LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
Kotryna Saukienė
Dirofilaria repens mikrofiliarijų aptikimas šunų kraujo mėginiuose bei kombinuoto antihelmintiko (milbemicino
oksimo/prazikvantelio) kramtomųjų tablečių veiksmingumas X smulkiųjų gyvūnų klinikoje
Detection of Dirofilaria repens microfilariae in dog’s blood samples and an oral milbemycin oxime/praziquantel formulation
efficacy evaluation in the X small animal clinic
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Gintaras Daunoras
Kaunas, 2017
DARBAS ATLIKTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad teikiamas magistro baigiamasis darbas Dirofilaria repens mikrofiliarijų aptikimas šunų kraujo mėginiuose bei kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/prazikvantelio) kramtomųjų tablečių veiksmingumas X smulkiųjų gyvūnų klinikoje:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
2016-12-06 Kotryna Saukienė
(data) (parašas) (autoriaus vardas, pavardė)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2016-12-06 Kotryna Saukienė
(data) (parašas) (autoriaus vardas, pavardė)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Darbas parengtas pagal keliamus reikalavimus ir gali būti ginamas.
2016-12-06 Gintaras Daunoras
(data) (parašas) (darbo vadovo vardas, pavardė)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
2016-12-09 Birutė Karvelienė
(aprobavimo data) (parašas) (klinikos vadovės vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (parašas) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė)
TURINYS
TURINYS...3
SANTRAUKA.........5
SUMMARY..........6
SANTRUMPOS.........7
ĮVADAS...................8
1. LITERATŪROS APŽVALGA...............10
1.1. Dirofilaria repens................10
1.1.1. Dirofiliarijozės patogenezė...10
1.1.2. Temperatūros įtaka D. repens plitimui........................11
1.1.3. Veislės ir amžiaus įtaka D. repens plitimui...12
1.2. D. repens mikrofiliarijų aptikimas šunų kraujo mėginiuose...............12
1.2.1. Modifikuotas Knott testas...12
1.2.2. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) .............13
1.3. D. repens invazijos gydymas...14
1.3.1. Dirofiliarijozės gydymas naudojant kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/prazikvantelio) kramtomąsias tabletes...14
1.3.1.1. Farmakodinaminės kombinuoto antihelmintinio vaisto (milbemicino oksimo/prazikvantelio) savybės...15
1.3.1.2. Farmakokinetinės kombinuoto antihelmintinio vaisto (milbemicino oksimo/prazikvantelio) savybės...15
1.3.2. Kitos gydymo galimybės nuo šunų D. repens mikrofiliarijų.........16
1.3.2.1. Dirofiliarijozės gydymas naudojant imidakloprido ir moksidektino užlašinamąjį tirpalą...16
1.4. Profilaktikos priemonės...17
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGOS..........19
2.1. Eksperimentinis klinikinis atsitiktinių imčių tyrimas...19
2.2. Tyrimo imtis............19
2.3. Gyvūnų skirstymas....................21
2.4. Kraujo mėginio ėmimas ir tyrimas......................22
2.4.1. Kraujo mėginio paėmimas...22
2.4.2. Paprastasis Knott testas..............22
2.4.3. Modifikuotas Knott testas...22
2.5. Mff rūšies nustatymas polimerazės grandinine reakcija (PGR) ................22
2.6. Gydymas...23
2.7. Statistiniai skaičiavimai...23
3. TYRIMO REZULTATAI..........24
3.1. Paprastojo ir modifikuoto Knott testo rezultatai.........24
3.2. Rūšies nustatymo rezultatai........................25
3.3. Šunų užsikrėtimui D. repens reikšmingų veiksnių analizė.............26
3.3.1. Amžiaus įtaka šunų užsikrėtimui D. repens...............26
3.3.2. Lyties įtaka šunų užsikrėtimui D. repens......................27
3.3.3. Kailio tipo įtaka šunų užsikrėtimui D. repens...27
3.3.4. Laikymo tipo įtaka šunų užsikrėtimui D. repens.........28
3.3.5. Sezono įtaka šunų užsikrėtimui D. repens...............29
3.3.6. Šuns dydžio įtaka užsikrėtimui D. repens.....................30
3.4. Gydymo kombinuotu anihelmintiku (milbemicino oksimu/prazikvanteliu) veiksmingumo vertinimas...31
3.4.1. Tiriamų gyvūnų skirstymas...31
3.4.2. Naudota gydymo schema....................31
3.4.3. Gydymo veiksmingumo įvertinimas abiejose tiriamųjų grupėse...32
REZULTATŲ APTARIMAS......................34
IŠVADOS.........36
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS.........37
LITERATŪROS SĄRAŠAS.........38
PADĖKA..........44
SANTRAUKA
Dirofilaria repens yra vienas iš labiausiai pasaulyje paplitusių uodų pernešamų filiarinių nematodų, sukeliančių poodinę dirofiliarijozę. Šia liga gali būti užkrėsti šunys, katės, kiti žinduoliai, tarp jų ir žmogus.
Tyrimo tikslas buvo aptikti mikrofiliarijas šunų kraujo mėginiuose ir įvertinti gydymo veiksmingumą naudojant kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/prazikvantelio) kramtomąsias tabletes.
Tyrimą sudarė 5 etapai: pirmajame iš 1 216 atsitiktiniu principu atrinktų šunų buvo paimtas veninis kraujas. Antrajame – mėginiai buvo ištirti paprastuoju ir modifikuotuoju Knott testu bei surinkta informacija apie šunis. Teigiami mėginiai buvo ištirti polimerazės grandininės reakcijos metodu. Trečiojoje dalyje A grupės šunims (n=32) buvo paskirtas gydymas kombinuotu antihelmintiku (milbemicino oksimas/prazikvantelis), o grupės B šunims (n=10) – fenbendazolo/pirantelio embonato/prazikvantelio tabletės. Ketvirtajame tyrimo etape, praėjus 2 sav. po gydymo, atlikti pakartotiniai mėginių tyrimai modifikuotuoju Knott testu ir vertintas gydymo veiksmingumas.
Paskutinėje tyrimo dalyje buvo paskirtas gydymas kombinuotu antihelmintiku B grupės šunims ir po 2 sav. atliktas pakartotinis tyrimas.
Iš 1 216 šunų kraujo mėginių, 49-uose buvo aptikta mikrofiliarijų. Dėl tyrimo sąlygų neįvykdymo, 7 šunys buvo pašalinti, todėl tolesni tyrimai buvo atlikti su 42 šunimis.
Atlikus polimerazės grandininę reakciją, visuose 49 mėginiuose identifikuotos D. repens.
Dirofiliarijoze dažniau buvo užsikrėtę šunys, kuriems daugiau nei 4 m. (p<0,001). Lytis ir laikymo tipas įtakos užsikrėtimui D. repens neturėjo. Daugiausiai sergančiųjų buvo ilgaplaukiai (77,6 proc.) ir didelių arba gigantinių veislių šunys, o kraujyje mikrofiliarijos dažniausiai buvo aptiktos šiltuoju sezonu (p<0,001).
Gydymo rezultatai parodė, kad vienkartinio kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/prazikvantelio) sudavimo veiksmingumas eliminuojant D. repens mikrofiliarijas buvo 90,48 proc., o fenbendazolo/pirantelio embonato/prazikvantelio tabletės nuo šios ligos buvo visiškai neveiksmingos.
Raktažodžiai: Dirofilaria repens, dirofiliarijozė, mikrofiliarijos, kraujo mėginiai, milbemicino oksimas, prazikvantelis, gydymo veiksmingumas.
SUMMARY
Dirofilaria repens is one of the most widespread mosquito borne filarioid which causes cutaneous dirofilariasis in dogs. Cats and other mammals, humans among them, can also be infected.
The aim of this study was to detect microfilariae in blood samples of dogs and evaluate efficacy of therapy by using oral formulation containing milbemycin oxime/praziquantel.
The study consisted of five parts. The first part was peripheral blood sampling from 1 216 randomized dogs. In the second part of the study all blood samples were examined by simple and modified Knott’s test and the information about dogs was collected. Positive samples were tested by a polymerase chain reaction (PCR). The third part consisted of treatment administration with oral formulation of milbemycin oxime/praziquantel for group A (n=32) and treatment with oral fenbendazole/pyrantel embonate/praziquantel for group B (n=10). In the fourth part of the study we re- examined blood samples using modified Knott’s test 2 weeks later. The last part of study was the treatment administration for group B and re-examination of blood samples by modified Knott’s test was applied 2 weeks later.
In 49 out of 1 216 dog blood samples microfilaremia was detected. Due to the failure to fulfil the conditions of the study, 7 dogs were removed from the study. The further study was done with 42 dogs.
All of 49 blood samples were tested using PCR and 100 % Dirofilaria repens was identified.
It was found out that dirofilariasis is often found in dogs over 4 years of age (p<0,001). Sex and living type predisposition has not been confirmed. Most of the patients were long haired (77,6 %), large and giant breeds and in most cases microfilaremia was found in blood samples in warm season (p<0,001).
The results of the study have shown that the efficacy eliminating D. repens microfilariae in dogs by applying the treatment of oral formulation of milbemycin oxime/praziquantel were 90,48 per cent compared with oral fenbendazole/pyrantel embonate/praziquantel, which was totally ineffective.
Keywords: D. repens, dirofilariasis, microfilariae, blood samples, milbemycin oxime, praziquantel, efficacy of therapy.
SANTRUMPOS
D. repens – Dirofilaria repens;
D. immitis – Dirofilaria immitis;
Growing degree days arba Growing degree units (GDDs) – augimo laipsniadieniai;
proc. – procentas;
mff – mikrofiliarija (-os);
PGR – polimerazės grandininė reakcija;
IFA – imunofermentinė analizės metodas;
GIS – geografinė informacinė sistema;
UV – ultravioletiniai spinduliai;
EDTA – etilendiamino - tetraacetato rūgšties druska;
L1 – pirmos stadijos lerva;
L3 – trečios stadijos lerva L4 – ketvirtos stadijos lerva;
m2 – kvadratiniai metrai;
mm – milimetrai;
µm – mikrometrai;
ml – mililitrai;
lent. – lentelė;
pav. – paveikslas;
m. – metai;
mėn. – mėnuo;
sav. – savaitė;
bp – bazių poros;
aps./min. – apsisukimai per minutę;
val. – valanda;
per os – į vidų;
X – kartai;
Tmax – didžiausia koncentracija;
t1/2 – laikas, per kurį suyra pusė medžiagos kiekio.
ĮVADAS
Pastaruoju metu uodų platinamų helmintų paplitimas Europoje yra padidėjęs ir jų svarba vis stiprėja, kadangi jie sukelia ligas šunims, katėms ir žmonėms [1].
Širdies kirminų liga, kurią sukelia Dirofilaria immitis (toliau D. immitis) šunims ir katėms yra gyvybiškai pavojinga, o Dirofilaria repens (toliau D. repens) – kiek mažiau, sukelia poodines šunų ir kačių pažaidas ir yra pagrindinis žmonių dirofiliarijozės veiksnys [2].
Naujausi tyrimai parodė, kad D. repens sparčiai plinta daugelyje Europos šalių. Viena iš potencialių priežasčių, kuri lemia tokį spartų šio parazito plitimą, yra globalinis klimato atšilimas.
Šiltas klimatas kartu su padidėjusiu užsikrėtusių šunų judėjimu, yra labai palankūs veiksniai vektoriams plisti ir ligoms pernešti [3, 4].
Diagnozuojant ir gydant D. repens invazijos sukeltus sveikatos sutrikimus, yra susiduriama su keliomis problemomis. Pagrindinė – dirofiliarijozė dažnai būna besimptomė, todėl diagnozavimas neretai būna atsitiktinis (mikroskopuojant kraujo tepinėlį, atliekant limfinių mazgų biopsiją) ar tiesiog, aptinkant suaugusį nematodą operacijos metu (šalinant navikus, atveriant abscesus).
Pasaulyje yra naudojama keletas gydymo schemų. Mokslininkai yra atlikę nemažai tyrimų, kurių metu tyrė ne tik gydymo efektyvumą nuo mikrofiliarijų (toliau mff), bet ir suaugusių nematodų išnaikinimo galimybes. Tyrimai užima daug laiko, kadangi D. repens vystymasis iki lytiškai subrendusių nematodų užtrunka maždaug 6–8 mėnesius [5].
Lietuvoje preparatai šunims, naikinantys mff kraujyje yra prieinami, tačiau patikimų galimybių naikinti suaugusius D. repens nematodus, vis dar nėra. Vienintelis metodas išnaikinti suaugusius kirminus – operacinis, tačiau jis nėra optimalus ir labai veiksmingas, nes suaugėlių gali būti daugelyje poodžio vietų, kirminai poodyje migruoja, vis gali atsirasti naujų.
Kadangi liga Lietuvoje yra sąlyginai nauja, remdamiesi literatūros šaltiniais bei tendencijomis, iškėlėme darbo tikslą: nustatyti X smulkiųjų gyvūnų klinikoje aptarnautų šunų Dirofilaria repens epidemiologinę situaciją, aptinkant mikrofiliarijas kraujo mėginiuose bei įvertinti gydymo kombinuotu antihelmintiku (milbemicino oksimo/prazikvantelio kramt. tabl.) veiksmingumą.
Šiam tikslui pasiekti buvo suformuluoti šie darbo uždaviniai:
1. surinkti ir išnagrinėti naujausią mokslinę literatūrą apie šunų Dirofilaria repens;
2. ištirti X smulkiųjų gyvūnų klinikoje 2015 m. apsilankiusių šunų kraujo mėginius paprastuoju ir modifikuotuoju Knott testu;
3. ištirti kraujo mėginius polimerazės grandininės reakcijos (toliau PGR) metodu ir tipizuoti mff;
4. įvertinti amžiaus, lyties, kailio tipo, laikymo tipo, sezono, šuns dydžio įtaką užsikrėtimui D. repens;
5. įvertinti gydymo nuo mff veiksmingumą šunims, naudojant kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/prazikvantelio) kramtomąsias tabletes.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Dirofilaria repens
D. repens yra Dirofilaria genties nematodas, kuris priklauso Onchocercidae šeimai, Spirurida būriui. D. repens yra pernešama daugiau kaip 60 uodų rūšių, priklausančių Aedes, Anopheles ir Culex gentims [6, 7].
1.1.1. Dirofiliarijozės patogenezė
Po lytinės brandos, apvaisinti moteriškosios lyties nematodai (makrofiliarijos) į periferinį kraują išleidžia pirmos stadijos lervas (L1 – mikrofiliarijas). Uodams siurbiant kraują, jos patenka į uodų organizmą, kur per 10–21 dieną išsivysto iki 3 stadijos lervų (L3). Galutiniame šeimininke (pvz., šuns organizme) lervos neriasi dar du kartus iki ketvirtos stadijos lervų (L4) ir suaugėlio. Iki lytiškai subrendusių nematodų vystymasis užtrunka maždaug 6–8 mėnesius. Subrendusios patelės būna 100–
170 mm ilgio ir 460–650 µm skersmens, o patinai 50–70 mm ilgio ir 370–450 µm skersmens. Suaugę nematodai išgyvena apie 5–10 metų [5].
Šunims D. repens invazija dažniausiai būna besimptomė, tačiau suaugę nematodai, randami poodiniuose audiniuose ir kraujyje cirkuliuojančios mff gali sukelti įvairaus laipsnio odos pažeidimus, pavyzdžiui, dermatitą, poodinius mazgelius, niežulį ir įvairias alergines reakcijas. Tam tikrais atvejais atsiranda eritema (79 proc.), papulės (62 proc.), židininė ar daugiažidininė alopecija (55 proc.), hiperkeratozė (18 proc.), šašai (14 proc.), akantozė (5 proc.), egzema (3 proc.), piodermija (3 proc.) ir edema (1 proc.) [6, 8–12].
Šunys yra galutiniai D. repens šeimininkai, tačiau šie nematodai taip pat gali būti perduodami katėms, kitų rūšių žinduoliams ir retais atvejais, žmonėms. Nuo tada, kai buvo atpažintas abiejų dirofiliarijų rūšių zoonozinis potencialas, ir daugėja užkrėstų šunų, kryžminis vektorių (uodų) maitinimasis yra pripažintu rizikos veiksniu žmonėms [1].
D. repens yra svarbiausias veiksnys, sukeliantis žmogaus dirofiliarijozę Europoje, kartais sukeliantis sunkius ar labai sunkius klinikinius ligos simptomus ir pažeidimus, net navikus. Literatūros duomenimis, nuo 1885 iki 2000 metų 37 skirtingose šalyse Europoje, Azijoje ir Afrikoje buvo nustatyti žmonių 782 dirofiliarijozės atvejai, daugiausiai sukelti D. repens [13–17], Rusijoje – 131 atvejis per 2000–2009 metus [18], Ukrainoje – 1465 atvejai per 1997–2012 metus [19].
1.1.2. Temperatūros įtaka D. repens plitimui
Temperatūros pokyčiai, kartu su padidėjusiu šunų judėjimu Europoje, sukėlė padidėjusį dirofiliarijozės geografinį paplitimą. Yra įrodymų, kad esant žemesnei nei 14°C temperatūrai, D. repens nevyksta vystymasis uoduose. Pagal vadinamus augimo laipsniadienius (angl. Growing degree-days), jų reikia 130, kol lerva tampa invazine. Vasaros temperatūros (aukščiausia rugpjūčio mėnesį) palankiausios lengviau vystytis D. repens (1 pav.) [20].
D. repens mff vystosi pagal temperatūrą: esant 28–30 °C – 8–13 dienų, 26 °C – 10–11 d., 22 °C – 16–20 d.
1971–2000 metais 854 meteorologinėse stotyse (išsidėsčiusiose 19 Europos šalių: Albanijoje, Austrijoje, Baltarusijoje, Bosnijoje ir Hercegovinoje, Kroatijoje, Čekijoje, Vokietijoje, Graikijoje, Vengrijoje, Latvijoje, Lietuvoje, Makedonijoje, Moldavijoje, Lenkijoje, Rumunijoje, Serbijoje, Slovakijoje, Slovėnijoje, Ukrainoje) nustačius vidutines temperatūras, matyti, kad 130 augimo laipsniadienių tarpsnį atitiko 112 vietų – gegužės mėn., 365 – birželio mėn., 548 – liepos mėn., 550 – rugpjūčio mėn., 299 – rugsėjo mėn., 65 – spalio mėn., 9 – lapkričio mėn. (žr. 1 pav.). Vidutinė paros temperatūra buvo apskaičiuojama pagal minimalią ir maksimalią paros temperatūrą [20].
1 pav. 854 Europos stotys, kuriose buvo pasiekti 130 augimo laipsniadienių (raudoni taškai pagal mėnesius), remiantis vidutine 29 metų oro temperatūra (1971–2000) [20]
Keičiantis pasaulio aplinkai, klimato kaita turi didelį potencialą skatinti tam tikrų ligų paplitimą, ypač tų, kurios perduodamos uodų [21].
Uodai yra šaltakraujai gyvūnai ir jų vidinė temperatūra labai priklauso nuo aplinkos temperatūros. Uodų pernešami patogenai yra labai jautrūs oro temperatūrai, todėl daugėja įrodymų, kad klimato kaita, gali padidinti sergamumą ir perdavimą iš patogeninių vektorių. Taip pat gali pakisti pernešėjų elgesys, kas gali lemti kitokį ligų perdavimo būdą, ne tik perdavimą kraujasiurbių nariuotakojų įkandimo metu [22].
Nustatyta, kad per ateinančius 15 metų dirofiliarijozė gali išplisti į 50 Europos šalių. Norint apskaičiuoti vienos dirofiliarijos kartų skaičių, duomenys buvo interpoliuoti naudojant tiesinę krigingo funkciją geografinės informacijos sistemoje (GIS). Modelis prognozavo dirofiliarijozės plitimą į kai kurias šiaurės ir šiaurės rytų Europos šalis, o klinikiniai bei epidemiologiniai tyrimai vėliau patvirtino, kad autochtoninės invazijos atsirado prieš tai buvusiose laisvose nuo dirofiliarijozės vietovėse, tokiose kaip Slovakija [26] ir Vengrija [27], kurios šiuo metu laikomos endeminėmis [23–25].
Taigi, optimali aplinkos temperatūra, kartu su tinkama drėgme, yra pagrindiniai veiksniai, palaikantys šio parazito gyvavimo ciklą [28–30].
1.1.3. Veislės ir amžiaus įtaka D. repens plitimui
Dirofiliarijozė dažniau pasireiškė šunims, kuriems daugiau kaip 3 metai ir didelių bei gigantiškų veislių šunims. Trumpaplaukiai gyvūnai užsikrėtė dažniau nei šunys turintys ilgą kailį. Taip pat, invazija buvo labiau paplitusi kaimo vietovėse, palyginti su miesto teritorija [31].
1.2. D. repens mikrofiliarijų aptikimas šunų kraujo mėginiuose
Esant D. repens invazijai, šunims ryškių klinikinių požymių dažniausiai nebūna. Todėl diagnozavimas yra sudėtingas, o serologinių testų nustatyti D. repens nėra [8]. Dažnai liga tampa nenustatyta ir nepastebėta plinta toliau [20].
Klasikiniai metodai šunų dirofiliarijozei nustatyti yra: pirmiausia, Knott testas, kuriuo aptinkamos mff periferiniame kraujyje ir, antra, IFA metodas, tačiau juo nustatoma tik D. immitis [32].
Knott testas šiuo metu yra laikomas mff šunų kraujyje aptikimo auksiniu standartu [6].
1.2.1. Modifikuotas Knott testas
Testui atlikti reikalingos šios medžiagos ir priemonės, bei veiksmų eiliškumas:
1. 1 ml kraujo su EDTA;
2. 9 ml 2 proc. formalino;
3. sumaišoma 15,0 ml mėgintuvėlyje;
4. centrifuguojama 500 aps./min.;
5. mišinys nupilamas;
6. į mėgintuvėlį įlašinamas metileno mėlynojo suspensijos 1 lašas;
7. paimama 2x10 µl nuosėdų, dedama ant objektinio stiklelio, uždedamas dengiamasis stiklelis, mikroskopuojama.
Taip pat diferencijuojant mff rūšį, yra naudojami tokie metodai, kaip morfometrinė mikrofiliarijų analizė, kuri atliekama su standartiniais šviesiniais mikroskopais ir kalibruotais okuliarais, kurių didžiausias padidinimas 200–400 X.
Tyrimo metu, kūno ilgis ir skersmuo, priekinio galo ir uodegos forma buvo nustatyta 10-čiai atsitiktinai parinktų mff. Įrodant patikimumą, matavimai buvo atlikti dar 30 mėginių parazitologijos institute, Ciuricho universitete, Šveicarijoje. Atitinkamai, nustatyta, kad vidutinis ilgis ± standartinis nuokrypis (µm) – 369,44±10,76; vidutinis skersmuo ± standartinis nuokrypis (µm) – 8,87±0,58 [33].
Kartais mff identifikavimas gali tapti sudėtingesnis, jeigu yra dubliuota infekcija (ir D. repens ir D. immitis) [34]. Dėl to, buvo sukurta keletas skirtingų molekulinių tyrimų schemų, identifikuojant vienos rūšies dirofiliarijas pagal tam tikrą nukleotidų (PGR) seką [35–40].
Vieno tyrimo metu nustatyta, kad didžiausias kiekis mff kraujyje randama kraujo mėginiuose, paimtuose vakare. Mėginių ėmimo laikas gali labai paveikti mikroskopinio tyrimo patikimumą. Tiriant dirbtinai užkrėstų šunų kraujo mėginius, visi mėginiai, kurie buvo neigiami mikroskopuojant, buvo teigiami tyrus realaus laiko PGR metodu [41].
1.2.2. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
PGR naudojama norint pagausinti tam tikrą DNR fragmentą. Tam tikslui naudojami pradmenys, kurių pagalba tam tikras DNR fragmentas padauginamas daugybę kartų. Naudojant tik vienai ar kelioms rūšims būdingus DNR fragmentus (pradmenis) galima tas rūšis tiksliai identifikuoti. Tai leidžia nustatyti, ar tiriamame mėginyje yra tiriamas patogenas.
Dirofiliarijų nustatymui naudojami ITS-2 regiono, DIDR-R1 ir DIDIR-F1 pradmenys, kuriais galima identifikuoti 6 skirtingas filiarijų rūšis. Mėginyje esant D. repens mff, PGR metodu susintetinami 484 bazių porų (toliau – bp) ilgio fragmentai, kuriuos galima matyti elektroforezės metu.
Taip pat COI geno amplifikacijai yra naudojami DR COI-F1, DR COI-R1 pradmenys. Šie pradmenys yra specifiniai D. repens rūšiai. Reakcijos metu amplifikuojamas 209 bp ilgio fragmentas.
Dar vienas metodas, naudojamas D. repens invazijos nustatymui, yra Kingston ir Morton metodas, kurio esmė – kraujo centrifugavimas hematokrito vamzdeliuose, po kurio nustatomas dirofiliarijozės užsikrėtimo lygis, pagal mikrofiliarijų skaičių 60 µl kraujo [42].
1.3. D. repens invazijos gydymas
1.3.1. Dirofiliarijozės gydymas naudojant kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/
prazikvantelio) kramtomąsias tabletes
Norint išvengti dirofiliarijozės plitimo tarp šunų, yra saugios ir efektyvios profilaktikos bei gydymo galimybės [1, 6]. Dirofiliarijozė gali būti gydoma makrociklinių laktonų junginiais. Gydymas grindžiamas šių junginių savybe sunaikinti L3 ir L4 mff stadijas [1, 5, 6].
Kombinuoto milbemicino oksimo/prazikvantelio (Milprazon, KRKA, Slovėnija) antihelmintiko tabletės yra skirtos šunims gydyti, esant mišriam užsikrėtimui endoparazitais (1 lent.).
1 lentelė. Milbemicino oksimo/prazikvantelio tabletės veikia nuo šių šunų suaugusių nematodų ir cestodų [43]
Cestodai Nematodai
Dipylidium caninum Ancylostoma caninum
Taenia spp. Toxocara canis
Echinococcus spp. Toxascaris leonina
Mesocestoides spp. Trichuris vulpis
- Crenosoma vulpis (užsikrėtimo lygiui mažinti)
- Angiostrongylus vasorum (užsikrėtimo lygiui mažinti užsikrėtus nesubrendusiais suaugusiais (L5) ir suaugusiais parazitais)
Be to, šį vaistą galima naudoti profilaktiškai nuo širdies kirmėlių ligos (Dirofilaria immitis), jei tuo pat metu reikalingas gydymas nuo cestodų. Vaisto veikimo trukmė – 1 mėn.
1.3.1.1. Farmakodinaminės kombinuoto antihelmintinio vaisto (milbemicino oksimo/prazikvantelio) savybės
Milbemicino oksimas priklauso makrociklinių laktonų grupei ir yra išskiriamas kaip Streptomyces hygroscopicus var. aureolacrimosus fermentacijos produktas. Milbemicino oksimas veikia bestuburių nervinių impulsų perdavimą. Milbemicino oksimas, kaip ir avermektinai ir kiti milbemicinai, padidina nematodų ir vabzdžių membranų pralaidumą chlorido jonams per glutamato valdomus chlorido jonų kanalus. Tai sukelia neuroraumeninės membranos hiperpoliarizaciją ir parazito suglebimu pasireiškiantį paralyžių bei gaišimą.
Prazikvantelis yra acilintas pirazino-izokvinolino darinys. Prazikvantelis veikia cestodus ir trematodus. Jis keičia parazitų membranų pralaidumą kalciui ir sutrikdo membranos struktūrų pusiausvyrą, todėl pasireiškia membranos depoliarizacija ir beveik momentinė raumenų kontrakcija (tetanija), greita sincitinio dangalo vakuolizacija ir po to atsirandanti dangalo dezintegracija (pūslėjimasis), sukelianti greitesnį parazito pašalinimą iš virškinimo trakto ar žūtį [43].
1.3.1.2. Farmakokinetinės kombinuoto antihelmintinio vaisto (milbemicino oksimo/prazikvantelio) savybės
Šunims sušėrus milbemicino oksimo, su nedaug ėdalo, didžiausias kiekis plazmoje atsiranda maždaug po 0,75–3,5 val. ir po to mažėja, nemetabolizuoto milbemicino oksimo pusinės eliminacijos laikas yra 1–4 paros. Biologinis prieinamumas yra maždaug 80 proc.
Šunims sušėrus prazikvantelio su nedaug ėdalo, didžiausias pirminės medžiagos kiekis serume atsiranda greitai (Tmax maždaug 0,25–2,5 val.) ir po to greitai mažėja (t1/2 maždaug 1 val.). Didelė dalis vaisto metabolizuojama pirmojo prasiskverbimo pro kepenis metu, biotransformacija kepenyse būna greita ir beveik visiška, daugiausia susidaro monohidroksilinti dariniai (bei šiek tiek di– ir tri–
hidroksilintų darinių), kurie prieš išskyrimą daugiausia būna konjuguojami su gliukuronidu ir (arba) sulfatu. Jungimasis su kraujo plazma yra maždaug 80 proc. Šalinimas yra greitas ir visiškas ( maždaug 90 proc. per 2 paras), daugiausia vaisto šalinama per inkstus [43].
Tyrimo rezultatai parodė, kad kramtomosios tabletės, į kurių sudėtį įeina milbemicino oksimas ir prazikvantelis yra naujas ir efektyvus būdas kontroliuoti šunų užsikrėtimą D. repens [44].
2007 metais sausio mėn. Rytinėje Sicilijoje, Katanijoje į benamių gyvūnų prieglaudą buvo pristatytas 2 metų amžiaus 6 kg sveriantis šuo su daugybiniais odos pažeidimais. Priglaudus gyvūną, šeimininkai pradėjo gydymą plataus spektro antihelmintikų kombinacija – 1 mg/kg milbemicino oksimo ir 10 mg/kg prazikvantelio ir jį naudojo kas mėnesį. 2007 m. kovo mėn. gyvūno šeimininkai
kreipėsi į veterinarijos gydytoją, nes ant dešinės užpakalinės kojos, ties kulno sąnariu, atsirado mazgelis. Po savaitės atsirado dar du palaipsniui didėjantys dariniai iš abiejų krūtinės pusių. Buvo atliktas klinikinis patikrinimas. Gyvūnas nekarščiavo, remiantis ultragarso tyrimo rezultatais, vidaus organų būklė buvo gera. Kraujo tyrime reikšmingų pakitimų nebuvo, kraujo mėginyje mff neaptikta.
Mazgelis ant kulno sąnario buvo 1,2x1,5 cm dydžio, neskausmingas, nepaslankus; mazgeliai ant krūtinės – 1,5x2,5 cm, paslankūs, neskausmingi. Mazgeliai buvo pašalinti, viduje viename iš jų rastas gyvas baltos pieno spalvos nematodas, kituose – žuvusio nematodo fragmentai apsupti mineralizuotais audiniais.
Pagal makroskopinio tyrimo rezultatus parazitas buvo identifikuotas kaip D. repens.
Atsižvelgiant į šiuos rezultatus ir vaisto veiksmingumą, buvo nuspręsta toliau naudoti milbemicino oksimo/prazikvantelio derinį, norint išvengti bet kokio žalojančio mff poveikio, tokio kaip mikrotromboembolizmo ir odos alerginių reakcijų [45].
Kalbant apie D. immitis gydymą ir prevenciją pirmiausiai skiriami vaistai, kurie žudo migruojančias lervas, ir Europoje prieinami yra selamektino ir milbemicino oksimo atskirai arba derinyje vaistai [46].
Buvo atliktas dar vienas tyrimas dviejose endeminėse Italijos dalyse. Iš viso 249 šunys iš dviejų vietovių buvo suskirstyti į dvi grupes: gydomus (T1) ir negydomus (T2). Kiekvieną mėnesį buvo atliekami kraujo (mikroskopinis ir PGR) tyrimai. Šunys, priklausantys grupei T1, kas 4 sav. gavo minimalią tikslinę dozę 0,5 mg/kg kūno svorio milbemicino oksimo ir 5 mg/kg kūno svorio prazikvantelio. T2 grupės šunims nebuvo skirtas gydymas milbemicino oksimo/prazikvantelio tabletėmis, tačiau, jeigu buvo būtina, buvo taikomas kitas antiparazitinis gydymas. Tyrimo trukmė buvo 336±2dienos kiekvienam šuniui.
Tyrimo pabaigoje liko 219 šunų (111–T1 ir 108–T2). Dėl įvairių priežasčių, nesusijusių su milbemicino oksimo/prazikvantelio naudojimu, 30 šunų buvo pašalinti iš tyrimo. T1 grupėje šunų, kurių kraujyje nerasta D. repens, buvo 100 proc. (111), o T2 grupėje – 94,7 proc. (102 šunys iš 108).
Milbemicino oksimo/prazikvantelio derinys pripažintas veiksmingu ir saugiu [44].
1.3.2. Kitos gydymo galimybės nuo šunų D. repens mikrofiliarijų
1.3.2.1. Dirofiliarijozės gydymas naudojant imidakloprido ir moksidektino užlašinamąjį tirpalą Atliktų studijų metu, buvo įvertintas 10 % imidakloprido ir 2,5 % moksidektino efektyvumas, gydant šunis nuo suaugusių D. repens kirminų. Dirbtinai užkrėsti buvo 24 biglių veislės šunys. Visi šunys buvo 10 mėn. amžiaus ir svėrė nuo 7 kg iki 12,2 kg. Vieno šuns užkrėtimui buvo paimtos 74 mff.
Gydymas buvo pradėtas praėjus 228 dienoms. Naudojant Knott testą mff buvo rastos 21 šuns kraujo mėginiuose.
11 šunų buvo gydyti imidakloprido ir moksidektino užlašinamuoju tirpalu taikant minimalią terapinę dozę (10 mg/kg imidakloprido ir 2.5 mg/kg moksidektino).
Praėjus 1 mėnesiui po paskutinio gydymo, visi šunys buvo eutanazuoti ir išskrosti. 11-oje kontrolinės grupės šunų buvo rasta gyvų D. repens nematodų, o 8 iš 11 gydytų šunų buvo be gyvų kirminų. Dauguma negyvų kirminų buvo inkapsuliuoti ir degeneravę. Gydymas buvo gerai toleruojamas visų tyrime dalyvavusių gyvūnų.
Daroma išvada, kad gydant šunis 6 mėn. iš eilės imidakloprido ir moksidektino užlašinamuoju tirpalu yra efektyvus ir saugus metodas nuo D. repens suaugusių kirminų [47].
Kitame tyrime, kuriame buvo naudotas imidakloprido ir moksidektino užlašinamasis tirpalas šunims gydyti nuo D. repens mff, gydymas buvo taikytas kas mėnesį, 4 mėn. iš eilės. Prieš tyrimą, visų šunų kraujo mėginiuose buvo rasta mff. Po vieno mėnesio gydymo, nė pas vieną šunį nebuvo rasta mff.
100 proc. šunų kraujo mėginiuose nebuvo rasta D. repens mff ir tokie išliko 6 mėn. po paskutinio gydymo [48].
Bet kartais gydymo galimybės yra ribotos, nes ne visi medikamentai yra prieinami [47]. Šiuo metu rinkoje nėra produktų, naudojamų specialiai naikinti suaugusius D. repens kirminus. Taikytinas chirurginis gydymas (kirminų pašalinimas), kai kirminai yra lokalizuoti mazgeliuose po oda, bet ne tada, kai jie yra gilesniuose audiniuose ar ant vidaus organų serozinių dangalų. Taip pat gali būti sunku rasti kirminus, esančius po oda, kadangi jie linkę keisti savo lokalizaciją.
Yra atlikta keletas tyrimų apie kitų vaistų naudojimą, gydant nuo D. repens, pavyzdžiui, injekcinio melarsomino ir makrociklinių laktonų per os derinys, bet tikrasis veiksmingumas yra diskutuotinas [48, 49].
1.4. Profilaktikos priemonės
Norint išvengti dirofiliarijozės plitimo turi būti taikomos patikimos prevencijos ir gydymo priemonės [50]. Prevencijos strategija rizikos veiksnių turintiems šunims susideda iš trijų žingsnių:
1. pirminis diagnostinis tyrimas;
2. invazijos perdavimo vektorių prevencija;
3. invazijos perdavimo stuburiniam šeimininkui prevencija [51].
Dėl to svarbu naikinti uodų veisimosi vietas, ypač ten, kur yra stovintis vanduo bei užkirsti kelią naujų uodų veisimosi vietų radimuisi [8].
Tyrimo rezultatai parodė, kad kramtomosios tabletės, į kurių sudėtį įeina milbemicino oksimas/prazikvantelis, yra naujas būdas efektyviai kontroliuoti poodinę dirofiliarijozę, kuri plinta į daugelį Europos šalių. Reguliariai, kas mėnesį, suduodant milbemicino oksimo/prazikvantelio tabletes, yra nutraukiamas D. repens vystymosi ciklas. Sumažinus užsikrėtusių šunų skaičių, yra išvengiama uodų užsikrėtimo mff per infekuotą kraują, ir taip sumažėja ligos plitimas tarp vektorių, šunų ir žmonių [44].
Iš praktinės pusės taip pat svarbi D. repens prevencija, nes suaugę parazitai bei migruojančios mff užsikrėtusiems šunims gali sukelti įvairius odos pažeidimus, kurie yra sudėtingai diagnozuojami bei gydomi [5–7].
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGOS
Magistro baigiamasis darbas rengtas 2013–2016 metais dr. L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje, o eksperimentinė dalis – vienoje Kauno smulkiųjų gyvūnų klinikoje, remiantis šunų kraujo mėginių tyrimais bei dirofiliarijoze sergančių šunų gydymo rezultatais. Tyrimą sudarė 5 etapai.
Pirmajame – iš 1 216 atsitiktiniu principu atrinktų šunų buvo paimtas veninis kraujas. Antrajame etape kraujo mėginiai buvo ištirti paprastuoju Knott testu ir iš laikytojų buvo surinkta detali informacija apie šuns amžių, veislę, lytį, gyvenimo tipą ir gyvenamąją vietą Mėginiai, kuriuose buvo aptiktos mff (n=49) papildomai buvo tiriami modifikuotuoju Knott testu ir PGR. Trečiojoje tyrimo dalyje tiriamieji šunys buvo suskirstyti į dvi grupes: A ir B. A grupei buvo paskirtas gydymas per os milbemicino oksimo ir prazikvantelio vaistu, o grupei B – fenbendazolo/pirantelio embonato/prazikvantelio tabletės.
Ketvirtajame etape iš visų šunų vėl buvo imamas kraujas ir atliekamas modifikuotas Knott testas praėjus 14 d. po paskirto gydymo. Vėliau B grupės šunims buvo paskirtas gydymas nuo mff ir po 14 d.
pakartoti kraujo mėginių tyrimai modifikuotuoju Knott testu.
2.1. Eksperimentinis klinikinis atsitiktinių imčių tyrimas
Norint aptikti D. repens mff šunų kraujo mėginiuose, paskirti reikiamą gydymą bei įvertinti gydymo veiksmingumą, būtina remtis specifiniais tyrimų būdais, metodologija, nes tai svarbu, kad gauti rezultatai būtų patikimi. Tyrimo eigą, tiriamųjų skaičių nulemia tai, kad dažniausiai D. repens invazija būna besimptomė, klinikiniai požymiai būna neryškūs arba nespecifiniai. Atlikti tyrimus su dirbtinai užkrėstais gyvūnais yra paprasčiau – žinoma, kada gyvūnas buvo užkrėstas, kokia mff koncentracija pateko į kraują, galima atlikti daugiau ir išsamesnių tyrimų vertinant D. repens vystymosi ciklą, trukmę, mff koncentracijos pakitimus kraujyje einant laikui. Šunis, skirtus tik tyrimams, auginti yra brangu [49], todėl eksperimentiniai klinikiniai atsitiktinių imčių tyrimai yra savotiškas „aukso standartas“ moksliniuose tyrimuose.
2.2. Tyrimo imtis
Iš viso buvo ištirti 1 216 skirtingų veislių, amžiaus, lyties, klinikinės būklės šunų kraujo mėginiai.
Šunys į kliniką buvo atvesti dėl įvairių sveikatos sutrikimų ir kraujas buvo imamas atlikti morfologinį kraujo tyrimą (jeigu reikia, ir biocheminį) ligų diagnostikai. Tie patys mėginiai naudoti ir Knott testui.
2 paveiksle pavaizduotas sergančių šunų skaičiaus ir lyties pasiskirstymas tarp veislių. Iš pateiktų duomenų matyti, kad daugiausiai buvo vokiečių aviganių veislės šunų (19), kas sudarė 45,24 proc., po
to mažėjančia tvarka 23,80 proc. sudarė mišrūnai, po 4,76 proc. rotveileriai bei auksaspalviai retriveriai, o kitų veislių (amerikiečių kokerspanieliai, vokiečių dogai, akita-inu, Džeko Raselo terjerai, Sibiro haskiai, Stafordšyro terjerai, Berno zanenhundai, Labradoro retriveriai bei airių seteriai) šunys sudarė tik po 2,38 proc. ir mažiau dirofiliarijoze sergančių šunų.
2 pav. Tiriamųjų šunų skaičiaus ir lyties pasiskirstymas tarp veislių
Tarp užsikrėtusių šunų patelių buvo šiek tiek mažiau, nei patinų. Patinų buvo 24, o patelių – 18.
Taigi didelio skirtumo tarp sergančių lyties atžvilgiu nebuvo.
2.3. Gyvūnų skirstymas
Darbe apžvelgiami gyvūnai buvo suskirstyti į grupes pagal tam tikrus požymius ir veiksnius (2 lent.). Taip pat sergantys šunys, pagal taikytą gydymo schemą buvo suskirstyti į dvi grupes (3 lent.).
2 lentelė. Visos darbe naudotos šunų imties skirstymas į grupes pagal tam tikrus požymius ir veiksnius
Aptikta mff Neaptikta mff
Amžius
Jauni (1–3 m.) 13 721
Vidutinio amžiaus ir seni (≥4 m.) 36 446
Lytis
Patelės 20 498
Patinai 29 669
Kailio tipas
Trumpaplaukiai 11 638
Ilgaplaukiai 38 529
Laikymo tipas
Patalpoje 16 510
Lauke 33 657
Sezonas
Šiltasis (III–VIII mėn.) 45 693
Šaltasis (IX–II mėn.) 4 474
Šuns dydis
Maži ir vidutinio dydžio (<20 kg) 9 487
Dideli ir gigantiniai (>20 kg) 40 680
3 lentelė. Užsikrėtusių mff šunų skirstymas pagal naudotą gydymo schemą
A B
39 10
2.4. Kraujo mėginio ėmimas ir tyrimas
Mėginiai buvo imami veterinarijos klinikos procedūrų kabinetuose, laikantis aseptikos ir antiseptikos reikalavimų, tik su laikytojų priežiūra.
2.4.1. Kraujo mėginio paėmimas
Kraujui imti naudotos šios priemonės ir medžiagos: 75 proc. etanolis, 21G (0,8x38,0 mm) adatos, 3 ml sterilūs švirkštai, 3 ml vakuuminiai mėgintuvėliai su EDTA K3 antikoaguliantu, vata, lateksinės pirštinės, turniketas, šaldiklis mėginiams laikyti.
Kraujas buvo imamas iš priekinės kojos venos – vena cephalica. Paimto kraujo kiekis turėjo būti apie 3 ml. Kraujas imamas į mėgintuvėlius su EDTA K3 ir vartoma 5 kartus, kad susimaišytų su antikoaguliantu.
2.4.2. Paprastasis Knott testas
Šis testas atliekamas ant objektyvinio stiklelio uždedant 1 lašą tiriamo kraujo, pridedama 1–2 lašai 0,9 proc. NaCl tirpalo ir mikroskopuojama 10X didinančiu objektyvu. Teigiamas rezultatas – kai peržiūrėjus visą lauką randama bent viena mikrofiliarija.
2.4.3. Modifikuotas Knott testas
Šis testas yra ypatingas tuo, kad galima suskaičiuoti mff 1 ml tiriamo kraujo, taip pat įmanoma preliminariai diferencijuoti, kokia dirofiliarijų rūšis yra mėginyje. Modifikuotu Knott testu yra matomos jau negyvos mff, ir dažniausiai jų matoma daugiau nei paprastuoju Knott testu. Į 15 ml mėgintuvėlį įpilama 1 ml tiriamo kraujo ir 9 ml 2 proc. formalino. Centrifuguojama 500 aps./min.
greičiu, 5 min. Po centrifugavimo mišinys nupilamas, o į nuosėdas įlašinama 1 lašas metileno mėlynojo dažų. 1 lašas nudažytų nuosėdų uždedamas ant objektinio stiklelio ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Mikroskopuojama 10X arba 40X didinančiu objektyvu.
2.5. Mff rūšies nustatymas polimerazės grandinine reakcija (PGR)
Kiekvienas kraujo mėginys, kuris buvo teigiamas mff atžvilgiu, buvo ištirtas PGR metodu, norint identifikuoti, kokia mff rūšis buvo kraujo mėginyje – D. repens ar D. immitis. Kraujas EDTA K3 vakuuminiame mėgintuvėlyje nebuvo išsiųstas tyrimams tą pačią dieną, todėl mėginiai buvo laikomi šaldiklyje (-20 °C). Surinkti mėginiai kas savaitę buvo vežami į Vytauto Didžiojo Universiteto gamtos mokslų fakulteto molekulinę laboratoriją ir mūsų pačių buvo atliekama PGR.
Prieš atliekant DNR išskyrimą, kraujo mėginiai buvo atšildomi kambario temperatūroje (+20 °C).
Reikiamas kraujo kiekis buvo paimamas iš mėginių, o likęs kraujas dedamas atgal į šaldiklį tam, jeigu prireiktų pakartoti tyrimą. Išskirta DNR taip pat yra šaldoma -20 °C temperatūroje.
2.6. Gydymas
Nuo D. repens mff A grupės šunims buvo paskirtas gydymas taikant minimalią rekomenduotiną dozę 0,5 mg/kg kūno svorio milbemicino oksimo ir 5 mg/kg kūno svorio prazikvantelio kramtomosiomis tabletėmis, o grupei B buvo skirtas alternatyvus gydymas – fenbendazolo/pirantelio embonato/prazikvantelio tabletės, kurių dozė paskaičiuota pagal gyvūno svorį. Po 14 dienų buvo vertinamas gydymo veiksmingumas abiejose šunų grupėse. Gavus tyrimo rezultatus, grupės B šunims taip pat buvo skirtas kombinuotas antihelmintikas (milbemicino oksimas/prazikvantelis) (4 lent.).
Gydymas abiejų grupių šunims buvo paskirtas tik gavus šeimininkų sutikimą. Grupės B šunims prieš pradedant tyrimą bet kokie vaistai nuo endoparazitų nebuvo duoti mažiausiai 6 mėn.
4 lentelė. Kombinuoto antihelmintiko (milbemicino oksimo/ prazikvantelio) dozavimas suaugusiems, mažų veislių šunims ir šuniukams [43]
Svoris Tabletės mažų
veislių šunims ir šuniukams
Tabletės suaugusiems šunims
0,5–1 kg 1/2 tabletės –
>1–5 kg 1 tabletė –
>5–10 kg 2 tabletės –
5–25 kg – 1 tabletė
>25–50 kg – 2 tabletės
>50–75 kg – 3 tabletės
2.7. Statistiniai skaičiavimai
Tyrimų rezultatai bendrinti ir jų statistiniai duomenys apskaičiuoti kompiuterine programa
„Microsoft Exel`2013“. Buvo apskaičiuoti gautų duomenų procentiniai skirtumai, χ2 (chi-kvadrato kriterijus) bei vidurkių skirtumų patikimumo koeficientas (p), kuris buvo laikomas patikimu kai p≤0,05. Darbas parengtas kompiuterine programa „Microsoft Word`2013‘.
3. TYRIMO REZULTATAI
Tyrimo metu iš viso buvo atlikti 1 216 šunų kraujo tyrimai. Šunys buvo parinkti atsitiktinai, buvo iš Kauno miesto ir rajono, Prienų, Kaišiadorių, Jonavos rajonų, Elektrėnų. Pagrindiniai tyrimo duomenys rinkti nuo 2015 m. vasario mėnesio iki 2015 gruodžio mėnesio. Iki to laiko, kai buvo pradėtas šis tyrimas, dirofiliarijoze sergantiems šunims gydyti buvo taikyti ir kiti medikamentai, tokie kaip imidakloprido ir moksidektino užlašinamasis tirpalas arba ivermektinas, tačiau mūsų atveju buvo pasirinktas kombinuotas antihelmintikas (milbemicino oksimas/ prazikvantelis). Pastarasis preparatas buvo tinkamiausias šunų laikytojams dėl prieinamumo, kainos, paprasto sušėrimo ir saugumo.
3.1. Paprastojo ir modifikuoto Knott testo rezultatai
Iš visų 1 216 šunų kraujo mėginių, atlikus paprastąjį Knott testą mff buvo aptiktos 49 mėginiuose (5 lent., 3 pav.). Su tais pačiais mėginiais buvo atliktas ir modifikuotas Knott testas (4 pav.).
3 pav. Mikrofiliarija 12 metų amžiaus vokiečių aviganio kraujyje (paprastasis Knott testas)
4 pav. Mikrofiliarija 12 metų amžiaus vokiečių aviganio kraujyje (modifikuotas Knott testas)
5 lentelė. Ištirtų šunų užsikrėtimas mff ir jų dalis procentais
Aptikta mff Neaptikta mff Užsikrėtusiųjų dalis (proc.)
Paprastasis Knott testas 49 1 167 4,03
Modifikuotas Knott testas 49 0 100
Paprastojo Knott testo rezultatus patvirtino modifikuotas testo variantas, ir mėginiai buvo siųsti tolimesniems tyrimams.
Mikroskopuojant kraujo mėginius, mff koncentracija labai skyrėsi. Vienuose matydavosi labai daug mff, kituose – vos kelios. Taip pat pastebėta, kad skiriasi ir mff judrumas, nors visi mėginiai buvo tiriami iš karto po kraujo paėmimo. Klinikoje kiekvieno gyvūno, kurio kraujas imamas atlikti morfologinį kraujo tyrimą, yra padaromas ir kraujo tepinėlis, kuris vėliau mikroskopuojamas.
Hematologui mikroskopuojant kraujo tepinėlį ir vertinant kraujo forminius elementus, buvo aptikta mikrofiliarija (5 pav.).
5 pav. Mikrofiliarija kraujo tepinėlyje
3.2. Rūšies nustatymo rezultatai
Visi kraujo mėginiai, kuriuose buvo mff, buvo ištirti PGR metodu. Taip buvo identifikuojama tiksli mff rūšis. Elektroforezės principas paremtas tuo, kad veikiant elektros srovei, neigiamą krūvį turinčių DNR fragmentų judėjimo greitis gelyje priklauso nuo jų dydžio.
Atlikus PGR naudojant skirtingus pradmenis, nustatyta, kad 100 proc. visų mėginių buvo rasta D. repens. 6 paveiksle pavaizduoti mūsų atlikto tipizavimo rezultatai.
6 pav. Elektroforezės rezultatas. D. repens COI geno amplifikacija naudojant DR COI-F1 ir DR COI- R1 pradmenis, kurie yra specifiniai D. repens rūšiai. Reakcijos metu amplifikuojama 209 bp ilgio fragmentas. 1 ir 8 – markeriai, žymintys DNR fragmentų dydį; 2 ir 7 – neigiama kontrolė; 3 – teigiama kontrolė; 4–6 – tiriami mėginiai (teigiami D. repens).
3.3. Šunų užsikrėtimui D. repens reikšmingų veiksnių analizė
Šiame etape susisteminti ir išanalizuoti 1 216 šunų duomenys, kuriems buvo atlikti kraujo tyrimai. Tiriamieji buvo skirtingų veislių, skirtingo amžiaus, laikymo sąlygų, abiejų lyčių ir į tyrimą buvo įtraukti skirtingu laiku.
3.3.1. Amžiaus įtaka šunų užsikrėtimui D. repens
Pagal amžiaus kriterijų mūsų tirtų šunų duomenys pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. Šunų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes
Aptikta mff Neaptikta mff Užsikrėtusiųjų dalis (proc.)
Jauni (1–3 m.) 13 721 1,07
Vidutinio amžiaus ir seni (≥4 m.) 36 446 2,96
Išanalizavę sugrupuotus duomenis pagal X smulkiųjų gyvūnų klinikoje 2014–2015 metais ištirtus dėl dirofiliarijozės šunų kraujo mėginius matyti, kad daugiau ištirtų šunų buvo jauni (1–3 m.), tačiau tarp užsikrėtusių vyravo vidutinio amžiaus ir seni (≥4 m.). Jie sudarė 73,5 proc. sergančiųjų.
Apskaičiavus χ2 kriterijų ir jų skirtumų patikimumą, darytina išvada, kad vidutinio amžiaus ir seni šunys mūsų tirtos populiacijos atveju, labiau linkę sirgti dirofiliarijoze (p<0,001).
3.3.2. Lyties įtaka šunų užsikrėtimui D. repens
Ištirti šunys buvo sugrupuoti pagal lytį, o duomenys pateikti 7 paveiksle.
7 pav. Ištirtos imties pasiskirstymas pagal lytį
Grafiškai pavaizduoti duomenys rodo, kad 57,4 proc. imties sudarė patinai, o 42,6 proc. – patelės.
Apskaičiavus χ2 kriterijų ir jų skirtumų patikimumą, galime teigti, užsikrėtimui dirofiliarijoze lytis įtakos neturėjo (p=0.796).
3.3.3. Kailio tipo įtaka šunų užsikrėtimui D. repens
Remiantis literatūros duomenimis, kailio ilgis ir tankumas yra svarbus veiksnys, galintis lemti užsikrėtimą D. repens. Vertinant šunų kailį, galima atsižvelgti į daugelį dalykų, tokių kaip kailio ilgis, tankumas, plauko storis, poplaukis. Mūsų atliktame tyrime, šunis sugrupavome pagal kailio ilgį (8 pav.)
8 pav. Trumpaplaukių ir ilgaplaukių šunų skaičiaus pasiskirstymas imtyje
Išanalizavus gautus duomenis, pastebėta, kad tyrimo metu trumpaplaukių šunų buvo ištirta 6,47 proc. daugiau nei ilgaplaukių, bet mff dažniau buvo aptinkamos ilgaplaukių šunų kraujo mėginiuose.
Apskaičiavus χ2 kriterijų, galime daryti išvadą, kad ilgaplaukiai šunys labiau linkę sirgti dirofiliarijoze (p<0,001).
3.3.4. Laikymo tipo įtaka šunų užsikrėtimui D. repens
Analizuojant duomenis, labai svarbu atkreipti dėmesį, kaip pasiskirstę šunys pagal laikymo tipą (7 lentelė).
7 lentelė. Tirtųjų šunų pasiskirstymas pagal laikymo tipą
Aptikta mff Neaptikta mff Užsikrėtusiųjų dalis (proc.)
Patalpoje 16 510 1,32
Lauke 33 657 2,71
Daugiausiai šunų, kuriems atlikti kraujo tyrimai, buvo gyvenantys patalpoje (kambaryje, garaže ir pan.) ir buvo išvedami į lauką, o lauke gyvenančių šunų tarp tiriamųjų buvo mažiau. Tačiau tarp sergančių šunų, daugiau nei pusę (67,35 proc.) sudarė lauke gyvenantys šunys. Po statistinio duomenų apdorojimo (χ2), gauti rezultatai parodė, kad statistinio ryšio tarp laikymo tipo ir užsikrėtimo dirofiliarijoze nėra (p=0.126).
3.3.5. Sezono įtaka šunų užsikrėtimui D. repens
Sezoniškumas sergamumui dirofiliarijoze turi didelę reikšmę. Ši liga pernešama uodų, o tai savaime paaiškina ligos užkrato perdavimo ir pasireiškimo laiką. Mff kraujyje daugiau aptinkama tik atšilus orams ir tai tęsiasi iki orų permainų pereinant į šaltąjį metų sezoną. Tik tuo metu jas yra įmanoma aptikti šunų kraujo mėginiuose, nes taip ligos sukėlėjai yra prisitaikę plisti. Savo tyrime šunis suskirstėme ir pagal tai, kokiu metų laiku buvo ištirti (9 pav.).
9 pav. Visų ištirtų šunų kraujo mėginių paėmimo laikas pagal sezoną
Apdorojant X smulkiųjų gyvūnų klinikoje ištirtų šunų duomenis, pagal sezoną jie buvo suskirstyti į 2 grupes – ištirtus šiltuoju ir šaltuoju metų laiku. Daugiau šunų kraujo mėginių buvo ištirta šiltuoju metų laiku – 738, o šaltuoju metų laiku – 478. Kaip atrodo šunų pasiskirstymas grupėse, kurių kraujyje buvo aptiktos mff, pavaizduota 10 paveiksle.
10 pav. Šunų, kurių kraujyje aptikta mff, pasiskirstymas pagal sezoną
Grafike pavaizduoti duomenys aiškiai rodo, kad didžiosios dalies šunų, kuriems buvo aptiktos mff ir nustatyta dirofiliarijozė (n=45), kraujo mėginiai buvo paimti šiltuoju metų laiku, o tik nedidelės dalies sirgusiųjų (n=4) kraujas buvo ištirtas šaltuoju metų laiku. Nors bendroje apskaitoje labai žymaus skirtumo tarp grupių pasiskirstymo nėra (šiltuoju sezonu 22 proc. daugiau ištirtųjų), tačiau sergančiųjų grupėje jis labai didelis (šiltuoju sezonu 84 proc. daugiau). Įvertinus statistinį ryšį tarp sezono ir užsikrėtimo, panaudojant χ2 kriterijų ir jų skirtumų patikimumą, nustatyta, kad požymiai yra priklausomi (p<0,001), todėl daroma išvada, kad šiltuoju metų laiku šunys turi didesnę galimybę užsikrėsti ir sirgti dirofiliarijoze.
3.3.6. Šuns dydžio įtaka užsikrėtimui D. repens
Vienas iš tyrimo duomenų analizės aspektų buvo išsiaiškinti, ar šuns dydis gali įtakoti užsikrėtimą, ir ar tai gali būti veiksnys, lemiantis polinkį užsikrėsti ir sirgti dirofiliarijoze. 8 lentelėje pateikiamas tirtųjų šunų skirstymas pagal dydį.
8 lentelė. Ištirtų šunų pasiskirstymas pagal dydį
Aptikta mff Neaptikta mff Užsikrėtusiųjų dalis (proc.)
Maži ir vidutinio dydžio (<20 kg) 9 487 0,74
Dideli ir gigantiniai (>20 kg) 40 680 3,28
Nepaisant šių dienų tendencijų, kai vis labiau populiarėja maži, kišeniniai, dar vadinami
„žaisliniai“ šuniukai, didesnę dalį (59,2 proc.) mūsų tyrimo imties sudarė dideli ir gigantiniai šunys.
Taip pat proporcingai tarp užsikrėtusiųjų daugiau buvo didelių ir gigantinių veislių atstovų (81,6 proc.).
Apskaičiavus χ2 kriterijų ir jų skirtumų patikimumą, darytina išvada, kad didesni šunys yra labiau linkę sirgti dirofiliarijoze (p<0,05).
3.4. Gydymo kombinuotu anihelmintiku (milbemicino oksimu/prazikvanteliu) veiksmingumo vertinimas
3.4.1. Tiriamų gyvūnų skirstymas
Tiriamieji šunys buvo suskirstyti į dvi grupes atsitiktinai. Gydymas buvo paskirtas visiems šunims, kurių mėginiuose buvo aptiktos mff (n=49). Tačiau eigoje iš tyrimo buvo pašalinti tie šunys, kurie buvo eutanazuoti arba neatvyko pakartoti kraujo tyrimo po paskirto gydymo (n=7), todėl tolimesni tyrimai buvo atlikti su 42 šunimis.
Tiriamieji buvo suskirstyti į 2 grupes: grupėje A buvo 32 šunys, o grupėje B – 10. Šiame etape buvo įvertintas tik gydymo veiksmingumas abiejose tiriamųjų grupėse, nepriklausomai nuo anksčiau minėtų veiksnių (veislės, lyties, amžiaus ir t.t.).
3.4.2. Naudota gydymo schema
Jau anksčiau minėta, kad tiriamiesiems gydyti būtent šie preparatai buvo pasirinkti, pirmiausia, dėl savo saugumo, antra, dėl prieinamos kainos šunų šeimininkams ir galiausiai dėl lengvo vaistų sušėrimo. Kita vertus, informacijos apie milbemicino oksimo/prazikvantelio (Milprazon, KRKA, Slovėnija) naudojimą šunims gydyti nuo D. repens Lietuvoje yra nedaug. Mūsų tyrimo metu taikyta gydymo schema aprašyta 9 lentelėje.
9 lentelė. Gydymo schema, naudota A ir B grupių šunims gydyti
Tiriamieji
Gydymo schema
Paskirtas preparatas
14 d. po gydymo
Paskirtas preparatas
14 d. po gydymo Aptikta
mff Neaptikta mff Aptikta
mff
Neaptikta mff
A
milbemicino oksimas/prazik
vantelis
4 28 gydymas nebuvo kartotas
B
fenbendazolo/
pirantelio embonato/praz
ikvantelio
10 0
milbemicino oksimas/prazi
kvantelis
0 10
Aptikus mff kraujo mėginiuose, vieniems šunims buvo paskirtas gydymas kombinuotu antihelmintiku iš karto, tą pačią dieną, kitiems šunims, gavus šeimininkų sutikimą, buvo skirtas kitokios sudėties antihelmintikas. Kadangi šunys buvo atvedami nevienodu laiku, tai ir jų kraujo mėginiai buvo ištirti skirtingu laiku per visą tyrimo laikotarpį.
3.4.3. Gydymo veiksmingumo įvertinimas abiejose tiriamųjų grupėse
Gydymo schemoje pažymėti ir gauti tyrimų rezultatai praėjus tam tikram laikui po paskirto gydymo (10 lent.).
10 lentelė. Gydymo rezultatai po skirtingos sudėties antihelmintikų sudavimo abiejose tiriamųjų grupėse
14 d. po gydymo (I) 14 d. po gydymo (II) Aptikta mff Neaptikta mff Aptikta mff Neaptikta mff
A 4 28 –
B 10 0 0 10
Prieš gydymą, abiejų grupių šunų kraujyje 100 proc. buvo rasta D. repens mff. Praėjus 2 sav. po paskirto gydymo buvo pakartoti kraujo tyrimai atliekant modifikuotą Knott testą ir registruojami gauti rezultatai. Pagrindinis kriterijus, pagal kurį vertintas vaisto veiksmingumas, buvo mff aptikimas kraujo
