LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Rokas Lukoševičius
HSA-MIR-1246 VAIDMUO STOROSIOS ŽARNOS VĖŽIO PATOGENEZĖJE
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovė Dr. Violeta Šaltenienė
TURINYS
Santrauka ... 4
Summary ... 6
Santrumpos ... 7
Įvadas ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. Literatūros apžvalga ... 10
1.1 MikroRNR ... 10
1.1.1 MikroRNR biogenezė ir brendimas ... 10
1.1.2 MikroRNR funkcija ... 11
1.2 MikroRNR raiškos pokyčiai vėžio patogenezėje ... 13
1.3 Metodai mikroRNR genams taikiniams nustatyti ... 14
1.4 Storosios žarnos navikai ... 15
1.4.1 Epidemiologija ir etiologija ... 15
1.5 MikroRNR raiškos pokyčiai storosios žarnos vėžyje ... 17
1.6 MiR-1246 funkcija vėžio patogenezėje ... 18
TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 19
2.1 Tyrimo objektas ... 19
2.2 Metodai ... 19
2.2.1 Ląstelių kultivavimas ... 19
2.2.2 Storosios žarnos vėžinių ląstelių transfekcija ... 19
2.2.3 RNR gryninimas ... 20
2.2.4 Kopijinės DNR sintezė ... 21
2.2.5 Genų raiškos nustatymas RL-PGR metodu ... 21
2.2.6 MiR-1246 raiškos nustatymas ... 21
2.2.7 Baltymų gryninimas ... 21
2.2.9 MiRNR ir geno taikinio sąsajos patikra liuciferazės kontroliniu vektoriumi ... 23
2.2.10 Statistinė analizė ... 24
Rezultatai ... 25
3.1 Hsa-miR-1246 raiškos analizė storosios žarnos vėžinėse ląstelėse ... 25
3.2 MikroRNR tiesioginės sąsajos su genu taikiniu analizė liuciferazės vektoriumi paremta sistema ... 25
3.3 CFTR ir AXIN2 genų raiškos analizė ... 27
3.4 CFTR ir AXIN2 baltymų raiškos analizė ... 30
Rezultatų aptarimas ... 32
Išvados ... 34
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius: Rokas Lukoševičius
Magistro darbo pavadinimas: Hsa-miR-1246 vaidmuo storosios žarnos vėžio patogenezėje
Vadovė: Dr. Violeta Šaltenienė
Šio magistro darbo tikslas: Ištirti hsa-miR-1246 funkciją storosios žarnos vėžio patogenezėje, eksperimentiškai nustatant šios mikroRNR genus taikinius.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti hsa-miR-1246 raišką storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620, palyginus su storosios žarnos audiniu.
2. Patvirtinti in silico nustatytus hsa-miR-1246 genus taikinius, naudojant liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremtą sistemą.
3. Nustatyti hsa-miR-1246 galimų genų taikinių raišką eksperimentiškai padidinus jos kiekį storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620.
4. Nustatyti hsa-miR-1246 genų taikinių baltymų raiškos lygį eksperimentiškai padidinus jos kiekį storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620 Western blot metodu.
Tyrimo objektas – su storosios žarnos vėžiu siejamos mikroRNR ir jos funkcijos tyrimas storosios žarnos vėžio patogenezėje. Komercinės storosios žarnos vėžio ląstelių linijos (Caco-2 ir SW620) buvo pasirinktos kaip sistema, tinkančios tyrimo objektui tyrinėti.
Tyrimo rezultatai parodė, kad hsa-miR-1246 raiška buvo didesnė komercinėse storosios žarnos vėžio ląstelėse (Caco-2 ir SW620), palyginti su kontrole (storosios žarnos audinys).
MiRNR ir genų taikinių tiesioginės sąsajos tyrimas, pasitelkiant liuciferazės vektoriumi paremtą reporterinę sistemą, parodė, kad CFTR (1537-1544 3' UTR) ir AXIN2 (313-320 3' UTR) genai yra tiesioginiai hsa-miR-1246 taikiniai. Atlikus CFTR ir AXIN2 genų taikinių raiškos tyrimą komercinių storosios žarnos vėžio ląstelių linijose (Caco-2 ir SW620), praėjus 48 val. po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi, buvo nustatyta, kad šių genų raiška sumažėjo. Komercinių storosios žarnos vėžio ląstelių linijose (Caco-2 ir SW620), praėjus 72 val. po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi, CFTR ir AXIN2 baltymų raiškos pokyčio nebuvo.
Šio tyrimo metu, liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremta sistema, pirmą kartą buvo nustatyta, tiesioginė hsa-miR-1246 ir genų CFTR bei AXIN2 sąsaja. Be to, hsa-miR-1246 epigenetinis poveikis CFTR bei AXIN2 genų raiškai.
SUMMARY
Author of master’s thesis: Rokas Lukoševičius
Title of master’s thesis: Hsa-miR-1246 role in colorectal cancer pathogenesis
Supervisor: PhD Violeta Šaltenienė
The aim of this study was to examine hsa-miR-1246 function in colorectal cancer pathogenesis, experimentally determine microRNA target-genes. Therefore, four study objectives were defined:
1. Determine expression level of hsa-miR-1246 in colorectal cancer cell lines (Caco-2, SW620), compared to normal colorectal tissue.
2. Confirm in silico predicted target-genes of hsa-miR-1246 by luciferase reporter system
3. Determine target-genes expression by experimentally increasing level of hsa-miR-1246 in colorectal cancer cells.
4. Determine protein expression of target-genes in colorectal cancer cells by experimentally increasing level of hsa-miR-1246.
The study object was colorectal cancer associated miRNAs and their function in colorectal cancer pathogenesis. For this purpose, commercial colorectal cancer cell lines (Caco2 and SW620) was used in this investigation.
The results showed that hsa-miR-1246 was overexpressed in commercial colorectal cancer cells (Caco-2 and SW620) compared to control (colorectal tissue). Luciferase assay showed that CFTR (1537-1544 3' UTR) and AXIN2 (313-320 3' UTR) are hsa-miR-1246 direct targets. Moreover, CFTR and AXIN2 gene expression was lower after 48 h post transfection with hsa-miR-1246 mimic in both cell lines (Caco-2 and SW620). Investigation of CFTR and AXIN2 protein expression level did not show protein level decrease in colorectal cancer cell lines (Caco-2 and SW620) after transfection with hsa-miR-1246 mimic.
In this study CFTR and AXIN2 genes first time were confirmed as target-genes of hsa-miR-1246 by using luciferase reporter system. Moreover, epigenetic effect of hsa-miR-hsa-miR-1246 to CFTR and AXIN2 genes expression was determined.
SANTRUMPOS
RNR ribonukleininė rūgštis
iRNR informacinė RNR
miRNR (miR) mikroRNR
nt nukleotidai
pri-miRNR pirminė mikroRNR
pre-miRNR prekursorinė mikroRNR
DGCR8 Di Džordžo sindromo chromosomos regionas 8
RISC RNR aktyvintas slopinimo kompleksas
AGO argonautų šeimos baltymai
tRNR transportinė RNR
PABPC poli A prikabinantis kompleksas
XPO5 eksportinas 5
P53 vėžio genas p53
SŽV storosios žarnos vėžys
AGO2 argonautų baltymas 2
PACT ląstelinis baltymas aktyvuojantis PKR
APC adenominės polipozės genas
KRAS KRAS proto onkogenas
RASA1 RAS p21 baltymo aktyvatorius
CCNG2 ciklinas G2
CFTR CF transmembraninio laidumo reguliatorius RIPA radio-imuninis precipitacijos tyrimas
ĮVADAS
Pagal dažnumą storosios žarnos vėžys užima trečiąją vietą, (GLOBOCAN, 2008 m.), o Lietuvoje šis vėžinis susirgimas patenka į dažniausių vėžinių ligų penketuką (Lietuvos vėžio registras, 2011 m.). Nustatyta, kad nekoduojančios RNR molekulės – mikroRNR dalyvauja potranskripciniame genų raiškos reguliavime ir lemia ląstelės ciklo pokyčius: diferencijaciją, proliferaciją, apoptozę (1). Šiuo metu žinoma apie 2500 subrendusių žmogaus mikroRNR sekų ir manoma, jog jos gali valdyti 2/3 žmogaus transkriptų (2). Šiuo metu duomenų bazėse yra daugiau nei 32 000 publikacijų (Pubmed, 2018) susijusių su mikroRNR ir vėžiu, tai rodo, kad mikroRNR atlieka svarbų vaidmenį ligos patogenezėje (15-19). MikroRNR yra stabilios kraujo plazmoje ar serume bei kituose kūno skysčiuose, todėl yra tinkamos kaip biožymenys įvairių ligų diagnostikai ir terapijai (3). Pirmoji tikslinė mikroRNR terapija „Miravisen“ pasiekusi žmonių klinikinius bandymus sukurta hepatito C gydymui, slopinant hsa-miR-122 raišką (4).
Šiame darbe buvo siekiama ištirti su storosios žarnos vėžio patogeneze siejamos hsa-miR-1246 funkciją ląstelėse bei nustatyti potencialius jos genus taikinius, remiantis liuciferazės vektoriumi paremta reporterine sistema. Yra žinoma, jog hsa-miR-1246 genai taikiniai yra p53 (5), CADM1 (6), CCNG2 (7) bei THBS2 (8), kurie dalyvauja ląstelių diferenciacijoje, inavizijoje, metastazavime ir yra atsakingi už vėžinių ląstelių atsparumą chemoterapijai, tačiau vis dar trūksta žinių apie hsa-miR-1246 vaidmenį storosios žarnos vėžio patogenezėje.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti hsa-miR-1246 funkciją storosios žarnos vėžio patogenezėje ir nustatyti jos genus taikinius.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti hsa-miR-1246 raišką storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620, palyginus su storosios žarnos audiniu.
2. Patvirtinti in silico nustatytus hsa-miR-1246 genus taikinius, naudojant liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremtą sistemą.
3. Nustatyti hsa-miR-1246 galimų genų taikinių raišką eksperimentiškai padidinus jos kiekį storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620.
4. Nustatyti hsa-miR-1246 genų taikinių baltymų raiškos lygį eksperimentiškai padidinus jos kiekį storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620 Western blot metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 MikroRNR
MikroRNR molekulės (miRNR) tai endogeninių, mažų, nekoduojančių, RNR molekulių klasė, kurias sudaro 18-25 nukleotidai. MiRNR yra komplementarios vienai ar daugiau informacinės RNR (iRNR) (9). 1993 m. mokslininkas Lee R C su bendraautoriais savo atliktame moksliniame tyrime pirmasis pateikė mintį, kad miRNR molekulės gali būti vienas iš genomo reguliacinių elementų (10). Tyrime buvo rašoma apie lin-4 geną, kuris koduoja daug mažų RNR produktų, kurie komplementarūs lin-14. Šiuo metu yra žinoma, kad žmogaus genomas koduoja per 2500 miRNR ir, kad šios molekulės susiję su biologiniais procesais ląstelėse (11). Keisdamos genų raišką potranskripciniame lygmenyje keičia ląstelėse vykstančius procesus: proliferaciją, diferenciaciją, metabolizmą ir t. t. (12).
1.1.1 MikroRNR biogenezė ir brendimas
MiRNR genezę galima suskirstyti į kelis etapus: miRNR brendimą branduolyje, patekimą į citoplazmą ir galutinį brendimą citoplazmoje, kuriame dalyvauja daugybė reguliacinių baltymų (13). Tik galutinai subrendusi miRNR gali dalyvauti potranskripciniame genų raiškos reguliavime (14).
Manoma, kad pirmiausiai miRNR branduolyje transkribuojama polimerazės II pagalba, nors kai kurie autoriai teigia, kad gali dalyvauti ir polimerazė III (15). Šis pirminis miRNR transkriptas (pri-miRNR) sudarytas iš 33 nt ilgio plaukų segtuko formos kamieno (angl. hair pin stem), terminalinės kilpos (angl. terminal loop) ir viengrandės RNR iškyšos (angl. single-strended RNA). Po transkripcijos pri-miRNR apdorojama RNazės III Drosha ir DGCR8, pastarasis atskelia 11 nt seką nuo pirminės miRNR plaukų segtuko formos molekulės ties SD jungtimi, kur ji iš dvigrandės tampa viengrande (16). Drosha veikimas gali pasireikšti tuo pačiu metu, kaip ir transkripcija ar prieš atskyrimą (angl. splicing), proceso eigoje susiformuoja beveik subrendusi miRNR (pre-miRNR) (1 pav.) (17).
Susiformavusi pre-miRNR branduolyje susijungia su Exoprtin-5 (XPO5) ir su Ras susijusiu branduolio baltymu – guanozino-5’-trifosfatu (angl. Ras-related nuclear protein – guanosine-5’-triphosphate). Šis baltymų kompleksas apsaugo pre-miRNR nuo degradacijos ir perneša pre-miRNR į citoplazmą (17). Patekusi į citoplazmą pre-miRNR sąveikauja su Dicer, kuris sutrumpina pre-miRNR iki 22 nt ilgio dvigrandės miRNR molekulės – viena jų vadinama „vedačiaja“ seka (angl. guide strand), kita „lydinčiaja“ (angl. passenger strand) (1 pav.). Dicer kartu su TAR RNR baltymu (TRBP) ir kinazę R-aktyvuojančiu baltymu (PACT) užtikrina susidariusio duplekso stabilumą (18,19). Dicer ne tik svarbus miRNR galutiniam subrendimui, bet geba reguliuoti galutinai subrendusios miRNR kiekį. Po miRNR duplekso susiformavimo, sekos atskiriamos ir vedančioji seka prijungiama prie RNR indukuoto
nutildymo komplekso (RISC) (angl. RNA induced silencing complex), kurį sudaro Dicer, TRBP, PACT, Argonaute-2 (AGO2) ir GW182 baltymai (20). Žinduolių organizmuose į RISC kompleksą įtraukiama vedančioji 5’ gale termodinamiškesnė mikroRNR seka, tuo tarpu lydinčioji seka degraduoja (20).
Per paskutiniuosius metus yra atlikta daugybė tyrimų, rodančių, jog mikroRNR brendimas gali vykti ne kanoniniu, o alternatyviuoju būdu. Tyrimuose rašoma, kad ne visada reikalingas Dicer baltymas, kartais miRNR gali susiformuoti iš tRNR pirmtakų (21).
Pav. nr. 1. MiRNR biogenezė. Paveikslėlyje pavaizduota, kaip pri-miRNR subręsta iki
pre-miRNR molekulės branduolyje ir eksportuojama į citoplazmą. Citoplazmoje pre-miRNR subręsta galutinai ir gali slopinti baltymų transliaciją ar suardyti iRNR molekules (pritaikyta pagal Lin S,
2015).
1.1.2 MikroRNR funkcija
Per pastaruosius kelis metus yra atlikta nemažai mokslinių tyrimų siekiant išsiaiškinti kaip miRNR taikininės iRNR sekos degraduoja. Gyvūnų miRNR ir Ago baltymai sąveikauja per RISC, kuris prisijungęs miRNR seką. MiRNR ir Ago kompleksas gali komplementariai ar beveik komplementariai jungtis prie iRNR ir keisti potranskripcinę geno raišką. Visiškai komplementarus iRNR ir miRNR kompleksas suskaldomas Ago baltymų pagalba (12). Dažniausiai yra nevisiškas sekų komplementarumas, tokiu atveju iRNR nėra suskaldomi Ago baltymų, o Ago baltymai įtraukia papildomus baltymus, kurie nutildo geną (22). MiRNR prisijungimo vieta (angl. target site) iRNR molekulėje vyksta 3’netransiuojamame iRNR regione ir atpažįstama pagal bazių porų komplementarumą sekoje. Tačiau 5’ miRNR sekos galas yra nemažiau svarbus molekulės prisijungimui
prie iRNR. Remiantis atliktais tyrimais miRNR prisijungimo vieta skirstoma į tris pagrindines klases: dominuojanti 5‘, dominuojanti kanoninė 5‘ ir komplementari 3‘ galo sritys (23,24).
MiRNR taikinių – iRNR molekulių nutildymas vyksta veikiant keliems baltymams, kurie vykdo transliacijos represiją (deadenilinimas, „kepurės“ struktūros pašalinimas (angl. 5’ decapping) (2 pav.). Pirmiausia iRNR molekulės deadenilinamos, iRNR poliA uodegos trumpinimas, veikiant citoplazminės deadenilazės kompleksui (PAN2-PAN3, CCR4-NOT) (25). Antro etapo metu nuo deadenilintos iRNR pašalinama 5’ „kepurės“ struktūra hidrolizės proceso pagalba. Pagrindinis baltymas atliekantis šią funkciją eukariotų ląstelėse yra „kepurės“ struktūrą pašalinantis baltymas (angl. Decapping protein 2 (DCP2)). Proceso metu susiformuoja 7-metil-guanozindifosfatas (angl. 7-methyl-guanosine diphosphate) ir 5’ monofosforilinta iRNR. Galiausiai 5’ monofosforilinta iRNR tampa 5’ – 3’ kryptimi veikiančios egzoribonukleazės I substratu (angl. 5’ to 3’ exoribonuclease 1(XRN1)) ir yra suskaldoma (26).
MiRNR gali vykdyti transliacijos represiją, tačiau tikslūs mechanizmai nėra žinomi. Manoma, kad miRNR blokuoja eukariotų transliacijos iniciacijos faktorių 4 (angl. eukaryotic initiation factor 4F (eIF4F)), dėl to nevyksta iRNR transliacija (2 pav.) (26). Transliacijos represija stebima dar miRNR ekspresijos pradžioje, tačiau vėliau toks efektas yra silpnas, taigi pagrindinis iRNR taikinių nuslopinimas vyksta dėl deadenilinimo proceso (27).
MiRNR gali slopinti iRNR transliaciją ar suardyti transkripto seką, tačiau taip pat gali slopinti pačių transkripcijos faktorių veikimą ir taip paveikti daugybės genų raišką. Manoma, kad miRNR reguliuoja iRNR kiekį ląstelėse labiau per transkripcijos faktorių nutildymą nei tiesiogiai miRNR pamatinei sekai sąveikaujant su iRNR (28).
Oocituose, ankstyvose embriono ląstelėse bei neuronuose iRNR liekia deadenilinta ar netransliuojama (miRNR ir iRNR kompleksas blokuoja (eIF4F)), ir tolimesni iRNR nutildymo procesai nevykdomi. Taigi, šiose ląstelėse nutildyta iRNR molekulė gali būti poliadenilinta ir grįžti į aktyvią formą, kuri gali būti transliuojama (25).
Išsami miRNR analizė atskleidė, kad molekulės gali komplementariai ar beveik komplementariai jungtis prie kelių ar kelių šimtų iRNR molekulių ir reguliuoti potranskripcinę genų raišką. MiRNR molekules koduojančių genų raiškos sutrikimai yra siejamai su daugybe ligų, tame tarpe ir vėžiniais susirgimais. MiRNR, kurių raiška vėžiniame audinyje sumažėja, dažniausiai veikia kaip naviką slopinančios miRNR, tuo tarpu miRNR, kurių raiška padidėja, veikia kaip naviką aktyvinančios ir vadinamos onkomiRNR (29).
Pav. nr. 2. Nuo miRNR priklausomas potranskripcinis genų nutildymas. AGO baltymai
sąveikauja su GW182 baltymu, kuris aktyvuotas sąveikauja su citoplazminiu poly(A) – prisijungiančiu baltymu (PABPC) ir su citoplazminiu deadenilinimo kompleksu PAN2-PAN3 bei CCR4-NOT. Nuo deadenilintos iRNR molekulės pašalinama kepurės struktūra, o egzoribonukleazė
1 ją degraduoja (pritaikyta pagal Kuzuoğlu‐Öztürk D, 2016).
1.2 MikroRNR raiškos pokyčiai vėžio patogenezėje
MiRNR molekulės siejamos su konkrečiais navikais, todėl pagal miRNR raiškos profilio pokytį galima diagnozuoti ar prognozuoti ligą (30). Didelė dalis miRNR koduojančių genų lokalizuojasi intronuose (angl. fragile sites) ar kitose genomo regionuose, kuriuose vėžinių susirgimų atveju vyksta mutacijos: delecijos ar translokacijos (31,32). Taigi, didelė dalis miRNR transkriptų yra reguliuojami tokių transkripcijos faktorių kaip Myc ar p53. Be to, ląstelėms specifiniai transkripcijos faktoriai: MEF2, PU.1 ir REST, PDGF, TGF-b ir BDNF gali užkirsti kelią pri-miRNR transkripcijai (17). MiRNR transkripcijai nemažiau svarbūs ir epigenetiniai faktoriai. Atlikti tyrimai parodė, kad DNR metilinimas ir histonų deacetilazės inhibitoriai (angl. Histone deacetylase inhibitors) gali reguliuoti miRNR koduojančių genų raišką (17). Potencialūs miRNR koduojančių genų potranskripciniai reguliatoriniai mechanizmai: (i) nukleotidų pokyčiai miRNR „plaukų segtuko“ struktūroje ir (ii) Drosha funkcijos pokyčiai, kurie gali lemti pri-miRNR transfomracijos į pre-miRNR sutrikimus, dėl ko gali pasikeisti subrendusios miRNR seka tuo pačiu, jos genai taikiniai (33,34). MiRNR biogenezė gali sutrikti ir dėl XPO5 funkcijos pokyčių. Kai kuriuose navikuose sutrinka pre-miRNR transportas iš branduolio į citoplazmą ir taip sutrikdomas miRNR brendimas ir sintezė.
Calin J A ir jo tyrėjų komanda 2002 m. nustatė, naviką slopinančio 13q14 chromosomos regiono deleciją lėtinės limfocitinės leukemijos atveju, ir pirmieji parodė, kad miR-15-3p ir hsa-miR-16-3p yra susijusios su navikiniu procesu. Būtent šis regionas koduoja miR-15 ir miR-16. Taigi, limfocituose sumažėjus šių mikroRNR molekulių raiškai naviko iniciacija neslopinama (35). Vėliau, ta pati mokslininkų grupė parodė, kad miRNR molekules koduojančių chromosomų regionuose esančios mutacijos susijusios su vėžiniais susirgimais (36).
MiRNR raiškos profilį galima panaudoti kaip diagnostinį įrankį, siekiant nustatyti vėžinius susirgimus, tačiau tam reikia atlikti daug tyrimų. Rosenfield N. 2008 metais su komanda įvairiuose pirminiuose naviko audiniuose ir metastatiniuose navikuose pagal miRNR profilio raiškos pokyčius identifikavo ir suklasifikavo 48-ias miRNR molekules iš 336-ių. Šis klasifikavimas įgalino atpažinti naviką 86 proc. tikslumu, bei atskirti mestastazinį naviko audinį 77 proc. tikslumu (37). Lawrie C H 2008 metais su tyrėjų komanda parodė, kad kraujyje cirkuliuojančių miRNR molekulių raiškos pokyčiai dar ankstyvoje vėžinio sirgimo stadijoje gali atspindėti naviko audinio tipą, o mikroRNR gali būti naudojama kaip biožymuo ankstyvai ligos diagnostikai (38).
Dėl nedidelio sekos ilgio miRNR molekulės yra labai stabilios aplinkos veiksniams, palyginus su iRNR, todėl išlieka audiniuose, kurie yra įlieti į parafiną ar pakartotinai užšaldyti, be to, miRNR aptinkamos ir biologiniuose skysčiuose (seilėse, šlapime, plaučių sekrete), kas dar labiau palengvina jų, kaip biožymenų panaudojimą (39).
Pavyzdžiui yra žinoma, kad miRNR-182-5p gali veikti kaip onkogeninė miRNR krūties (40), kiaušidžių (41), ar šlapimo pūslės (42) naviko audiniuose, tuo tarpu plaučių naviko audinyje – naviką slopinanti (43). Tokie miRNR funkcijos pokyčiai skirtinguose organizmo audiniuose priklauso nuo skirtingo mikroRNR genų taikinių kiekio, pseudogenų raiškos, ilgųjų nekoduojančių RNR molekulių, žiedinių RNR, kurios gali komplementariai susijungti su miRNR (44).
SŽV atveju (et-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, and miR-23a buvo validuotos kraujo plazmoje ir siūlomos kaip biožymenys (45). MiRNR-122 naudojama hepatito C gydymui (46). Taigi, miRNR profilio nustatymas navikiniuose audiniuose, bei jų potencialių genų taikinių nustatymas galėtų pasitarnauti kaip ankstyvos diagnostikos priemonė ar net kaip terapinis įrankis.
1.3 Metodai mikroRNR genams taikiniams nustatyti
Siekiant nustatyti mikroRNR molekulių funkciją ląstelėje, svarbu išsiaiškinti jų genus taikinius. Jei miRMR molekulė turi iRNR taikininį, kurios koduojamas baltymas susijęs su biologiniais procesais vykstančiais ląstelėje, galima nuspėti, kad ši miRNR molekulė yra šio proceso valdymo dalis. Šiuo metu yra žinoma nemažai metodų miRNR ir jos genų taikinių sąsajoms patikrinti (47).
Vienas iš pagrindinių yra in silico predikcija, vykdoma matematiniais algoritmais paremtomis programomis. In silico predikcijos metu, programa bando surasti komplementarią miRNR molekulei seką žmogaus transkriptome. Šiai patikrai svarbiausi aspektai yra subrendusios miRNR sekos ilgis ir komplementarumas su iRNR seka 2-8 mikroRNR nukleotidais (5‘ – 3‘ kryptimi) (44,47). Atlikus in silico predikciją kiekvienai miRNR molekulei gali būti priskirta nuo kelių iki kelių tūkstančių genų taikinių, taigi, patikrinti kurie genai taikiniai iš tikrųjų yra mikroRNR taikiniai, nėra lengva (48).
MikroRNR genų taikinių (iRNR) raiška gali būti nustatyta kiekybinės tikro laiko PGR metodu, naudojant mikrogardeles (angl. microarray) arba atlikus RNR sekoskaitą, o miRNR ir iRNR sąveika gali būti patvirtinta liuciferazę produkuojančiu vektoriumi paremta reporterine sistema (4,49). Siekiant išmatuoti iRNR transliacijos skirtumus gali būti naudojamas ribosomų profiliavimas atlikus ląstelių transfekciją miRNR imitatoriais (49,50). Taip pat naudojami AGO ir miRNR imunoprecipitacijos metodai leidžiantys aptikti ir atlikti miRNR ir jos geno taikinio iRNR komplekso sekoskaitą (50).
1.4 Storosios žarnos navikai
Susirgimai storosios žarnos vėžiu (SŽV) pasaulyje dažnėja, nuo kurių miršta vis daugiau darbingo amžiaus žmonių, išsivysčiusiuose pasaulio šalyse. Pagrindiniai rizikos veiksniai – netinkama mityba, rūkymas, mažas fizinis aktyvumas, nutukimas (51). SŽV atsiradimui svarbūs ir genetiniai ir epigenetiniai pokyčiai, dėl kurių įprastas storosios žarnos epitelis laikui bėgant gali išsivystyti į adenokarcinomą (52). Šio proceso genezę aprašė Fearon E R ir Vogelstein B 1990 metais (53). Vėliau SŽV pradėtas klasifikuoti pagal molekulinius subtipus, priklausomai nuo to, kuris molekulinis kelio pažeidimas lėmė naviko atsiradimą (54).
1.4.1 Epidemiologija ir etiologija
Pagal dažnumą SŽV yra 2-oje vietoje moterų ir 3-čioje vyrų tarpe pasaulyje. 2012 metais maždaug 746 tūkst. vyrų ir 614 tūkst. moterų buvo diagnozuotas SŽV, tai yra maždaug 10 proc. iš visų naujai diagnozuotų vėžinių susirgimų (55,56). SŽV yra 3-čias pagal dažnumą vėžinis susirgimas pasaulyje (51,57). Daugiau nei 50 proc. SŽV nustatoma išsivysčiusiose šalyse. Didžiajai daliai sergančiųjų navikas pasireiškė sporadiškai esant 50 metų amžiaus ir senesniems. SŽV rizika didėja su amžiumi, net 80 proc. sergančiųjų navikas buvo diagnozuotas virš 60 metų (51). SŽV susirgimų skaičius didesnis Australijoje, Naujojoje Zelandijoje, Japonijoje, Šiaurės Amerikoje, daugelyje Europos šalių ir yra mažesnis mažiau urbanizuotose regionuose tokiuose kaip Afrika, Azija, Pietų Amerika (3 pav.) (51,57). Lietuvoje SŽV dažnis – 23,4 atvejai 100 tūkst. individų, bei yra mažesnis nei dažnis Europoje (30,4 atvejų 100 tūkst. individų) (57).
Pav. nr. 3. SŽV epidemiologija pasaulyje. Paveiksle galima matyti su amžiumi susietą
ligos pasireiškimą ir vyrų bei moterų mirtingumo dažnį pasaulyje. Visuose regionuose vyrų mirtingumas didesnis nei moterų, taip pat mirtingumo dažnis didesnis labiau išsivysčiusiuose
pasaulio regionuose (pritaikyta pagal Kuipers E J, 2015).
Dažniausiai neoplazijos metu nustatomos mutacijos genuose APC, CTNNB1, KRAS, BRAF, SMAD4, TGFBR2 ir PIK3CA, dėl to sutrinka signaliniai ląstelių keliai ir polipai palaipsniui transformuojasi į SŽV (51,58) (4 pav.). BRAF, KRAS ir PIK3CA genų mutacijos įvyksta ankstyvoje adenomos vystymosi fazėje, kas lemia tolesnį adenomų augimą. Nustatyta, kad šių genų mutacijos storosios žarnos epitelyje įvyksta dar prieš ląstelės virtimą vėžine.
Klasikinio SŽV atveju adenoma išsivysto iš polipų prekursorių, atipiškų kriptų (angl. aberrant crypt foci), kurie per 10 – 15 metų pereina į ankstyvą tubulinę ar tubulioviliozinę adenomą, o adenoma į adenokarcinomą (51), progresija gali būti spartesnė esant paveldėjimui, vadinamam Linčo sindromui (51,59).
Pav. nr. 4. Storosios žarnos adenokarcinomos genezės schema. Paveiksle pavaizduotos
dvi galimos normalaus epitelio transformacijos į adenokarcinomą. Pirmoji transformacija vadinama klasikiniu virsmu, pavaizduota viršuje, jos metu adenokarcinoma išsivysto iš tubulinių adenomų.
Žemiau pavaizduotas alternatyvus virsmas, kai polipai virsta adenokarcinoma. Visi pavaizduoti genai susiję su vėžiniu procesu, jų mutacijos dažniausiai įgimtos, tačiau gali atsirasti dėl
epigenetinių pokyčių (pritaikyta pagal Kuipers E J, 2015).
1.5 MikroRNR raiškos pokyčiai storosios žarnos vėžyje
2006 metais Cummins J M su kolegomis nustatė miRNR profilį SŽV ląstelėse (60). Nuo tada yra identifikuota daugiau nei 200 miRNR, kurių raiška pakitusi SŽV atveju. 2015 metais mokslininkas Taniguchi K ir jo komanda nustatė, kad SŽV atveju, esant hsa-miR-124 raiškos padidėjimui, slopinamas navikinių ląstelių augimas per PTB1/PKM1/PKM2 kaskadą (61). Taip pat panašaus dizaino studija atlikta Kim T ir jo komandos 2018 metais parodė, kad miR-17-5p per ETM geną reguliuoja baltymo vimentino kiekį ir taip skatina SŽV ląstelių migraciją bei invaziją (62). Nagel R ir jo tyrėjų komanda 2008 metais nustatė miR-135 raiškos padidėjimą SŽV audinyje. Ši mikroRNR slopina APC geno raišką taip aktyvindama WNT signalinį kelią (63). Procesas sutrikdo ląstelių proliferaciją, diferenciaciją ir apoptozę, todėl ląstelė tampa navikine (64). Yra nustatyta, kad esant miRNR raiškos pokyčiui SŽV audinyje jis nustatomas ir kraujo serume (65). Literatūros duomenimis miR-139-5p (66), miR-103 (67), miR-1290 (68), miR-17-3p ir miR-106a (69) raiška buvo pakitusi ir SŽV sergančių pacientų kraujo serume, todėl šios mikroRNR yra tinkamos SŽV diagnostikai ir prognostikai.
1.6 MiR-1246 funkcija vėžio patogenezėje
Neseniai nustatyta, jog hsa-miR-1246 yra susijusi su storosios žarnos vėžiu (45). Genas koduojantis hsa-miR-1246 lokalizuojasi 2q31.1. Wang S. ir jo tyrėjų grupės tyrimo rezultatai parodė, jog CCNG2 (asocijuojamas su ląstelių augimo inhibavimu) genas yra tiesioginis miRNR-1246 taikinys. Eksperimentiškai padidinus miR-1246 kiekį suaktyvėjo storosios žarnos navikinių ląstelių proliferacija, migracija bei invaziškumas, tuo tarpu, išjungus miR-1246 koduojantį geną šių funkcijų aktyvumas sumažėjo. Šie atradimai parodė miR-1246 ir CCNG2 geno sąsają ir atskleidė vieną iš galimų miR-1246 funkcijų SŽV ląstelėse. Pastarasis atradimas gali būti panaudotas kaip naujas terapinis taikinys (70). Cooks T ir jo tyrėjų grupė 2018 metais atliko tyrimą, kurio metu nustatė, kad storosios žarnos vėžinės ląstelės, kuriose yra p53 genų mutacija, produkuoja egzosomas, kuriose gausu miR-1246, turi įtakos makrofagų virsmui į su naviku siejamus makrofagus (angl. tummors associated macrophages, TAM‘s), kurie skatina naviko progresiją (71). Neerincx M kartu su tyrėjais 2015 m. nustatė, jog hsa-miR-1246 raiška SŽV ląstelėse ir metastatinėse ląstelėse būna didesnė, palyginus su kontroliniu audiniu (72). MiRNR-1246 turi daugybę taikinių transkriptome, kurie susiję su įvairiais signaliniais keliais, todėl sąsaja su SŽV patogeneze nėra iki galo ištirta. Siekiant nustatyti hsa-miR-1246 funkcijas ląstelėje ir išsiaiškinti epigenetinį signalinių kelių valdymą, svarbu nustatyti jos genus taikinius.
TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – hsa-miR-1246 storosios žarnos vėžio patogenezėje. Šiam tikslui buvo naudota komercinės storosios žarnos vėžio ląstelės Caco-2 ir SW20.
2.2 Metodai
2.2.1 Ląstelių kultivavimas
Eksperimentams buvo naudojamos komercinės storosios žarnos vėžio ląstelės Caco-2 (ATCC® HTB-37™) ir SW620 (ATCC® CCL-227™) , auginamos terpėje “Ham's F-12 Nutrient Mixture” (Gibco by Life Technologies, JAV) papildytoje 10 proc. veršelio embriono serumu (Gibco by Life Technologies, JAV) ir 1 proc. antibiotikų penicilino – streptomicino (Gibco by Life Technologies, JAV) tirpalu, kultivuojamos 37 ° C temperatūroje 5 proc. CO2 inkubatoriuje.
Ląstelės buvo persėjamos, kai padengdavo auginimo indo dugną 70-80 proc. Ląstelių plovimui buvo naudojamas 1x fosfatinis buferinis druskos tirpalas (Gibco by Life Technologies, JAV), o ląstelių atkabinimui nuo augimo paviršiaus 0,25 proc. tripsino – 1x etilendieminotetraacetato (EDTA) (Gibco by Life Technologies, JAV) tirpalas. Ląstelių skaičiavimui buvo naudota vienkartinė skaičiavimo kamera („Kova Glasstic Slide“ (Thermo Fisher Scientific, JAV).
2.2.2 Storosios žarnos vėžinių ląstelių transfekcija
Storosios žarnos vėžinių ląstelių atvirkštinė transfekcija atlikta naudojant reagentą Lipofectamine 3000 (Invitrogen, JAV) ir miRNR imitatorius: hsa-miR-1246 (Ambion by Life Technologies, JAV), hsa-miR-1-3p (Ambion by Life Technologies, JAV) (teigiama kontrolė) ir Negative Control # 1 (mirVana miRNA Mimic, Ambion by Life Technologies, JAV) (neigiama kontrolė) 24-ių šulinėlių plokštelėje (genų raiškos ir liuciferazės reporterinei analizei), ir 6-ių šulinėlių plokštelėje (baltymų raiškai). Genų raiškos analizei buvo atlikti trys techniniai pakartojimai, du liuciferzės reporterinei analizei ir vienas baltymų raiškos analizei, o nepriklausomi eksperimentai buvo pakartoti ne mažiau, kaip tris kaip 3 kartus. Naudojant teigiamą miRNR kontrolę (hsa-miR-1-3p), buvo nustatytas imitatoriaus kiekis, kuris keičia miRNR geno taikinio (TWF1) raišką vėžinėse ląstelėse daugiau nei du kartus. Siekiant pakeisti miRNR genų taikinių raišką, transfekcija Caco-2 ląstelėse buvo atlikta
naudojant 90 nM miR-1246 imitatoriaus koncentraciją galutiniame transfekcijos tūryje, tuo tarpu SW620 – 60 nM.
Genų raiškos analizei ląstelės buvo naudojamos analizei po transfekcijos praėjus 24 val. ir 48 val., baltymų raiškos analizei po 72 val., tiesioginės miRNR sąsajos su genu taikiniu patikrai, liuciferazės eksperimentiniu vektoriumi paremtu metodu po 48 val.
Transfekcija atlikta lipofektaminu yra paremta lipidinių nano dalelių technologija. Katijoninis lipidas sudarytas iš teigiamai įkrautų galvučių ir vienos arba dviejų hidrokarboninių uodegų. Krūvį turinti galvutė sąveikauja su nukleininės rūgšties fosfatinėmis grupėmis ir sudaro transfekcijos kompleksą. Teigiamai įkrautas liposomos paviršius (prisijungęs nukleininę rūgštį) jungiasi prie neigiamai įkrauto ląstelės paviršiaus. Manoma, kad transfekcijos kompleksas patenką į ląstelės vidų endocitozės proceso metu (73) (5 pav.).
Pav. nr. 5. Lipidų valdomos katijoninės pernašos mechanizmo schema (Thermo Fisher
Scientific)
2.2.3 RNR gryninimas
Visuminės RNR išgryninta iš komercinių storosios žarnos ląstelių Caco-2 ir SW620, naudojant rinkinį RNeasy Mini Kit (Qiagen, Vokietija), remiantis gamintojo rekomendacijomis. RNR koncentracija išmatuota spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, JAV). Koncentracija ir švarumas nustatyti atitinkamai pagal 260 nm bangos ilgio šviesos sugertį ir 260 nm bei 280 nm ilgio šviesos sugerties santykį (74).
2.2.4 Kopijinės DNR sintezė
Kopijinės DNR sintezės reakcijai naudota visuminė RNR (50 ng/µl) su rinkiniu High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, JAV), remiantis gamintojo rekomendacijomis.
2.2.5 Genų raiškos nustatymas RL-PGR metodu
Genų raiškos nustatymas tikro laiko kiekybinės polimerazės grandininės reakcijos metodu TL-kPGR reakcija buvo atlikta realaus laiko termocikleryje ABI 7500 (Applied Biosystems, JAV) 96-ių šulinėlių plokštelėse MicroAmp Optical (Applied Biosystems, JAV), naudojant rinkinį Power SYBR™ Green PCR Master Mix (Invitrogen, JAV), ir pradmenis, specifiškai gausinančius tiriamųjų genų fragmentus (CFTR ir AXIN2, ACTB), remiantis gamintojo rekomendacijomis. Genų raiškos rezultatai skaičiuoti naudojant 2ˆ(–delta delta CT) metodą, ACTB geną naudojant kaip vidinę kontrolę.
2.2.6 MiR-1246 raiškos nustatymas
MiR-1246 raiška tikro laiko kiekybinės polimerazės grandininės reakcijos metodu TL-kPGR reakcija buvo atlikta realaus laiko termocikleryje ABI 7500 (Applied Biosystems, JAV) 96-ių šulinėlių plokštelėse MicroAmp Optical (Applied Biosystems, JAV) naudojant TaqMan™ Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, JAV), TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, JAV) bei TaqMan™ Advanced miRNA Assay (Applied Biosystems, JAV) atsižvelgiant į gamintojo rekomenduojamas sąlygas. miR-1246 raiška nustatyta komercinėse storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620 ir palyginta su raiška nustatyta storosios žarnos audinyje. MiR-1246 raiškos rezultatai skaičiuoti naudojant 2ˆ(–delta delta CT) metodą, miR-16 naudojant kaip vidinę kontrolę.
2.2.7 Baltymų gryninimas
Baltymai iš Caco-2 ir SW620 ląstelių buvo skiriami naudojant 1 x RIPA (angl. radioimmunoprecipitation) (Abcam, JK) lizės buferį, kurio sudėtyje yra proteazių bei fosfatų inhibitoriai (Sigma Aldrich, JAV), kurie apsaugo baltymus nuo suirimo. Ląstelės po transfekcijos praėjus 72 val. du kartus nuplaunamos šaltu PBS (Gibco by Life Technologies, JAV) ir lizuojamos 1 x RIPA lizės buferiu. Po 15 min. inkubacijos ląstelės intensyviai gramdomos plastikiniu gramdikliu ir turinys perkeliamas į 1,5 ml talpos mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai centrifuguojami 15 min. 14 000 x g jėga 4°C.
Baltymų koncentracija matuota spektofotometru SunriseTM (Tecan Šveicarija), ties 562 bangos
koncentracija vertinta pagal standartinę kreivę, gautą išmatavus žinomos koncentracijos baltymą iš rinkinio „Pierce BCA protein Assay Kit“ (Thermo Fisher Scientific, JAV). Baltymai saugomi -20 °C temperatūroje.
2.2.8 Baltymų raiškos nustatymas Western Blot metodu Western Blot metodas atliktas penkiais etapais:
Mėginio paruošimas. Išgryninti baltymai atskiesti distiliuotu vandeniu iki reikiamos koncentracijos ir sumaišyti buferiu 4X Bolt LDS Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific, JAV), kuris suteikia baltymams neigiamą krūvį, ir 10X Sample Reducing Agent (Thermo Fisher Scientific, JAV), kuris reikalingas baltymų redukcijai elektroforezės metu ir inkubuojami maišyklėje (Eppendorf, Vokietija) 70 °C temperatūroje 10 min.
Gelio elektroforezė. Elektroforezė buvo atlikta naudojant poliakrilamido gelį Bolt 4-12 proc. Bis-Tris Plus Mini Gel, 12-well (Novex by Thermo Fisher Scientific, JAV) su leidimo buferiu 1X Bolt MES SDS (Thermo Fisher Scientific, JAV) specialiame inde Mini Gel Tank (Thermo Fisher Scientific, JAV), esant 165 V įtampai 40 min.
Baltymų dydis vertintas pagal žinomos koncentracijos baltymus MagicMark XP Western Protein Standard (Thermo Fisher Scientific, JAV) ir SeaBlue Plus2 Pre-Stained (Thermo Fisher Scientific, JAV).
Baltymų perkėlimas ant PVDF membranos. Po elektroforezės baltymai iš poliakrilamido gelio buvo perkelti „šlapiuoju“ būdu ant 0,45µm dydžio poras turinčios PVDF membranos (Invitrol by Themo Fisher Scientific, JAV) (membranos apruošimas aprašytas žemiau), naudojant perkėlimo buferį Bolt Transfer Buffer (Thermo Fisher Scientific, JAV), papildytą metanoliu (20 proc.) ir reagentu Bolt Antioxidant (Thermo Fisher Scientific, JAV), specialiame inde Mini Gel Tank (Thermo Fisher Scientific, JAV), esant 20V įtampai 60 min.
Membranos blokavimas, inkubacija antikūnais ir plovimas. PDVF membrana blokuota reagentais Western Breeze Blocker/Diluent (A/B)“ (Thermo Fisher Scientific, JAV) ir plauta 16 x plovimo buferiu Western Breeze (Thermo Fisher Scientific, JAV). Su pirminiais antikūnais prieš baltymą AXIN (AB109307; Abcam, JK) ir CFTR (AB2784; Abcam, JK) GAPDH (AM4300, Thermo Fisher, JAV) membrana inkubuota per naktį, o su antriniu antikūnu „Western Breeze Chemiluminescent Kit“ (Invitrogen, JAV), anti-rabbit arba anti-mouse (Thermo Fisher Scientific, JAV), atitinkamai pagal pirminį antikūną.
Siekiant ištirti kito baltymo kiekį toje pačioje membranoje, antriniai ir pirminiai antikūnai buvo pašalinti naudojant pašalinimo buferį Restore Western Blot (Thermo Fisher Scientific, JAV).
Imunodetekcija. Imunodetekcija atlikta naudojant chemiliuminescentinį substratą ir dokumentavimo sistemą „ChemiDoc VRS+Sysem“ (Bio-Rad, JAV).
Baltymų raiškos analizė. Baltymų raiškos analizė atlikta naudojant programinį paketą ImageLab v.6 (Bio-Rad, JAV). Baltymų raiška buvo normalizuota pagal endogeninio GAPDH baltymo raišką.
2.2.9 MiRNR ir geno taikinio sąsajos patikra liuciferazės kontroliniu vektoriumi
Vektorių konstravimas in silico. Vektoriai buvo sukonstruoti in silico naudojant laisvos prieigos internetinę duomenų bazę TargetScan v7.1, kurioje galima sužinoti galimų miRNR genų taikinių sekas bei Genome Compiler programą, kuri naudojama taikininės sekos bei komerciškai įsigyto vektoriaus ligavimui in silico, restrikcijos endonukleazių pasirinkimui.
Vektorių konstravimas in vitro. Pirmiausiai buvo atliktas komerciškai užsakytų viengrandžių DNR taikinių sekų hibridizavimas, suhibridizuotų sekų karpymas HindIII (Invitrogen Anza TM, JAV) ir
SpeI (Invitrogen Anza TM, JAV) greito veikimo restrikcijos endonukleazėmis, siekiant paruošti lipnius
galus ligavimui, bei sekų gryninimas iš agarozės gelio, siekiant pašalinti reazių nukirptus DNR fragmentus. Komerciškai įsigytas plazmidinis vektorius taip pat karpomas HindIII (Invitrogen Anza TM,
JAV) ir SpeI (Invitrogen Anza TM, JAV) greito veikimo restrikcijos endonukleazėmis, siekiant paruošti
lipnius galus ligavimui, sukarpytas vektorius gryninamas iš agarozės gelio siekiant pašalinti iškirptus DNR fragmentus. Paruošti vektorius ir miRNR geno taikinio dvigrandės DNR seka suliguota T4 DNA ligase (NEB TM, JK). Po ligavimo eksperimentiniai vektoriai su miRNR taikininėmis sekomis buvo
pagausinti E.coli Shuffle kompetentinėse bakterijose ir patikrinti Sanger (GAMINTOJAS) sekoskaitos metodu.
Žinduolių ląstelių transfekcija. Komercinės skrandžio adenokarcinomos ląstelės AGS (ATCC® CRL-1739™) buvo transfekuotos sukontruotais eksperimentiniais ir kontroliniu vektoriais bei hsa-miR-1246 imitatoriumi (Ambion by Life Technologies, JAV) ir neigiamos kontrolės miRNR (mirVana miRNA, negative control #1, Ambion by Life Technologies, JAV). Po transfekcijos ląstelės inkubuotos 37°C 5 proc. CO2 inkubatoriuje 48 val. Po inkubacijos ląstelės lizuotos lizės buferiu iš rinkinio
Dual-Light™ Luciferase & β-Galactosidase Reporter Gene Assay System (Invitrogen, JAV).
Liuciferazės ir ß-galaktozidazės matavimas. Siekiant išmatuoti liuciferazės aktyvumą ląstelių lizate buvo naudojamas rinkinys Dual-Light™ Luciferase & β-Galactosidase Reporter Gene Assay System (Invitrogen, JAV) ir luminometras (Tecan, Šveicarija).
Liuciferazės ir ß-galaktozidazės matavimo duomenų analizė. Pagal eksperimentinės ir kontrolinės plazmidės pagaminto baltymo skaidymo šviesos intensyvumą buvo normalizuotas eksperimentinio baltymo kiekis.
MikroRNR molekulės geno taikinio tiesioginė sąsaja buvo nustatyta, jei baltymo skaidymo šviesos intensyvumo matavimo rezultatai, tarp tiriamųjų grupių, buvo statistiškai reikšmingi.
2.2.10 Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta naudojant Studio R kompiuterinę programą. Tiriamųjų grupių palyginimui naudoti Mann Whitney U ir Stjudento T testai. Jei p < 0,05 skirtumai tarp dviejų grupių laikyti statistiškai reikšmingais.
REZULTATAI
3.1 Hsa-miR-1246 raiškos analizė storosios žarnos vėžinėse ląstelėse
Šio darbo eksperimentams atlikti buvo pasirinktos moksliniuose tyrimuose plačiai naudojamos komercinės storosios žarnos vėžinės ląstelės Caco-2 ir SW620. Kadangi buvo planuojama ištirti hsa-miR-1246 galimų genų taikinių raišką, eksperimentiškai padidinus šios miRNR kiekį, pirmiausia buvo atlikta hsa-miR-1246 raiškos analizė Caco-2 ir SW620 ląstelėse.
Buvo nustatyta, kad Caco-2 ląstelėse (n = 10) hsa-miR-1246 raiška buvo 3,3 (p = 5,7 x 10-5)
karto didesnė, o ląstelėse SW620 (n = 10) 2,5 karto (p = 0,015) didesnė, palyginti su storosios žarnos audiniu (kontrolė) (n = 12) (6 pav.).
Pav. nr. 6. Hsa-miR-1246 raiška storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620 palyginti su kontrole (storosios žarnos audiniu). Paveiksle pavaizduotos normalizuotos miRNR
raiškos dCt vertės logoritminėje skalėje. Žvaigždute (*) pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai (*p < 0,05).
3.2 MikroRNR tiesioginės sąsajos su genu taikiniu analizė liuciferazės vektoriumi
paremta sistema
Naudojantis matematiniais algoritmais paremtu internetiniu įrankiu „TargetScan v7.1“ bei moksline literatūra buvo parinkti potencialūs hsa-miR-1246 genai taikiniai CFTR ir AXIN2, kurie in silico turėjo po vieną aštuonių merų mikroRNR sąveiką geno taikinio sekoje.
* *
MikroRNR tiesioginės sąsajos su genu taikiniu patikrai naudota komercinė skrandžio adenokarcinomos ląstelių linija (AGS). Teigiamos kontrolės hsa-miR-1-3p ir jos genas taikinys TWF1 buvo naudoti siekiant optimizuoti eksperimento sąlygas: parinkti efektyvią miRNR imitatoriaus koncentraciją; parinkti reikiamą eksperimentinio vektoriaus, bei kontrolinio vektoriaus galutines koncentracijas; parinkti reikiamą inkubacijos laiką po transfekcijos. AGS ląstelių linija buvo transfekuojama pasirinkus 50mM galutinę hsa-miR-1246 imitatoriaus koncentraciją, eksperimentinės bei kontrolinės plazmidės santykį 1:5. Luciferazės bei ß-galaktozidazės aktyvumas matuotas praėjus 72 val. po transfekcijos.
Ląstelės buvo transfekuotos eksperimentiniais vektoriais, turinčiais 8-merų hsa-miR-1246 prisijungimo vietas CFTR (1537-1544 3‘ UTR) ir AXIN2 (313-320 3‘ UTR) genų taikinių sekose, kurios buvo įterptos į vektorius, šalia liuciferazę koduojančio geno 3’ netransliuojamo regiono.
Ląstelėse, transfekuotose imitatoriumi hsa-miR-1246 ir vektoriumi su CFTR geno seka, liuciferazės aktyvumas sumažėjo 50 proc. (p = 0,005), palyginti su neigiama kontrole (7 pav.). Ląstelėse transfekuotose imitatoriumi hsa-miR-1246 ir vektoriumi su AXIN2 liuciferazės aktyvumas sumažėjo 52,7 proc. (p = 0,039) (8 pav.). Ląstelėse, transfekuotose imitatoriumi hsa-miR-1246 ir vektoriumi su CFTR arba AXIN2 mutantine geno seka, liuciferazės aktyvumo pokytis nenustatytas (7, 8 pav.).
Pav. nr. 7. Liuciferazės aktyvumas po ląstelių transfekcijos miRNR-1246 ir vektoriais, turinčiais laukinio bei mutantinio tipo CFTR geno taikinines sekas. Žvaigždute (*)
pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai (*p £ 0,05). CFTR_mt – vektorius turintis CFTR mutantinę seką, t. y. hsa-miR-1246 prisijungimo vietos neturinti seka. CFTR_wt – vektorius turintis CFTR seką, prie kurios komplementariai gali jungtis hsa-miR-1246.
Pav. nr. 8. Liuciferazės aktyvumas po ląstelių transfekcijos miRNR-1246 ir vektoriais, turinčiais AXIN2 laukinio bei mutantinio tipo taikinines sekas. Žvaigždute (*)
pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai (*p £ 0,05). AXIN2_mt – vektorius turintis AXIN2 mutantinę seką, t.y. hsa-miR-1246 prisijungimo vietos neturinti seka. AXIN2_wt –
vektorius turintis AXIN2 seką, prie kurios komplementariai gali jungtis hsa-miR-1246.
3.3 CFTR ir AXIN2 genų raiškos analizė
Atlikus transfekciją miR-1246 imitatoriumi, po 24 val. CFTR geno raiška Caco-2 ląstelėse padidėjo 1,04 proc. (p = 0,46), o po 48 val. sumažėjo 1,27 karto (p = 0,17) (9 pav.). Praėjus 24 val. po transfekcijos miR-1246 imitatoriumi AXIN2 geno raiška padidėjo 1,04 karto (p = 0,02), po 48 val. AXIN2 geno raiška sumažėjo 1,7 karto (p = 0,09) (10 pav.).
Pav. nr. 9. CFTR raiškos pokytis Caco-2 ląstelių linijoje paveikus ląsteles miR-1246 imitatoriumi, po transfekcijos praėjus 24 ir 48 val. Paveiksle pavaizduotos ∆Ct vertės,
normalizuotos pagal ACTB geną, pavaizduotos logoritminėje skalėje.
Pav. nr. 10. AXIN2 raiškos pokytis Caco-2 ląstelių linijoje paveikus ląsteles miR-1246 imitatoriumi, po transfekcijos praėjus 24 ir 48 val. Paveiksle pavaizduotos ∆Ct
vertės, normalizuotos pagal ACTB geną, pavaizduotos logoritminėje skalėje.
SW620 ląstelėse praėjus 24 val. po transfekcijos miR-1246 imitatoriumi CFTR geno raiška sumažėjo 1,04 karto (p = 0,52), o po 48 val. - raiška sumažėjo 1,16 karto (p = 0,03) (11 pav.).
Pav. nr. 11. CFTR raiškos pokytis SW620 ląstelių linijoje paveikus ląsteles miR-1246 imitatoriumi, po transfekcijos praėjus 24 ir 48 val. Paveiksle matomos ∆Ct vertės,
normalizuotos pagal ACTB geną, pavaizduotos logoritminėje skalėje. Žvaigždute (*) pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai (*p £ 0,05).
AXIN2 geno raiška SW620 ląstelėse po transfekcijos miR-1246 imitatoriumi praėjus 24 val. padidėjo 1,13 karto (p = 0,49), o po 48 val. - raiška sumažėjo 1,19 karto (p = 0,0006) (12 pav.).
Pav. nr. 12. AXIN2 raiškos pokytis SW620 ląstelių linijoje paveikus ląsteles miR-1246 imitatoriumi, po transfekcijos praėjus 24 ir 48 val. Paveiksle matomos ∆Ct
vertės, normalizuotos pagal ACTB geną, pavaizduotos logoritminėje skalėje. Žvaigždute (*) pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai (*p £ 0,05).
*
*
3.4 CFTR ir AXIN2 baltymų raiškos analizė
CFTR baltymo raiška Caco-2 ląstelėse 72 val. po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi sumažėjo 1,66 karto (p = 0,2), palyginus su neigiama kontrole, AXIN2 baltymo raiška Caco-2 ląstelėse sumažėjo 1,01 karto (p = 0,93) (13 pav.).
CFTR (168 kDa) GAPDH (36 kDa) AXIN2 (95 kDa) GAPDH (36 kDa)
Pav. nr. 13. CFTR ir AXIN2 baltymo raiška Caco-2 ląstelėse po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi praėjus 72 val., palyginti su
neigiama kontrole, normalizuota pagal GAPDH baltymo raišką. NC –
neigiamu miRNR kontrolės imitatoriumi paveiktų ląstelių baltymo mėginiai; M1246 – su hsa-miR-1246 paveiktų ląstelių baltymo mėginiai
NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6
SW620 ląstelių linijoje praėjus 72 val. po transfekcijos CFTR raiška sumažėjo 1,04 karto (p = 0,63), AXIN2 baltymo neaptikta (14 pav.).
CFTR (168 kDa)
GAPDH (36 kDa)
Pav. nr. 14. CFTR baltymo raiška SW620 ląstelėse po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi praėjus 72 val., palyginti su neigiama kontrole, normalizuota pagal GAPDH baltymo raišką. NC
– neigiamu miRNR kontrolės imitatoriumi paveiktų ląstelių baltymo mėginiai; M1246 – su hsa-miR-1246 paveiktų ląstelių baltymo mėginiai
NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6 NC M1 24 6
REZULTATŲ APTARIMAS
Storosios žarnos vėžys (SŽV) vienas iš dažniausiai pasireiškiančių navikų Lietuvoje ir pasaulyje, todėl genetiniai ir epigenetiniai tyrimai, susiję su šios ligos patogeneze yra labai reikšmingi. Yra žinoma, kad mikroRNR molekulės svarbios įvairių ligų, tarp jų ir vėžinių, patogenezėje, todėl mikroRNR raiškos, jų genų taikinių ir funkcijos tyrimai atskleidžia daugiau galimybių panaudoti šias molekules kaip diagnostinį ar terapinį įrankį. Neseniai atrasta hsa-miR-1246 yra siejama su stemplės adenokarcinoma (75), prostatos (76) bei smulkialąsteliniu plaučių (77), storosios žarnos (78) navikais, kuriuose buvo nustatyta padidėjusi jos raiška.
Šio tyrimo metu buvo nustatyta, jog hsa-miR-1246 raiška yra padidėjusi komercinėse storosios žarnos vėžio ląstelėse SW620 ir Caco-2, palyginus su storosios žarnos audiniu. Kitų mokslininkų atliktose studijose taip pat buvo nustatyta padidėjusi hsa-miR-1246 raiška komercinėse storosios žarnos vėžio ląstelėse HCT116, HT-29, RKO, SW48, ir SW480, palyginus su storosios žarnos audiniu (45).
Yra žinoma, jog hsa-miR-1246 genai taikiniai yra p53 (5), CADM1 (6), CCNG2 (7) bei THBS2 (8), kurie dalyvauja ląstelių diferenciacijoje, inavizijoje, metastazavime ir yra atsakingi už vėžinių ląstelių atsparumą chemoterapijai, tačiau vis dar trūksta žinių apie hsa-miR-1246 vaidmenį storosios žarnos vėžio patogenezėje.
Šiame darbe, naudojant liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremtą sistemą, buvo patvirtinta, kad CFTR (1537-1544 3' UTR) ir AXIN2 (313-320 3' UTR) genai yra hsa-miR-1246 tiesioginiai taikiniai, kurie in silico turėjo po vieną 8-nių merų mikroRNR ir geno taikinio sekos sąveiką.
Ląstelėse, kurios buvo transfekuotos hsa-miR-1246 imitatoriumi ir vektoriais su CFTR geno seka, liuciferazės aktyvumas sumažėjo 50 proc. (p = 0,005), palyginus su neigiama kontrole, o AXIN2 – 52,7 proc. (p = 0,039), todėl galima teigti, jog šie genai yra tiesioginiai hsa-miR-1246 taikiniai.
Siekiant patvirtinti hsa-miR-1246 potranskripcinę reguliaciją in vitro, buvo atlikta jos genų taikinių CFTR ir AXIN2 raiška, eksperimentiškai padidinus jos kiekį ląstelėje. Praėjus 48 val. po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi sumažėjo CFTR ir AXIN2 genų raiška storosios žarnos vėžinėse ląstelėse SW620 ir Caco-2, palyginus su neigiama kontrole, tai parodė, kad hsa-miR-1246 reguliuoja potranskripcinį tiriamųjų genų aktyvumą Caco-2 ir SW620 ląstelėse.
CFTR genas koduoja baltymą, vadinamą cistinės fibrozės tarpmembraninio laidumo reguliatoriumi, kuris reguliuoja rūgščių bei šarmų pusiausvyrą ir užtikrina žmogaus organizmo homeostazę, be to, veikia kaip naviką slopinantis genas (79). Šis baltymas veikia kaip kanalas tarp ląstelių, kurios gamina gleives, prakaitą, seiles, ašaras ir virškinimo fermentus. Baltymas transportuoja neigiamo krūvio daleles (Cl- ir HCO-3) į ląsteles ir iš jų. Chloro jonų transportavimas padeda kontroliuoti
vandens judėjimą audiniuose, kas turi įtakos reikiamam gleivių kiekio susidarymui. Gleivės apsaugo kvėpavimo takų, virškinimo ir reprodukcinės sistemos organų audinius (80).
Esant CFTR geno mutacijoms, ar sumažėjusiai geno raiškai, virškinimo trakte sumažėja anijonų (Cl- ir HCO-3), todėl sutrinka skysčių transportas ląstelėse, gleivių sekrecija ir pH. Yra žinoma, kad
sutrikusi joninių kanalų funkcija keičia ląstelės homeostazę, turi įtakos ląstelės ciklui, proliferacijai, apoptozei, todėl siejama su navikų patogeneze (80). Atlikti tyrimai su pelėmis parodė, kad esant CFTR geno mutacijoms, pelėms išsivystė plonosios ir storosios žarnos navikai, o 60 proc. pelių neturinčioms šio geno (angl. knockout mouse) išsivystė plonosios arba storosios žarnos navikai per pirmuosius gyvenimo metus (79).
AXIN2 geno koduojamas baltymas kartu su kitais baltymais (CKI, GSK3, APC) suriša beta kateniną ir slopina WNT signalinį kelią (angl, Wingless/Integrase-1) (81), kuris yra siejamas su naviko geneze ir metastazėmis (82). Kendimalla R ir jo tyrėjų grupė 2017 m. nustatė, kad nutildžius WNT signalinio kelio genų reguliatorius – AXIN2, DKK1, APCDD1 inicijuojama naviko genezė ar naviko recidyvas storojoje žarnoje (64).
Siekiant nustatyti hsa-miR-1246 poveikį baltymų lygmenyje, buvo atlikta CFTR bei AXIN2 baltymų raiškos analizė, padidinus jos kiekį imitatoriumi storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 bei SW620, tačiau statistiškai reikšmingo CFTR ir AXIN2 baltymų raiškos pokyčio nenustatėme. Yra žinoma, kad geno raiška iRNR ir baltymo lygyje kinta neproporcingai, nes nuo vienos iRNR molekulės ląstelėje gali būti susintetinta nuo kelių tūkstančių iki kelių milijonų baltymo molekulių (83), tai reiškia, kad dėl potranskripcinių ar transliacinių mechanizmų, pakitus geno raiškai iRNR lygyje, baltymo raiška gali nepasikeisti (84). Tokie skirtumai pastebėti tiriant baltymus, kurie dalyvauja transkripcijoje, ląstelės ciklo reguliacijoje, diferenciacijoje ar proliferacijoje (83).
Apibendrinant, šio tyrimo metu, liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremta sistema, pirmą kartą buvo nustatyta tiesioginė hsa-miR-1246 ir genų CFTR bei AXIN2 sąsaja. Be to, hsa-miR-1246 epigenetinis poveikis CFTR bei AXIN2 genų raiškai. Siekiant išsiaiškinti hsa-miR-1246 poveikį vėžinių ląstelių funkcijai reikėtų atlikti ląstelių proliferacijos, apoptozės, gyvybingumo, kolonijų formavimo tyrimus.
IŠVADOS
1. Hsa-miR-1246 raiška storosios žarnos vėžinėse ląstelėse SW620 ir Caco-2 buvo didesnė, palyginti su storosios žarnos audiniu.
2. Naudojant liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremtą sistemą, buvo patvirtinta, kad CFTR ir AXIN2 genai yra hsa-miR-1246 tiesioginiai taikiniai.
3. Eksperimentiškai padidinus hsa-miR-1246 kiekį, po 48 val. AXIN2 geno raiška sumažėjo storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620, o CFTR geno raiška sumažėjo SW620 ląstelėse.
4. Eksperimentiškai padidinus hsa-miR-1246 kiekį storosios žarnos vėžinėse ląstelėse Caco-2 ir SW620 AXIN2 ir CFTR baltymų raiška nepakito.
LITERATŪRA
1. Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature [Internet]. 2004 Sep 16 [cited 2019 Mar 13];431(7006):350–5. Available from: http://www.nature.com/articles/nature02871
2. Nana-Sinkam SP, Croce CM. Clinical Applications for microRNAs in Cancer. Clin Pharmacol
Ther [Internet]. 2013 Jan;93(1):98–104. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1038/clpt.2012.192
3. Pichler M, Calin GA. MicroRNAs in cancer: from developmental genes in worms to their clinical application in patients. Br J Cancer [Internet]. 2015 Aug 9;113(4):569–73. Available from: http://www.nature.com/articles/bjc2015253
4. Levin AA, Chen A, Patick AK, Rodriguez-Torres M, van der Meer AJ, King BD, et al. Treatment of HCV Infection by Targeting MicroRNA. N Engl J Med. 2013;368(18):1685–94.
5. Liao J, Zhou X, Zhang Y, Lu H. MiR-1246: A new link of the p53 family with cancer and Down syndrome. Cell Cycle [Internet]. 2012 Jan 15;11(14):2624–30. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/cc.20809
6. Sun Z, Meng C, Wang S, Zhou N, Guan M, Bai C, et al. MicroRNA-1246 enhances migration and invasion through CADM1 in hepatocellular carcinoma. BMC Cancer [Internet]. 2014 Dec 27;14(1):616. Available from: http://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2407-14-616
7. Hasegawa S, Eguchi H, Nagano H, Konno M, Tomimaru Y, Wada H, et al. MicroRNA-1246 expression associated with CCNG2-mediated chemoresistance and stemness in pancreatic cancer. Br J Cancer [Internet]. 2014 Oct 12;111(8):1572–80. Available from: http://www.nature.com/articles/bjc2014454
8. Chen J, Yao D, Zhao S, He C, Ding N, Li L, et al. MiR-1246 promotes SiHa cervical cancer cell proliferation, invasion, and migration through suppression of its target gene thrombospondin 2. Arch Gynecol Obstet [Internet]. 2014 Oct 8;290(4):725–32. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s00404-014-3260-2
9. Bhaskaran M, Mohan M. MicroRNAs. Vet Pathol [Internet]. 2014 Jul 17;51(4):759–74. Available from: http://journals.sagepub.com/doi/10.1177/0300985813502820
10. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell [Internet]. 1993 Dec 3;75(5):843–54. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/009286749390529Y
11. Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Res [Internet]. 2014 Jan 1;42(D1):D68–73. Available from: https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gkt1181
12. Ameres SL, Zamore PD. Diversifying microRNA sequence and function. Nat Rev Mol Cell Biol [Internet]. 2013 Aug 26;14(8):475–88. Available from: http://www.nature.com/articles/nrm3611 13. Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet [Internet]. 2010 Sep 27;11(9):597–610. Available from: http://www.nature.com/articles/nrg2843
14. Catalanotto C, Cogoni C, Zardo G, Catalanotto C, Cogoni C, Zardo G. MicroRNA in Control of Gene Expression: An Overview of Nuclear Functions. Int J Mol Sci [Internet]. 2016 Oct 13;17(10):1712. Available from: http://www.mdpi.com/1422-0067/17/10/1712
15. Borchert GM, Lanier W, Davidson BL. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol [Internet]. 2006 Dec 12;13(12):1097–101. Available from: http://www.nature.com/articles/nsmb1167
16. Blaszczyk J, Tropea JE, Bubunenko M, Routzahn KM, Waugh DS, Court DL, et al. Crystallographic and Modeling Studies of RNase III Suggest a Mechanism for Double-Stranded RNA Cleavage. Structure [Internet]. 2001 Dec 1;9(12):1225–36. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969212601006852
17. Romero-Cordoba SL, Salido-Guadarrama I, Rodriguez-Dorantes M, Hidalgo-Miranda A. miRNA biogenesis: Biological impact in the development of cancer. Cancer Biol Ther [Internet].
2014 Nov 2;15(11):1444–55. Available from:
http://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/15384047.2014.955442
18. Chendrimada TP, Gregory RI, Kumaraswamy E, Norman J, Cooch N, Nishikura K, et al. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature
[Internet]. 2005 Aug 22;436(7051):740–4. Available from:
http://www.nature.com/articles/nature03868
19. Lee Y, Jeon K, Lee J-T, Kim S, Kim VN, Kim VN. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J [Internet]. 2002 Sep 2;21(17):4663–70. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12198168
20. Maniataki E, Mourelatos Z. A human, ATP-independent, RISC assembly machine fueled by pre-miRNA. Genes Dev [Internet]. 2005 Dec 15;19(24):2979–90. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16357216
21. Ha M, Kim VN. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol [Internet]. 2014 Aug 16;15(8):509–24. Available from: http://www.nature.com/articles/nrm3838
22. Ipsaro JJ, Joshua-Tor L. From guide to target: molecular insights into eukaryotic RNA-interference machinery. Nat Struct Mol Biol [Internet]. 2015 Jan 7;22(1):20–8. Available from: http://www.nature.com/articles/nsmb.2931
James C. Carrington, editor. PLoS Biol [Internet]. 2005 Feb 15;3(3):e85. Available from: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pbio.0030085
24. Iorio M V, Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review.; Available from: http://mirbase.org/
25. Jonas S, Izaurralde E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet [Internet]. 2015 Jul 16;16(7):421–33. Available from: http://www.nature.com/articles/nrg3965
26. Jeske M, Temme C, Wahle E. Assaying mRNA Deadenylation In Vitro. In Humana Press, Totowa, NJ; 2014. p. 297–311. Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-62703-971-0_24
27. Jackson RJ, Hellen CUT, Pestova T V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol [Internet]. 2010 Feb 1;11(2):113–27. Available from: http://www.nature.com/articles/nrm2838
28. Gosline SJC, Gurtan AM, JnBaptiste CK, Bosson A, Milani P, Dalin S, et al. Elucidating MicroRNA Regulatory Networks Using Transcriptional, Post-transcriptional, and Histone Modification Measurements. Cell Rep [Internet]. 2016 Jan 12;14(2):310–9. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124715014552
29. Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs — microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer [Internet]. 2006 Apr;6(4):259–69. Available from: http://www.nature.com/articles/nrc1840 30. Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer [Internet]. 2006
Nov;6(11):857–66. Available from: http://www.nature.com/articles/nrc1997
31. Farazi TA, Hoell JI, Morozov P, Tuschl T. MicroRNAs in Human Cancer. In Springer, Dordrecht; 2013. p. 1–20. Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-94-007-5590-1_1
32. Zhang L, Huang J, Yang N, Greshock J, Megraw MS, Giannakakis A, et al. microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human cancer [Internet]. 2006. Available from: www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0508889103
33. Davis BN, Hilyard AC, Nguyen PH, Lagna G, Hata A. Smad Proteins Bind a Conserved RNA Sequence to Promote MicroRNA Maturation by Drosha. Mol Cell [Internet]. 2010 Aug
13;39(3):373–84. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276510005332
34. Trabucchi M, Briata P, Garcia-Mayoral M, Haase AD, Filipowicz W, Ramos A, et al. The RNA-binding protein KSRP promotes the biogenesis of a subset of microRNAs. Nature [Internet]. 2009 Jun 20;459(7249):1010–4. Available from: http://www.nature.com/articles/nature08025
35. Adrian Calin G, Dan Dumitru C, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic
leukemia [Internet]. Available from: www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.242606799
36. Adrian Calin G, Sevignani C, Dan Dumitru C, Hyslop T, Noch E, Yendamuri S, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers [Internet]. 2004. Available from: www.gene.ucl.ac.uk
37. Rosenfeld N, Aharonov R, Meiri E, Rosenwald S, Spector Y, Zepeniuk M, et al. MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin. Nat Biotechnol [Internet]. 2008 Apr 23;26(4):462–9. Available from: http://www.nature.com/articles/nbt1392
38. Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, Pushkaran B, Liggins AP, Pulford K, et al. Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol [Internet]. 2008 Jun 1;141(5):672–5. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1365-2141.2008.07077.x
39. Iorio M V, Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med [Internet]. 2012 Mar 8;4(3):143–59. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22351564
40. Krishnan K, Steptoe AL, Martin HC, Wani S, Nones K, Waddell N, et al. MicroRNA-182-5p targets a network of genes involved in DNA repair. RNA [Internet]. 2013 Feb 1;19(2):230–42. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23249749
41. Liu Z, Liu J, Segura MF, Shao C, Lee P, Gong Y, et al. MiR-182 overexpression in tumourigenesis of high-grade serous ovarian carcinoma. J Pathol [Internet]. 2012 Oct 1;228(2):204–15. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/path.4000
42. Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Tanaka Y, Tabatabai ZL. Oncogenic miRNA-182-5p Targets Smad4 and RECK in Human Bladder Cancer. PLoS One [Internet]. 2012;7(11):51056. Available from: www.plosone.org
43. Sun Y, Fang R, Li C, Li L, Li F, Ye X, et al. Hsa-mir-182 suppresses lung tumorigenesis through down regulation of RGS17 expression in vitro. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2010
May 28;396(2):501–7. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X1000820X
44. Bracken CP, Scott HS, Goodall GJ. A network-biology perspective of microRNA function and dysfunction in cancer. Nat Rev Genet [Internet]. 2016 Dec 31;17(12):719–32. Available from: http://www.nature.com/articles/nrg.2016.134
45. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. Akagi T, editor. PLoS One [Internet]. 2014 Apr 4;9(4):e92921. Available from: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0092921 46. Lindow M, Kauppinen S. Discovering the first microRNA-targeted drug. J Cell Biol [Internet].
47. Huang Y, Zou Q, Song H, Song F, Wang L, Zhang G, et al. REVIEW A study of miRNAs targets prediction and experimental validation.; Available from: http://www.
48. Carroll AP, Goodall GJ, Liu B. Understanding principles of miRNA target recognition and function through integrated biological and bioinformatics approaches. Wiley Interdiscip Rev
RNA [Internet]. 2014 May 1;5(3):361–79. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1002/wrna.1217
49. Guo H, Ingolia NT, Weissman JS, Bartel DP. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature [Internet]. 2010 Aug 12;466(7308):835–40. Available from: http://www.nature.com/articles/nature09267
50. Hendrickson DG, Hogan DJ, McCullough HL, Myers JW, Herschlag D, Ferrell JE, et al. Concordant Regulation of Translation and mRNA Abundance for Hundreds of Targets of a Human microRNA. Zamore PD, editor. PLoS Biol [Internet]. 2009 Nov 10;7(11):e1000238. Available from: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pbio.1000238
51. Kuipers EJ, Grady WM, Lieberman D, Seufferlein T, Sung JJ, Boelens PG, et al. Colorectal cancer. Nat Rev Dis Prim [Internet]. 2015 Nov 5;1:15065. Available from: https://doi.org/10.1038/nrdp.2015.65
52. Lao VV, Grady WM. Epigenetics and colorectal cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol
[Internet]. 2011 Dec 18;8(12):686–700. Available from:
http://www.nature.com/articles/nrgastro.2011.173
53. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell [Internet]. 1990 Jun 1;61(5):759–67. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2188735
54. Dienstmann R, Vermeulen L, Guinney J, Kopetz S, Tejpar S, Tabernero J. Consensus molecular subtypes and the evolution of precision medicine in colorectal cancer. Nat Rev Cancer [Internet]. 2017 Feb 4;17(2):79–92. Available from: http://www.nature.com/articles/nrc.2016.126
55. Kuipers EJ, Grady WM, Lieberman D, Seufferlein T, Sung JJ, Boelens PG, et al. COLORECTAL
CANCER.; Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4874655/pdf/nihms769726.pdf
56. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer
[Internet]. 2015 Mar 1;136(5):E359–86. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25220842
57. GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012 v1.0 [Internet]. Available from: https://publications.iarc.fr/Databases/Iarc- Cancerbases/GLOBOCAN-2012-Estimated-Cancer-Incidence-Mortality-And-Prevalence-Worldwide-In-2012-V1.0-2012
