LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Ana Kazakevič
INVAZINIŲ KLEBSIELLA PNEUMONIAE PADERMIŲ IŠPLĖSTO SPEKTRO BETA-LAKTAMAZIŲ CHARAKTERISTIKA
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas
Lekt. Asta Dambrauskienė
2
TURINYS
SUMMARY ... 5
INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7
BIOETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Mikroorganizmų atsparumas antibiotikams – grėsmė šiuolaikinei medicinai ... 13
1.2. K. pneumoniae klinikinė svarba ir atsparumo antibiotikams problema ... 15
1.3. K. pneumoniae atsparumo beta-laktaminiams antibiotikams mechanizmai ... 16
1.4. Beta-laktamazių klasifikacija ... 18
1.5. Išplėsto spektro beta-laktamazių charakteristika ... 20
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 23
2.1. Tiriamųjų atranka, tyrimo organizavimas ir statistinė duomenų analizė... 23
2.2. Mikrobiologiniai tyrimo metodai ... 24
2.2.1. Bakteriologinis tyrimas. Pasėlio metodas ... 24
2.2.2. K. pneumoniae identifikavimas ... 25
2.2.3. K. pneumoniae išplėsto spektro beta-laktamazių nustatymas ... 26
2.2.4. K. pneumoniae atsparumo antibiotikams įvertinimas ... 26
2.3. Genetiniai tyrimo metodai ... 27
2.3.1. K. pneumoniae DNR išskyrimas ... 27
2.3.2. Polimerazės grandininės reakcijos atlikimas ... 27
3. REZULTATAI ... 29
3.1. Invazinių Klebsiella pneumoniae padermių, gaminančių išplėsto spektro beta-laktamazes, atsparumas įvairių grupių antibiotikams ... 29
3.2. Invazinių Klebsiella pneumoniae padermių išplėsto spektro beta-laktamazių vyraujantys tipai ir jų pasiskirstymas priklausomai nuo skyriaus profilio ... 30
3.3. Invazinių Klebsiella pneumoniae padermių išplėsto spektro beta-laktamazių tipų sąsajos su atsparumu ne beta-laktaminiams antibiotikams ... 33
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
5. IŠVADOS ... 41
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
3
SANTRAUKA
Ana Kazakevič
INVAZINIŲ KLEBSIELLA PNEUMONIAE PADERMIŲ IŠPLĖSTO SPEKTRO BETA-LAKTAMAZIŲ CHARAKTERISTIKA
Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) yra vienas iš kliniškai svarbiausių oportunistinių
patogenų, kolonizuojantis žmogaus virškinamąjį traktą, odos ir viršutinių kvėpavimo takų gleivinę bei galintis sukelti sunkias invazines infekcijas, pneumonijas, šlapimo takų, žaizdų infekcijas, sepsį ir kt. Šios infekcijos gali sparčiai plisti tarp pacientų ir sukelti pavojingus protrūkius asmens sveikatos priežiūros įstaigose (ASPĮ). Nustatyta, kad reikšmingiausias K. pneumoniae atsparumo mechanizmas yra išplėsto spektro beta-laktamazių (ISBL) gamyba, kuri yra koduojama plazmidžių genuose.
Darbo tikslas: nustatyti invazinių K. pneumoniae padermių atsparumą antibiotikams ir įvertinti su atsparumu susijusių ISBL charakteristiką.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL, atsparumo įvairių grupių antibiotikams dažnį.
2. Nustatyti vyraujančius ISBL tipus K. pneumoniae padermėse.
3. Įvertinti ISBL tipų sąsajas su atsparumu ne beta-laktaminiams antibiotikams.
Tyrimo metodika: Iš 2015-2016 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių atrinktos ISBL gaminančios padermės. Atrinktoms padermėms nustatytas atsparumas antibiotikams ir įvertintas pagal Europos komiteto skirto jautrumo antibiotikams tyrimams (EUCAST) reikalavimus. Invazinių K. pneumoniae padermių ISBL tipai nustatyti polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodu. Statistinė analizė atlikta naudojantis IBM SPSS 23.0 statistiniu duomenų paketu.
Tyrimo objektas: LSMU ligoninės Kauno klinikose 2015-2016 m. gydytų pacientų, kuriems iš kraujo arba likvoro buvo išskirtos invazinės K. pneumoniae padermės, gaminančios ISBL bei mikrobiologinių tyrimų rezultatų protokolai.
Rezultatai: Iš atrinktų invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL, 90,9 proc. buvo atsparios aminoglikozidams, 74,5 proc. – fluorochinolonams bei 80,0 proc. sulfonamidams/pirimidinams. Invazinių K. pneumoniae padermių atsparių plačiausio veikimo spektro antibiotikams – karbapenemams šio tyrimo metu, nenustatyta. 69,1 proc. tirtų invazinių K. pneumoniae padermių pasižymėjo dauginiu atsparumu antibiotikams (DAA) - fluorochinolonams, cefalosporinams bei aminoglikozidams. Daugiausiai tokių padermių buvo nustatyta terapinio profilio skyriuose gydytiems pacientams (30,9 proc.). Reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriuose (RITS) iš viso
4 buvo išskirta 21,8 proc. DAA pasižyminčių invazinių K. pneumoniae padermių, tuo tarpu chirurginio profilio skyriuose dauginio K. pneumoniae atsparumo pasiskirstymo dažnis siekė 16,4 proc. Tyrimo metu nustatyta, kad beveik visos – 53 padermės (po 96,4 proc.) gamino TEM, SHV ir CTX1 tipų ISBL, tuo tarpu mažiausiai paplitę buvo CTX4 ir CMY2 tipai (po 12,7 proc.). CTX4 ir CTX2 tipai vyravo RITS, tuo tarpu CMY2 tipas dažniau išskirtas iš tiriamųjų medžiagų pacientų, kurie buvo gydyti terapinio profilio skyriuose. OXA tipas dažniau buvo nustatytas chirurginio profilio skyriuose. Tyrimas parodė, kad didžioji dauguma invazinių K. pneumoniae padermių gaminančių TEM, SHV, CTX2 ir CTX1 tipų ISBL buvo atsparios gentamicinui (GM), tuo tarpu didžiausias atsparumas trimetoprimui/sulfametoksazoliui (SXT) buvo nustatytas padermėse, turinčiose OXA tipą. Statistinės analizės rezultatai rodo, kad mažiausiai paplitusį tarp invazinių K. pneumoniae padermių - CTX4 tipą gaminančios padermės statistiškai reikšmingai dažniau (100,0 proc.) buvo atsparios amikacinui (AN), palyginti su šio geno negaminančiomis padermėmis (31,3 proc.), o vertinant ISBL tipų sąsajas su atsparumu ciprofloksacinui (CIP), nustatyta, kad didžioji dalis CTX1 (77,4 proc.) ir beveik visos (94,1 proc.) OXA tipus gaminančios padermės buvo atsparios šiam antibiotikui.
Išvados: Visos invazinės K. pneumoniae padermės, gaminančios ISBL buvo jautrios karbapenemams. Didžioji dalis tirtų padermių pasižymėjo dauginiu atsparumu trims skirtingoms antibiotikų grupėms. Dažniausiai invazinių K. pneumoniae padermių atsparumas buvo susijęs su TEM, SHV bei CTX1 ISBL tipų gamyba. Invazinės K. pneumoniae padermės, gaminančios įvairių tipų ISBL dažniau buvo atsparios ne beta-laktaminiams antibiotikams, palyginti su atitinkamų ISBL tipų negaminančiomis padermėmis. Dažniausiai skirtingų ISBL tipų gamyba buvo susijusi su atsparumu GM.
5
SUMMARY
CHARACTERISTICS OF EXTENDED-SPECTRUM BETA-LACTAMASES PRODUCED BY INVASIVE KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS
Klebsiella pneumoniae is one of the most clinically important opportunistic pathogens that
colonizes the human digestive tract, the skin and upper respiratory tract mucous membrane and can cause invasive infections, pneumonia, urinary tract or wound infections, sepsis and other. These infections can rapidly spread between patients and cause outbreaks in health care institutions. It was found that the most significant resistance mechanism of K. pneumoniae is the extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) production, which is encoded by the plasmid genes.
Aim of the study: To identify the resistance of invasive K. pneumoniae strains to antibiotics and evaluate the molecular characteristics of the ESBL.
Objectives:
1. To identify the frequency of invasive K. pneumoniae strains resistance to various groups of antibiotics.
2. To identify the prevalent types of ESBL in K. pneumoniae strains.
3. To evaluate the relationship between the ESBL types and the resistance to non-beta-lactam antibiotics.
Methods: The research included invasive K. pneumoniae strains, which produces ESBL. Resistance to antibiotics identified for selected strains and evaluated according to the requirements of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). ESBL types of invasive K.
pneumoniae strains were determined using the polymerase chain reaction (PCR) method. The
statistical analysis was performed using the IBM SPSS 23.0 statistical package.
Research object: Invasive K. pneumoniae strains, producing ESBL isolated from blood or cerebrospinal fluid (CSF) of patients treated in „Hospital of Lithuanian University of Health Sciences“ during 2015-2016 and microbiological results reports.
Results: 90.9 percent of chosen invasive K. pneumoniae strains were resistant to aminoglycosides, 74.5 percent – to fluoroquinolones and 80.0 percent - to sulfonamides/pyrimidines. All invasive strains of K. pneumoniae producing ESBL were sensitive to carbapenems. 69.1 percent of isolated invasive K.
pneumoniae strains were characterized by multiple resistance to fluoroquinolones, cephalosporins and
aminoglycosides. Most of these strains were isolated from patients treated in the therapeutic profile units (30.9 percent), 21.8 percent of the multiresistant invasive strains of K. pneumoniae were isolated from pacients treated in intensive care units, 16.4 percent - from surgical profile units. The research showed that the most prevalent types of ESBL were TEM, SHV and CTX1 (96.4 percent), while the
6 least prevalent - CTX4 and CMY2 types (12.7 percent). CTX4 and CTX2 types predominated in intensive care units, while CMY2 type was more often isolated from the material of patients treated in the therapeutic profile units. OXA type was more commonly found in the surgical profile units. The research showed that the majority of invasive K. pneumoniae strains producing TEM, SHV, CTX2 and CTX1 types of ESBL were resistant to gentamicin, while the highest resistance to trimethoprim/sulfamethoxazole was detected in strains that have an OXA type. The results of the statistical analysis showed that the least common invasive K. pneumoniae strains producing CTX4 type were statistically significantly more frequently (100.0 percent) resistant to amikacin, compared to this type non producing strains (31.3 percent). The most of CTX1 (77.7 percent) and OXA-producing strains (94.1 percent) were resistant to ciprofloxacin.
Conclusions: All invasive strains of K. pneumoniae producing ESBL were sensitive to carbapenems. Most of the investigated strains were characterized by multiple resistance to three different antibiotic groups. Generally, resistance of invasive K. pneumoniae strains was associated with TEM, SHV and CTX1 ESBL types. Invasive K. pneumoniae strains producing different types of ESBL were more resistant to non-beta-lactam antibiotics, compared to non-ESBL-producing strains. Generally, the production of different ESBL types was associated with resistance to gentamicin.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS
8
BIOETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Tyrimui atlikti 2017-12-21 buvo gautas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Bioetikos centro leidimas Nr. BEC-LMB (M)-154 (1 priedas). Tyrimo metu buvo užtikrintas gautų duomenų konfidencialumas bei tiriamųjų anonimiškumas.
9
SANTRUMPOS
AN ASPĮ CAZ CIPCLSI (angl. Clinical and Laboratory
Standards Institute)
CTX DAA DNR
amikacinas
asmens sveikatos priežiūros įstaiga ceftazidimas
ciprofloksacinas
Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas
cefotaksimas
dauginis atsparumas antibiotikams dezoksiribonukleorūgštis
EARS-Net (angl. European Antimicrobial
Resistance Surveillance Network)
ECDC (angl. European Centre for Disease
Prevention and Control)
ES
EUCAST (angl. European Comittee on
Antimicrobial Suspectibility Testing)
GM HI
ISBL(angl. Extended-Spectrum
Beta-lactamases) IMP JAV KFV/ml K. pneumoniae LSMU MEM
NCBI (angl. National Center for
Biotechnology Information)
PGR PPB
Europos atsparumo antibiotikams stebėsenos tinklas
Europos ligų kontrolės ir prevencijos centras
Europos Sąjunga
Europos komitetas skirtas jautrumo antibiotikams tyrimams
gentamicinas
hospitalinė infekcija
išplėsto spektro beta-laktamazės
imipenemas
Jungtinės Amerikos Valstijos kolonijas formuojantys vienetai/mililitre Klebsiella pneumoniae Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
meropenemas
Nacionalinis biotechnologijos informacijos centras
polimerazės grandininė reakcija peniciliną prijungiantys baltymai
10 PSO
RITS
SXT
Pasaulio sveikatos organizacija reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyrius
11
ĮVADAS
Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) yra vienas iš kliniškai svarbiausių oportunistinių
patogenų, kolonizuojantis žmogaus virškinamąjį traktą, odos ir viršutinių kvėpavimo takų gleivinę bei galintis sukelti sunkias invazines infekcijas, pneumonijas, šlapimo takų, žaizdų infekcijas, sepsį ir kt. Šios infekcijos gali sparčiai plisti tarp pacientų ir sukelti pavojingus protrūkius asmens sveikatos priežiūros įstaigose (ASPĮ). Dažniausiai tai atsitinka pacientams su nusilpusia imunine sistema, po chemoterapinio gydymo, sergantiems cukriniu diabetu, alkoholizmu bei intubuotiems ligoniams [1, 2, 3]. Neracionalus antimikrobinių vaistų vartojimas didina K. pneumoniae atsparumą antibiotikams. Dėl šios priežasties, labai svarbi yra nuolatinė atsparių padermių stebėsena bei atsparumo antibiotikams mechanizmų identifikavimas [4, 5].
Didžiausią grėsmę kelia K. pneumoniae padermės, gaminančios išplėsto spektro beta-laktamazes (angl. extended-spectrum beta-lactamases – ISBL), kurių dėka šie patogenai tampa atsparūs beta-laktaminiams antibiotikams – penicilinams, cefalosporinams, monobaktamams. [2, 6, 7]. Nustatyta, kad K. pneumoniae ISBL gamyba yra koduojama plazmidėse, kurios gali būti perduodamos nuo vieno patogeno kitam. Dėl šios priežasties ISBL gaminančių mikroorganizmų rūšių daugėja ir tai tampa rimta visuomenės sveikatos problema [6, 8]. Plazmidėse esančiuose genuose taip pat gali būti koduojamas atsparumas kitiems antibiotikams. Tokiu būdu vystosi dauginis atsparumas (multirezistentiškumas) kelioms antibiotikų grupėms ir K. pneumoniae sukeltų infekcijų gydymas tampa komplikuotas [2, 7].
Pagal Europos antimikrobinio atsparumo stebėsenos tinklo (angl. European Antimicrobial
Resistance Surveillance Network - EARS-Net) duomenis, 2016 m. EARS – Net veikloje
dalyvaujančiose Europos Sąjungos (ES) šalyse, dažniausiai invazinės K. pneumoniae padermės buvo atsparios trečios kartos cefalosporinams. Daugelis jų gamino ISBL, o taip pat pasižymėjo dauginiu atsparumu skirtingų grupių antibiotikams. Invazinių K. pneumoniae padermių dauginis atsparumas trečios kartos cefalosporinams, aminoglikozidams ir fluorochinolonams 2013-2016 m. Lietuvoje padidėjo beveik 10 proc. (nuo 33,3 proc. iki 42,1 proc.), tuo tarpu kai kitose ES šalyse atsparumas šiems vaistams nesiekia 10 proc. [4].
Invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL atsparumas antibiotikams Lietuvoje ir kitose pasaulio šalyse iki šiol išlieka didelis. Atsižvelgiant į šią problemą, darbe siekta detaliau pažvelgti į invazinių K. pneumoniae padermių atsparumo antibiotikams mechanizmus bei nustatyti ISBL tipų variantus, lemiančius atsparumą įvairiems antibiotikams.
12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti invazinių K. pneumoniae padermių atsparumą antibiotikams ir įvertinti su atsparumu susijusių ISBL charakteristiką.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL, atsparumo įvairių grupių antibiotikams dažnį.
2. Nustatyti vyraujančius ISBL tipus K. pneumoniae padermėse.
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Mikroorganizmų atsparumas antibiotikams – grėsmė šiuolaikinei medicinai
Antibiotikų eros pradžia yra laikoma data, kuomet pirmą kartą buvo atrastas penicilinas. Per daugiau nei 80 metų buvo pagaminta ir gamtoje atrasta daugybė įvairių antibiotikų, kurie tapo efektyviausia priemone gydyti infekcines bakterinės kilmės ligas. Antibiotikų dėka sumažėjo mirtingumas nuo tokių infekcinių ligų kaip meningitas, pneumonija, sepsis, sunkios pooperacinių žaizdų infekcijos, o taip pat prailgėjo vidutinė žmonių gyvenimo trukmė [2, 9, 10].
Praėjus keliems dešimtmečiams po penicilino atradimo, kuomet žymiai sumažėjo sergamumas infekcinėmis ligomis, išryškėjo kita problema – neracionalus antibiotikų vartojimas nulėmė atsparių bakterijų padermių paplitimą [2, 9]. Pirmasis apie tai pranešė penicilino atradėjas – Aleksandras Flemingas, tačiau dėl nepakankamo finansavimo moksliniams tyrinėjimams šioje srityje, jo nuomonė nebuvo pakankamai įvertinta [2]. Vis dėl to vėliau buvo įrodyta, kad didelis bakterijų genomo plastiškumas nulemia tai, jog bakterijos sugeba ne tik prisitaikyti prie besikeičiančių aplinkos sąlygų, bet ir gali perduoti kai kuriuos atsparumą lemiančius veiksnius kitoms, mažiau virulentiškoms bakterijų padermėms. Dėl šios bakterijų savybės, mikroorganizmų atsparumas antibiotikams sparčiai plinta, o taip pat vystosi dauginis atsparumas antibiotikams (DAA) [11, 12].
Šiuo metu bakterijų atsparumas antibiotikams yra viena iš svarbiausių ir sudėtingiausių visuomenės sveikatos problemų visame pasaulyje [2, 3, 8, 10, 13]. Kiekvienais metais Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) apie 2 mln. žmonių užsikrėčia patogenais, kurie yra atsparūs antibiotikams ir mažiausiai 23 tūkst. žmonių miršta dėl šių infekcijų, [14] tuo tarpu 29 ES šalyse kasmet dėl antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų miršta 25 tūkst. žmonių [2].
Nuo 1998 metų kiekvienais metais EARS-Net tinklas registruoja duomenis apie 7 patogeninių mikroorganizmų, kurie gali sukelti invazines infekcijas, atsparumo antibiotikams paplitimą. Tai
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli (E.coli), K. pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Enterococcus faecium ir Enterococcus faecalis [15].
Europos ligų prevencijos ir kontrolės tinklo (ang. European Centre for Disease Prevention and
Control - ECDC) duomenimis, atsparumas antimikrobiniams vaistams ne visose šalyse yra vienodas.
Didžiausias atsparumas antibiotikams stebimas Pietų ir Rytų Europos šalyse, tuo tarpu mažiausias – Šiaurės Europos šalyse. Šie skirtumai yra susiję su nevienodu antibiotikų vartojimu, infekcijų kontrole bei skirtingais sveikatos priežiūros modeliais įvairiose Europos šalyse [4].
Viena svarbiausių priežasčių, dėl kurių vystosi bakterijų atsparumas antimikrobiniams vaistams yra antibiotikų vartojimas [2, 9]. Šiuo metu antibiotikai yra vieni dažniausiai skiriamų vaistų visame pasaulyje, jie yra plačiai naudojami ne tik infekcinių bakterinės kilmės ligų gydymui, bet ir
14 veterinarijoje bei augalininkystėje profilaktiniais tikslais. Nustatyta, kad net iki 50 proc. atvejų antibiotikai nėra tinkamai paskiriami, dažnai jie skiriami nepagrįstai arba neužtikrinama reikalinga gydymo antibiotikais trukmė bei skiriama netinkama dozė [2]. Neracionalus antibiotikų vartojimas didina atsparių mikroorganizmų atsiradimo tikimybę, kurie gali plisti tarp žmonių per aplinkos daiktus, kontaktuojant su gyvūnais arba vartojant maisto produktus (1 pav.) [9, 14].
Nepaisant antimikrobinio atsparumo skirtumų tarp šalių, bakterijų atsparumas antibiotikams neabejotinai yra rimta viso pasaulio problema, reikalaujanti nuolatinės epidemiologinės priežiūros [3]. Netinkamai parinktas antimikrobinis gydymas didina atsparių mikroorganizmų padermių paplitimą ir dėl to didėja pacientų mirštamumo rizika, ilgėja ligonių, gydomų ASPĮ hospitalizacijos laikas bei didėja su gydymu susijusios išlaidas [2]. Turint omenyje, kad pastaruoju metu senka naujų antibiotikų gamybos ištekliai ir mikroorganizmų atsparumas antimikrobiniams vaistams plinta greičiau negu spėjama pagaminti naujus antibiotikus, infekcinių ligų sukeltų atsparių bakterijų padermių gydymas tampa komplikuotas [2, 3].
15 1.2. K. pneumoniae klinikinė svarba ir atsparumo antibiotikams problema
Enterobacteriaceae šeima – didelė, heterogeniška gramneigiamųjų lazdelių grupė. Dauguma
šios grupės bakterijų yra aptinkama žmogaus ir gyvūnų virškinamajame trakte kaip normaliosios mikrofloros dalis. Enterobakterijos yra viena kliniškai svarbiausių ir dažniausiai išskiriamų klinikinėse mikrobiologijos laboratorijose bakterijų grupė, kartu su stafilokokais ir streptokokais dažniausiai sukelianti įvairias infekcijas. Pagal nacionalinio biotechnologijos informacijos centro (angl. National
Center for Biotechnology Information, NCBI) taksonomijos bazės duomenis, Enterobacteriaceae
šeimą sudaro 63 gentys, iš kurių 20-25 rūšys yra kliniškai svarbios [16, 17]. Dažniausiai pavojingas infekcijas žmonėms sukelia šie Enterobacteriaceae šeimos atstovai: E. coli, Klebsiella spp. ir
Enterobacter spp. [18].
Tarp kliniškai bei epidemiologiškai svarbiausių Klebsiella genties patogenų, reikšmingą vietą užima K. pneumoniae. Tai patogenas, kolonizuojantis žmogaus virškinamąjį traktą, o taip pat dažnai aptinkamas ant hospitalizuotų pacientų odos ar viršutinių kvėpavimo takų gleivinių. Dažniausiai K.
pneumoniae sukeltos infekcijos greitai plinta tarp hospitalizuotų pacientų ir sukelia protrūkius tretinio
lygio ASPĮ. [4, 19]. Ypatingai pavojingi yra protrūkiai, sukelti K. pneumoniae rūšių, gaminančių ISBL, kadangi šios padermės yra atsparios daugeliui antibiotikų, o taip pat pasižymi DAA [1].
Dažniausiai infekcijų protrūkiai sukelti bakterijų padermių gaminančių ISBL yra registruojami reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriuose (RITS) [20]. Tai yra susiję su įvairias rizikos veiksniais, tokiais kaip: dažna kateterizacija, ilga pacientų hospitalizacijos trukmė, dirbtine plaučių ventiliacija, gausus plataus veikimo spektro antibiotikų vartojimas [21]. Padidėjus makroorganizmo imlumui infekcijoms dėl vartojamų imunosupresinių vaistų, chemoterapinio gydymo, atliktos transplantacijos, sergantiems cukriniu diabetu ar lėtiniu alkoholizmu, K. pneumoniae gali sukelti sunkius ūminius respiracinius sindromus, pneumonijas, žaizdų, šlapimo takų infekcijas bei sepsį. Pneumonijos, sukeltos Klebsiella genties bakterijų padermių dažnai yra lydimos destrukcinių plaučių parenchimos pažeidimų ir dėl to formuojasi abscesai bei empiemos [4, 22, 23]. Nustatyta, kad kai kurios K. pneumoniae padermės sveikiems žmonėms sukelia invazines infekcijas, pvz. kepenų abscesus su bakteriemija [4]. Be to, K. pneumoniae iš visų gramneigiamų mikroorganizmų yra antras pagal dažnumą patogenas sukeliantis hospitalines kraujo infekcijas [24].
ECDC tinklo pateiktoje antimikrobinio atsparumo ataskaitoje nurodoma, kad šiuo metu didžiausią nerimą kelia didelis gramneigiamų bakterijų padermių, tarp jų ir K. pneumoniae, atsparumas daugeliui antibiotikų. Dėl didelio patogenų rezistentiškumo daugeliui antibakterinių preparatų, dažnai nelieka kitų gydymo alternatyvų, o pradedant gydyti infekcijas plačiausio veikimo spektro antibiotikais – karbapenemais, padidėja rizika bakterijoms prisitaikyti ir atsirasti naujoms, karbapenemams atsparioms patogenų padermėms [3].
16 2016 m. ES šalyse daugiau nei trečdalis (34,5 proc.) invazinių K. pneumoniae padermių buvo atsparios bent vienai antibiotikų grupei (fluorochinolonams, aminoglikozidams, trečios kartos cefalosporinams ar karbapenemams) ir beveik penktadalis (15,8 proc.) padermių pasižymėjo DAA – fluorochinolonams, trečios kartos cefalosporinams ir aminoglikozidams. Pagrindinis K. pneumoniae padermių atsparumą antibiotikams lemiantis veiksnys yra fermentų – ISBL gamyba [4]. Nustatyta, kad esant ISBL gaminančių padermių sukeltai infekcijai, pacientų mirštamumas yra dvigubai didesnis, nei tais atvejais, kai infekciją sukelia bakterijų padermės, nesintezuojančios ISBL [25].
1.3. K. pneumoniae atsparumo beta-laktaminiams antibiotikams mechanizmai
Beta-laktaminiai antibiotikai yra viena didžiausių antibiotikų grupių, naudojamų beveik visų rūšių infekcijoms, turinčioms platų etiologijos spektrą gydyti. Šiuo metu yra žinomos penkios beta-laktaminių antibiotikų rūšys: penicilinai, cefalosporinai, monobaktamai, beta-laktamazių inhibitoriai, kurie yra naudojami kartu su penicilinais ar cefalosporinais bei karbapenemai. Pastarieji yra laikomi plačiausio veikimo spektro antibiotikais, gebantys sunaikinti daugelį gramneigiamų bei gramteigiamų bakterijų. [2, 6]. Visi beta-laktaminiai antibiotikai pasižymi bendra savybe – jų cheminėje struktūroje yra beta-laktamo žiedas, kuris yra svarbus antimikrobiniam poveikiui (2,3 pav.) [26]. Beta-laktaminių antibiotikų veikimo mechanizmas yra paremtas bakterijų ląstelių sienelių biosintezės fermentų (peptidoglikanų), vadinamų peniciliną prijungiančių baltymų (PPB), slopinimu. Bakterijų ląstelės sienelė praranda vientisumą ir įvyksta bakterijos lizė [7].
2 pav. Beta-laktaminiai antibiotikai ir jų struktūra [27] 3 pav. Beta-laktaminio žiedo struktūra [27]
Pagal Pasaulio sveikatos organizaciją (PSO), atsparumas antibiotikams įvardijamas kaip tam tikromis savybėmis pasižyminčio mikroorganizmo gebėjimas atsilaikyti prieš antibiotikus, kuriems natūraliai jis turi būti jautrus [5]. Atsparumas antibiotikams gali būti įgimtas, kuris formuojasi dėl
17 antibiotikui jautrių taikinių trūkumo bakterijoje arba dėl nepralaidžios didelėms antibiotikų molekulėms bakterijos ląstelės sienelės. [5, 7]. Įgyto atsparumo išsivystymą lemia vertikalioji bei horizontalioji genų pernašos. Vertikalioji genų pernaša dažniausiai yra susijusi su taškinėmis mutacijomis chromosomų genuose, dėl kurių išsivysto atsparumas antibiotikams, tuo tarpu horizantaliosios genų pernašos metu atsparumo antibiotikams genai yra pernešami iš vienos bakterijos kitai bakteriofagų, transpozonų arba plazmidžių dėka [5, 11].
Bakterijai įgyjus atsparumo genų apsaugai nuo antimikrobinių medžiagų poveikio, ji gali naudoti įvairius biocheminius atsparumo antibiotikams mechanizmus, tokius kaip antibiotiko pašalinimas iš ląstelių – taikinių aktyvių pompų pagalba, PPB, dalyvaujančių ląstelės sienelės sintezėje modifikacija, antibiotikų inaktyvacija, naujų metabolinių kelių įgijimas keičiant senuosius, kuriuos slopina antibiotikų poveikis ir kt. (4 pav.) [5]. Didžiausią reikšmę bakterijų atsparumui beta-laktaminiams antibiotikams turi jų gebėjimas gaminti fermentus – beta-laktamazes, hidrolizuojančius bet-laktaminio antibiotiko žiedą. Toks mechanizmas yra vadinamas antibiotiko modifikacija, kuomet bakterijos gaminami fermentai atpažįsta antibiotiką, jį modifikuoja ir neleidžia prisijungti prie taikinių. Beta-laktamazei susijungus su antibiotiku, tarp jų susidaro nekovalentinis ryšys. Acetilinimo reakcijos metu susiformuoja kovalentinis acil – esterinis ryšys ir įvyksta hidrolizė, kurios metu antibiotikas inaktyvuojamas ir išlaisvinamas aktyvusis fermentas [5]. Ši savybė yra būdinga gramneigiamoms lazdelėms, tarp jų ir K. pneumoniae [5, 7, 17, 28].
4 pav. Bakterijos atsparumo antibiotikams mechanizmai [29]
Vienu svarbiausiu veiksniu, lemiančių atsparumo genų išplitimą tarp tos pačios ar skirtingų rūšių bakterijų yra laikomos pernešamos arba kitaip konjugacinės plazmidės. Plazmidės tai yra genetiniai nechromosominiai elementai, sudaryti iš žiedo formos dvigrandės DNR molekulės,
18 suteikiančios bakterijoms galimybę pernešti atsparumo antibiotikams genus iš vienos bakterijos kitai. Plazmidžių genuose yra koduojama ne tik ISBL gamyba, lemianti K. pneumoniae atsparumą beta-laktamams, tačiau juose taip pat yra genų, sąlygojančių atsparumą ir kitoms klinikinėje praktikoje naudojamoms antibiotikų grupėms – fluorochinolonams, aminoglikozidams, sulfonamidams/pirimidinams [10].
1.4. Beta-laktamazių klasifikacija
Beta-laktamazės – tai įvairių mikroorganizmų gaminami fermentai, kurie hidrolizuoja daugumą beta-laktaminių antibiotikų suardydami beta-laktaminio žiedo jungtis. Šiuo metu yra žinoma apie 1000 skirtingų beta-laktamazių, o joms klasifikuoti dažniausiai yra naudojamos Bush-Jacoby-Medeiros (funkcinė klasifikacija) bei Ambler (molekulinė klasifikacija) klasifikacijos schemos (1 lentelė) [5, 7, 26]. Remiantis molekuline Ambler klasifikacija, pagal aminorūgščių sekos homologiją, beta-laktamazės skirstomos į keturias klases žymimas raidėmis nuo A iki D. A, C ir D klasės tai serino beta laktamazės, o B klasei priskiriamos metalo-beta-laktamazės [7]. Remiantis funkcine Bush-Jacoby-Medeiros schema, pagal substrato ir slopiklio komplekso sudėtį, beta-laktamazės skirstomos į cefalosporinazes, karbapanemazes, penicilazes ir nepriskiriamus nei vienai iš minėtų grupių. Šios grupės žymimos skaičiais nuo 1 iki 4. [7, 30].
Abi klasifikacijos koreliuoja tarpusavyje: visi fermentai priskiriami prie 1 funkcinės grupės, sudaro struktūrinę klasę C, 2 grupę sudaro A ir D klasės betalaktamazės, tuo tarpu 3 grupės fermentai priskiriami B klasei. 4 grupę sudaro įvairūs fermentai nepriskiriami nei vienai molekulinei klasei.
1 lentelė. Beta-laktamazių klasifikacija pagal Ambler ir Bush-Jacoby-Medeiros schemas [7] Ambler molekulinė klasė Bush-Jacoby-Medeiros funkcinė grupė Inaktyvuojamas antibiotikas Slopinimas inhibitoriais (klavulano r., tazobaktamas) Fermentų pavyzdžiai
C 1 Cefalosporinai (I, II, III) NE Cefalosporinazės
ampC, CMY-2
A 2a Penicilinai TAIP PCI
2b Penicilinai, cefalosporinai (I) TAIP SHV-1, TEM-1, TEM-2 2be Penicilinai, monobaktamai,
cefalosporinai (I, II, III, IV)
TAIP CTX-M-15,
19 1 lentelės tęsinys
2br Penicilinai, cefalosporinai (I) NE 30, TEM-76, SHV-10 2c Penicilinai, karbenicilinas TAIP PSE-1, CARB-3
D 2d Penicilinai, kloksacilinas SILPNAS OXA-1, OXA-10
A 2e Cefalosporinai (I, II, III, IV) TAIP CepA
2f Karbapenemai TAIP IMI-1, KPC-2,
KPC-3
B 3 Daugelis beta laktaminių
antibiotikų, įskaitant karbapenemus
NE IMP-1, NDM-1,
VIM-1
1 grupės (C klasės) beta-laktamazės:
Tai grupė fermentų, kurių gamybą koduoja ampC genas, todėl šios beta-laktamazės dažnai yra vadinamos „ampC fermentais“. Jų veikimas negali būti sustabdytas beta-laktamazių inhibitoriais, dažniausiai naudojamais klinikinėje praktikoje (pvz. klavulanine r., sulbaktamu, tazobaktamu). Šių fermentų gamyba dažniausiai yra koduojama choromosomose, tačiau kartais ir plazmidžių genuose. 1 grupės fermentai dažniausiai sutinkami Enterobacteriaceae šeimos bakterijose, tarp jų ir K.
pneumoniae. Šios beta-laktamazės labiausiai nulemia atsparumą cefalosporinams, tačiau taip pat veikia
ir penicilinus bei monobaktamus [30].
2 grupės (A ir D klasių) beta-laktamazės:
Tai yra didžiausia grupė beta-laktamazių, kuriai priklauso ir ISBL, lemiančios atsparumą daugeliui laktaminių antibiotikų, tačiau dauguma šios grupės fermentų yra slopinama beta-laktamazių inhibitoriais. Kadangi fermentai, priklausantys 2 funkcinei beta beta-laktamazių grupei yra koduojami plazmidžių genuose, jie gali būti lengvai pernešami nuo vieno mikroorganizmo kitam, sukeliant atsparumą atitinkamiems antibiotikams [7, 26, 30].
Pagrindiniai 2 grupės fermentų tipai yra SHV ir TEM. TEM-1 tipas pirmą kartą identifkuotas 1965 m. Enterobacteriaceae šeimos bakterijose ir greitai paplito tarp Haemophilus, Neisseria ir Vibrio spp. genčių. Didžioji dauguma K. pneumoniae padermių pasižymi įgimtu atsparumu ampicilinui, kurį lemia plazmidžių genuose koduojamos SHV-1 tipo beta laktamazės gamyba. Šis fermentas pirmą kartą buvo atrastas 1979 m. ir dabar dažniausiai yra sutinkamas Klebsiella spp. ir E. coli bakterijose [7, 26, 30].
A molekulinės klasės beta-laktamazėms yra priskiriamos ir karbapanemazės, kurios hidrolizuoja karbapenemų beta-laktaminį žiedą ir inaktyvina šios grupės antibiotikus. Šiuo metu labiausiai paplitusi yra K. pneumoniae karbapenemazė – KPC, kuri pirmą kartą identifikuota 1996 m. JAV, o vėliau išplito visame pasaulyje. Nustatyta, kad kai kurios K. pneumoniae padermės,
20 gaminančios KPC tipo karbapanemazę sukėlė kelis infekcijos protrūkius įvairiose Europos šalyse, tačiau iki šiol Europoje nėra užregistruota daug infekcijų, sukeltų tokių K. pneumoniae padermių [6].
2d grupės beta laktamazės, priskiriamos prie D molekulinės klasės fermentų – tai oksacilinazės, kurios nulemia atsparumą ureidopenicilinams ir karboksipenicilinams. Labiausiai reikšmingos yra plataus spektro oksacilinazės, kurios geba hidrolizuoti daugumą beta-laktaminių antibiotikų, išskyrus karbapenemus [31].
3 grupės (B klasės) beta-laktamazės:
B molekulinei beta-laktamazių klasei priklauso metalo-beta-laktamazės, kurios nulemia atsparumą visiems beta-laktamams, tarp jų ir karbapenemams – meropenemui (MEM) ir imipenemui (IMP). Šių fermentų veikimo nestabdo įprastiniai beta-laktamazių inhibitoriai, išskytus EDTA. Metalo-beta-laktamazės dažniausiai sutinkamos P. aeruginosa, Bacteroides fragilis ir
Stenotrophomonas maltophilia padermėse [30].
B klasės metalo-beta-laktamazėms priklauso naujausiuose leidiniuose aprašytas NDM-1 fermentas, pavadintas Indijos sostinės Naujojo Delio vardu. Tai beta-laktamazė, suteikianti bakterijoms atsparumą daugeliui antibiotikų, tarp jų ir karbapenemams, nors daugelis šį fermentą gaminančių bakterijų padermių vis dar išlieka jautrios tigeciklinui bei kolistinui. Dažniausiai šį fermentą gamina gramneigiamos bakterijos, tarp jų ir K. pneumoniae. Iki šiol ES šalyse nėra užfiksuota infekcijos protrūkių, sukeltų K. pneumoniae padermių, gaminančių NDM-1 beta-laktamazę, tačiau nustatyta, kad jos gamyba yra koduojama plazmidėse, todėl gali greitai plisti tarp bakterijų [6].
4 grupės beta-laktamazės:
4 funkcinę grupę sudaro keli nepakankamai ištirti fermentai, kurie nėra priskirti nei vienai molekulinei klasei pagal Ambler laktamazių klasifikacijos schemą. Žinoma, kad tai beta-laktamazės, slopinančios penicilinų veikimą [30].
1.5. Išplėsto spektro beta-laktamazių charakteristika
ISBL – tai plazmidžių bei chromosomų koduojami fermentai, kurie hidrolizuoja daugumą penicilinų, cefalosporinų ir monobaktamų, išskyrus cefamicinus ir karbapenemus. Dauguma ISBL yra slopinama beta-laktamazių inhibitorių, tokių kaip klavulaninė r., tazobaktamas, sulbaktamas, pagalba. Jų dėka yra išsaugomas beta-laktaminių antibiotikų aktyvumas ir užtikrinamas platesnis jų veikimas. Nustatyta, kad beta-laktamazių slopikliai labiausiai veikia bakterijų gaminamas A molekulinės klasės beta-laktamazes ir mažiau yra aktyvūs prieš B, C ir D klasių beta-laktamazes [5, 32].
21 Pirmosios ISBL gaminančios bakterijų padermės buvo nustatytos 1983 m. Vokietijoje ir iki šiol yra stebimos bei tiriamos visame pasaulyje [33]. Jų paplitimas yra susijęs su horizontaliąja ISBL genų pernaša plazmidėmis ir rečiau su šių genų atsiradimu de novo. ISBL gamyba labiausiai yra būdinga E. coli ir K. pneumoniae bakterijų padermėms, tačiau yra nustatoma ir kitose
Enterobacteriaceae šeimos bakterijose. ISBL teigiamos bakterijų padermės dažniausiai yra
identifikuojamos tretinio lygio ASPĮ hospitalizuotiems žmonėms su nusilpusia imunine sistema ir sukelia infekcijų protrūkius. Vis dėl to, paskutiniu metu vis dažniau ISBL gaminančios bakterijų padermės sutinkamos ir bendruomenėje, tarp sveikų žmonių. ISBL paplitimas priklauso nuo geografinės vietovės, ligoninės ar skyriaus, bakterijų rūšies [7, 32].
Kliniškai svarbiausi ir dažniausiai nustatomi ISBL tipai gramneigiamose bakterijose yra SHV, TEM bei CTX-M. Atsiradus taškinėms mutacijoms SHV ar TEM fermentuose, viena aminorūgštis gali pasikeisti į kitą, tokiu būdu užtikrinant naujo ISBL tipo atsiradimą. Dėl šios priežasties, ISBL įvairių tipų skaičius didėja [5].
TEM tipas:
TEM tipo ISBL yra klasifikuojamos į TEM-1 ir TEM-2 tipus. TEM-1 beta-laktamazė yra dažniausiai sutinkamas fermentas gramneigiamose bakterijose, ypač E. coli ir K. pneumoniae padermėse. Taip pat TEM tipo beta-laktamazės dažnai identifikuojamos kitos nefermentuojančios lazdelės – P. aeruginosa padermėse. Šis tipas lemia atsparumą penicilinams bei pirmos kartos cefalosporinams [20].
1984 m. Prancūzijoje iš K. pneumoniae padermės pirmą kartą buvo identifikuotas TEM-3 tipas, kuris ilgą laiką buvo vadintas CTX-1 tipu dėl savo gebėjimo slopinti cefotaksimo (CTX) aktyvumą. Vėliau buvo nustatyta, kad TEM-3 tipas susiformavo kaip TEM-2 tipo atmaina, pasikeitus kelioms aminorūgštims. Šiuo metu yra žinoma apie 100 įvairių TEM tipo variantų [30].
SHV tipas:
Apie 68 proc. SHV-1 tipo beta-laktamazės aminorūgščių yra sutinkama ir TEM-1 fermente, todėl šios beta-laktamazės struktūriškai yra panašios. SHV-1 tipo ISBL dažniausiai yra identifikuojama K. pneumoniae padermėse ir yra susijusi su prigimtiniu plazmidėse koduojamu atsparumu ampicilinui. Taip pat, šis ISBL tipas yra nustatomas P. aeruginosa ir Acinetobacter spp. bakterijų padermėse. Dažniausiai SHV tipo ISBL yra sutinkamos ES šalyse bei JAV [34].
CTX-M tipas:
CTX-M tipas pirmą kartą buvo išskirtas iš CTX atsparios E. coli padermės. Pavadinimas „CTX-M“ (CefoTaXime) apibrėžia fermento gebėjimą hidrolizuoti CTX. CTX-M ISBL yra jautrios
22 beta-laktamazių inhibitoriams, naudojamiems klinikinėje praktikoje, pvz. tazobaktamui, klavulaninei r. Šiuos fermentus gamina net 26 skirtingos bakterijų rūšys, tačiau pagrindiniu ISBL šaltiniu yra laikomos E. coli, K. pneumoniae ir Proteus mirabilis bakterijų padermės. Nustatyta, kad CTX-M tipo fermentai gana retai aptinkami nefermentuojančiose bakterijose, tokiose kaip P. aeruginosa,
23
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
2.1. Tiriamųjų atranka, tyrimo organizavimas ir statistinė duomenų analizė
2015-2016 metų laikotarpiu pacientams, gydytiems Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Kauno klinikose atlikti kraujo ir likvoro pasėliai. Remiantis biocheminėmis bakterijų savybėmis ir MALDI - Tof automatizuota bakterijų identifikavimo sistema masių spektrometrijos metodu buvo atrinktos K. pneumoniae padermės. Pagal atrankos kriterijų – atsparumą trečios kartos cefalosporinams (ceftazidimui (CAZ) ir/arba CTX), tolesniems tyrimams diskų difuzijos metodu atrinktos K. pneumoniae padermės, kurios galimai gamina ISBL. Taikant dviejų antibiotikų diskų sinergetinį metodą, galutinai atrinktos 55 K. pneumoniae padermės, gaminančios ISBL ir atlikta jų analizė.
Atrinktoms K. pneumoniae padermėms nustatytas atsparumas antibiotikams ir tirti ISBL tipai polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodu. Darbo metodika patvirtinta LSMU bioetikos centro komisijos leidimu Nr. BEC-LMB(M)-154 (1 priedas).
Tyrimo objektas: LSMU ligoninės Kauno klinikose 2015-2016 m. gydytų pacientų, kuriems iš kraujo arba likvoro buvo išskirtos invazinės K. pneumoniae padermės, gaminančios ISBL bei mikrobiologinių tyrimų rezultatų protokolai.
Taikant diskų difuzijos metodą, ištirtas K. pneumoniae padermių atsparumas 4 skirtingoms antibiotikų grupėms (2 lentelė). K. pneumoniae padermės, kurios in vitro buvo atsparios bent vienam antibiotikui vienoje grupėje, laikytos padermėmis atspariomis visai antibiotikų grupei, o nustačius šios bakterijos atsparumą trims antibiotikų grupėms: aminoglikozidams, fluorochinolonams ir cefalosporinams, laikyta, kad tokia padermė pasižymi DAA.
2 lentelė. Antibiotikų, kuriems ištirtas invazinių K. pneumoniae gaminančių ISBL atsparumas, sąrašas
Antibiotikų grupė Antibiotikas
Karbapenemai meropenemas, imipenemas
Aminoglikozidai amikacinas, gentamicinas
Fluorochinolonai ciprofloksacinas
24 Invazinių K. pneumoniae padermių atsparumo įvairių grupių antibiotikams bei ISBL tipų paplitimo skirtumai palyginti priklausomai nuo skyriaus profilio, kuriame buvo gydyti pacientai (3 lentelė).
3 lentelė. LSMU Kauno klinikų skyrių, kuriuose išskirta ISBL gaminanti K. pneumoniae, sąrašas SKYRIUS
Chirurginio profilio skyriai Terapinio profilio skyriai Reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriai
Chirurgijos skyrius
Galvos smegenų chirurgijos skyrius Krūtinės chirurgijos Ortopedijos ir traumatologijos skyrius Gastroenterologijos skyrius Nefrologijos skyrius Hematologijos skyrius Naujagimių ligų skyrius 2 vaikų ligų skyrius Reumatologijos skyrius
Centrinės reanimacijos skyrius Naujagimių reanimacijos ir ITS Vaikų ITS
Širdies chirurgijos anestezijos ir ITS Neurochirurgijos reanimacijos ir ITS Kardiologijos ITS
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojantis IBM SPSS 23.0 statistiniu duomenų paketu. Buvo laikoma, kad skirtumas tarp lyginamų grupių yra statistiškai reikšmingas, kai p ≤ 0,05, o pasikliovimo lygmuo 95 proc. Analizuojant dažnių skirtumą tarp kelių grupių naudotas neparametrinis statistinis kriterijus 2. Jei laukiami skaičiai buvo mažesni negu 5, taikytas Fišerio tikslusis testas.
2.2. Mikrobiologiniai tyrimo metodai
2.2.1. Bakteriologinis tyrimas. Pasėlio metodas
Tiriamosios medžiagos (kraujo ir likvoro) mikrobiologinis tyrimas atliktas laikantis visų reikalavimų, nurodytų standartinėse metodikose.
Kraujas pasėlio tyrimui steriliomis sąlygomis imtas iš periferinės venos į specialius buteliukus (aerobinį ir anaerobinį) pripildytus mitybinėmis terpėmis – Bactec terpės. Buteliukai pristatyti į laboratoriją per 2 val. nuo kraujo paėmimo ir inkubuoti BACTEC Fx automatinėje sistemoje. Esant bakterijų augimui, kraujo ir mitybinės terpės mišinyje nustatomi CO₂ pokyčiai, kuriuos automatinė sistema fiksuoja ir pažymi kompiuteryje. Sistemai užfiksavus bakterijų augimą, atlikti du tepinėliai, iš kurių vienas buvo nudažytas Gramo būdu, o kitas paliktas natyvinis. Tepinėlių mikroskopija atlikta naudojant 1000x padidinimą: natyviniame tepinėlyje buvo vertintas
25 mikroorganizmų buvimas bei judrumas, o Gramo būdu dažyto tepinėlio pagalba vertinta bakterijų forma, dažymosi pobūdis bei išsidėstymas. Remiantis atliktos mikroskopijos duomenimis, parinktos tinkamos pasėliui kietos mitybinės terpės: 5 proc. kraujo agaras, šokoladinis bei McConkey agarai ir atlikta išankstinė antibiotikograma.
Buteliuko turinys, kuriame užfiksuotas mikroorganizmų augimas švelniai sumaišytas, dangtelis nudezinfekuotas ir paliktas kelioms minutėms nudžiūti. Naudojant specialias adatas, keli kraujo lašai inokuliuoti į Petri lėkšteles su skirtingais agarais. Naudojant sterilią kilpelę lašai paskleisti viršutiniame agaro sektoriuje, kelių kvadratinių centimetrų plote. Po to, išsėta sektoriais ant viso agaro paviršiaus. Ant užsėto kraujo agaro kita sterilia kilpele uždėtas simbiozinio stafilokoko brūkšnys. Kraujo bei šokoladinis agarai 24-48 val. inkubuoti CO2 sąlygomis, 35C temperatūroje, o MacConkey mitybinė terpė inkubuota 18-24 val. 35C temperatūroje.
Likvoras mikrobiologiniam pasėlio tyrimui steriliomis sąlygomis imtas į sterilų užsukamą centrifuginį mėgintuvėlį. Tiriamoji medžiaga kambario temperatūros sąlygomis pristatyta į laboratoriją per 15 min nuo jos paėmimo ir iš karto nucentrifuguota 1500 x g 15 min. Naudojant sterilią pipetę viršutinis skaidrus skysčio sluoksnis nutrauktas ir išpiltas į nukenksminimo indą. Iš nuosėdų atlikti du tepinėliai: dažytas Gramo būdu ir metileno mėliu. Atlikta tepinėlių mikroskopija naudojant 1000x padidinimą. Vertintas polimorfonuklearų kiekis regėjimo lauke ir mikroorganizmų buvimas. Pagal atliktos mikroskopijos duomenis parinkti tinkami pasėliui mitybiniai agarai. Sterilios kilpelės pagalba nuosėdos užneštos ant 5 proc. kraujo, šokoladinio bei McConkey agarų ir paskleistos kelių kvadratinių centimetrų plote, viršutiniame šių terpių sektoriuje, o paskui naudojant tą pačią kilpelę, išsėta sektoriais ant viso agaro paviršiaus. Kita sterilia kilpele ant 5 proc. kraujo agaro uždėtas simbiozinio stafilokoko brūkšnys. Kraujo ir šokoladinis agarai inkubuoti 24-48 val. 35C temperatūroje CO2 inkubatoriuje, o MacConkey mitybinė terpė - 18-24 val. 35C temperatūroje. Likusios nuosėdos inokuliuotos į Bactec gausinimo terpę, kuri įdėta į BACTEX Fx automatinę sistemą. Nustačius bakterijų augimą Bactec terpėje, atliktas tepinėlis ir nudažytas Gramo būdu. Pagal mikroskopijos duomenis atliktas pasėlis į 5 proc. kraujo, šokoladinį bei McConkey agarus ir atlikta išankstinė antibiotikograma.
2.2.2. K. pneumoniae identifikavimas
K. pneumoniae padermės identifikuotos remiantis šiam mikroorganizmui būdingomis savybėmis. K. pneumoniae augdamos ant kietų mitybinių terpių formuoja stambias, beveik susiliejančias kolonijas. Ant
MacConkey agaro šios bakterijos kolonijos yra labai gleivėtos, šlapios.
Naudojant sterilią kilpelę kelios K. pneumoniae kolonijos, augusios ant MacConkey agaro perkeltos į mėgintuvelius su įvairiomis terpėmis, kurios sudaro “margają eilutę”. Tai Simonso citrato agaras, manito
26 druskos agaras, Kliglerio geležies agaras, fenilalanino agaras, šlapalo agaro terpė ir SIM terpė. K.
pneumoniae padermėms būdingas sacharidų skaidymas iki rūgščių ir CO2, katalazės bei lizino dekarboksilazės sintezė, Simonso citrato ir šlapalo hidrolizės skaidymas bei nesintezuotas indolas.
Remiantis MALDI-Tof automatizuota bakterijų identifikavimo sistema galutinai patvirtintos
K. pneumoniae padermės.
2.2.3. K. pneumoniae išplėsto spektro beta-laktamazių nustatymas
ISBL gamybos patikrai buvo taikytas standartinis diskų difuzijos metodas. Paruošta 0,5 MacFarlando drumstumo K. pneumoniae suspensija užsėta ant Miulerio - Hintono agaro ir 20 mm atstumu tarp diskų centrų uždėti indikatorinių cefalosporinų - CTX (5 μg) ir CAZ (10 μg) diskeliai. Iš disko į terpę su tiriamąja bakterijų kultūra difundavusi antimikrobinė medžiaga slopina mikroorganizmų augimą. Susidarius mažesnei nei 21 mm apie CTX diskelį arba mažesnei nei 22 mm apie CAZ diskelį bakterijų augimo slopinimo zonai, buvo laikyta, kad tokia K. pneumoniae padermė galimai gamina ISBL. Nustačius tiriamos bakterijos atsparumą bent vienam trečios kartos cefalosporinui buvo atliekamas ISBL sintezę patvirtinantis testas paremtas dvigubos diskų difuzijos metodu – dviejų antibiotikų diskų sinergetiniu metodu. Testo metu naudoti cefalosporinų - CTX (30 µg) ir CAZ (30 µg) bei amoksicilino (20 µg) su klavulanine rūgštimi (10 µg) diskai, Miulerio - Hintono agaro paviršiuje išdėlioti 20 mm atstumu tarp diskų centrų. Testas laikytas teigiamu jeigu slopinamosios zonos apie cefalosporino diskus išsiplėtė link disko, turinčio klavulaninės rūgšties. Atliekant ISBL gamybos patvirtinantį testą buvo naudota K.
pneumoniae ATCC 700603 kontrolinė padermė.
2.2.4. K. pneumoniae atsparumo antibiotikams įvertinimas
K. pneumoniae atsparumas antibiotikams nustatytas naudojant diskų difuzijos metodą,
paremtą standartine metodika. Iš 3-5 morfologiškai vienodų, izoliuotų bakterijų kolonijų, sterilia kilpele paimtų nuo kraujo agaro buvo pagaminta 0,5 MacFarlando drumstumo suspensija 0,9% NaCl tirpale. Naudojant spektrofotometrą nustatytas inokuliato kolonijų kiekis paruoštoje suspensijoje, kuris atitiko 1 – 2 × 10⁸ KFV/ml. Paruošta inokuliavimo medžiaga užsėta ant Miulerio-Hintono agaro per 15 min. nuo jos paruošimo. Ši procedūra atlikta naudojant sterilų medvilninį tamponėlį, kuriuo paruoštas inokuliatas paskirstytas štrichais per visą Petri lėkštelėje esančio agaro paviršių, kelis kartus sukant lėkštelę 60 laipsnių kampu, kad būtų užtikrintas kokybiškas inokuliato paskirstymas. Petri lėkštelės dangtelis paliktas 3-5 min, kad adsorbuotųsi drėgmės perteklius prieš uždedant antibiotikų diskus. Diskai prisotinti antibiotikais uždėti ant lėkštelės ir gerai prispausti prie agaro. Ši procedūra atlikta naudojant mechaninį paskirstymo aparatą arba sterilias žnyples. Petri lėkštelės inkubuotos 18-24 val.
27 35˚C temperatūroje. Po atliktos inkubacijos milimetrais buvo išmatuotos bakterijų augimą slopinamosios zonos. Slopinimo zonų dydžiai interpretuoti pagal EUCAST (4 lentelė).
4 lentelė. K. pneumoniae atsparumo antibiotikams ribos pagal EUCAST
Antibiotikas Koncentracija diske (μg) Zonos diametras (mm) Jautru Atsparu Gentamicinas 10 ≥17 <17 Ciprofloksacinas 5 ≥26 <26 Cefotaksimas 5 ≥20 <20 Ceftazidimas 10 ≥22 <22 Amikacinas 30 ≥18 <18 Meropenemas 10 ≥22 <22 Imipenemas 10 ≥22 <22
2.3. Genetiniai tyrimo metodai
2.3.1. K. pneumoniae DNR išskyrimas
Atrinktoms invazinėms K. pneumoniae padermėms, kurioms ISBL gamyba patvirtinta fenotipiniu metodu, buvo išskirta DNR. DNR išskyrimui buvo naudotas DNeasy Tissue rinkinys (“Qiagen”, Vokietija) pagal gamintojo rekomendacjas.
2.3.2. Polimerazės grandininės reakcijos atlikimas
Atlikus DNR išskyrimą, visoms invazinėms K. pneumoniae padermėms, gaminančioms ISBL buvo atlikta dauginė PGR, kurios taikinys buvo skirtingų tipų ISBL (blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaCTX-1,
blaCTX-2, blaCTX-4, blaCMY-2).
PGR – tai yra metodas skirtas DNR fragmento pagausinimui in vitro atlikti. Norimam DNR fragmentui yra parenkami specifiniai DNR taikiniui pradmenys, kurie komplementariai prisijungia prie DNR, ko pasekoje įvyksta naujo DNR fragmento sintezė. PGR reakcija vyksta cikliškai. Vieną ciklą sudaro 3 etapai (5 pav.) [35]:
28 1. Dvigrandės DNR denatūravimas
2. Naudojamų specifinių pradmenų prisijungimas prie DNR fragmento grandinių komplementarumo principu
3. DNR grandinės sintezė (pradmens ilginimas)
5 pav. Polimerazės grandininės reakcijos schema [35]
29
3. REZULTATAI
3.1. Invazinių Klebsiella pneumoniae padermių, gaminančių išplėsto spektro beta-laktamazes, atsparumas įvairių grupių antibiotikams
Vertinant invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL atsparumo įvairių grupių antibiotikams dažnį, nustatyta, kad 90,9 proc. visų tirtų šios bakterijos padermių buvo atsparios aminoglikozidams, 74,5 proc. – fluorochinolonams ir 80,0 proc. sulfonamidams/pirimidinams. Invazinių K. pneumoniae padermių atsparių plačiausio veikimo spektro antibiotikams – karbapenemams šio tyrimo metu, nenustatyta (6 pav.).
6 pav. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL, atsparumas įvairių grupių antibiotikams
AG – aminoglikozidai; FQ – fluorochinolonai; CAR – karbapenemai; SA/PY – sulfonamidai/pirimidinai
Vertinant atsparių skirtingoms antibiotikų grupėms K. pneumoniae padermių išskyrimo dažnį priklausomai nuo skyriaus profilio, kuriame buvo gydyti pacientai, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (5 lentelė). Atsparumas aminoglikozidams, fluorochinolonams bei sulfonamidams/pirimidinams buvo dažnesnis chirurginio profilio skyriuose (atitinkamai 100 proc., 90,0 proc. ir 90,0 proc.). Mažiausiai atsparių aminoglikozidams bei sulfonamidams/pirimidinams K.
pneumoniae padermių buvo išskirta iš tiriamųjų medžiagų pacientų, gydytų terapinio profilio skyriuose
(atitinkamai 83,3 proc. ir 75,0 proc.), o fluorochinolonams – RITS (57,1 proc.), tačiau šie rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi.
90,9% 74,5% 0,0% 80,0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AG FQ CAR SA/PY
30 5 lentelė. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių,
gaminančių ISBL, atsparumas įvairioms antibiotikų grupėms chirurginio, terapinio bei reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriuose
Antibiotikų grupė
Antimikrobinis atsparumas proc. (abs. skaičiais) Chirurginio
profilio skyriai RITS
Terapinio
profilio skyriai p reikšmė
Aminoglikozidai 100 (10) 95,2 (20) 83,3 (20) 0,208
Fluorochinolonai 90,0 (9) 57,1 (12) 83,3 (20) 0,061
Karbapenemai 0 (0) 0 (0) 0 (0) -
Sulfonamidai/piri
midinai 90,0 (9) 81,0 (17) 75,0 (18) 0,603
RITS – reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriai
Tarp tirtų invazinių K. pneumoniae padermių stebėtas dauginis atsparumas trims skirtingoms antibiotikų grupėms: fluorochinolonams, cefalosporinams bei aminoglikozidams (69,1 proc.). Dauginio atsparumo antibiotikams dažnis skyrėsi priklausomai nuo paciento hospitalizavimo vietos. Statistiškai reikšmingai (p=0,045) daugiau atsparių minėtoms antibiotikų grupėms invazinių K.
pneumoniae padermių buvo išskirta terapinio profilio skyriuose gydytiems pacientams (30,9 proc.), iš
kurių 12,8 proc. – pacientams gydytiems nefrologijos skyriuje. RIT skyriuose iš viso buvo išskirta 21,8 proc. dauginiu atsparumu pasižyminčių invazinių K. pneumoniae padermių, daugiausiai – centrinės reanimacijos skyriuje, tuo tarpu chirurginio profilio skyriuose dauginio K. pneumoniae atsparumo pasiskirstymo dažnis siekė 16,4 proc.
3.2. Invazinių Klebsiella pneumoniae padermių išplėsto spektro beta-laktamazių vyraujantys tipai ir jų pasiskirstymas priklausomai nuo skyriaus profilio
Atlikus 55 K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL analizę, nustatyta, kad beveik visos – 53 padermės (po 96,4 proc.) gamino TEM, SHV ir CTX1 tipų ISBL, tuo tarpu mažiausiai paplitę buvo CTX4 ir CMY2 tipai (po 12,7 proc.) (7 pav.).
31 7 pav. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių ISBL tipų
paplitimas
Vertinant ISBL tipų pasiskirstymą pagal skyriaus profilį, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta. Tyrimo metu pastebėta, kad mažiausiai paplitęs - CTX4, o taip pat CTX2 tipai vyravo RITS profilio skyriuose, tuo tarpu CMY2 tipas dažniau išskirtas iš tiriamųjų medžiagų pacientų, kurie buvo gydyti terapinio profilio skyriuose. OXA ISBL tipas dažniau buvo nustatytas chirurginio profilio skyriuose (6 lentelė).
6 lentelė. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių ISBL tipų paplitimas chirurginio, terapinio bei reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriuose
ISBL tipai
ISBL tipų paplitimas proc. (abs. skaičiais)
Chirurginio
profilio skyriai RITS
Terapinio
profilio skyriai P reikšmė
TEM 100 (10) 100 (21) 91,7 (22) 0,262 SHV 100 (10) 95,2 (20) 95,8 (23) 0,790 CTX4 0 (0) 23,8 (5) 8,3 (2) 0,123 CTX2 90 (9) 95,2 (20) 75,0 (18) 0,143 CTX1 100 (10) 95,2 (20) 95,8 (23) 0,790 OXA 80 (8) 52,4 (11) 62,5 (15) 0,333 CMY2 10 (1) 4,8 (1) 20,8 (5) 0,261
RITS – reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriai
Statistinės analizės metu buvo nagrinėjama kaip skiriasi įvairių ISBL tipų paplitimas priklausomai nuo to, kiek yra skirtingų tipų vienoje kombinacijoje. Nustatyta, kad dažniausiai invazinėse K. pneumoniae padermėse buvo sutinkamos tik dviejų ISBL tipų kombinacijos: TEM/CTX1, SHV/CTX1 ir TEM/SHV (po 92,7 proc.) (8 pav.), kurios dažniausiai (100 proc.) buvo
96,4% 96,4% 12,7% 85,5% 96,4% 61,8% 12,7% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
32 išskirtos iš tiriamųjų medžiagų pacientų, hospitalizuotų chirurginio profilio skyriuose (7 lentelė). Daugiau nei pusė (50,9 proc.) K. pneumoniae padermių gamino visų tirtų ISBL tipų kombinaciją – TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA, išskyrus mažiausiai paplitusius – CTX4 ir CMY2 tipus. Daugiausiai tokių padermių buvo nustatyta chirurginio profilio skyriuose (70,0 proc.), tačiau šie skirtumai nebuvo statistiškai reikšmingi. Tyrimo metu išskirtos tik dvi invazinės K. pneumoniae padermės gaminančios šešių skirtingų tipų kombinaciją, o padermių, turinčių maksimalų (septynių) tyrimo metu nagrinėjamų tipų skaičių kombinacijoje, nenustatyta.
8 pav. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių išplėsto spektro beta laktamazių tipų kombinacijų paplitimas
1 – TEM/CTX1; 2 – SHV/CTX1; 3 – TEM/SHV; 4 – TEM/SHVCTX1; 5 – TEM/SHV/CTX2/CTX1; 6 – TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA; 7 - TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA/CMY2; 8 - TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA/CTX4
7 lentelė. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių ISBL tipų kombinacijų paplitimas chirurginio, terapinio bei reanimacijos ir intensyviosios terapijos
skyriuose
ISBL tipų kombinacijos
ISBL tipų kombinacijų paplitimas proc. (abs. skaičiais) Chirurginio profilio skyriai RITS Terapinio profilio skyriai P reikšmė TEM/CTX1 100 (10) 95,2 (20) 87,5 (21) 0,377 SHV/CTX1 100 (10) 90,5 (19) 91,7 (22) 0,612 TEM/SHV 100 (10) 95,2 (20) 87,5 (21) 0,377 TEM/SHV/CTX1 100 (10) 90,5 (19) 83,3 (20) 0,353 TEM/SHV/CTX2/CTX1 90,0 (9) 85,7 (18) 66,7 (16) 0,184 92,7% 92,7% 92,7% 89,1% 78,2% 50,9% 1,8% 1,8% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1 2 3 4 5 6 7 8
33 7 lentelės tęsinys TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA 70,0 (7) 47,6 (10) 45,8 (11) 0,407 TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA/CMY2 TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA/CTX4 0,0 (0) 0,0 (0) 0,0 (0) 0,0 (0) 4,2 (1) 4,2 (1) 0,518 0,518
RITS – reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriai
3.3. Invazinių Klebsiella pneumoniae padermių išplėsto spektro beta-laktamazių tipų sąsajos su atsparumu ne beta-laktaminiams antibiotikams
Tyrimo metu ištirtos 55 K. pneumoniae padermės, gaminančios ISBL ir nustatytas jų atsparumas ne beta-laktaminiams antibiotikams. Daugiausiai padermių buvo atsparios aminoglikozidų grupės antibiotikui – gentamicinui (GM) (87,3 proc.), o mažiausiai – amikacinui (AN) (40,0 proc.). Taip pat buvo nustatyta 41 padermė atspari ciprofloksacinui (CIP) ir 44 padermės – trimetoprimui/sulfametoksazoliui (SXT). Tai sudarė atitinkamai 74,5 proc. ir 80,0 proc. (9 pav.)
9 pav. 2015-2016 m. LSMU Kauno klinikose išskirtų invazinių K. pneumoniae padermių, gaminančių ISBL, atsparumas ne beta-laktaminiams antibiotikams
AN – amikacinas; GM – gentamicinas; CIP – ciprofloksacinas; SXT - trimetoprimas/sulfametaksazolis
Vertinant K. pneumoniae atsparumo ne beta-laktaminiams antibiotikams dažnį, priklausomai nuo gaminamų ISBL tipų, nustatyta, kad beveik pusė (42,9 proc.) padermių, kurios gamino CMY2 tipą buvo atsparios visiems tirtiems ne beta-laktaminiams antibiotikams, iš kurių daugiausiai – CIP (85,7 proc.). OXA tipą turinčios K. pneumoniae padermės taip pat dažniausiai pasižymėjo atsparumu šiam antibiotikui (94,1 proc.). Statistinės analizės rezultatai rodo, kad visos (100 proc.) K. pneumoniae padermės gaminančios CTX4 tipą, pasižymėjo atsparumu abiems aminoglikozidų grupės antibiotikams
40,0% 87,3% 74,5% 80,0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AN GM CIP SXT
34 – AN ir GM, o daugiau nei pusė (po 57,1 proc.) tokių padermių buvo atsparios ir kitiems ne beta-laktaminiams antibiotikams – CIP ir SXT. Invazinės K. pneumoniae padermės, gaminančios TEM, SHV, CTX2 ir CTX1 ISBL tipus dažniausiai buvo atsparios GM (atitinkamai – 90,6 proc.; 86,8 proc.; 93,6 proc; ir 88,7 proc. padermių). Tuo tarpu didžiausias atsparumas SXT buvo nustatytas padermėse, turinčiose OXA tipą. (8 lentelė).
Analizuojant K. pneumoniae invazinių padermių gaminančių ir negaminančių tam tikrus išplėsto spektro beta-laktamazių tipus, atsparumą ne beta-laktaminiams antibiotikams, nustatyta, kad CTX4 tipą gaminančios padermės statistiškai reikšmingai dažniau (100,0 proc.) buvo atsparios AN, palyginti su šio tipo ISBL negaminančiomis padermėmis (31,3 proc.). Tuo tarpu atpsarumas šiam antibiotikui OXA tipo negaminančių padermių grupėje buvo statistiškai reikšmingai didesnis (57,1 proc.) nei padermių turinčių šį tipą (29,4 proc.) (8 lentelė).
Didžioji dalis TEM (90,6 proc.) ir CTX2 (93,6 proc.) tipus gaminančių padermių buvo atsparios GM, o šių tipų negaminančių padermių atsparumas minėtam antibiotikui siekė atitinkamai 0,0 proc. ir 50,0 proc. (p<0,05) (8 lentelė).
Tyrimo metu nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant K. pneumoniae atsparumą CIP tarp padermių turinčių CTX1 ir OXA tipus bei šių tipų neturinčių padermių. Didžioji dalis CTX1 (77,4 proc.) ir beveik visos (94,1 proc.) OXA tipą gaminančios padermės buvo atsparios šiam antibiotikui, tuo tarpu CTX1 ir OXA negaminančių padermių atsparumas CIP buvo atitinkamai 0,0 proc. ir 42,9 proc (9 lentelė).
8 lentelė. Invazinių K. pneumoniae padermių gaminančių TEM+, SHV+, CTX4+, CTX2+, CTX1+, OXA+, CMY2+ ir negaminančių TEM-, SHV-, CTX4-, CTX2-, CTX1-, OXA-, CMY2- ISBL tipus,
atsparumas ne beta-laktaminiams antibiotikams
Antibiotikas
Antimikrobinis atsparumas proc. (abs. skaičiais)
TEM+ TEM- SHV+ SHV- CTX4+ CTX4- CTX2+ CTX2- CTX1+ CTX1- OXA+ OXA- CMY2+ CMY2- AN 41,5 (22) 0,0 (0) 37,7 (20) 100,0 (2) 100 (7) 31,3 (15) 38,3 (18) 50,0 (4) 39,6 (21) 50,0 (1) 29,4 (10) 57,1 (12) 57,1 (4) 37,5 (18) P reikšmė* 0,356 0,156 0,001 0,401 0,644 0,040 0,278 GM 90,6 (48) 0,0 (0) 86,8 (46) 100,0 (2) 100 (7) 85,4 (41) 93,6 (44) 50,0 (4) 88,7 (47) 50,0 (1) 88,2 (30) 85,7 (18) 57,1 (4) 91,7 (44) P reikšmė* 0,014 0,760 0,363 0,006 0,240 0,546 0,037
35 8 lentelės tęsinys
AN – amikacinas; GM– gentamicinas; CIP – ciprofloksacinas; SXT - trimetoprimas/sulfametaksazolis
* - taikytas Fisherio tikslusis testas
Analizuojant 9 lentelės duomenis, nustatyta, kad didėjant ISBL tipų skaičiui K. pneumoniae padermėje, stebima atsparumo AN mažėjanti, o GM, CIP ir SXT – didėjanti tendencija.
Tyrimo rezultatai rodo, kad K. pneumoniae padermės koduojančios penkių tipų kombinaciją - TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA, statistiškai reikšmingai dažniau buvo atsparios GM (95,4 proc.) ir CIP (96,4 proc.) ir rečiau AN (25,0 proc.) palyginus su šių tipų negaminančiomis padermėmis. Padermės, turėjusios dviejų (TEM/SHV), trijų (TEM/SHV/CTX1) ar keturių (TEM/SHV/CTX1/CTX2) tipų kombinacijas taip pat dažniausiai buvo atsparios aminoglikozidų grupės antibiotikui – GM (atitinkamai 90,2 proc., 91,8 proc., 95,3 proc.), o rečiausiai – AN (atitinkamai 39,2 proc., 38,8 proc., 34,9 proc.) (9 lentelė).
9 lentelė. Invazinių K. pneumoniae padermių gaminančių ir negaminančių įvairias ISBL tipų kombinacijas, atsparumas ne beta-laktaminiams antibiotikams
CIP 73,6 (39) 100,0 (2) 75,5 (40) 50,0 (1) 57,1 (4) 77,1 (37) 72,3 (34) 87,5 (7) 77,4 (41) 0,0 (0) 94,1 (32) 42,9 (9) 85,7 (6) 72,9 (35) P reikšmė* 0,552 0,448 0,243 0,337 0,014 0,0001 0,421 SXT 79,2 (42) 100,0 (2) 81,1 (43) 50,0 (1) 57,1 (4) 83,3 (40) 80,9 (38) 75,0 (6) 83,0 (44) 0,0 (0) 85,3 (29) 71,4 (15) 71,4 (5) 81,3 (39) P reikšmė* 0,637 0,363 0,134 0,508 0,037 0,183 0,429 VISI 13,2 (7) 0,0 (0) 13,2 (7) 0,0 (0) 14,3 (1) 12,5 (6) 8,5 (4) 37,5 (3) 13,2 (7) 0,0 (0) 14,7 (5) 9,5 (2) 42,9 (3) 8,3 (4) P reikšmė* 0,760 0,760 0,637 0,050 0,760 0,454 0,037 Antibiotikas
Antimikrobinis atsparumas proc. (abs. skaičiais)
1+ 1- 2+ 2- 3+ 3- 4+ 4- 5+ 5- 6+ 6- AN 39,2 (20) 50,0 (2) 38,8 (19) 50,0 (3) 34,9 (15) 58,3 (7) 25,0 (7) 55,6 (15) 0,0 (0) 40,7 (22) 100,0 (1) 38,9 (21) P reikšmė* 0,528 0,456 0,129 0,020 0,600 0,400 GM 90,2 (46) 50,0 (2) 91,8 (45) 50,0 (3) 95,3 (41) 58,3 (7) 95,4 (27) 77,8 (21) 100,0 (1) 87,0 (47) 100,0 (1) 87,0 (47) P reikšmė* 0,074 0,022 0,004 0,045 0,873 0,873
36 9 lentelės tęsinys
1 – TEM/SHV; 2 – TEM/SHVCTX1; 3 – TEM/SHV/CTX2/CTX1; 4 – TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA; 5 - TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA/CMY2; 6 - TEM/SHV/CTX2/CTX1/OXA/CTX4
AN – amikacinas; GM – gentamicinas; CIP – ciprofloksacinas; SXT - trimetoprimas/sulfametaksazolis
* - taikytas Fisherio tikslusis testas
CIP 74,5 (38) 75,0 (3) 77,6 (38) 50,0 (3) 74,4 (32) 75,0 (9) 96,4 (27) 51,9 (14) 100,0 (1) 74,1 (40) 100,0 (1) 74,1 (40) P reikšmė* 0,735 0,165 0,642 0,0001 0,745 0,745 SXT 80,4 (41) 75,0 (3) 83,7 (41) 50,0 (3) 83,7 (36) 66,7 (8) 85,7 (24) 74,1 (20) 100,0 (1) 79,6 (43) 0,0 (0) 81,5 (44) P reikšmė* 0,602 0,087 0,182 0,230 0,800 0,200 VISI 13,7 (7) 0,0 (0) 14,3 (7) 0,0 (0) 9,3 (4) 25,0 (3) 14,3 (4) 11,1 (3) 0,0 (0) 13,0 (7) 0,0 (0) 13,0 (7) P reikšmė* 0,571 0,423 0,168 0,521 0,873 0,873
