami pažeidimai prisideda prie kitų toksiškumo mechanizmų. Pavyzdžiui, Aβ oligomerai sinapsių plyšyje jungiasi prie esminių sinapsinių receptorių – glutamato, NMDA, AMPA, per didelė receptorių stimuliacija sutrikdo oksidacijos-redukcijos mechanizmus ir Ca2+ reguliaciją. Tai
sukelia sinapsių disfunkciją ir žalą neuronams (77). Aβ oligomerai gali dideliu giminingumu jungtis su α7 nikotininiais receptoriais, kurie svarbūs Aβ patekimui ir viduląsteliniam kaupimui neuronuose (78). Nustatyta, kad Aβ tiesioginiu ar netiesioginiu būdu pažeidžia mitochondrijų baltymus, o tai sukelia mitochondrijų fragmentaciją, sutrikdo bioenergetiką ir prisideda prie sinapsių netekimo (79). Mitochondrijų funkcijų pažeidimai priklauso nuo regiono ‒ didesnė žala nustatyta hipokampo ir žievės srityse ‒ regionuose, susijusiose su mokymusi ir atmintimi (80). Sinapsėse esančios mitochondrijos yra labiau pažeidžiamos negu nesinapsinės (79,80). In vitro tyrimai rodo, kad didelės Aβ koncentracijos (µM), tiesiogiai yra toksiškos neuronams, sukelia jų žūtį, o mažesnės koncentracijos (nM) aktyvuoja glijos ląsteles, sukelia uždegiminį atsaką ir neuronai žūva dėl oksidantų poveikio (81).
Apibendrinant literatūros duomenis galima teigti, kad Aβ turi įtakos mikroglijos ir astrocitų fiziologinėms funkcijoms, o šių ląstelių veiklos sutrikdymas pažeidžia neuronus, todėl yra svarbu ištirti poveikį glijos ląstelėms, nes tai galimai yra pradiniai pokyčiai, kurie vėliau turi įtakos neuronų gyvybingumui ir sinapsių nykimui. Taip pat, nors Aβ polinkis oligomerizuotis yra gerai žinomas, tačiau įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-42 poveikis glijos ląstelėms (mikroglijai ir astrocitams) nėra
22
2. TYRIMO METODIKA
Darbo objektas: Pirminė glijos ląstelių kultūra ruošiama iš 5-7 dienų amžiaus Wistar veislės žiurkių smegenų didžiųjų pusrutulių.
2.1 Pirminės glijos ląstelių kultūros ruošimas
Pirmiausia, buvo paruošiami ląstelių auginimo flakonėliai – jie padengiami 0,01 proc. poli-L-lizino tirpalo ir sterilaus vandens mišiniu (1:10). Paruošti flakonėliai laikomi 30 minučių.
Pagal glijos ląstelių išskyrimo iš smegenų didžiųjų pusrutulių protokolą išskiriama pirminė glijos ląstelių kultūra. Ląstelių kultūros paruošimui buvo naudojami 5−7 dienų amžiaus Wistar žiurkiukai. Gyvūnai užmigdomi ir vėliau dekapituojami (Valstybinės Veterinarijos tarnybos leidimas atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr. 0217 ir Nr. 0228). Galvos dedamos į 60 proc. spiritą. Ląstelių išskyrimas atliekamas sterilioje aplinkoje laminarinio srauto spintoje Herasafe KS12 (Vokietija) naudojant sterilius instrumentus ir terpes.
Išpreparuoti didieji pusrutuliai perkeliami į Petri lėkštelę su fosfato druskos buferiniu tirpalu (PBS) (4°C), papildytu penicilinu-streptomicinu (10000 IU/ml – 10000 µg/ml) ir 13 mM gliukozės. Pincetu atsargiai pašalinamos kraujagyslės ir didieji pusrutuliai perkeliami į naują Petri lėkštelę su švariu PBS (4°C), kurioje skalpeliu mechaniškai padalijami į mažesnius gabalėlius. Naudojant sterilią 5 ml pipetę didžiųjų pusrutulių gabalėliai perkeliami į mėgintuvėlį su pašildytu iki 37°C temperatūros Verseno tirpalu (5 ml) ir inkubuojama 5 min. (37°C temperatūroje), kas minutę švelniai pamaišant tirpalą (vyksta cheminis skaidymas). Po inkubacijos mišinys yra švelniai trituruojamas naudojant sterilias skirtingo skersmens Pastero pipetes. Trituratas perpilamas į sterilų 50 ml tūrio mėgintuvėlį su 5 ml ląstelių kultūrų augimo terpe DMEM + glutamax (Dulbecco's Modified Eagle Medium), kuri papildyta 5 proc. veršelio serumu ir penicilinu-streptomicinu (10000 IU/ml – 10000 µg/ml). Gautas tirpalas centrifuguojamas 290 x g, 5 min (centrifuga Eppendorf 5810R, Kanada), kambario temperatūroje. Nupilamas supernatantas. Užpilama šviežia glijos auginimo terpė (5 ml). Filtruojama pro 100 µm porų dydžio sietelį.
Po 30 min. inkubacijos iš flakonėlių nusiurbiamas 0,01 proc. poli-L-lizino tirpalo ir sterilaus vandens mišinys ir supilama paruošta ląstelių suspensija. Papildoma šviežia glijos auginimo terpe iki 5ml/flakonėliui.
23 Ląstelės auginamos 10-12 parų inkubatoriuje (Heraeus, Vokietija) normoksijos sąlygomis (37°C temperatūroje, 95 proc. ‒ oro, 5 proc. ‒ CO2, oro drėgmė ‒ 95 proc.), kas 2-4 dienas pakeičiant
50 proc. terpės šviežia glijos auginimo terpe.
2.2 Glijos kultūros ląstelių ir grynos mikroglijos sėjimas eksperimentui
Ląstelių auginimui paruošiamos 96 šulinėlių lėkštelės ‒ jos padengiamos 0,01 proc. poli-L-lizino tirpalo ir sterilaus vandens mišiniu (1:10). Lėkštelės laikomos 30 minučių.
Glijos kultūrai gauti yra naudojamas 0,25 proc. tripsinas su EDTA. Ląstelės nupurtomos ir nusiurbiama terpė. Į flakonėlį pilama 3 ml 0,25 proc. tripsino su EDTA ir inkubuojama 5 min. 37°C, 5 proc. CO2 inkubatoriuje. Tada užpilama 3 ml ląstelių kultūrų augimo terpės DMEM + glutamax
(Dulbecco's Modified Eagle Medium), kuri papildyta 5 proc. veršelio serumu ir penicilinu-streptomicinu (10000 IU/ml – 10000 µg/ml) ir viskas kartu nusiurbiama centrifugavimui. Centrifuguojama 290 x g, 5 min (centrifuga „Eppendorf 5810R“, Kanada), kambario temperatūroje. Nuo ląstelių suspensijos, kuri buvo veikta 0,25 proc. tripsinu paliekamas kuo mažesnis kiekis terpės ir jos sumaišomos su tripsinu neveikta ląstelių suspensija.
Grynos mikroglijos kultūrai gauti ląstelės yra nupurtomos nuo flakonėlio dugno.
2.3 Ląstelių tankio ir gyvybingumo nustatymas Tripano mėliu
Klasikinis, dažniausiai naudojamas būdas ląstelių tankiui ir gyvybingumui nustatyti yra tripano mėlio testas. Metodas pagrįstas intaktinių ląstelių membranos gebėjimu nepraleisti tripano mėlio į ląstelę.
Jei ląstelės membrana yra pažeista, padidėja jos pralaidumas įvairioms molekulėms ir patekus tripano mėlio dažams, žuvusi ląstelė nusidažo mėlyna spalva.
Tiksliam ląstelių tankiui ir gyvybingumui įvertinti į ependorfo mėgintuvėlį sumaišoma 20 μl ląstelių suspensijos ir 20 μl tripano mėlio dažo. Ląstelių gyvybingumas vertinamas naudojant hemocitometro (MARIENFELD) kamerą. Ant hemocitometro kameros prispaudžiamas dengiamasis stiklelis, kamera automatine pipete su plonu antgaliu užpildoma 20 μl ląstelių ir tripano mėlio suspensija, antgalį priliečiant prie pat stiklelio krašto. Skaičiuojamos gyvos ląstelės, kurios nebuvo nusidažiusios
24 mėlynai keturiuose kameros kvadratuose. Gautas gyvų ląstelių skaičius sumuojamas, dauginamas iš 4 (ląstelių skaičius skaičiuojamas 16-oje kvadratų) bei dauginama iš 2 (skiedimų skaičius) ir iš 5000, taip įvertinama vieno kvadrato tūrio dalis mililitre. Gautas skaičius yra gyvų ląstelių kiekis viename mililitre. Po to apskaičiuojama visoje suspensijoje esančių gyvų ląstelių skaičius: gautas ląstelių skaičius mililitre buvo dauginamas iš turimo ląstelių suspensijos tūrio. Ląstelės sėjamos po 200 µl suspensijos į anksčiau paruoštas ląstelių auginimo 96 šulinėlių lėkšteles, įvertinant ląstelių tankį taip, kad 3383 ląstelės/1 mm2.
Iki eksperimento ląstelės auginamos vieną parą inkubatoriuje (Heraeus, Vokietija) normoksijos sąlygomis (37 °C temperatūroje, 95 proc. – oro, 5 proc. – CO2, oro drėgmė – 95 proc).
2.4 Aβ1-42 peptidų paruošimas
Sintetiniai Aβ1-42 peptidai buvo gauti iš American Peptide (JAV) ir Bachem (Šveicarija).
Junginiai su šiais peptidais buvo paruošiami, vadovaujantis žemiau išvardintais protokolais. 2.4.1 Aβ1-42 mažų peptido oligomerų paruošimas
1 mg sintetinių Aβ1-42 peptidų buvo ištirpinta 400 μl kambario temperatūros
heksafluorizopropanolyje (HFIP). Į silikonizuotą mėgintuvėlį buvo įpilta 900 μl bidistiliuoto vandens bei 100 μl pagaminto peptidų ir HFIP tirpalo. Paruoštas mišinys inkubuojamas 20 min. kambario temperatūroje ir 15 min. centrifuguojamas 12000 apsisukimų/min. greičiu, naudojant „Eppendorf 5414“ centrifugą (Vokietija). Gautas supernatantas perpilamas į kitą silikonizuotą mėgintuvėlį ir HFIP išgarinamas traukos spintoje, kol tirpalo tūris sumažėja 100 μl. Po to Aβ1-42 tirpalas 24 val. inkubuojamas
vandens vonioje, kambario temperatūroje švelniai judinant mėgintuvėlį. Gaunami oligomerai, kurių dydis vidutiniškai 1-3 nm. Paruošti oligomerų tirpalai laikomi -20 °C temperatūroje.
2.4.2 Aβ1-42 didelių peptido oligomerų paruošimas
1 mg sintetinių Aβ1-42 peptidų buvo ištirpinta 400 μl kambario temperatūros HFIP. Į
nesilikonizuotą mėgintuvėlį buvo įpilta 900 μl bidistiliuoto vandens ir 100 μl pagaminto peptidų ir HFIP tirpalo. Paruoštas mišinys inkubuojamas 20 min. kambario temperatūroje ir 15 min. centrifuguojamas 12000 apsisukimų/min. greičiu naudojant „Eppendorf 5414“ centrifugą (Vokietija). Gautas supernatantas perpilamas į kitą nesilikonizuotą mėgintuvėlį ir švelniai pučiant azoto srovę HFIP išgarinamas. Po to Aβ1-42 tirpalas inkubuojamas 24 val. kambario temperatūroje vandens vonioje,
švelniai judinant mėgintuvėlį. Gaunami oligomerai, kurių dydis vidutiniškai 4-10 nm. Paruošti oligomerų tirpalai laikomi -20 °C temperatūroje.
25 2.4.3 Aβ1-42 fibrilių paruošimas
1 mg sintetinio Aβ1-42 buvo ištirpinta su 400 μl HFIP kambario temperatūroje. Į paprastą
mėgintuvėlį (nesilikonizuotą) įpilama 900 μl bidistiliuoto vandens tirpalo ir 100 μl paruošto HFIP ir peptidų tirpalo, 20 min. inkubuojama kambario temperatūroje. Po to tirpalas centrifuguojamas 15 min. 12000 aps./min. greičiu, naudojant centrifugą „Eppendorf 5414“ (Vokietija). Po centrifugavimo supernatantas perpilamas į kitą nesilikonizuotą mėgintuvėlį. Po HFIP išgarinimo Aβ1-42 tirpalas
inkubuojamas vandens vonioje 7 paras 37°C temperatūroje. Gautos Aβ1-42 fibrilės išpilstomos ir
užšaldomos -20°C temperatūroje. 2.4.4 HFIP tirpalo paruošimas
Į mėgintuvėlį buvo įpilta 100 μl HFIP ir 900 μl bidistiliuoto vandens. Paruoštas HFIP mišinys inkubuojamas 20 min. kambario temperatūroje ir 15 min. centrifuguojamas 12000 aps./min. greičiu, naudojant „Eppendorf 5414“ (Vokietija) centrifugą. Gautas supernatantas perpilamas į kitą mėgintuvėlį ir HFIP išgarinamas traukos spintoje, kol tirpalo tūris sumažėja 100 μl. Paruoštas HFIP tirpalas buvo užšaldomas -20 °C temperatūroje.
2.5 Glijos ląstelių identifikavimas pagal specifinius žymenis
GFAP ekspresuojantys astrocitai buvo nustatomi atliekant imunocitocheminį dažymą. Pirma, atliekamas kultūros fiksavimas 4 proc. paraformaldehidu PBS tirpale (20 min.). Ląstelės permeabilizuojamos su 0,3 proc. tritonu X-100 PBS tirpale (5 min.), blokuojama naudojant 10 proc. jaučio serumo albuminą (BSA) (1 val.). Po blokavimo ląstelės inkubuojamos su pirminiu pelės monokloniniu antikūnu GFAP 1 valandą. Po to naudojamas antrinis antikūnas prieš pelės IgG žymėtas AlexaFluor®555, kuris matomas per TxRed filtrų rinkinį. Kartu su antriniu antikūnu dedami: branduolio dažas Hoechst 33342 (15 μg/ml; matomas per DAPI filtrų rinkinį) ir mikroglijos žymuo izolektinas B4
(20 ng/ml). Šis dažas rišasi prie mikroglijos ląstelėms specifinio RET (angl. receptor tyrosine kinaze) receptoriaus ir švyti žaliai naudojant FITC filtrų rinkinį. Vaizdinta fluorescenciniu mikroskopu OLYMPUS IX71S1F-3 (Japonija).
26 2.6 Glijos ląstelių gyvybingumo įvertinimas
Mikroglijos ir astrocitų gyvybingumas buvo vertinamas fluorescencinės mikroskopijos metodu, naudojant mikroskopą OLYMPUS IX71S1F-3 (Japonija) ir fluorescuojančių dažų: propidžio jodido (5 μg/ml; matomas per TxRed filtrų rinkinį ir Hoechst 33342 (15 μg/ml) kombinaciją (inkubuojant 5-7 min. 37 °C temperatūroje). Hoechst 33342 specifiškai jungiasi su branduolio DNR, todėl visų ląstelių branduoliai švyti mėlyna spalva, o propidžio jodidas praeina tik pro vientisumą praradusias membranas, todėl branduoliai švytėję raudonai buvo vertinami kaip nekroziniai. Kad būtų galima atskirti žuvusias mikroglijos ląsteles nuo žuvusių astrocitų, buvo naudojamas fluorescuojantis mikroglijos žymuo ‒ izolektinas B4 (20 ng/ml), inkubuojant su juo 15 min. 37 °C temperatūroje.
Mikroglijos ir astrocitų ląstelės buvo skaičiuojamos mažiausiai 3 mikroskopinio vaizdo laukuose (3 šulinėliai vieno eksperimento metu) ir nekrozinių branduolių skaičius išreiškiamas procentais nuo viso ląstelių skaičiaus vaizdo lauke.
2.7 Uždegiminio citokino IL-6 matavimas
Uždegiminio citokino interleukino-6 koncentracijai nustatyti naudotas Rat IL-6 ELISA Kit (Thermo Scientific, JAV). Bandinių paruošimas ir matavimai atlikti remiantis gamintojo protokolu. Reakcijos produkto kiekis buvo įvertintas pagal optinį tankį (matuota absorbcija prie 450 nm ir 550 nm bangos ilgių) (Thermo Scientific Multiskan GO, Suomija). IL-6 koncentracijos pavyzdžiuose apskaičiuotos iš kalibracinės kreivės, kuri gauta matuojant gamintojo standartą.
2.8 Statistinė duomenų analizė
Eksperimentų statistinė duomenų analizė (ne mažiau kaip 3-6 eksperimentai su skirtingomis didžiųjų pusrutulių kultūromis) buvo atlikta naudojantis kompiuterine statistine programa Sigma Plot 13.0. Atliktų eksperimentų duomenų vidurkiai pateikti su vidutinėmis kvadratinėmis paklaidomis, statistiniam palyginimui naudojant vienakryptę ANOVA (ONE-WAY ANOVA). Skirtumai tarp vidurkių buvo laikomi patikimais, jei p<0,05.
27
3. REZULTATAI
3.1 Glijos kultūrų sudėties ir ląstelių gyvybingumo vertinimas
Astrocitų populiacija yra heterogeniška. Vienas iš astrocitų klasifikavimo būdų yra pagal GFAP ekspresiją. Norint įvertinti tiriamosiose kultūrose esančią GFAP ekspresuojančių astrocitų dalį, buvo atliktas imunocitocheminis žymėjimas (3 pav.).
Grynos mikroglijos kultūros grynumas 99 proc. (pagal izolektino B4 fluorescenciją) (4 pav.).
Nustatyta, kad glijos ląstelių kultūrą sudarė 39 proc. mikroglijos (pagal izolektino B4 fluorescenciją) ir
61 proc. astrocitų ląstelių. Įvertinta, kad 12 proc. yra GFAP teigiamų ir 88 proc. GFAP neekspresuojančių astrocitų.
3 pav. Glijos ląstelių kultūros sudėties vertinimas pagal specifinius žymenis.
Žaliai švyti izolektinu B4 žymėtos mikroglijos ląstelės, raudonai – GFAP ekspresuojantys astrocitai, o
28 Fluorescencinės mikroskopijos būdu buvo vertinamas ląstelių skaičius ir gyvybingumas (5 pav.). Ląstelių branduoliai pagal jų spalvą buvo klasifikuojami į gyvus ir nekrozinius. Gyvos mikroglijos ląstelės buvo žalios spalvos su tolygiu mėlynai Hoechst 33342 dažu nusidažiusiu branduoliu, o nekrozinių ląstelių branduoliai nusidažė propidžio jodido dažu ir švytėjo raudonai. Nenusidažiusių ląstelių mėlyni ir raudoni branduoliai buvo priskiriami atitinkamai gyviems ir žuvusiems astrocitams.
4 pav. Izolektinu B4 žymėtos mikroglijos ląstelės grynoje kultūroje Žaliai švyti izolektinu B4 žymėtos mikroglijos ląstelės.
29 3.2 Įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-42 įtaka mikroglijos ir astrocitų ląstelių gyvybingumui glijos ir grynoje mikroglijos kultūrose
Šio tyrimo metu buvo siekiama nustatyti Aβ1-42 įvairaus dydžio oligomerų poveikį mikroglijos
ir astrocitų ląstelių gyvybingumui grynoje mikroglijos kultūroje ir glijos kultūroje.
Ląstelių kultūros buvo veiktos 0,5 ir 1 μM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais. Kultūros
buvo inkubuojamos 30; 90; 180; 270 min. Taip pat ląstelių kultūros veiktos 1 μM dideliais Aβ1-42
oligomerais ir fibrilėmis inkubuojant 90; 180 ir 270 min. Buvo atliekamos kontrolės be priedų, bei su Aβ1-42 tirpikliu HFIP, paruoštu pagal tą patį protokolą, kaip ir Aβ1-42 pavyzdžiai, tik be šio peptido. Po
inkubacijos buvo vertinamas mikroglijos ir astrocitų gyvybingumas.
Pirmiausia, tirtas poveikis grynai mikroglijos ląstelių kultūrai (6 pav.). Gauta, kad maži Aβ1-42
oligomerai yra toksiški mikroglijos ląstelėms grynoje mikroglijos kultūroje. Skirtingos koncentracijos mažų Aβ1-42 oligomerų poveikis išsiskiria po 30 min. ir 270 min. inkubacijos. Žūčiai sukelti pakako 0,5
µM koncentracijos, po 30 min. inkubacijos žuvusių ląstelių skaičius siekė 10 proc., o po 270 min. – 39 proc. 1 µM koncentracijos maži Aβ1-42 oligomerai veikė greičiau ir pasižymėjo didesniu toksiškumu: po
5 pav. Glijos ląstelių gyvybingumo nustatymas pagal branduolio dažymąsi.
Gyvos mikroglijos ląstelės – žalios su mėlynai nusidažiusiu branduoliu, nekrozinės – su raudonai nusidažiusiu branduoliu. Gyvos astrocitų ląstelės – mėlynai nusidažę branduoliai, nekrozinės – raudonai nusidažę branduoliai.
30 30 min. nekrozinių branduolių skaičius buvo 18,35 proc., po 270 min. – 53,55 proc. Po 90 min. ir 180 min. skirtingos koncentracijos maži Aβ1-42 oligomerai veikia panašiai.
Svarbi astrocitų fiziologinė funkcija yra homeostazės palaikymas smegenyse. Yra žinoma, kad astrocitai geba sušvelninti toksinių medžiagų poveikį neuronams po pažeidimų ir juos apsaugoti: šalina glutamato perteklių ar medžiagų apykaitos produktus, taip pat sugeria jonų perteklių, atpalaiduotą iš pažeistų neuronų (82). Todėl šiame darbe tyrėme, ar astrocitai gali pakeisti mažų Aβ1-42 oligomerų
poveikį mikroglijai. Aβ1-42 mažų oligomerų poveikis mikroglijos ląstelėms glijos kultūroje pateiktas 7
pav. Žūčiai sukelti pakako 0,5µM koncentracijos. Jau po 30 min. inkubacijos Aβ1-42 maži oligomerai
reikšmingai padidino nekrozinių branduolių skaičių iki 28 proc. lyginant su kontrole. Ilgėjant inkubacijos trukmei nekrozinių branduolių skaičius didėjo ir po 270 min. siekė 53 proc. 1 µM koncentracijos maži Aβ1-42 oligomerai taip pat buvo toksiški mikroglijos ląstelėms, po 30 min.
nekrozinių branduolių skaičius buvo 33 proc., po 270 min. – 59 proc., tačiau reikšmingo skirtumo lyginant su 0,5 µM koncentracijos poveikiu nestebėta.
6 pav. Įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-42 įtaka mikroglijos ląstelėms grynoje mikroglijos
kultūroje
Eksperimento metu įvertintas grynos mikroglijos kultūros gyvybingumas po poveikio 0,5 µM ir 1µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais ir 1µM dideliais Aβ1-42 oligomerais ir fibrilėmis. Statistiškai
patikima,- lyginant su kontrole; *- p<0,05 n= 3-6
Inkubacijos trukmė, min.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 N ek ro zinia i b ra n d u o li ai, pr o c. -20 0 20 40 60 80 0,5 µM maži A 1 µM maži A Kontrolė 1 µM dideli A 1 µM A fibrilės HFIP * * * * * * * *
31 8 pav. pateikiamas Aβ1-42 mažų, didelių oligomerų ir fibrilių poveikis astrocitų ląstelėms glijos
kultūroje. Gauti rezultatai rodo, kad maži Aβ1-42 oligomerai turi nedidelį poveikį astrocitų
gyvybingumui: veikiant 0,5 µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais nuo 30 iki 270 min. žūva nuo
1 iki 7 proc. ląstelių, o veikiant 1 µM koncentracijos oligomerais ‒ nuo 2 iki 9 proc. Statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole matomas po 180 ir 270 min. nuo inkubacijos pradžios.
7 pav. Įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-42 įtaka mikroglijos ląstelėms glijos kultūroje Eksperimento metu įvertintas mikroglijos kultūros gyvybingumas po poveikio 0,5 µM ir 1µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais ir 1µM dideliais Aβ1-42 oligomerais ir fibrilėmis. Statistiškai
patikima lyginant su kontrole; *- p<0,05 n= 3-6
Inkubacijos trukmė, min.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 N ek ro zinia i b ra n d u o li ai, pr o c. -20 0 20 40 60 80 0,5 µM maži A 1 µM maži A Kontrolė 1 µM dideli A 1 µM A fibrilės HFIP * * * * * * * *
32 Nustatyta, kad dideli Aβ1-42 oligomerai ir fibrilės nesukelia mikroglijos ir astrocitų ląstelių
žūties glijos ląstelių ir grynoje mikroglijos ląstelių kultūroje (6 pav., 7 pav., 8 pav.) ir nėra toksiški lyginant su kontrole. HFIP, naudojamas oligomerų ruošimui, toksinio poveikio glijos ląstelėms taip pat neturėjo.
8 pav. Įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-42 įtaka astrocitų ląstelių gyvybingumui glijos
kultūroje
Eksperimento metu įvertintas nekrozinių astrocitų ląstelių branduolių skaičius glijos kultūroje po poveikio 0,5µM ir 1µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais. Statistiškai patikima, lyginant su
kontrole; *- p<0,05 n= 3-6
Inkubacijos trukmė, min.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 N ek ro zinia i b ra n d u o li ai, pr o c. -20 0 20 40 60 80 0,5 µM maži A 1 µM maži A Kontrolė 1 µM dideli A 1 µM A fibrilės HFIP * *
33 3.3 Mažų Aβ1-42 poveikio mikroglijos ir astrocitų gyvybingumui grynoje mikroglijos ir glijos kultūrose ryšys su NMDA receptoriaus aktyvumu
LSMU Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijoje atlikti tyrimai su grynos mikroglijos kultūra rodo, kad maži Aβ1-42 oligomerai sukelia nuo NMDA receptorių priklausomą mikroglijos ląstelių
depoliarizaciją (83) ir Ca2+ kaupimą (duomenys nepublikuoti). Tad tolesniuose tyrimuose buvo vertinta,
ar mažų Aβ1-42 oligomerų poveikis mikroglijos ir astrocitų gyvybingumui priklauso nuo NMDA
receptoriaus aktyvumo. Tyrimui naudoti 3 NMDA receptorių blokatoriai: MK 801, D-AP5 ir memantinas.
9 pav. pateikiamas NMDA receptorių blokatorių poveikis 0,5 µM mažų Aβ1-42 sukeliamos
mikroglijos žūties intensyvumui grynoje mikroglijos ląstelių kultūroje. Šios koncentracijos peptidas turėjo reikšmingą poveikį mikroglijos ląstelių gyvybingumui po 30 min. nuo inkubacijos pradžios (6 pav.). Gauti rezultatai rodo, kad D-AP5 neturėjo apsauginio poveikio mikroglijos ląstelėms ir nekrozinių
9 pav. Mažų Aβ1-42 poveikis grynos mikroglijos gyvybingumui naudojant NMDA receptorių
blokatorius
Eksperimento metu grynos mikroglijos ląstelių kultūra buvo preinkubuojama su NMDA blokatoriais (20µM) – MK 801, D-AP5 ir memantinu ir paveikta 0,5µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais.
Statistiškai patikima, lyginant su 0,5µM koncentracijos mažų Aβ1-42 oligomerų poveikiu; *- p<0,05 n=
3-5
Inkubacijos trukmė, min.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 N ek ro zinia i b ra n d u o li ai, pr o c. -10 0 10 20 30 40 50 A A MK 801 A D-AP5 A Memantinas Kontrolė * *
34 branduolių skaičius nesiskyrė lyginant su mažų Aβ1-42 poveikiu viso eksperimento metu. Naudotas
blokatorius MK 801 apsaugojo mikroglijos ląsteles nuo mažų Aβ1-42 sukeliamos žūties: nekrozinių
branduolių skaičius po 30 min. sumažėjo 1,66 proc., tačiau tai reikšmingai nesiskyrė lyginant su 0,5 µM mažų Aβ1-42 poveikiu. Statistiškai reikšmingas skirtumas stebimas po 90 min.: nekrozinių branduolių
skaičius sumažėjo 8,9 proc. Panašiu poveikiu pasižymėjo memantinas: po 90 min. nekrozinių branduolių skaičius sumažėjo 8,77 proc. ir patikimai skyrėsi lyginant su tiriamuoju mažų Aβ1-42 poveikiu.
10 pav. tyrimo rezultatai rodo, kad naudoti blokatoriai neturėjo apsauginio poveikio mikroglijos ląstelėms glijos ląstelių kultūroje ir statistiškai reikšmingo skirtumo ląstelių gyvybingumui lyginant su 0,5 µM koncentracijos mažų Aβ1-42 poveikiu nėra.
Inkubacijos trukmė, min.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 N ek ro zinia i b ra n d u o li ai, pr o c. -20 0 20 40 60 80 A A A D-AP5 A Memantinas Kontrolė
10 pav. Mažų Aβ1-42 poveikis mikroglijos gyvybingumui glijos ląstelių kultūroje naudojant NMDA
receptorių blokatorius
Eksperimento metu glijos kultūra buvo preinkubuojama su NMDA blokatoriais (20µM) – MK 801, D-AP5 ir memantinu ir paveikta 0,5µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais. Statistiškai patikima,
35 11 pav. vaizduoja NMDA receptorių blokatorių poveikį mažų Aβ1-42 oligomerų sukeliamai
astrocitų nekrozei. Skirtingai negu mikroglijos ląstelėms, astrocitams NMDA blokatoriai turėjo apsauginį poveikį. Po 90 min. inkubacijos su Aβ1-42 oligomerais nekrozinių branduolių skaičius
blokatoriais veiktoje kultūroje nesiskyrė nuo 0,5 µM Aβ1-42 poveikio. Po 180 min. matoma, kad visi
naudoti NMDA receptorių blokatoriai apsaugo astrocitus nuo mažų Aβ1-42 sukeliamos žūties. Nekrozinių
branduolių skaičius sumažėjo 2,28 proc. (MK 801), 2,35 proc. (D-AP5) ir 2,69 proc. (memantinas) ir reikšmingai skyrėsi lyginant su pavyzdžiais be blokatorių. Po 270 min. nekrozinių branduolių skaičius sumažėjo 6,11 proc. (MK 801), 5,48 proc. (D-AP5), 4,6 proc. (memantinas) ir reikšmingai skyrėsi lyginant su 0,5µM koncentracijos mažų Aβ1-42 oligomerų poveikiu. Astrocitai nebuvo pilnai apsaugoti
nuo toksinio mažų Aβ1-42 poveikio. Buvo patikrinta, ar naudojami NMDA receptorių blokatoriai ir
pasirinkta eksperimentui koncentracija (20 µM), nėra toksiški tiriamoms ląstelių kultūroms. Ląstelių gyvybingumo pokyčių nestebėta (duomenys nepateikti).
11 pav. Mažų Aβ1-42 poveikis astrocitų gyvybingumui glijos ląstelių kultūroje naudojant NMDA
receptorių blokatorius
Eksperimento metu glijos kultūra buvo preinkubuojama su NMDA blokatoriais (20µM) – MK 801, D-AP5 ir memantinu ir paveikta 0,5µM koncentracijos mažais Aβ1-42 oligomerais. Statistiškai patikima,
lyginant su 0,5µM koncentracijos mažų Aβ1-42 oligomerų poveikiu; *- p<0,05 n= 3-5
Inkubacijos trukmė, min.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Ne k ro zinia i b ra n d u o li ai, pr o c. 0 2 4 6 8 A A A + D-AP5 A Memantinas Kontrolė * * * * * *
36 3.4 Uždegiminio citokino IL-6 matavimas glijos ląstelių terpėje
Yra duomenų, kad AL sergančiųjų pacientų smegenyse randama padidėjusi IL-6 koncentracija ir manoma, kad stimuliacija Aβ1-42 oligomerais didina IL-6 išskyrimą iš mikroglijos ląstelių (84). Šio
eksperimento metu buvo ištirta, ar maži Aβ1-42 oligomerai gali sukelti glijos ląstelių aktyvaciją ir
padidinti uždegiminio citokino IL-6 išskyrimą. Glijos ląstelės buvo veiktos 24 val. 0,5 µM koncentracijos mažais Aβ1-42. Nustatyta, kad po poveikio žūva 80 proc. mikroglijos ir 6 proc. astrocitų
ląstelių (duomenys nepateikti). Gauti rezultatai pateikti 12 pav. rodo, kad tokios koncentracijos maži Aβ1-42 nesukėlė glijos ląstelių aktyvacijos – po poveikio IL-6 koncentracija statistiškai reikšmingai
nesiskyrė nuo kontrolės (be priedų).
12 pav. Uždegimino citokino IL-6 koncentracija glijos ląstelių auginimo terpėje
Eksperimento metu išmatuota uždegiminio citokino IL-6 koncentracija po 24 val. poveikio 0,5 µM koncentracijos Aβ1-42. n=3
