LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Džoneta Maslauskienė
STAPHYLOCOCCUS AUREUS IR PVL TOKSINO REIKŠMĖ PEDIATRIJOJE Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Astra Vitkauskienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3
SUMMARY ... 5
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
I. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Epidemiologija ... 12
1.2. Etiologija ... 14
1.3. Staphylococcus aureus charakteristika ... 15
1.4. S. aureus patogeniškumas ir PVL toksinas ... 16
1.5. S. aureus atsparumas antibiotikams ... 18
1.6. PVL ir S. aureus reikšmė pediatrijoje ... 19
II. TYRIMO METODIKA IR METODAI... 22
2.1. Tyrimo atlikimo vieta ... 22
2.2. Tiriamoji grupė ... 22
2.3. Tyrimo objektas ... 22
2.4. DNR išskyrimas iš tiriamosios medžiagos ... 23
2.5. Amplifikacija ... 23
2.6. Hibridizacija... 25
2.7. Rezultatų vertinimas ir interpretacija ... 26
III. REZULTATAI ... 28
3.1. S. aureus paplitimas Kauno klinikose vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais ... 28
3.2. S. aureus atsparumas antibiotikams 2012 – 2015 metais vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams ... 29
3.3. PVL toksino paplitimas sunkiomis S. aureus infekcijomis sergantiesiems ir vaikų terapiniame, intensyvios terapijos bei chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 ... 30
3.4. S. aureus atsparumo antibiotikams dinamikos 2012 – 2015 metais palyginimas bei atsparumo antibiotikams sąsajos su PVL toksino gamyba ... 31
IV. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33
V. IŠVADOS ... 36
3
SANTRAUKA
Džoneta Maslauskienė. Staphylococcus aureus ir PVL toksino reikšmė pediatrijoje.
Staphylococcus aureus – viena iš geriausiai žinomų ir daugiausiai vaikams infekcijų
sukeliančių bakterijų. Mikroorganizmas išsiskiria gebėjimu gaminti daug patogeniškumą lemiančių veiksnių, o kai kurios padermės gamina PVL toksiną, kuris atlieka didelį vaidmenį infekcijų išsivystyme ir yra susijęs su sunkesne S. aureus sukeltų infekcijų forma. Šio mikroorganizmo sukeltų infekcijų gydymas pastaruoju metu kelia didelį klinicistų susijaudinimą dėl sparčiai didėjančio sukelėjo atsparumo antibiotikams.
Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti S. aureus ir PVL toksino paplitimą vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose, bei įvertinti S. aureus atsparumą antibiotikams. Tiriant S. aureus paplitimo dažnį buvo analizuoti 7946 pasėlių duomenys, gauti iš Kauno klinikų vaikų terapijos, intensyvios terapijos ir chirurgijos skyriuose gydytų pacientų 2012 – 2015 metų laikotarpyje. Nustatant PVL toksino dažnį ir lyginant atsparumo antibiotikams dinamiką, bei tiriant PVL toksino gamybos sąsajas su atsparumu antibiotikams, buvo vertinta 121 S. aureus padermė, kuri buvo išskirta iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje, Kauno klinikose vaikų terapijos, intensyvios terapijos ir vaikų chirurgijos skyriuose 2012 – 2015 metais gydytų pacientų. Tyrimo metu PVL nustatymui buvo naudotos iš viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų, pūlių ir sterilių kūno skysčių standžiose 5 proc. kraujo agaro terpėse išaugintos S. aureus bakterijų kultūros. Tiesiogiai iš bakterijų kultūrų buvo išskirta genominė DNR ir atlikta polimerazės grandininė reakcija (PGR). Pagausinti DNR fragmentai buvo atskirti naudojant DNR hibridizacijos metodą pagal GenoType Staphylococcus VER 2.0 rinkinį. Rezultatai įvertinti pagal rinkinyje pateiktą protokolą. Iš gautųjų rezultatų buvo apskaičiuotas PVL toksino dažnis.
Tyrimo metu nustatyta, kad Kauno klinikose vaikų terapijos, intensyvios terapijos ir chirurgijos skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais S. aureus dažnis tirtoje imtyje buvo 40,9 proc. Tiriant atsparumą antibiotikams, nustatyta, kad didžiausias S. aureus atsparumas buvo penicilinui – 84,3 proc., atsparumas klindamicinui – 3,8 proc., oksacilinui – 1,9 proc. PVL toksino dažnis sunkiomis S. aureus sukeltomis infekcijomis sergančiųjų tirtoje imtyje buvo 14,9 proc. S.
aureus atsparumas oksacilinui, priklausomai nuo metų, svyravo nuo 3 iki 13,3 proc., o klindamicinui
buvo stebima mažėjimo tendencija nuo 22,5 proc. iki 3 proc., tačiau 2015 metais padidėjo iki 6,1 proc. Didžiausias atsparumas nustatytas penicilinui, kuris 2012 – 2015 svyravo nuo 80 proc. iki 95 proc.
4 Mūsų atlikto tyrimo duomenimis, S. aureus padermės, kurios gamino PVL buvo atsparesnės oksacilinui (16,7 proc.) ir penicilinui (100 proc.), bei šiek tiek jautresnės klindamicinui.
5
SUMMARY
Džoneta Maslauskienė. The importance of Staphylococcus aureus and PVL toxin in paediatrics.
Staphylococcus aureus is one of the most common infections, causing most of bacteria and
infectious disorders. Microorganism is characterized by its ability to make a lot of elements causing pathogenicity while some strain make PVL toxin, which plays a major part in infection development and is connected with a more complicated infection form, caused by S. aureus. A treatment of infections, caused by this microorganism, worries clinicians a lot as it rapidly becomes resistant to antibiotics.
The goal of this research was to find out the prevalence rate of S. aureus and PVL toxin in children’s therapeutics, intensive therapy and surgery departments and to evaluated S. aureus resistence to antibiotics. There were 7946 swab cultures analysed from children’s therapeutics, intensive therapy and surgery departments in Kaunas Clinics from the period of 2012 – 2015 while researching the prevalence rate. Estimating PVL toxin rate and comparing the dynamics of the resistance to antibiotics as well as analysing PVL toxin’s production interface with resistance to antibiotics, the strain of 121 S. aureus was evaluated. It was differencated in children’s therapeutics, intensive therapy and surgery departments in The Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kaunas Clinics, the treated patients in the period of 2012 – 2015. Bacterial cultures from upper and lower respiratory tract, pus and sterile liquid in tigh 5 proc. blood agar area grown S. aureus were used in the research. Genomic DNA was directly extracted from bacteria cultures and polymerase chain reaction (PCR) was performed. Extended DNA fragments were separated using DNA hybridization methods, according to GenoType Staphylococcus VER 2.0 kit. The results were evaluated according to the example in the kit. Final results were used to calculate the PVL toxin prevalence rate.
During the reasearch it was pointed out that in children’s therapeutics, intensive therapy and surgery departments in Kaunas Clinics from the period of 2012 – 2015 40,9 proc. Of the cases the analysed material was of S. aureus strain. While analyzing the resistence to antybiotics, it was found out that the greatest resistence of S. aureus was to penicillin – 84,3 proc., clindamycin – 3,8 proc., oxacillin – 1,9 proc. The patients, who were diagnosed with a severe infection, caused by S. aureus made 14,9 proc. of those cases with S. aureus strain, producing PVL toxin. S. aureus resistence to oxacillin varified from 3 to 13,3 proc., depending on the age. The tendency of decrease from 22,5 proc. to 3 proc. was noticeable while speaking about clindamycin, however in 2015 it increased to 6,1 proc. The biggest resistence was estimated to penicillin, which varified from 80 proc. to 95 proc. in the year
6 2012 – 2015. According to the data of the research, S. aureus, which produced PVL was more resistant to oxacillin (16,7 proc.) and penicillin (100 proc.) and a little bit more sensitive to clindamycin.
7
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Tyrimams atlikti nebuvo reikalingas biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas, nes dirbama buvo ne su pacientais, o su mikroorganizmais. Tyrimui naudotos Staphylococcus aureus kultūros ir nuasmeninta duomenų bazė.
8
SANTRUMPOS
EARSS – Europos antimikrobinio atsparumo stebėjimo tinklas (angl. European Antimicrobial Resistance Surveillance System)
ECDC – Europos ligų prevencijos ir kontrolės centras (angl. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC))
MASA – meticilinui atsparus Staphylococcus aureus MJSA – meticilinui jautrus Staphylococcus aureus PVL – Pantono Valentino leukocidinas
S. aureus – Staphylococcus aureus
9
ĮVADAS
Staphylococcus gentis priklauso Staphylococcaceae šeimai. Šią gentį sudaro net apie 49 stafilokokų rūšys (1). Klinikinėje praktikoje svarbiausios yra Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus ir Staphylococcus aureus rūšys. Staphylococcus epidermidis yra
sąlygiškai patogeniška bakterija, galinti sukelti infekcijas susilpnėjus imunitetui, Staphylococcus
saprophyticus yra šlapimo takų infekcijų sukėlėjas, Staphylococcus aureus (toliau – S. aureus) – viena
iš geriausiai žinomų ir viena dažniausiai žmonių aplinkoje sutinkamų bakterijų (2).
Daugelio pasaulio medikų ir mokslininkų teigimu, jų galima rasti ant 3 iš 10 žmonių odos, nosies gleivinės (3). Čia gyvendamos bakterijos yra normalios mikrofloros dalis ir nedaro jokios žalos. Tačiau tam tikrose situacijose jos gali sukelti įvairiausias infekcijas ir sindromus – nuo lengvų odos iki sudėtingų ir gyvybei pavojingų infekcijų (4).
Ypač didelį susirūpinimą kelia antibiotikams atsparios S. aureus padermės (5). Šiomis dienomis meticilinui atsparios S. aureus padermės (MASA) kelia nemažai diskusijų, nes yra priskiriamos prie labiausiai paplitusių hospitalinių infekcijų sukėlėjų ir yra pirmaujanti mirties priežastis tarp hospitalinėmis infekcijomis sergančių pacientų (6).
Pagrindinė S. aureus patogeniškumo priežastis, dėl kurios jis dažnai išvengia imuninės sistemos poveikio, yra jo gebėjimas išskirti įvairių imuninės sistemos vengimo faktorių, įskaitant stipraus poveikio citotoksinus, pvz., leukocidinus, proteazes ir veiksnius, kurie užkerta kelią imuninių ląstelių pažinimui ir sukelia jų žūtį (7) (8) (9) (10). Patogeniškumo priežasčių yra daug, tačiau įrodyta, kad būtent Pantono Valentino leukocidinas (PVL) sukelia žmogaus baltųjų kraujo ląstelių lizę, kas ypač svarbu infekcijos vystymuisi (11). PVL toksinas, sudarydamas poras ląstelių membranoje, suardo kraujyje neutrofilinius granuliocitus, kurie pradeda gynybą prieš S. aureus sukeltą infekciją ir taip slopinamas imuninės sistemos atsakas. Dėl PVL poveikio sukeliamas ryškus uždegiminis procesas su audinių nekroze (4) (12).
Nors yra mažiau nei 2 proc. visų S. aureus padermių, kurios gamina PVL, tačiau kai kuriose šalyse jos geba sukelti su PVL toksinu susijusias infekcijas endeminiu mąstu ir net sukelia gyvybei pavojingas invazines ligas (11) (13) (14) (15). Atlikta nemažai studijų, parodančių, kad dažniausiai S.
aureus sukeltos infekcijos pasireiškia vaikams ir jaunesnio amžiaus asmenims. Kai kurios šių
padermių gamina PVL toksiną, o PVL teigiamų padermių sukeltos infekcijos gydomos ilgiau ir sunkiau nei PVL negaminančių padermių infekcijos, dažnai jos baigiasi mirtimi (16) (17).
Atliekant šį tyrimą buvo tiriamos PVL gaminančios S. aureus padermės, taikant DNR hibridizacijos metodą. Darbo tikslas buvo įvertinti S. aureus ir PVL toksino paplitimą vaikų
10 terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose, bei S. aureus atsparumą antibiotikams šiuose skyriuose. Buvo nustatyta S. aureus ir PVL toksino dažnis 2012 – 2015 metais vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams, bei įvertintas S.
aureus atsparumas antibiotikams. Taip pat buvo palyginta S. aureus atsparumo antibiotikams dinamika
2012 – 2015 metais ir įvertintos atsparumo antibiotikams sąsajos su PVL toksino gamyba.
Raktiniai žodžiai: S. aureus, MASA, MJSA, PVL Autoriui interesų konflikto nebuvo.
11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti S. aureus ir PVL toksino paplitimą vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose, bei S. aureus atsparumą antibiotikams.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti S. aureus dažnį Kauno klinikose vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais.
2. Nustatyti S. aureus atsparumą antibiotikams 2012 – 2015 metais vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams.
3. Nustatyti sunkiomis S. aureus infekcijomis sergantiesiems ir vaikų terapiniame, intensyvios terapijos bei chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais PVL toksino dažnį. 4. Palyginti S. aureus atsparumo antibiotikams dinamiką 2012 – 2015 metais bei įvertinti atsparumo antibiotikams sąsajas su PVL toksino gamyba.
12
I.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Epidemiologija
Šiuo metu žinoma, kad Staphylococcus gentį sudaro apie 49 stafilokokų rūšys (1), tačiau viena svarbiausių ir daugiausiai diskusijų kelianti rūšis yra Staphylococcus aureus. Tai vienas iš reikšmingiausių infekcijų sukėlėjų, kuris paplitęs tiek ligoninėje, tiek visuomenėje. S. aureus priskiriamas normaliai žmogaus mikrofloros daliai ir kolonizuoja apie 30 proc. sveikų žmonių odą, nosies gleivinę, žarnyną, moterims makštį, tarpvietę, įvairias žaizdas, pvz. nudegimų. Taip pat gali kolonizuoti ar užkrėsti beveik visus savo šeimininko gilesnius audinius, įskaitant kaulus, sąnarius, raumenis, širdį, plaučius (1) (18).
S. aureus paplitęs mus supančioje aplinkoje ir yra susijęs su itin dideliu sergamumu ir
mirtingumu. Jo sukeltos infekcijos įvairiose Europos ir pasaulio valstybėse paplitę nevienodai (19) (20). Europoje šios infekcijos sudaro 2 – 40 proc. visų sveikatos priežiūros įstaigose įgytų stafilokokinių infekcijų (21). Europos antimikrobinio atsparumo stebėjimo tinklo (EARSS) ir Europos ligų prevencijos ir kontrolės centro duomenimis (ECDC), daugiausiai meticilinui atsparių S. aureus (MASA) sukeltų infekcijų registruojama Pietų Europos šalyse – iki 50 proc., o mažiausiai Islandijoje ir Europos šiaurinėse šalyse – iki 5 proc. Tuo tarpu Rytų ir Vidurio Europoje, įskaitant ir Lietuvą, MASA paplitimas gali siekti iki 25 proc. (1 pav.) (22) (23).
13 1 pav. MASA paplitimas Europos šalyse 2012 metais (ECDC, 2014)
MASA sukeliamos infekcijos ypač aktuali problema Ausralijoje, kurioje MASA paplitę iki 70 proc., Japonijoje bei Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV), kur MASA paplitimas siekia net iki 80 proc. (24). 2007 metais buvo paskelbta, kad kiekvienais metais JAV susiduriama su 90 000 naujų meticilinui atsparių S. aureus atvejų, iš kurių net 20 000 pasibaigia mirtimi. Apskaičiuota, kad kiekvienais metais Jungtinėse Amerikos Valstijose S. aureus sukelia daugiau nei 1,8 mln mirčių (25). Toki aukšti mirštamumo rodikliai pranoksta net tokių ligų kaip ŽIV, virusinio hepatito ir tuberkuliozės mirštamumo rodiklius (2 pav.) (26) (27).
14 2 pav. Mirčių skaičius per metus JAV 2009
Su visuomene siejamos S. aureus bakterijos dažniausiai yra jautrios meticilinui. Tačiau su ligoninės aplinka susiję stafilokokai yra atsparūs jam, o kartais – ir kitiems antibiotikams. Dėl to šios infekcijos yra ypač pavojingos, jų gydymas – ilgas, brangus ir sudėtingas. JAV, Didžiojoje Britanijoje ir kitose šalyse meticilinui atsparūs stafilokokaijau plačiai cirkuliuoja ne tik ligoninėse, bet ir visuomenėje, dėl to situacija kelia didelį susirūpinimą (3 pav.) (28).
3 pav. Penicilinui ir meticilinui atsparių S. aureus plitimas Jungtinėse Amerikos Valstijose (28)
1.2. Etiologija
Pagrindinis S. aureus plitimo kelias yra kontaktinis. Mikroorganizmas dažniausiai perduodamas tiesioginio ir netiesioginio kontakto būdu per stafilokokais užterštą odą, rankas, higienos
15 reikmenis, gali būti įgyjamas nuo įvairių aplinkos paviršių. Taip pat bakterija gali plisti per orą. Šis plitimo kelias svarbus viršutinių kvėpavimo takų kolonizacijai (29) (30).
Tapti S. aureus nešiotuju riziką didina asmens amžius, lytis, sezoniškumas, šeimos istorija, tam tikras gyvenimo būdas, pvz. intraveninių narkotikų vartojimas, tam tikros ligos, tokios kaip cukrinis diabetas, įvairios odos ligos. Pastebėta, kad dažniau S. aureus kolonizuoja asmenis, kurie dirba medicinos įstaigose (2) (18) (31) (32). Viršutinių kvėpavimo takų S. aureus kolonizacijai įtakos gali turėti ir alerginės ligos, gyvenimas su kitais asmenimis.
Neretai S. aureus gali kolonizuoti organizmo tam tikras kūno vietas nesukeliant jokių simptomų ir mes galime būti jo nešiotojais apie tai net nežinodami (33). Tačiau tam tikrose situacijose, tokiose kaip suprastėjus mitybai, pervargus ar susirgus kokia kita liga, organizmo gebėjimas pasipriešinti sukėlėjui nusilpsta ir S. aureus gali sukelti pačių įvairiausių infekcijų – nuo santykinai lengvų odos, tokių kaip folikulitas, furunkuliozė, iki sudėtingų ir gyvybei pavojingų infekcijų, tokių kaip giluminis abscesas, osteomielitas, pneumonija, sepsis, bakteremija ir endokarditas (34) (18).
1.3. Staphylococcus aureus charakteristika
Staphylococcus aureus yra 1μm diametro, sferinės formos mikroorganizmas. Tai nejudrus
sporų nesudarantis fakultatyvinis anaerobas (35). Žiurint pro mikroskopą S. aureus atrodo taip, kaip ir kiti stafilokokai – išsidėstę krūvelėmis, primenančiomis vynuogių kekes. Gramo būdu dažosi mėlynai (4 pav.) (36).
4 pav. S. aureus pro mikroskopą (1000x)
Kraujo agaro terpėse S. aureus auga didelėmis, apvaliomis, auksinio atspalvio kolonijomis, apie kurias dažnai matoma hemolizės zona (5 pav.) (36).
16 5 pav. S. aureus kolonija ant kraujo agaro
S. aureus identifikacijai svarbu tai, kad jie gamina fermentą katalazę, todėl kartais
naudojamas katalazės aktyvumo testas, norint atskirti stafilokokus nuo enterokokų ir streptokokų. Pačią S. aureus rūšį nuo kitų stafilokokų padeda atskirti koaguliazės testas, kuris būna teigiamas (37).
Auksiniai stafilokokai pasižymi gebėjimu gaminti daugiau nei 30 skirtingų ektraląstelinių produktų. Beveik visos stafilokokų padermės išskiria grupę baltymų ir citotoksinų, kurie apima hemolizinus, nukleazes, proteazes, lipazes, hialiuronidazę ir kolaganazę. Kai kurios padermės gamina vieną ar daugiau egzobaltymų, kurie apima toksinio šoko sindromo toksiną – 1 (TŠST – 1), stafilokokinius enterotoksinus (SEA – E, G – I), eksfoliacinius toksinus (ETA ir ETB) ir Pantono Valentino leukocidiną (PVL) (38) (39).
1.4. S. aureus patogeniškumas ir PVL toksinas
S. aureus patogeniškumas priklauso nuo įvairių pačios bakterijos paviršiaus komponentų ir
ekstraląstelinių baltymų. Pagrindinė organizmo gynyba prieš S. aureus yra neutrofilų atsakas. Kuomet
S. aureus patenka ant odos paviršiaus, neutrofilai ir makrofagai migruoja į infekcijos vietą. S. aureus šį
atsaką sugeba blokuoti įvairiais būdais, pvz. blokuoja leukocitų chemotaksį, taip pat apsisaugoti padeda bakteriją gaubianti polisacharidinė kapsulė. Nors yra labai sunku nustatyti konkrečius virulentiškumo veiksnius, susijusius su infekcija, dažnas stafilokokų, kurie gamina leukocidinus, nustatymas pacientams su sunkiomis odos ir minkštųjų audinių infekcijomis, ypač furunkulioze, odos abcesais ir visuomenėje įgyta sunkia nekrozuojančia pneumonija, rodo, kad PVL yra vienas iš virulentiškumo faktorių, kurie atlieka didelį vaidmenį infekcijos išsivystyme. Įrodyta, kad būtent PVL sukelia žmogaus baltųjų kraujo ląstelių lizę (11) (40) (41) (42) (43) (44).
Visos S. aureus padermės gali gaminti mažiausiai tris (HlgAB, HlgCB ir LukAB/HG) iš šešių žinomų leukocidinų. Labiausiai virulentiškos klinikinės padermės, galinčios užkrėsti žmogų, gamina net penkias rūšis leukocidinų (HlgAB, HlgCB, LukAB/HG, Pantono Valentino leukocidiną (PVL) ir LukED) (45).
17 Pantono Valentino leukocidino toksiną gamina tik nedaugelis (apie 2 proc.) visų
Staphylococcus aureus padermių, įskaitant ir meticilinui jautrias ir jam atsparias padermes, kai tuo
tarpu gama hemoliziną gamina daugiau kaip 99 proc. S. aureus padermių (46).
PVL buvo atrastas 1894 metais, kai Van de Valde pastebėjo, kad šis auksinio stafilokoko išskiriamas toksinas geba lizuoti triušio leukocitus (47). Tačiau pavadinimą toksinas gavo tik 1932 metais, po to, kai Sir Philip Noel Panton and Francis Valentine jį aprašė ir susiejo toksiną su minkštųjų audinių infekcija, šių mokslininkų garbei toksinas ir buvo pavadintas Pantono Valentino leukocidinu (PVL) (48). Po atlikto tyrimo Prancūzijoje, S. aureus padermės kurios gamina PVL, pirmiausia buvo susietos su pirmine odos infekcija (49), o tolimesni tyrimai parodė, kad PVL lemia ne tik pirminę odos infekciją, bet ir pneumoniją (40).
PVL toksiną produkuojančios S. aureus padermės dažniausiai nustatomos polimerazės grandinine reakcija (PGR) pagrįstais metodais, kurių metu aptinkamos genetinės sekos, koduojančios PVL bei kitas S. aureus produkuojamas medžiagas (50) (51). PVL yra užkoduotas dviejų genų LukS – PV ir LukF – PV (44). Luks – PV ir LukF – PV yra atitinkamai 939 ir 978 nukleotidų dydžio. Jie yra atskirti timino nukleotido ir trankskribuojami kaip viena iRNR molekulė (43).
PVL toksiną sudaro du komponentai LukS – PV ir LukF – PV. Jie atitinka 32 ir 38 kDa dydį. Šie du komponentai geba suformuoti neutrofilų membranoje poras ir sukelti neutrofilų suardymą, ko pasekoje išsivysto leukopenija, hemoragijos ir audinių nekrozė (43) (11). S. aureus sukeliamos infekcijos metu, pirmiausiai sekretuojami vandenyje tirpūs LukF – PV ir LukS – PV monomerai. Jie jungiasi prie leukocitų membranos paviršiaus (6 pav. A). Vėliau monomerai jungiasi į heterodimerus (6 pav. B), šie į heterotetromerus (6 pav. C). Heterotetromerai susirenka į disko pavidalą ir formuoja porą sudarančią struktūrą, kuri yra sudaryta iš LukF – PV ir LukS – PV subvienetų (6 pav. D). Po tam tikrų konformacinių pokyčių susiformuoja transmembraninė pora (6 pav. E), kuri lengvai leidžia į ląstelę patekti kalcio jonams, kurie ir sukelia kraujo ląstelės mirtį – nekrozę ir apoptozę (52) (43).
18 1.5. S. aureus atsparumas antibiotikams
Viena svarbiausių S. aureus savybių, dėl kurios registruojamas didelis stafilokokinių infekcijų skaičius ir pasireiškia didelis mirtingumas – mikroorganizmo atsparumas antibiotikams (1) (53). Prieš atsirandant antibiotikams, pacientų mirštamumas nuo stafilokokų sukeltų infekcijų sudarė daugiau nei 80 proc. Antibiotikų eros pradžia prasidėjo atradus peniciliną, o vėliau ir meticiliną. Šie antibiotikai priskiriami beta laktaminiams antibiotikams ir dar vadinami penicilazei atspariais penicilinais. 1940 metų pradžioje, atradus peniciliną, pacientų, sergančių stafilokokine infekcija, prognozė ženkliai pagerėjo, mirštamumo rodikliai sumažėjo iki 12 – 22 proc. Tačiau dar po kelių metų, iš pradžių ligoninėse, o vėliau ir visuomenėje buvo nustatyti penicilinui atsparūs stafilokokai (28) (30). 1994 metais Kirby pirmasis ištyrė S .aureus atsparumą penicilinui (54). Jis yra nulemtas blaz geno, kuris koduoja penicilinazę, kuri dabar žinoma kaip β-laktamazė. Ji geba skaidyti peniciliną. Tai daugiausia ektraląstelinis baltymas, kuris yra sintezuojamas, kuomet stafilokokas yra veikiamas beta laktaminių antibiotikų. Tuomet hidrolizuojamas beta laktamo žiedas ir beta laktamas tampa neaktyvus (55). Iki 1960 metų pabaigos daugiau kaip 80 proc. visų nustatomų stafilokokų buvo atsparūs penicilinui (28). Tais pačiais 1960 metais buvo sukurtas dar vienas šiuos mikroorganizmus veikiantis antibiotikas – meticilinas, tinkantis S. aureus sukeltoms infekcijoms gydyti. Tai buvo pirmasis pusiau sintetinis penicilinazei atsparus penicilinas. Tačiau labai greitai stafilokokai tapo atsparūs ir šiam antibiotikui. Toks S. aureus, atsparus meticilinui, buvo pavadintas meticilinui atspariu S. aureus (MASA). Nustatyta, kad už atsparumą meticilinui yra atsakingas mecA genas, randamas visose MASA padermėse (56). MecA genas yra atsakingas už peniciliną prisijungiančio baltymo 2a (PBP2) sintezę. Būtent šis baltymas leidžia stafilokokams išgyventi net ir esant didelioms beta laktaminių antibiotikų koncentracijoms (44). Toks, greitai besivystantis atsparumas daugeliui antibiotikų įgijamas horizontalaus genų perdavimo iš išorės šaltinių būdu, tačiau atsparumo įgijimui labai svarbu ir chromosominės mutacijos, antibiotikų pasirinkimas infekcijos gydymo metu (28).
Šiuo metu MASA pripažįstama kaip viena iš svarbiausių ir pavojingiausių S. aureus padermių. MASA dažniausiai išauginama iš žaizdų, kraujo, šlapimo, šlapimo, skreplių ir nudegimų. Dažniausiai MASA išauginama pacientams, kurie gydėsi chirurgijos, reanimacijos, intensyvios terapijos bei vaikų skyriuose (57). Meticilinui atsparių padermių plitimas kelia didelį klinicistų susijaudinimą, nes infekcijų, kurias sukelia MASA, gydymo rezultatai būna blogesni už infekcijų, kurias sukelia meticilinui jautrūs stafilokokai (58) (30) (59). Kadangi sukelėjas yra ypač atsparus antibiotikams ir gamina daug virulentiškumo veiksnių, įskaitant stafilokokų enterotoksinus, proteazes, leukocidinus, baltymus susijusius su adhezija, jo sukeltų infekcijų gydymas yra gana sudėtingas (60) (61).
19 1.6. PVL ir S. aureus reikšmė pediatrijoje
S. aureus sukeliamos infekcijos ir jo atsparumas antibiotikams jau ne pirmąją dešimtmetį
kelia susirūpinimą tarp stafilokokinėmis infekcijomis sergančiųjų pacientų, ypač vaikų ir naujagimių, o
S. aureus PVL produkuojančios padermės jau tapo svarbia pasauline problema. S. aureus sukeliamos
invazinės infekcijos, įskaitant bakteremiją ir sepsį, yra vienos iš labiausiai mirtinų bakterinių ligų visame pasaulyje (62). Manoma, kad daugiau nei 1,4 mln naujagimių mirčių visame pasaulyje yra invazinių infekcijų pasekmė (63).
Atlikta nemažai studijų, parodančių S. aureus sukeliamų infekcijų svarbą tarp vaikų ir naujagimių. Lenkijos neonatalogijos priežiūros tinklo ataskaitos duomenimis, 2009 – 2012 metais S.
aureus sukėlė 6,5 proc. naujagimių infekcijų. Maždaug 33 proc. iš infekcijas sukėlusių S. aureus buvo
atsparūs meticilinui (MASA) (64). Atlikus tyrimą Jungtinėje Karalystėje, paaiškėjo, kad S. aureus buvo dažniausias naujagimių sepsio sukelėjas (63), o Švedijoje tarp tirtųjų sergančiųių vaikų, S. aureus buvo dažniausias patogenas rastas kraujo mėginiuose (65). Taip pat pastebėta, kad S. aureus labai dažnai linkęs sukelti kraujo infekcijas vaikams, kurie jau serga sunkiomis ligomis. Vaikams, turintiems piktybinių navikų, S. aureus sukelia 9 – 13 proc. kraujo infekcijų, sergantiems įgimta širdies liga – 13 proc., o turėjusiems kepenų persodinimą – net 20 proc. (66) (67) (68).
Ypatingai didelis dėmesys atkreipiamas į PVL gaminančias S. aureus padermes. Nors šį toksiną gaminančių padermių yra mažiau nei 2 proc., tačiau kai kuriose šalyse, su Staphyloccocus
aureus išskiriamu PVL toksinu susijusios infekcijos pasireiškia endeminiu mąstu ir net sukelia gyvybei
pavojingas ligas (13) (69). Dažniausiai meticilinui atsparios S. aureus PVL gaminančios padermės sukelia sunkias odos ir minkštųjų audinių infekcijas (40) (70) (71). Nors liga priskiriama paviršinėm infekcijom, tačiau nuo jos miršta daug pacientų. Šiuo metu ši infekcija yra tarp 10 dažniausių priežasčių, dėl kurių vaikai patenka į ligonines (69).
S. aureus sukeltų infekcijų epidemiologija per pastaruosiuos metus sparčiai keitėsi. 2005
metais Purcel ir kiti paskelbė gerokai padidėjusį MASA sukeltų infekcijų dažnį. 1990 metais S. aureus sukeltų odos ir minkštųjų audinių infekcijų buvo nustatoma <10 atvejų per metus, tuo tarpu 2003 metais nustatomų ligos atvejų per metus skaičius išaugo beveik iki 500 (72). Iki 2005 metų MASA sukeltos infekcijos JAV sudarė beveik 75 proc. visų stafilokokinių infekcijų. Tokie dideli MASA rodikliai reikalavo empirinio gydymo antibiotikais pokyčių, kuomet buvo įtariamas MASA (73), o ypač odos ir minštųjų audinių infekcija, kuri sudarė daugiau nei 50 proc. infekcijų sukeltų MASA (74). 2009 metais atlikta Gerber ir bedraautorių analizė, kuri apėmė 6 metų laikotarpį, taip pat parodė MASA ir jos sukeltų odos ir minkštųjų audinių infekcijų problemos aktualumą. Ištyrus beveik 60 000
S. aureus infekcijomis sergančių vaikų, nustatyta, kad 51 proc. šių infekcijų buvo sukeltos MASA, o
20 Atlikta nemažai studijų, parodančių, kad šios padermės taip pat gali sukelti sunkių invazinių ligų, tokių kaip osteomielitas, infekcinis endokarditas, sepsis (11) (13). PLV toksinas siejamas ir su lėtinėmis pasikartojančiomis infekcijomis, tokiomis kaip furunkuliozė. Pastebėta, kad PVL sukeltos infekcijos dažniau pasireiškia jauniems, iki tol buvusiems sveikiems, asmenims (11). Remiantis tyrimų duomenimis, nustatyta, kad vis dažniau PVL aukomis tampa jauni sveiki asmenys, įskaitant ir moksleivius (vidutinis amžius = 20 metų) (76) (77). PVL gaminančios S. aureus padermės gali sukelti ir daugiau sunkių ligų, tokių kaip nekrozinis plaučių uždegimas. Ši infekcija reikalauja ypatingo dėmesio, nes mirštamumo rodikliai nuo šios ligos gali siekti net 40 proc. (78) (11). Nustatyta, kad organizmo imlumas infekcijoms ir atsiradusios stafilokokinės infekcijos sunkumo laipsnis priklauso nuo geografinio paplitimo bei jautrumo antibiotikams (79) (12).
Labai daug PVL gaminančių S. aureus padermių nustatoma vaikams, sergantiems S. aureus sukeltomis infekcijomis, Kolumbijoje, kur PVL paplitimas tarp MASA padermių svyruoja nuo 73 iki 98,7 proc. Manoma, kad įvairių studijų rezultatai svyruoja gana plačiame intervale dėl pasirinktųjų tiriamųjų imties, skirtingo tiriamųjų vaikų amžiaus. Taip pat vis dažniau nustatomas mikroorganizmo atsparumas antibiotikams. Ištyrus Kartagenos mieste gydytus vaikus, nustatyta, kad iš visų tirtųjų S.
aureus atvejų 47,5 proc. sudarė MASA sukeltos infekcijos ir 52,5 proc. atvejai buvo sukelti MJSA.
Didžiają dalį tiriamųjų sudarė mokyklinio amžiaus vaikai ir paaugliai. 73,91 proc. visų S. aureus padermių turėjo PVL genus: tarp MASA buvo 80,92 proc. PVL teigiamų, o tarp MJSA 67,59 proc. PVL teigiamų S. aureus. Taip pat nustatytas PVL ryšys su atsparumu antibiotikams. PVL neigiamos padermės (23,61 proc.) buvo atsparesnės eritromicinui nei PVL teigiamos (9,31 proc.). Panašius rezultatus susijusius su PVL paplitimu tarp MASA, pateikė ir kiti Kolumbijos mokslininkai (80). Jimenez ir bendraautoriai nustatė, kad 73 proc. MASA padermių buvo PVL teigiamos, gautų iš vaikų sergančių infekcijomis (81). Bukaramangos mieste nustatyta 88 proc. PVL teigiamų MASA padermių (82). Bogotoje, Marquez - Ortiz ir kiti nustatė net 98,7 proc. MASA PVL teigiamas padermes, sukėlusias infekcijas vaikams (83).
Didelis PVL gaminančių S. aureus padermių paplitimas užfiksuotas Ganoje (60 proc.) ir kitose Vakarų Afrikos šalyse (84) (85). Ištyrus Ganos vaikus iki 15 metų, S. aureus buvo dažniau nustatomas mergaitėms, dažniausiai lietinguoju laikotarpiu. Taip pat pastebėta, kad daugiau nei pusė tirtųjų S. aureus padermių gamino PVL (58 proc). Toki rezultatai kelia didelį susirūpinimą, nes šios padermės gali tapti sunkių invazinių ligų šaltiniais. Kitų autorių duomenimis, PVL paplitimas Afrikos šalyse tarp S. aureus padermių kur kas mažesnis, jis svyruoja nuo 8 proc. Angoloje (86) iki 36 proc. San Tomoje ir Principe (87). Manoma, kad tokių skirtingų rezultatų priežastis tam pačiam žemyne gali būti susijusi su prastesnėmis gyvenimo ir sanitarinėmis sąlygomis.
Europoje pastebimas mažesnis PVL gaminančių S. aureus paplitimas. Net mažiau nei 1 proc. PVL teigiamų padermių (0,7 proc.) nustatyta tarp MJSA ir tik 4,4 proc. MASA PVL gaminančių
21 padermių Šiaurės Ispanijoje (88). Kiek didesnis PVL dažnis užfiksuotas Graikijoje. Iš 287 tirtųjų S.
aureus atvejų PVL geną turėjo 27 proc. 45 proc. PVL teigiami buvo nustatyti tarp MASA ir 12 proc.
tarp MJSA padermių (89).
Kitose Europos šalyse atliktose studijose nurodoma, kad PVL buvo dažniau nustatoma MJSA padermėse. Turkijoje atliktame tyrime PVL genas nenustatytas nei viename MASA atvejyje, o tarp MJSA padermių PVL geną turėjo 10,3 proc. Nors PVL buvo retai nustatomas tarp MJSA, tačiau 2006 metais jo aptikta buvo dvigubai daugiau atvejų nei 2005 metais, kuomet nustatyta tik 5 proc. PVL gaminančių MJSA (90). Didesnis PVL dažnis tarp MJSA lyginant su MASA nustatytas ir Anglijoje. 2009 metais čia atlikta 390 atvejų analizė rodo, kad PVL gamino 9,7 proc. S. aureus padermių, o 16,9 proc. iš visų mėginių buvo MASA. Pažymėtina, kad PVL susijęs su MASA padermėmis buvo pakankamai retas atvejis (0,8 proc.), tačiau PVL susijęs su MJSA buvo daug dažnesnis atvejis (9 proc.) ir sudarė beveik tris ketvirtadalius PVL gaminančių S. aureus infekcijų. PVL infekcijos buvo dažniau nustatomos vyriškos lyties atstovams jaunesniame amžiuje (91). Tokie rezultatai rodo, kad PVL paplitęs tiek tarp MSSA, tiek tarp MJSA, tad reikia priežiūros ir stebėsenos programų, bei vykdyti tinkamą antibiotikų gydymą atsižvelgiant į PVL (92).
Nors nemažai klinikinių studijų yra ištyrę ir aprašę PVL gaminančių S. aureus sukeltas sunkias odos, minkštųjų audinių, plaučių ligas, PVL toksino vaidmuo infekciniam procesui nėra iki galo išaiškintas, vyrauja kontraversiškos nuomonės. Reikalingos tolesnės studijos, nagrinėjančios toksino patogenezę, ligos išeitis, gydymo efektyvumą bei prevencijos galimybes (12).
22
II.
TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo atlikimo vieta
Tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Laboratorinės medicinos klinikoje, mikrobiologijos laboratorijoje. Tyrimui naudojami mėginiai gauti iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės, Kauno klinikų vaikų terapijos, intensyvios terapijos ir vaikų chirurgijos skyrių.
2.2. Tiriamoji grupė
Tyrime buvo vertinta 121 S. aureus padermė, kuri buvo išskirta iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje, Kauno klinikose vaikų terapijos, intensyvios terapijos ir vaikų chirurgijos skyriuose 2012 – 2015 metais gydytų pacientų apatinių kvėpavimo takų sekreto, viršutinių kvėpavimo takų sekreto, pūlių ir sterilių skysčių. Pacientų vidutinis amžius buvo 12 ± 10 metų. Tyrimo metu buvo atlikta išskirtų padermių retrospektyvinė duomenų analizė.
2.3. Tyrimo objektas
PVL nustatymo tyrimui buvo naudotas iš viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų, pūlių ir sterilių kūno skysčių standžiose 5 proc. kraujo agaro terpėse išaugintos bakterijų kultūros. Tiesiogiai iš bakterijų kultūrų išskyrėme genominę DNR, kurią naudojome tolimesniems tyrimams.
Tyrimui buvo naudojamas rinkinys (,,GenoType Staphylococcus VER 2.0“, Vokietija), paremtas DNR hibridizacijos metodu ir leidžiantis nustatyti šias rūšis: S. aureus, S. haemolyticus, S.
epidermidis, S. hominis, S. warneri, S. simulans ir S.lugdunensis. Tuo pačiu metu gali būti nustatytas ir
meticilinui atsparumą lemiantis mecA genas, ir dvikomponentis citotoksinis virulentiškumo faktorius PVL.
23 Visa procedūra buvo padalinta į tris etapus:
1. DNR išskyrimas iš tiriamosios medžiagos (iš standžiose terpėse šviežiai išaugintų bakterijų kultūrų); 2. DNR amplifikacija su specialiais pradmenimis;
3. DNR hibridizacija.
Siekiant užtikrinti teisingą tyrimo atlikimą ir rinkinio sudedamųjų dalių teisingą veikimą, kiekvienoje juostelėje nurodytos dvi kontrolės zonos:
Konjugato kontrolės (CC – Conjugate Control) zona – rodo teisingą hibridizaciją ir teisingai vykstančią chromogeninę reakciją;
Universali kontrolės (UC – Universal Control) zona – rodo, kad DNR amplifikuota teisingai.
2.4. DNR išskyrimas iš tiriamosios medžiagos
Kaip pradinė DNR išskyrimo medžiaga buvo naudojamos specialiose mitybinėse terpėse šviežiai išaugintos S. aureus bakterijų kultūros. Darbo vieta buvo apsaugota nuo DNR užteršimo. Tyrimui buvo naudojamos bakterijų kultūros, išaugintos ant standžių 5 proc. kraujo agaro mitybinių terpių (,,Becton Dickinson and Company“, USA). Su kilpele buvo surenkamos 3 – 5 išaugusių bakterijų kolonijos ir suspenduojamos į 150 μl sterilų vandenį bei sumaišoma iki tolygaus drumstumo. Renkant kolonijas, buvo svarbu parinkti panašaus dydžio kolonijas, taip pat svarbu nesurinkti per daug bakterijų kultūrų DNR išskyrimui, nes per didelis tiriamosios medžiagos kiekis galėjo sukelti PGR slopinimą. Tirpalas su bakterijomis buvo inkubuotas termomikseryje (,,Eppendorf“, Vokietija) 95 °C temperatūroje 10 minučių. Tuomet tirpalas buvo nucentrifuguotas maksimaliu greičiu (14000 aps/min) 5 minutes. Supernatantas perkeltas į naują mėgintuvėlį ir iki DNR amplifikacijos buvo laikomas -24 °C temperatūroje. PGR buvo naudojama 5 μl tiriamosios medžiagos.
2.5. Amplifikacija
Amplifikacijos mišinys (45 μl) buvo ruošiamas patalpoje, kurioje sudarytos sąlygos apsaugoti tiriamąją medžiagą nuo DNR užteršimo. Prieš tai paruoštas DNR tirpalas buvo padėtas į atskirą darbo zoną.
24 Amplifikacijai buvo naudojama 5 U Taq DNR polimerazė iš Qiagen (Vokietija) rinkinio, kuri buvo atskiesta su buferiu, kad butų gauta 1 U Taq DNR polimerazė. Iš šio rinkinio taip pat buvo naudojama PGR buferis, MgCl2 tirpalas ir vanduo. Mėginius sudarė:
35 μl pradmenų mišinio (PNM);
5 μl 10x PGR buferio Taq DNR polimerazei (yra 15 mM MgCl2);
2 μl 25 mM MgCl2 tirpalo;
0,2 μl (1 U) Taq DNR polimerazės; 3 μl vandens;
5 μl šviežiai išskirto DNR tirpalo.
Galutinė MgCl2 koncentracija šiame amplifikacijos mišinyje – 2,5 mM.
Ruošiant neigiamą kontrolę, į vieną pavyzdį vietoj DNR tirpalo buvo įpilta 5 μl vandens. Buvo paruoštas mišinys, kuriame yra visi reagentai, išskyrus DNR tirpalą ir atidžiai, bet gerai sumaišyta. Kiekviename iš paruoštų PGR mėginių – 45 μl alikvoto.
PGR reakcija buvo atliekama termocikleryje (,,Kyratec“, Australija). Buvo pasirinkta optimali DNR gausinimui skirta programa (1 lentelė).
1 lentelė. Programa skirta DNR amplifikacijai
5:00 min 95°C 1 ciklas 0:30 min 95°C 10 ciklų 2:00 min 58°C 0:25 min 95°C 20 ciklų 0:40 min 53°C 0:40 min 70°C 8:00 min 70°C 1 ciklas
25 2.6. Hibridizacija
Prieš pradedant hibridizacijos etapą, vonelė su vandeniu buvo pašildyta iki 45 °C. Prieš naudojimą hibridizacijos ir plovimo tirpalai buvo pašildyti iki 40 °C. Reagentai privalėjo būti be nuosėdų. Kad nuosėdos visiškai ištirpų, šiek tiek pamaišėme.
Pipetės (,,Rainin“, USA) pagalba buvo ruošiami darbiniai tirpalai. Buvo skiedžiami konjugato ir substrato koncentratai 1:100 su atitinkamu buferiu, gerai išmaišomi ir paliekami kambario temperatūroje. Kiekvienai juostelei buvo pilama po 10 μl koncentrato į 1 ml atitinkamo buferio. Konjugato koncentratą reikėjo praskiesti prieš kiekvieną naudojimą.
Dirbant su juostelėmis visą laiką buvo dėvimos pirštinės. Į kiekvieną iš plokštelės griovelių buvo įpilama po 20 μl denatūravimo tirpalo.Į tirpalą buvo įpilta 20 μl amplifikuoto mėginio, pipete gerai sumaišyta ir inkubuota kambario temperatūroje 5 minutes. Tuo metu, pincetu atsargiai iš pakuotės buvo išimtos juostelės ir paprastu pieštuku atitinkamai sužymėtos. Į kiekvieną šulinėlį atsargiai įpilta po 1 ml pašildyto hibridizacijos buferio. Buvo švelniai pakratyta, kol tirpalas įgavo tolygią spalvą. Buvo dirbama atidžiai, kad tirpalas iš vieno plokštelės griovelio nepatektų į šalia esančius griovelius.
Į kiekvieną plokštelės griovelį buvo atsargiai įdėta po vieną juostelę. Juostelės buvo visiškai panardintos į tirpalą ir ta pusė, kurioje juostelės buvo sužymėtos, buvo nukreipta į viršų. Juostelėms sudėti ir panardinti buvo naudojamas pincetas, kuris buvo nuvalomas po kiekvienos juostelės panardinimo, kad būtų išvengta užteršimo.
Plokštelė su panardintomis juostelėmis buvo dedama ant TwinCubator platformos (,,Hain Lifescience“, GmbH) ir inkubuojama 30 minučių 45°C temperatūroje. Kratymo dažnis buvo pastovus ir buvo užtikrinta, kad tirpalas būtų gerai išmaišytas. Po tirpalo išmaišymo, naudojant Pastero pipetę, buvo visiškai išsiurbtas hibridizacijos buferis. Tada ant kiekvienos juostelės užpilta 1 ml plovimo buferio ir inkubuota ant TwinCubator platformos 15 minučių 45 °C temperatūroje.
Nuo šio žingsnio buvo dirbama kambario temperatūroje. Buvo visiškai pašalintas plovimo buferis, o likęs skystis pašalintas švelniai apverčiant plokštelę aukštyn kojomis ant sugeriamojo popieriaus. Kiekvieną juostelė buvo plaunama su 1 ml skalavimo tirpalo 1 minutę, dedant jas ant TwinCubator platformos. Ant kiekvienos juostelės buvo įpilta 1 ml praskiesto konjugato ir inkubuota 30 minučių ant Twincubator platformos. Tirpalas buvo visiškai pašalintas ir kiekviena juostelė nuplauta du kartus po 1 minutę su 1 ml skalavimo tirpalu ir vieną kartą 1 minutę su maždaug 1 ml distiliuoto vandens, uždedant plokštelę ant TwinCubator platformos. Įpilta 1 ml atskiesto substrato ant kiekvienos juostelės ir inkubuota tamsoje, nepurtant. Reakcija buvo sustabdoma tada, kai juostelės tapo aiškiai matomos, trumpai du kartus plaunant jas su distiliuotu vandeniu. Galiausiai, juostelės pincetu buvo išimamos iš dėklo ir išdžiovinamos tarp dviejų sugeriamojo popieriaus sluoksnių.
26 2.7. Rezultatų vertinimas ir interpretacija
Juostelės buvo įklijuojamos į vertininimo lapą, kuris buvo įtrauktas į GenoType Staphylococcus VER 2.0 rinkinį. Rinkinyje buvo pateiktas trafaretas (1 pav.), pagal kurį buvo atliekamas vertinimas. Kiekviena juostelė iš viso turi 11 reakcijos zonų.
1 pav. Trafaretas, pateiktas GenoType Staphylococcus VER 2.0 rinkinyje
Konjugato kontrolės (CC – Conjugate Control) zona
Šioje zonoje privalo būti matoma linija, nes ji rodo įvykusią reakciją tarp substrato ir konjugato.
Universali kontrolės (UC – Universal Control) zona
Ši kontrolės zona rodo teisingą DNR išskyrimą iš bakterijų kultūros ir teisingai atliktą amplifikaciją. Neigiamoje kontrolėje ši zona turi būti neigiama, nes mišinyje vietoj DNR buvo pilamas vanduo.
Kitos linijos
Tai specifiniai zondai tam tikrai bakterijos rūšiai ir vertinami pagal interpretacijos diagramą (2 pav). S. aureus identifikuojamas pagal visiškai išryškėjusias 5 ir 9 zonas.
27 2 pav. Interpretacijos diagrama
28
III.
REZULTATAI
3.1. S. aureus paplitimas Kauno klinikose vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais
Tiriamuoju laikotarpiu duomenų bazėje buvo registruoti 7946 pasėliai, paimti iš Kauno klinikų vaikų terapinio, intensyvios terapijos ir chirurginio skyrių 2012 – 2015 metais. S. aureus išaugo 3248 pasėliuose, t.y. 40,9 proc. atvejų (3.1.1. lentelė). Pastebėjome, kad daugiausia S. aureus teigiamų pasėlių buvo 2012 metais, jie sudarė 43,5 proc. visų pasėlių. 2013 metais teigiamų pasėlių sumažėjo iki 38,8 proc., o iki 2015 metų jų skaičius išaugo iki 40,9 proc. (3.1.1. diagrama).
3.1.1. S. aureus augimas 2012 – 2015 metais
Tiriamasis laikotarpis, metais
2012 2013 2014 2015 Viso: Pasėlių sk., n 1938 2201 1970 1837 7946 Teigiamų pasėlių sk., n (%) 843 (43,5 ) 853 (38,8 ) 801 (40,7 ) 751 (40,9 ) 3248 (40,9 )
3.1.1. Teigiamų S. aureus pasėlių skaičius (%) 2012 – 2015 metais
Vaikų terapiniame skyriuje nustatyta 27,03 proc., intensyvios terapijos skyriuje (VITS) – 30,99 proc. ir vaikų chirurginiame skyriuje – 36,95 proc. teigiami S. aureus atvejai (3.1.2. diagrama).
36 37 38 39 40 41 42 43 44 2012 2013 2014 2015 S. aureus teigiamų pasėlių sk. (%)
29 3.1.2. S. aureus augimas vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose
gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais
3.2. S. aureus atsparumas antibiotikams 2012 – 2015 metais vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams
Nustatėme S. aureus atsparumą klindamicinui, oksacilinui ir penicilinui visuose trijuose skyriuose. Didžiausias S. aureus atsparumas 2012 – 2015 metais nustatytas penicilinui – 84,3 proc. Atsparumas klindamicinui – 3,8 proc., oksacilinui – 1,9 proc. (3.2.1. lentelė).
3.2.1. S. aureus atsparumas antibiotikams 2012 – 2015 metais Tiriamasis laikotarpis, metais
2012 2013 2014 2015 Viso: Atsparumas klindamicinui, n (%) 13 (3,2) 13 (3) 21 (5) 15 (4,1 ) 62 (3,8 ) Atsparumas oksacilinui, n (%) 16 (4) 17 (3,9) 13 (3,1) 14 (3,8 ) 60 (1,9 ) Atsparumas penicilinui, n (%) 349 (86,2) 363 (83,4) 355 (84,2) 302 (82,5 ) 1369 (84,3 ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Vaikų terapinis skyrius VITS Vaikų chirurgijos skyrius
S. aureus augimas iš tiriamųjų medžiagų (%)
30 3.3. PVL toksino paplitimas sunkiomis S. aureus infekcijomis sergantiesiems ir vaikų terapiniame, intensyvios terapijos bei chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015
Tiriamąją grupę, iš kurių mėginių išaugo S. aureus, sudarė 121 pacientas. Jų amžius svyravo nuo 2 iki 22 metų. Mergaitės sudarė ~37,2 proc., berniukai ~62,8 proc. Daugiausia mėginių (n = 91), iš kurių išaugo S. aureus buvo gauta iš vaikų chirurgijos skyriaus, jie sudarė 75,2 proc. visų tirtųjų pavyzdžių. Vaikų intensyvios terapijos skyriaus mėginiai sudarė 15,7 proc. (n = 19), o pavyzdžiai gauti iš vaikų terapinio skyriaus 9,1 proc. (n = 11).
Nustatėme, kad PVL toksiną gamino 18 (14,9 proc.) S. aureus padermių. Daugiausia PVL toksiną gaminančių S. aureus nustatėme vaikų chirurgijos skyriuje – 18,7 proc. Vaikų intensyvios terapijos skyriuje PVL gamino tik 5,3 proc., o vaikų terapiniame skyriuje nenustatėme nei vienos PVL gaminančios S. aureus padermės (3.3.1. lentelė) (3.3.2. diagrama).
3.3.1. PVL toksino dažnis 2012 – 2015 metais Vaikų terapinis skyrius VITS Vaikų chirurginis skyrius Viso: S. aureus teigiamų mėginių skaičius, n (%) 11 (9,1) 19 (15,7) 91 (75,2) 121 PVL teigiami atvejai, n (%) 0 1 (5,3) 17 (18,7) 18 (14,9)
3.3.2. PVL toksino dažnis vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Vaikų terapinis skyrius VITS Vaikų chirurgijos skyrius PVL gaminantys S. aureus
31 3.4. S. aureus atsparumo antibiotikams dinamikos 2012 – 2015 metais palyginimas bei atsparumo antibiotikams sąsajos su PVL toksino gamyba
Palyginome S. aureus, gautų išvaikų terapinio, intensyvios terapijos ir chirurgijos skyrių išaugintų S. aureus kultūrų, atsparumą klindamicinui, oksacilinui ir penicilinui 2012 – 2015 metų laikotarpyje (3.4.1. lentelė).
3.4.1. S. aureus atsparumas klindamicinui, oksacilinui ir penicilinui 2012 – 2015 metais Tiriamasis laikotarpis, metais
2012 (n = 15) 2013 (n = 40) 2014 (n = 33) 2015 (n = 33) Atsparumas klindamicinui, n (%) 3 (20) 9 (22,5) 1 (3) 2 (6,1) Atsparumas oksacilinui, n (%) 2 (13,3) 4 (10) 1 (3) 3 (9,1) Atsparumas penicilinui, n (%) 12 (80) 38 (95) 27 (81,8) 29 (87,9)
Didžiausias atsparumas nustatytas penicilinui, kuris svyruoja nuo 80 proc. iki 95 proc. Daugiausia atsparių penicilinui S. aureus padermių nustatyta 2013 metais. Atsparumas oksacilinui svyruoja nuo 3 iki 13,3 proc., o klindamicinui nuo 3 iki 22,5 proc. Taip pat pastebima, kad nuo 2014 metų didėja S. aureus atsparumas šiems antibiotikams (3.4.2. diagrama).
3.4.2. Antibiotikų atsparumo dinamika 2012 – 2015 metais
Nustatėme, kad S. aureus, kurie gamina PVL yra atsparesni oksacilinui ir penicilinui, šiek tiek jautresni klindamicinui. Iš 18 PVL gaminančių S. aureus atvejų, atsparūs klindamicinui buvo 2 (11,1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2012 m. 2013 m. 2014 m. 2015 m. Atsparumas klindamicinui (%) Atsparumas oksacilinui (%) Atsparumas penicilinui (%)
32 proc.), oksacilinui 3 (16,7 proc.), penicilinui –visi 18 (100 proc.). PVL negamino 103 S. aureus atvejai. Atsparūs klindamicinui buvo 13 (12,6 proc.), oksacilinui 7 (6,8 proc.), penicilinui 87 (84,5 proc.) (3.4.7. lentelė).
3.4.7. S. aureus atsparumo antibiotikams sąsajos su PVL toksino gamyba Atsparumas klindamicinui, n (%) Atsparumas oksacilinui, n (%) Atsparumas penicilinui, n (%) PVL gaminantys S. aureus 2 (11,1) 3 (16,7) 18 (100) PVL negaminantys S. aureus 13 (12,6) 7 (6,8) 87 (84,5)
33
IV. REZULTATŲ APTARIMAS
Staphylococcus aureus yra pripažintas kaip vienas svarbiausių ir dažniausių infekcijų sukelėjų
tarp įvairaus amžiaus grupių vaikų (93). Kadangi vaikai turi dažnesnį kontaktą su aplinkiniais, dažniau dalinasi įvairiais daiktais, rečiau plauna rankas, todėl vaikų grupėse nustatomas didesnis S. aureus paplitimo dažnis lyginant su suaugusiais. Įvairių autorių duomenimis, S. aureus paplitimas tarp vaikų įvairiose tiriamųjų grupėse, priklausomai nuo amžiaus grupės ženkliai skiriasi ir gali būti nuo 7,6 proc. iki 70 proc. (94) (95).
Atlikta nemažai studijų parodančių S. aureus paplitimo įvairovę tarp vaikų įvairiose šalyse. Kolumbijoje atlikto tyrimo duomenimis, S. aureus dažnis tarp vaikų buvo 39,8 proc. Universitetinėje ligoninėje patvirtinta 44,5 proc. teigiamų S. aureus padermių, o vaikų tirtųjų iš dienos priežiūros centro 35 proc. (96). Kitų Kolumbijos mokslininkų duomenimis, S. aureus paplitimo dažnis panašus. Pagal Juan Rebollo - Perez ir bendradarbių atliktą tyrimą, S. aureus nešiotojai yra 38,5 proc. ikimokyklinio amžiaus vaikų (97).
Kai kuriose valstybėse S. aureus nešiotojų nustatoma dar daugiau. Tokių valstybių gausu Afrikos žemyne. Botsvanos Respublikoje nustatyta 55 proc. vaikų iki 18 metų, kurie buvo kolonizuoti
S. aureus (98), o Ganoje – net 60 proc. S. aureus nešiotojų (84) (85).
Didelė S. aureus padermių paplitimo įvairovė nustatoma Europos šalyse. Portugalijoje S.
aureus nešiotojai sudaro tik 17 proc. (99), Vengrijoje – 21,3 proc. visų tirtųjų vaikų (100), o tiriant
Milano moksleivius Italijoje nustatyta net 53,1 proc. S. aureus nešiotojų (101).
Nors Lietuva pagal ECDC duomenis priskiriama prie Europos šalių, kuriose S. aureus paplitęs iki 25 proc. (23), tačiau mūsų tyrimo duomenimis, S. aureus dažnis tirtųjų vaikų imtyje didesnis ir atitinka 40,9 proc. Didesnį S. aureus paplitimo dažnį tarp vaikų ir jaunuolių, nei nurodo ECDC, gavo ir kiti Lietuvos mokslininkai. Kirkliauskienė ir kiti nustatė, kad S. aureus paplitimas siekia 45,7 proc. tarp VU MF pirmo kursu studentų (102), o tiriant ikimokyklinio ir mokyklinio amžiaus vaikų grupes išskirta 53,8 proc. S. aureus padermių. Taip pat nustatyta, kad Staphylococcus
aureus paplitimas tarp ikimokyklinio amžiaus vaikų yra 46,5 – 47,0 proc., tarp 11 – 15 metų vaikų S. aureus paplitimas padidėja iki 59,0 proc., tarp 16 – 19 metų – iki 73,0 proc. (103).
PVL gaminančių S. aureus padermių paplitimas įvairiose pasaulio šalyse yra gana skirtingas. Daugiausia tokių padermių nustatoma Afrikoje, tokiose valstybėse kaip Gana, Tunisas, kur PVL toksino dažnis gali siekti net iki 74 proc. (84) (85).
Europos šalyse nustatoma kur kas mažiau PVL toksiną gaminančių S. aureus padermių. Mūsų atlikto tyrimo duomenimis PVL paplitimas siekė 14,9 proc. tarp sunkiomis S. aureus infekcijomis
34 sergančiųjų ir vaikų terapijos, intensyvios terapijos bei chirurgijos skyriuose gydytų pacientų 2012 – 2015 metais. Anglijoje atlikto tyrimo duomenimis, tarp tirtųjų vaikų išaugusių S. aureus padermių, kurios gamino PVL, buvo dar mažiau, tik 1,6 proc. (41). Kiek didesnis PVL dažnis nustatytas Ispanijoje. Čia buvo ištirta 53 vaikai, kurie sirgo S. aureus sukeltomis odos ir minkštųjų audinių infekcijomis, nustatyta 26 proc. PVL gaminančių S. aureus padermių (104).
Mokslinių studijų duomenys rodo didėjantį S. aureus vaidmenį infekcinėje patologijoje. S.
aureus išplitimas visuomenėje ir gydymo įstaigose – problema, kurią šiuo metu stengiasi išspręsti
dauguma net ir išsivysčiusių pasaulio šalių. Be to, didėja šių bakterijų atsparumas vartojamiems antibiotikams (103). Visuomenėje paplitusių S. aureus padermių atsparumo antibiotikams daugelio šalių tyrimų duomenys yra panašūs (99) (105). Mūsų atlikta S. aureus atsparumo penicilinui analizė patvirtino kitų mokslininkų gautus rezultatus, tačiau atsparumas klindamicinui ir oksacilinui šiek tiek skiriasi nuo kitų autorių pateikiamų duomenų. Mūsų S. aureus padermių atsparumo antibiotikams tyrimo duomenys rodo, kad S. aureus padermės yra atsparios stafilokokinių infekcijų gydymui vartojamiems antibiotikams. Itin aukštas atsparumas nustatytas penicilinui – 84,3 proc. Klindamicinui ir oksacilinui atsparumas gana mažas ir atitinka 3,8 proc. ir 1,9 proc.
Panašius atsparumo antibiotikams duomenis gavo ir Portugalijoje atliktos mokslinės studijos. Jų metu nustatyta, kad vaikų nosies šnerves kolonizuojančios S. aureus padermės atsparios penicilinui 88,5 – 95,7 proc., klindamicinui 5,5 proc., oksacilinui atsparumas mažesnis nei 1 proc. (99). Didesnis
S. aureus atsparumas klindamicinui ir oksacilinui užfiksuotas Nigerijoje, kur jis siekia atitinkamai 8,8
proc. ir 16,2 proc. Tuo tarpu atsparumas penicilinui išlieka panašus kaip ir kituose moksliniuose darbuose ir siekia 88,2 proc. (106).
Lyginant mūsų tyrimo atsparumo antibiotikams rezultatus su kitų Lietuvos mokslininkų gautais rezultatais, atsparumas penicilinui išlieka taip pat didelis ir gali siekti iki 93,8 proc. (103). Kiek kitokie atsparumo antibiotikams rezultatai buvo gauti tiriant iš VU MF pirmo kurso studentų išskirtų S.
aureus atsparumą. Nustatyta, kad penicilinui atsparios tik 64,7 proc. išskirtų padermių. Atsparumo
dažnis klindamicinui - 5,04 proc., o oksacilinui visos išskirtos S. aureus padermės buvo jautrios (102). Vengrijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad taip pat visos S. aureus padermės buvo jautrios oksacilinui, o klindamicinui atsparumas siekė 1,1 proc. (100).
Lyginant PVL gaminančių ir negaminančių S. aureus padermių atsparumą antibiotikams vyrauja kontraversiškos nuomonės. Mes nustatėme, kad PVL gaminančios S. aureus padermės yra atsparesnės penicilinui ir oksacilinui, o PVL negaminančios padermės atsparesnės klindamicinui. Tai, jog PVL negaminančios padermės yra atsparesnės klindamicinui pastebėjo ir kiti mokslininkai. Dharm R. Bhatta ir bendraautoriai atlikto tyrimo Nepale metu taip pat nustatė, kad PVL negaminančios S.
aureus padermės klindamicinui yra atsparesnės (107). PVL negaminančių padermių atsparumą
35 penicilinui atsparesnės yra taip pat PVL negaminančios S. aureus padermės, o tai prieštarauja mūsų gautiems rezultatams (108).
Apibendrinant mūsų gautus tyrimo duomenis, galime teigti, kad nustatytas S. aureus paplitimo ir PVL toksino dažnis yra panašus į daugelio kitų mokslinių tyrimų rezultatus. Ištyrus S.
aureus atsparumą antibiotikams, kaip ir daugelis kitų pasaulyje atliktų studijų, nustatėme, kad
mikroorganizmas ypač atsparus penicilinui ir šiek tiek atsparus klindamicinui. Taip pat gavome nedidelį atsparumą oksacilinui, tačiau yra autorių, kurie pateikia priešingus rezultatus ir teigia, kad visos S. aureus padermės buvo jautrios šiam antibiotikui. Ne visiškai su kitų moklininkų paskelbtais rezultatais sutampa ir mūsų gautos PVL sąsajos su atsparumu antibiotikams. Mes patvirtinome kitų studijų rezultatus, kad PVL negaminančios S. aureus padermės yra atsparesnės klindamicinui, tačiau priešingai nei mes, kiti autoriai pateikia, kad PVL negaminančios padermės taip pat atsparesnės penicilinui ir oksacilinui. Norint patikslinti atsparumo antibiotikams rezultatus, reiktų tyrimą atlikti su daugiau S. aureus padermių.
36
V.
IŠVADOS
1. Kauno klinikose vaikų terapiniame, intensyvios terapijos ir chirurginiame skyriuose gydytiems pacientams 2012 – 2015 metais 40,9 proc. atvejų tiriamojoje medžiagoje buvo išskirtos S.
aureus padermės.
2. Nustatėme, kad didžiausias S. aureus atsparumas 2012 – 2015 buvo penicilinui – 84,3 proc., atsparumas klindamicinui – 3,8 proc., oksacilinui – 1,9 proc.
3. Pacientams, kuriems buvo diagnozuota sunki S. aureus sukelta infekcija, 14,9 proc. atvejų sukėlė S. aureus padermės, gaminančios PVL toksiną.
4. S. aureus atsparumas oksacilinui, priklausomai nuo metų, svyravo nuo 3 iki 13,3 proc., o klindamicinui buvo stebima mažėjimo tendencija nuo 22,5 proc. iki 3 proc., tačiau 2015 metais padidėjo iki 6,1 proc. Didžiausias atsparumas nustatytas penicilinui, kuris 2012 – 2015 svyruoja nuo 80 proc. iki 95 proc.
Taip pat nustatėme, kad S. aureus, kurie gamina PVL yra atsparesni oksacilinui (16,7 proc.) ir penicilinui (100 proc.), bei šiek tiek jautresni klindamicinui.
37
VI. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Alvydas Pavilonis, Rita Plančiūnienė, Modestas Ružauskas, Žaneta Maželienė. Plazmos nekoaguliuojančių stafilokokų paplitimas visuomenėje ir atsparumas antibiotikams. Laboratorinė medicina, 2014. Nr. 1(61), p. 43–47
2. Mandell GL, Douglas R, Bennett JE. Principles and practice of infectious diseases. Biomedical Books, 2005
3. Fabiana Venegas Pires, Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha, Lígia Maria Abraão, Patrícia Y. F. Martins, Carlos Henrique Camargo, and Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza. Nasal Carriage of Staphylococcus aureus in Botucatu, Brazil: A Population-Based Survey, PLoS One., 2014
4. Scott D. Kobayashi, Natalia Malachowa, and Frank R. DeLeo. Pathogenesis of Staphylococcus
aureus Abscesses. Am J Pathol. 2015; 185(6): 1518–1527.
5. Madeleine G. Sowash and Anne-Catrin Uhlemann, Community-Associated Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus Case Studies. Methods Mol Biol. 2014; 1085: 25–69.
6. Otto M. 2013. Community-associated MRSA: what makes them special. Int J Med Microbiol, 2013
7. Alonzo F, III, Torres VJ. Bacterial survival amidst an immune onslaught: the contribution of the Staphylococcus aureus leukotoxins. PLoS Pathog., 2013
8. Yoong P, Torres VJ. 2013. The effects of Staphylococcus aureus leukotoxins on the host: cell lysis and beyond. Curr. Opin. Microbiol., 2013
9. Spaulding AR, Salgado-Pabon W, Kohler PL, Horswill AR, Leung DY, Schlievert PM. Staphylococcal and streptococcal superantigen exotoxins. Clin. Microbiol., 2013
10. Falugi F, Kim HK, Missiakas DM, Schneewind O. Role of protein A in the evasion of host adaptive immune responses by Staphylococcus aureus. American society for microbiology, mBio, 2013
38 11. Gillet Y, Issartel B, Vanhems P, Fournet JC, Lina G, Bes M, et al. Association between
Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leukocidin and highly lethal
necrotising pneumonia in young immunocompetent patients. Lancet. 2002; 359:753–9
12. Irina Kulečnikova, Violeta Radžiūnienė, Virginija Žilinskaitė. Auksinio stafilokoko, gaminančio Pantono-Valentino leukocidino (PVL) toksiną, klinikiniai aspektai. Klinikinės praktinės apžvalgos, 2014
13. Miller LG, Perdreau-Remington F, Rieg G et al. Necrotizing fasciitis caused by community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Los Angeles. N Engl J Med 2005; 352: 1445–1453
14. Shallcross LJ, Fragaszy E, Johnson AM & Hayward AC. The role of the Panton-Valentine leucocidin toxin in staphylococcal disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis, 2013 13(1): 43-54
15. Rafai M, Abouelalaa K, Skhsoukh Y, Balkhi H, Belyamani L & Dimou. Evolution of a fatal septic arthritis caused by a Panton-Valentine leukocidin (PVL)-producing Staphylococcus aureus strain. Joint Bone Spine, 2013, 80(5): 525-7
16. Noritomo Fujisaki, Atsunori Nakao, Ayana Okamoto, Takeshi Nishimura, Hayato Yamashita, Michiko Ishikawa and Joji Kotan. Clinical Feature: Community- acquired Pneumonia Caused by Panton- Valentine Leukocidin- positive Staphylococcus aureus, 2016
17. L. Cupane, N. Pugacova, D. Berzina, V. Cauce, D. Gardovska, E. Miklaševics. Patients with Panton-Valentine leukocidin positive Staphylococcus aureus infections run an increased risk of longer hospitalisation, 2012
18. Steven Y. C. Tong,Joshua S. Davis,Emily Eichenberger,b Thomas L. Holland, Vance G. Fowler, Jr., Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology,Clinical Manifestations, and Management, 2015
19. Rhee Y, Aroutcheva A, Hota B, Weinstein RA, Popovich KJ. Evolving Epidemiology of Staphylococcus aureus Bacteremia. Infect Control Hosp Epidemiol 2015; 36:1417–1422.
39 20. Tom S, Galbraith JC, Valiquette L, Jacobsson G, Collignon P, Schonheyder HC et al. Case fatality ratio and mortality rate trends of community-onset Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect 2014; 20:O630–632.
21. Struelens MJ, Hawkey PM, French GL, Witte W, Tacconelli E. Laboratory tools and strategies for methicillin-resistant Staphylococcus aureus screening, surveillance and typing: state of the art and unmet needs. Clinical microbiology and infection. 2009;2(15):112-119.)
22. EARSS Annual Report 2012. EARSS European antimicrobial resistance surveillance system Management Team, members of the Advisory Board, and national representatives of EARSS. The Netherlands. 2012
23. Antimikrobinio atsparumo priežiūra Europoje, priežiūros ataskaita, ECDC, 2014
24. Tacconelli E. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: risk assessment and infection control policies. Clinical microbiology and infection. 2007;14:407-410
25. Spellberg, Brad. Rising Plague: the Global Threat from Deadly Bacteria and Our Dwindling Arsenal to Fight Them. Amherst, NY: Prometheus, 2009
26. Summary of notifiable diseases: United States, 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2011;58(53):1–100
27. Boucher H.W., Corey G.R. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis. 2008; 46(Suppl 5):S344–S349
28. Franklin D. Lowy Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, J. Clin. Invest. 2003; 111:1265–1273
29. Solberg CO, Spread of Staphylococcus aureus in hospitals: causes and prevention. Scand J Infect Dis. 2000; 32(6):587-95
30. Humpreys H, Grundmann H, Skov R, Lucet JC, Cauda R. Prevention and control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical microbiology and infection. 2009;2(15):120-124
40 31. Sollid JUE, Furberg AS, Hanssen AM, Johannessen M. Staphylococcus aureus: determinants of human carriage. Infect Genet Evol. 2014;21: 531–4132. Lilly Cheng Immergluck, Shabnam Jain, Susan M. Ray, Robert Mayberry, Sarah Satola, Trisha Chan Parker et al. Risk of Skin and Soft Tissue Infections among Children Found to be Staphylococcus aureus MRSA USA300 Carriers’’, West J Emerg Med. 2017 Feb; 18(2): 201–212
33. VILNIAUS UNIVERSITETO MEDICINOS FAKULTETO Studentų mokslinės draugijos LXV konferencija, 2013
34. Gregory J. Moran, Anusha Krishnadasan; Rachel J. Gorwitz, Greg E. Fosheim, Valeria Albrecht, Brandi Limbagoet al. Prevelence of methicillin-Resistant Staphylococcus aureus as Etiology of Community-Acquired Pneumonia. Clin Infect Dis, 2012 54 (8): 1126-1133
35. Karen L de Mesy Bentley, Ryan Trombetta, Kohei Nishitani, Sheila N Bello-Irizarry, Mark Ninomiya, Longze Zhang et al. Evidence of Staphylococcus Aureus deformation, proliferation, and migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research, 2017
36. R. Hugh Dunstan , Johan Gottfries, Christof von Eiff, Timothy K. Roberts, Effect of Low Temperature on Growth and Ultra-Structure of Staphylococcus spp, 2012
37. Jacques-Antoine Hennekine, Marie-Laure De Buyser, Sylviane Dragacci. Staphylococcus aureus and its poising toxins: characterizacion and outbreak investigation. FEMS Microbiology Reviews, 2012. Pages 815–836
38. Dinges M, Orwin P, Schilievert P. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev, 2000; 13: 16–34
39. Dr Laura J Shallcross, Ellen Fragaszy, Prof Anne M Johnson, Andrew C Hayward. The role of the Panton-Valentine leucocidin toxin in staphylococcal disease: a systematic review and meta-analysis, The Lancet Infectious Diseases; 2013, Pages 43–54
40. Lina G, Piémont Y, Godail-Gamot F, Bes M, Peter MO, Gauduchon V, Vandenesch F, Etienne J. Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis., 1999 Nov;29(5):1128-32
