Desmoplazija kalių pieno liaukos navikuose priklausomai nuo histologinio tipo

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Adomas Burneika

Desmoplazija kalių pieno liaukos navikuose

priklausomai nuo histologinio tipo

Desmoplasia in canine mammary gland tumors according

to a histological type

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: Doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė

2 DARBAS ATLIKTAS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Desmoplazija kalių pieno liaukos navikuose priklausomai nuo histologinio tipo“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Adomas Burneika

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Adomas Burneika

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Prof. habil. dr.

Saulius Petkevičius

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)

3

Turinys

1.1 Pieno liaukos navikas ... 9

1.2 Pieno liaukos navikų klasifikacija ... 9

1.3 Gerybiniai ir piktybiniai navikai ... 11

1.4 Etiologija ... 12

1.5 Prognozė ... 12

1.6 Pieno liaukos limfinis drenažas ... 13

1.7 Metastazių susidarymas plaučiuose ... 14

1.8 Desmoplazija ... 15

1.8.1 Miofibroblastai ir reaktyvioji stroma ... 15

1.8.2 Stromos vaidmuo navike ... 16

1.8.3 Imuninis atsakas navike ... 16

1.8.4 Molekulės reguliuojančios naviko-stromos sąveiką ... 17

1.8.5 Požymiai rodantys desmoplazijos pasireiškimą ... 17

1.8.6 Su naviku susiję kolageno požymiai ... 17

1.8.7 Epitelio išskirtas TGF- β ir desmoplazija ... 18

1.8.8 Epitelio išskirtas PDGF ir desmoplazija ... 18

1.8.9 Epitelio išskirtas VEGF ir desmoplazija ... 19

1.8.10 Desmoplazija – karcinomos inhibitorius ... 20

2. Tyrimo metodai ir medžiagos ... 21

2.1 Navikų mėginių paėmimas ... 21

2.2 Mėginių paruošimas mikroskopiniam tyrimui ... 21

2.3 Mikroskopinis tyrimas ... 21 2.4 Duomenų apsakičiavimas ... 22 3. Tyrimo rezultatai ... 23 Nuotraukos ... 29 Išvados ... 32 Literatūros sąrašas ... 33

4

Santrauka

Desmoplazija kalių pieno liaukos navikuose priklausomai nuo histologinio tipo Adomas Burneika

Magistro baigiamasis darbas

Desmoplazija, tai navikinių procesų sukeltas jungiamojo audinio išvešėjimas, dėl padidėjusio fibroblastų skaičiaus. Manoma, kad desmoplazija dažniausiai pasireiškia piktybiniuose navikuose. Tačiau tyrimais vienareikšmiškai nenustatyta ar desmoplazija yra sukeliama kaip navikinių ląstelių apsaugos barjeras nuo imuninio atsako, ar tai yra organizmo apsauginė reakcija nuo naviko invazijos. Šio tyrimo metu buvo tiriamas desmoplazijos pasireiškimas kalių pieno liaukos navikuose. Nustatyta, kad desmoplazija pasireiškė 16 iš 19 tirtų navikų. Desmoplazijos siprumas juose skyrėsi. Silpna desmopazija pasireiškė 53 proc. atvejų, vidutinio stiprumo – 27 proc. atvejų, o stipri 10 proc. Pagal histologinį tipą daugiausia desmoplazija pasireiškė tubuliopapilinėje – solidinėje, tubuliopapilinėje ir tubuliopapilinėje – cistinėje karcinomose.

5

Summary

Desmoplasia in canine mammary gland tumors according to a histological type Adomas Burneika

Master‘s Thesis

The increased growth of collagen tissue, because of bigger amount of miofibroblasts, is called desmoplasia. It is thought that desmoplasia is most often seen in malignant tumors. Scientists do not agree on wether desmoplasia is created by tumor cells to protect against immune response or is it a deffense mechanism created by a host organism. In this study there was investigated desmoplasia in canine mammary gland tumors according to a histologycal type. It was established that desmoplasia was found in 16 out of 19 investigated tumors. The intensity of desmoplasia was different. It was found that 53% of tumors had low intensity desmoplasia, 27% - medium intensity, and 10% - high intensity. According to a histological type desmoplasia most commonly was found in tubulopapillar – solid, tubulopapillar, and tubulopapilar – cyctic carcinoma.

6

Santrumpos

SMA-α – lygiųjų raumenų aktinas-α (ang. smooth muscle actin-α) FGF – fibroblastų augimo faktorius (ang. fibroblast growth factor)

PDGF – trombocitų augimo faktorius (ang. platelet-derived growth factor)

VEGF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius (ang. vascular endothelial growth factor) TGF-β – transformuojantis augimo faktorius-β (ang. transforming growth factor- β) MMP – matricinė metalproteinazė (ang. matrix metalloproteinase)

FAP – fibroblastus aktyvuojantis proteinas (ang. fibroblast activation protein) LO – lizolio oksidas

TAN – navikiniai neutrofilai (ang. tumor associated neutorphils) cm – centimetrai

7

Įvadas

Dažniausia šunų gaišimo priežastis yra įvairių navikų sukelti patologiniai pakitimai (1,2), o kalėms didžiausią mirtingumą lemia pieno liaukos navikų sukeltos ligos. Tikslus šių navikų paplitimas nėra žinomas dėl kelių priežasčių. Pirma, neretai maži navikai ar navikai, atsiradę sunkiai prieinamose kūno vietose, šeimininkų lieka nepastebėti ir todėl neskiriamas gydymas. Antra, net šeimininkams anksti pastebėjus naviką ir laiku kreipiantis į veterinarijos gydytoją, auglys nebūna šalinamas, nes kliniškai jis neatrodo piltybinis (3).

Dažniausiai chirurgiškai pašalinti pieno liaukos navikai būna gerybiniai. Histologinių tyrimų duomenimis tik apie 30 proc. visų chirurgiškai šalintų navikų yra piktybiniai (3). O net ir nustačius, kad navikas yra piktybinis, jis metastazuoja retai (2). Todėl didelį mirtingumą nuo pieno liaukos navikų lemia ne ligos agresyvumas, o pavėluotas diagnozės nustatymas. Dažniausiai diagnozuojama apžiūrėjus naviką išoriškai ir įvertinus gyvūno bendrą klinikinę būklę. Tačiau svarbiausia yra nustatyti naviko histologinį tipą ir metastazavimo riziką (1).

Šunų ir žmonių pieno liaukos, bei su jomis susijusios ligos, turi daugybę tiek struktūrinių tiek molekulinių panašumų. Ir žmonės ir šunys, yra labai paplitę visame pasaulyje, o jų genetinė įvairovė yra labai didelė. Gyvena tokioje pačioje aplinkoje ir yra supami tų pačių kancerogeninių veiksnių. Lyginant su kitais gyvūnais (pvz. katėmis), šuns kūno svoris yra artimas žmogaus (4). O pieno liaukos navikų paplitimas šunų tarpe beveik toks pat didelis kaip ir žmonių. Todėl ši gyvūnų rūšis yra labai tinkama atrandant ir pritaikant naujas onkologines diagnostines ir terapeutines priemones (1).

Kolagenas esantis naviko mikroaplinkoje yra vienas svarbiausių veiksnių lemiančių naviko augimą ir plitimą. Jo kiekis pieno liaukos audinyje tiesiogiai koreliuoja su mamograminiu tankiu, kuris ir parodo pieno liaukos naviko vystymosi pradžią. Tačiau svarbus yra ne tik kolageno tankis, bet ir kolageno pėdsakai, kurie audinyje gali parodyti naviko atsikartojimą. Taip pat atitinkami kolageno pėdsakai gali parodyti ar kolagenas skatina naviko augimą ar jį stabdo. Todėl naviko stroma yra svarbus taškas, kurį paveikus galima stabdyti naviko augimą. O kolageno pėdsakų identifikavimas svarbus sukuriant naujas terapines ir diagnostines procedūras (5).

Navikų ląstelinėje struktūroje kartais galima pastebėti neįprastai padidėjusį kolageno kiekį, vadinamą naviko desmoplazija. Ji dažniausiai asocijuojama su piktybiniais navikais, tačiau autorių teigimu tiriant odos navikus, tiek piktybiniuose tiek gerybiniuose navikuose desmoplazija pasireiškė taip pat dažnai. Dauguma autorių teigia, kad desmoplazija yra naviko sukelta reakcija, kuri padeda navikui plisti, augti sudaryti metastazes ar net apsisaugoti nuo organizmo imuninio atsako. Tačiau kitų autorių teigimu, desmoplazija gali būti šeimininko atsakas į naviko sukeltą uždegimą, siekiant jį uždaryti ir šitaip sustabdyti jo plitimą. Todėl išsiaiškinus desmoplazijos vaidmenį piktybiniuose

8 navikuose, galima būtų nustatyti piktybiškumo laipsnį, tikslesnę prognozę, bei parinkti tinkamą gydymo būdą (6).

Tikslas: Įvertinti desmoplazijos intensyvumą piktybiniuose kalių pieno liaukos navikuose. Uždaviniai:

1. Išanalizuoti literatūrą apie kalių pieno liaukos navikų desmoplaziją. 2. Atlikti surinktų mėginių histopatologinį tyrimą.

3. Įvertinti desmoplazijos pasireiškimą histopatologiniuose mėginiuose ir jos priklausomybę nuo histologinio tipo.

9

1 Literatūros apžvalga

1.1

Pieno liaukos navikas

Visi navikai, tiek piktybiniai, tiek gerybiniai turi du pagrindinius komponentus: parenchimą ir stromą. Parenchima sudaryta iš proliferuojančių navikinių ląstelių, o stroma iš jungiamojo audinio ir kraujagyslių. Parenchiminės ląstelės yra naviko pagrindas, kurios ir nulemia naviko patologines savybes bei tolimesnę būseną, tačiau augimas ir vystymasis priklauso nuo naviko stromos. Stromoje esantis jungiamasis audinys sudaro sistemą, kuri aprūpina parenchimą pakankamu kiekiu kraujo. Tarpusavio ryšys tarp navikinių ląstelių ir stromos užtikrina naviko augimą (7).

Navikai yra sudaryti iš stromos ir epitelio kombinacijų, tokių kaip adenomos/karcinomos ir mioepitelinių ląstelių komplekso, kadangi dar embrioniniame pavidale pieno liauka vystosi iš epitelio ir mezenchimos. Pradinis naviko vystymasis gali būti matomas kaip pieno liaukos latakėlių ar skiltelių hiperplazija. Ji gali progresuoti iki displazijos ir galiausiai susidaro naujas navikinis audinys. Šitaip nepiktybinė adenoma, gali tapti neinvazine karcinoma, kuri vėliau virs metastazuojančia karcinoma (2).

1.2

Pieno liaukos navikų klasifikacija

Daugelyje straipsnių aprašyta jog kiekvienas navikas yra individualus ir turi skirtingas histopatologines savybes. Todėl rekomenduojama daryti kiekvieno naviko biopsiją nustatant jų piktybiškumą bei tipą. Pirmoji klasifikacija įvesta 1983m, Gilbertson rėmėsi daugiausiai tik navikinių ląstelių išplitimo laipsniu organizme. Bet vėliau buvo įvesta labiau susisteminta nauja kalių pieno liaukos navikų klasifikacija (1 ir 2 lentelės) (8,9).

1983m Gilbertson ir kitų įvesta 0-3 stadijų klasifikacija:

0 stadija – piktybinio naviko proliferacija, apribota pieno liaukos anatominių struktūrų – carcinoma in situ;

1 stadija – navikinis audinys plinta už anatominių struktūrų – invazija į aplinkinę stromą, navikinės ląstelės randamos kraujagyslėse ir limfiniuose mazguose;

2 stadija – navikinio audinio invazija kraujagyslėse ar limfagyslėse, arba metastazėse regioniniuose limfiniuose mazguose;

10 1. Epiteliniai pieno liaukos piktybiniai

navikai

2. Epiteliniai piktybiniai pieno liaukos navikai – specifiniai tipai Karcinoma in situ; Paprastoji karcinoma: • Tubulinė; • Tubuliopapilinė; • Cistinė – papilinė; • Kribriforminė.

Mikropapilinė invazinė karcinoma; Solidinė karcinoma;

Komedokarcinoma; Anaplastinė karcinoma;

Karcinoma, kilusi iš adenomos komplekso ar mišraus naviko – histologiniuose preparatuose dar nustatoma ir gerybinio naviko elementų;

Karcinoma – kompleksinis tipas – epitelinis komponentas piktybinis, mioepitelinis – gerybinis; Karcinoma ir piktybinė mioepitelioma – epitelinis ir mioepitelinis komponentai yra piktybiniai;

Karcinoma – mišrus tipas – epitelinis komponentas piktybinis, mioepitelinis – gerybinis ir yra mezencheminis komponentas – kremzlinis ir kaulinis audiniai;

Latakinė karcinoma – epitelinis piktybinis komponentas kilęs iš latakinės adenomos;

Intralatakinė papilinė karcinoma – epitelinis piktybinis komponentas kilęs iš intralatakinės papilinės adenomos.

Plokščialąstelinė karcinoma; Adenoplokščialąstelinė karcinoma; Mucinus gaminanti karcinoma;

Lipidų turinti (sekretuojanti) karcinoma; Šeivinių ląstelių karcinoma;

Piktybinė mioepitelioma;

Plokščialąstelinės karcinomos šeivinių ląstelių variantas;

Karcinoma – šeivinių ląstelių variantas; Uždegiminė karcinoma.

3. Piktybiniai mezenchiminiai pieno liaukos navikai

4. Piktybinis mišrus pieno liaukos navikas Osteosarkoma; Chondrosarkoma; Fibrosarkoma; Hemangiosarkoma; Kitos sarkomos. Karcinosarkoma

5. Gerybiniai pieno liaukos navikai 6. Pieno liaukos hiperplazija , displazija

Paprastoji adenoma:

• Intralaktakinė papilinė adenoma (latakinė papiloma);

• Latakinė adenoma (bazaloidinė adenoma); • Su plokščialąsteline diferenciacija

(keratohialino granulės); Fibroadenoma;

Mioepitelioma;

Adenomos kompleksas (adenomioepitelioma); Gerybinis mišrus navikas.

Latakų ektazija;

Skilčių hiperplazija (adenozė); Tolygi hiperplazija:

• Aktyvi (sekretuojanti);

• Fibrozinė (tarpskiltelinis fibrozinis jungiamasis audinys);

Epiteliozė; Papilomatozė;

Fibroadenominiai pakitimai; Ginekomastija.

7. Spenelio navikai 8. Spenelio hiperplazija, displazija Adenoma;

Karcinoma;

Karcinoma su epidermio infiltracija

Spenelio odos melanozė

11

Piktybiniai navikai Gerybiniai navikai

1. Karcinoma:

1. Neinfiltruojanti (in situ) karcinoma; 2. Karcinomos kompleksas;

3. Paprastoji karcinoma: • Tubuliopapilinė; • Solidinė;

• Anaplastinė.

4. Specifiniai karcinomos tipai: • Šeivinių ląstelių; • Plokščialąstelinė; • Mucininė; • Riebalinė. 2. Sarkoma: • Fibrosarkoma; • Osteosarkoma; • Kitos sarkomos. 3. Karcinosarkoma

4. Karcinoma ar sarkoma gerybiniame navike. 1. Adenoma: • Paprastoji adenoma; • Adenomos kompleksas; • Bazaloidinė. 2. Fibroadenoma:

• Mažai ląstelių turinti; • Daug ląstelių turinti. 3. Gerybinis mišrus navikas 4. Latakinė papiloma

Pieno liaukos hiperplazija, displazija: Neklasifikuojami navikai 1. Latakų hiperplazija;

2. Skiltelių hiperplazija; • Epitelinė • Adenozinė 3. Cistos;

4. Latakų ektazija;

5. Židininė fibrozė (fibrosklerozė); 6. Ginekomastija.

2 lentelė. Kalių pieno liaukos navikų klasifikacija (10) (Misdorp ir kt., 1999)

1.3

Gerybiniai ir piktybiniai navikai

Pačiu paprasčiausiu būdu pieno liaukos navikai skirstomi į piktybinius ir gerybinius (10). Gerybiniai navikai paprastai būna maži, gerai apriboti, palpuojant – kieti. Piktybiniai navikai būna didesni, daugiau nei 5cm diametro, greitai augantys, skausmingi, neaiškių ribų, infiltruojantys. Piktybinio naviko vietoje dažnai matomas uždegimas, todėl oda būna paraudusi ir edemiška (1).

Navikai gali formuotis pavieniai arba daugybiniai. Daugybiniai navikai formuojasi iškarto keliose pieno liaukose, porinėse arba skirtingų porų. Gali išaugti vienos pusės pieno liaukoje arba abiejų (10).

Norint priskirti kuriai nors klasei, įvertinamas naviko dydis, ar yra metastazių, tai infiltruojantis ar neinfiltruojantis navikas. Infiltruojančiai dažniausiai auga paprastoji, skiltelinė, epitelioidinė, šeivinių ląstelių, anaplastinė karcinoma, bei smulkialatakinės adenokarcinomos kompleksas. Neinfiltruojantys navikai paprastai būna intralatakinė karcinoma ir skiltelinė karcinoma in situ (10).

12

1.4

Etiologija

Svarbiausi faktoriai lemiantys pieno liaukos navikus yra amžius ir hormonai. Kiti veiksniai, tokie kaip veislė, mityba ir nutukimas yra mažiau svarbūs navikinių darinių atsiradimui (11). Kritinis amžius patelėms, kai rizika atsirasti pieno liaukos navikams didžiausia, yra nuo aštuntų iki vienuoliktų gyvenimo metų (12), o jaunesnėms nei penkių metų amžiaus kalėms, tikimybė itin maža (11), Kiti šaltiniai teigia kad 9-12 mėn. šunys praktiškai nesusiduria su šiais susirgimais.

Manoma, kad kiaušidžių išskiriami hormonai, kaip estrogenas ir progesteronas, ankstyvajame periode yra svarbiausia priežastis pieno liaukos navikų invazijai bei augimui (9,11,13). Būtent todėl rujų skaičius tiesiogiai koreliuoja su navikų pasireiškimu vėlesniame amžiuje (2,11). Tyrimais nustatyta, kad kastruojant patelę prieš pirmą rują, tikimybė pasireikšti pieno liaukos navikams yra 0,05 proc., jei kastruojant prieš antrą rują – 8 proc., o jei po antros rujos – 26 proc. (3,8,9,11,14). Tačiau nebuvo nustatyta jokių reikšmingų prevencinių pokyčių, kai ovariohisterektomija buvo atliekama po antros rujos (9,11).

Pieno liaukos navikai gali pasireikšti visų veislių šunims bei mišrūnams. Tačiau tokios veislės kaip Pomeranijos špicas, vokiečių aviganis, labradoro retriveris, koker ir Bretanės spanielis, taksas, pudelis, pointeris, foksterjeras, anglų seteris (1,9,10,11,12,14,15), Maltos čihuahua, afganų kurtas, biglis, vakarų Škotijos baltasis terjeras, jorkšyro terjeras, frizos bišonas (11,12) turi daug didesnę riziką navikų atsiradimui nei kitos veislės ar mišrūnai. Veisliniai šunys turi daug didesnę riziką pasireikšti pieno liaukos navikams nei mišrūnai (2).

Nutukimas gali būti svarbus faktorius lemiantis pieno liaukos navikų atsiradimą, kadangi riebalinis audinys ir didelis cholesterolio kiekis yra geras androgenų ir progesterono šaltinis (13). Tiriant šunų šėrimo įpročius nustatyta, kad nutukę, šeriami raudona mėsa, vienerių metų šunys turi didesnę tikimybę pieno liaukos navikams pasireikšti. Viršsvoris didžiausią įtaką daro pirmaisiais gyvenimo metais, vėlesniame amžiuje nutukimas didelės reikšmės navikų atsiradimui neturi (11).

1.5

Prognozė

Prognozę nulemia naviko tipas. Sarkomos dažniausiai asocijuojamos su trumpesniu išgyvenimo laikotarpiu, nei karcinomos. Galutinė prognozė nustatoma pagal šešis požymius, kurie išvardijami nuo blogiausio iki geriausio:

• Metastazės į drenuojančius limfinius mazgus, • Intravaskuliniai navikų embolai,

• Naviko invazija į periferinius audinius, • Unikalus histologinis tipas,

13 Stadija Naviko dydis Metastazės regioniniuose

limfiniuose mazguose Tolimosios metastazės

1 <3cm didžiausias skersmuo Nėra Nėra

2 3-5cm didžiausias skersmuo Nėra Nėra

3 >5cm didžiausias skersmuo Nėra Nėra

4 Visų dydžių Yra Nėra

5 Visų dydžių Yra Yra

3 lentelė. Šunų pieno liaukos navikų stadijos įvertinimas, pagal PSO, neįskaitant uždegiminių karcinomų (11).

Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis prognozė nusakoma remiantis pieno liaukos naviko stadija (3 lentelė). Mažesni nei 1cm navikai dažniausiai reiškia gerą prognozę. 2-3cm skersmens navikas reiškia blogesnę prognozę, o pooperacinė išgyvenimo trukmė apie 22 mėn. Prognozė daug blogesnė pacientų, su didesniu nei 3cm naviku. Šiuo atveju pooperacinė gyvenimo trukmė iki 1m. Kaip bebūtų, visus didesnius nei 0,5cm navikus rekomenduojama tirti histopatologiškai (11).

Teigiami faktoriai Neigiami faktoriai Mažų veislių šuo (dažniau turi

nepiktybinius navikus);

Išreikšti estrogeno ir progesterono receptoriai;

Patinas (dažniau turi nepiktybinius navikus).

Navikas >3cm diametro;

Atsivėręs arba priaugęs prie aplinkinių audinių; Suregavę limfiniai mazgai;

Metastazavę į tolimesnius organus;

Neišreikšti estrogeno ir progesterono receptoriai;

Histologinis tipas (karcinoma – blogai diferencijuota, paprastoji, tvirtoji, anaplastinė, uždegiminė karcinoma, sarkoma);

Metastazavę į limfinius mazgu; Proliferacijos indeksas.

4 lentelė. Faktoriai lemiantys pieno liaukos naviko prognozę (9).

1.6

Pieno liaukos limfinis drenažas

Dauguma piktybinių mezenchiminės kilmės navikų (sarkomos) metastazuoja per kapiliarus ir venas, bet piktybinės epitelinės kilmės navikai (karcinomos) metastazuoja per limfinę sistemą. Todėl žinant normalios ir navikinės pieno liaukos limfos apytaką, nesunku suprasti kuriuos limfmazgius reikia įvertinti, pastebėjus karcinomos pirmus klinikinius požymius (5 lentelė) (11).

14 Pieno liauka Normalus limfinis drenažas Navikinis limfinis drenažas M1, kranialinė krutininė Pažasties LM _{Krūtinkaulinis LM} Pažasties LM

M2, kaudalinė krutininė Pažasties LM Pažasties LM

Krūtinkaulinis LM

M3, kranialinė pilvinė Pažasties LM Paviršinis kirkšninis LM

Pažasties LM Paviršinis kirkšninis LM

Medialinis klubinis LM M4, kaudalinė pilvinė Paviršinis kirkšninis LM Paviršinis kirkšninis LM _{Pažastinis LM} M5, kirkšninė Paviršinis kirkšninis LM Paviršinis kirkšninis LM,

Pakinklinis LM 5 lentelė. Normalios ir navikinės pieno liaukos limfinis drenažas, LM-limfinis mazgas (Goldschmidt ir kt. 2011) (11)

1.7 Metastazių susidarymas plaučiuose

Busimos metastazės vietoje susidaro palanki mikroaplinka navikui augti, dar prieš atkeliaujant navikinėms ląstelėms (16,17). Pasirodžius pirmoms ląstelių kolonijoms, jos toliau pertvarko mikroaplinką taip, kad sudarytų kuo geresnes sąlygas navikui. Remiantis tyrimais navikinės ląstelės pradeda plisti į kitas kūno vietas jau ankstyvuoju naviko augimo metu. Todėl didelė dalis pacientų gali turėti metastazių, nors ir liga diagnozuota anksti (16). Pieno liaukoje susiformavę navikai dažniausiai metastazuoja į plaučius, kepenis, smegenis ir kaulus (17). Formuojant pieno liaukos naviko metastazes dalyvauja daugybė aplinkląstelinių membranos proteinų įskaitant kolageną, fibronektiną, tenasciną C, versikaną, periostiną. Antrinėje naviko atsiradimo vietoje gali būti matomas toks pat kolageno nusėdimas, kaip limfmazgiuose ir kauluose. Metastazėms susidaryti plaučiuose būtinos ląstelės artimos kamieninėms. Navikinės ląstelės sintetina tenasciną C, kuris yra svarbus navikinių ląstelių kolonizacijai. Jis pro ląstelių tarpus ir wnt signalinius kelius reguliuoja kamieninių ląstelių formavimąsi. Wnt signaliniai keliai, tai iš proteinų sudaryti transdukciniai kanalai, kuriais perduodami signalai praeinantys pro ląstelės membraną. Fibroblastai tarpininkauja tarp tenascino C išskyrimo plaučiuose ir metastazinių pieno liaukos naviko ląstelių augimo. Jeigu šitoks ryšys tarp navikinių ląstelių integrinų ir naujai susiformavusios aplinkląstelinės membranos išnyktų, navikas negalėtų toliau formuoti kamieninių ląstelių ir metastazės augimas sustotų (16).

15 1 pav. Aplinkląstelinės membranos pokyčiai metastazės vietoje (16).

1.8 Desmoplazija

Desmoplazija, tai navikinių procesų sukelta fibroplazija ir kolageninės stromos išvešėjimas. O fibroplazija yra fibrozinio audinio formavimasis bei vystymasis, dėl padidėjusių fibroblastų skaičiaus (18). Dažniausiai desmoplazinių navikų ląsteliniai komponentai yra maži, o navikinės ląstelės pavienės, išmėtytos lyg sūkuriais, kartais būna susijungusių šonais po kelis tarp kolageno pluoštų (6). Jos su stroma apsikeičia dideliu kiekiu signalizuojančių molekulių, įskaitant augimo faktorius, citokinus, hormonus ir uždegiminius mediatorius. Šie signalai reguliuoja naviko augimo greitį, ląstelių diferenciaciją, bei stromą ir navikines ląsteles (22).

,,Desmoplazinis atsakas“ solidiniuose navikuose (pvz. pieno liaukos karcinomose) apibūdinamas kaip epitelinės kilmės naviko nenormalus aktyvumas, kai stromos fibroblastai sintetina gausias kolageno atsargas ir naviką supančią aplinkląstelinę matricą. Desmoplazinė stroma esanti šiuose navikuose dažnai apima aktyvuotąjį lygiųjų raumenų aktiną-α (SMA-α), kolageno skaidulas sintetinančius fibroblastus, fibronektinus, proteoglikanus ir tenasciną C (19).

1.8.1 Miofibroblastai ir reaktyvioji stroma

Pagrindinės karcinomos stromos ląstelės yra miofibroblastai. Jie susidaro iš paprastų fibroblastų ir yra panašūs į miofibroblastus, esančius gyjančioje žaizdoje (3,16,20,21,22,23). Šios ląstelės skiriasi tuo, kad žaizdos miofibroblastai nustoja veikti, kai žaizda sugija, priešingai nei naviko miofibroblastai, kurie nuolat skatina fibrozę ir augimą (23). Fenotipiškai nuo fibroblastų jie skiriasi didesniu proliferacijos laipsniu, sintetina kitokius aplinkląstelinės matricos proteinus ir augimo faktorius. Imunohistochemiškai miofibroblastai skiriami pagal tai ar išskiria vimentiną, SMA-α, lygiųjų raumenų miozino sunkiąją grandinę, desminą, kalponiną, ir α1-integriną (3,20,21,22,16,23).

16 Karcinomų desmoplaziją skatina miofibroblastai. Jie sekretuoja didžiąją dali kolageno ir kitų aplinkląstelinės matricos proteinų. Juose esantis SMA-α ir lygiųjų raumenų miozinas, gali priversti audinį susitraukti (6,22). Naviko tankį ir kietumą lemia miofibroblastų sugebėjimas susitraukti ar atleisti kolageną. Karcinomose, kuriose desmoplazija neišreikšta, miofibroblastų praktiškai nebūna arba jie sunkiai pastebimi. Apskritai miofibroblastai sarkomose randami retai ir jie sudaro labai nedidelę naviko lastelinės sandaros dalį (22).

Karcinomai progresuojant, miofibroblastų kiekis ir jų lokalizacija navike nuolat keičiasi. Gerokai didesni miofibroblastų kiekiai randami invazinėse, nei in situ karcinomose. Didelių, piktybinių navikų miofibroblastai nukeliauja į besivystančios karcinomos periferiją, už pamatinės membranos. Šitoks ląstelių išsidėstymas įvyksta navikui transformuojantis į invazinę karcinomą. Tuomet didelė dalis miofibroblastų randama invazinės dalies priekyje. Sklerotinėse karcinomos vietose miofibroblastai matomi retai. Taigi miofibroblastų diferenciacija išprovokuojama in situ karcinomos navikinių ląstelių skleidžiamų citokinų. Taip pat išnykusi pamatinė membrana, kuri normaliai skiria epitelinę ir stromos dalį, sudaro sąlygas tolimesnei ląstelių diferenciacijai, bei epitelinių ląstelių ir fibroblastų suvienodėjimui. Manoma kad navikiniai miofibroblastai yra padidėjusio aktyvumo, todėl skatina šalia esančių karcinomos ląstelių augimą (22).

1.8.2 Stromos vaidmuo navike

Dalis autorių remiasi teorija, kad fibroblastų aktyvavimas skatina ne tik navikinių ląstelių kolageno sintezę, bet ir tolimesnę jų proliferaciją. Šitoks mechanizmas tiesiogiai skatina naviko augimą bei invaziją. Navikinės ląstelės naikindamos aplinkląstelinę matricą aktyvuoja aplinknavikinės stromos ląsteles, kurios formuoja naujos matricos komponentus. Todėl desmoplazija karcinomose reiškia blogą prognozę dėl didesnės naviko atsikartojimo, metastazavimo ar su naviku susijusios mirties tikimybės (6).

1.8.3 Imuninis atsakas navike

Tanki aplinkląstelinė matrica reguliuoja kiek ir kokių imuninių ląstelių patenka į naviką. Pavyzdžiui, tvirti linijiniai kolageno pluoštai veikia lyg bėgiai, kuriais imuninės ląstelės juda į naviką ar iš jo. Tokie aplinkląstelinės matricos komponentai kaip β1 integrinai, ne integrinų receptoriai DDR1 ir su leukocitais susijusios LAIR jungimosi vietos sulaiko imunines ląsteles naviko mikroaplinkoje. Aplinkląstelinės matricos tankumas reguoliuoja T limfocitų aktyvaciją, brendimą ir diferenciaciją. Neseniai atliktais tyrimais nustatyta, kad pieno liaukos naviko aplinka, kurioje daug kolageno, pritraukia su naviku susijusius neutrofilus. O šių neutrofilų sumažėjimas stabdo metastazių atsiradimą. Deja bet vis dar neaišku kaip neutrofilai skatina metastazių atsiradimą (16).

17

1.8.4 Molekulės reguliuojančios naviko-stromos sąveiką

Navikinės ląstelės su stroma sąveikauja tiesiogiai iš ląstelės į ląstelę, naudodamos augimo faktorius ir citokinus, bei tokius navikinių ląstelių sintetinamus autokrininius augimo faktorius kaip:

• fibroblastų augimo faktorius (FGF) - stimuliuoja navikinių ląstelių proliferaciją; • trombocitų augimo faktorius (PDGF);

• kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF) - reguliuoja mikroaplinką, skatina fibroblastų proliferaciją, fibroplaziją (desmoplaziją), angiogenezę, ir uždegimą, skatinantį naviko augimą bei invaziją;

• transformuojantis augimo faktorius-β (TGF- β), tai multifunkcinis citokinas, kuris skatina augimą, audinių fibrozę, epitelinę – mezenchiminę pernašą. TGF- β yra svarbus tarpininkas tarp vėžinių ląstelių ir jų mikroaplinkos. Jo trūkumas fibroblastuose, gali lemti aktyvuotos mikroaplinkos susidarymą, kuri inicijuoja šalia esančių epitelinių ląstelių transformaciją (6).

1.8.5 Požymiai rodantys desmoplazijos pasireiškimą

Tiriant fibroblastus aktyvuojantį proteiną (FAP), SMA-α ir matricinę metalproteinazę (MMP) nustatyta, kad jų kiekis tiesiogiai koreliuoja su didesniu desmoplazijos laipsniu, dažnesniais metastazavimo atvejais ir trumpesne išgyvenimo trukme (6).

Fibroblastus aktyvuojantis proteinas – tai II tipo membraninis glikoproteinas, priklausantis serino proteazės grupei, bei turintis tiek dipeptidilpeptidazinį, tiek kolagenolitinį aktyvumą. Jis yra selektyviai išreiškiamas pieno liaukos aplinknavikinės stromos fibroblastuose, bei gyjančių žaizdų granuliaciniame audinyje (6,22). Aptinkamas ir pirminiuose navikuose ir jų metastazėse. FAP, priklausomai nuo vietos, pasireiškia labai skirtingai: fibroblastuose, kurie supa navikines ląsteles, šis proteinas išreiškiamas itin stipriai, aplinknavikinės stromos distalinėje dalyje proteinas matomas neryškiai, o fibroblastuose esančiuose šalia normalaus audinio, pasireiškia tik protarpiais arba išvis nepastebimas (6).

Lygiųjų raumenų aktinas lyginant su normaliu audiniu selektyviai matomas epitelinės kilmės naviko stromoje. O jame esantys miofibroblastai ir yra desmoplazijos šaltinis. MMP skatina naviko invaziją ir yra išskiriama naviko arba stromos ląstelių (6).

1.8.6 Su naviku susiję kolageno požymiai

Būsimus piktybinio naviko klinikinius požymius parodo specifinės kolageno žymės, esančios pirminėse kalių pieno liaukos karcinomose. Net jeigu naviko tipas, laipsnis ar maža metastazių tikimybė leido manyti, kad prognozė buvo gera, padidėjęs kolageno pluošto plotis ir nepakankama naviko-stromos riba reiškia blogą prognozę. Todėl naviko kolagenas yra svarbus kaip taikinys naujiems pieno liaukos karcinomos gydymo būdams kurti (4).

18 Padidėjęs mamograminis tankis yra gerai žinomas rizikos faktorius įspėjantis apie pieno liaukos naviko progresavimą ir metastazavimą į limfinius mazgus. Jis taip pat koreliuoja su padidėjusiu kolageno kiekiu navike, bei kolageno pluošto lygumu. Tačiau padidėjęs kolageno pluošto tankis neturi jokios reikšmės išgyvenimo trukmei. Jis yra svarbus tik kaip terapinis taškas pieno liaukos karcinoms gydymui.

Navikai, neturintys naviko–stromos ribos, turi kolageno visame pirminiame navike, kuriame kolageno pluoštai įsimaišę tarp pavienių ląstelių ar jų grupių. Dingus naviko – stromos barjerui, kolagenas persiorganizuoja, šitaip skatindamas naviko augimą. Labai agresyvių navikų kolageno pluoštai persiorganizuoja greičiau nei naviką stabdančios kolageno žymės arba šių žymių išvis nebūna. Todėl jie ir progresuoja greičiau nei kiti tokio pačio tipo navikai (4).

Tiriant in vitro nustatyta, jog didesnis kolageno pluošto storis skatina didesnę navikinių ląstelių invaziją. O tiriant in vivo navikiniuose dariniuose buvo rasta daugiau tiesių, ilgesnių ir platesnių kolageno pluoštų nei sveikame audinyje. Trumpa paciento išgyvenimo trukmė tiesiogiai priklauso nuo kolageno skaidulų ilgio (4).

1.8.7 Epitelio išskirtas

ir desmoplazija

Karcinomos ląstelės išskiria didelius kiekius TGF- β tam, kad iššauktų desmoplazinį atsaką iš jų kaimyninių mezenchiminių ląstelių. TGF- β1 išskiriamas pirminių navikų aktyviuosiuose taškuose ir limfinių mazgų metastazėse, todėl manoma, kad jis veikia šalia esančias organizmo stromos ląsteles. Jis taip pat gali sukelti fibroblastų diferenciaciją į miofibroblastus (6,20,22). Kolagenas I, III, V tipai, fibronektinas, hialurononas, tenascinas ir elastinas yra aplinkląstelinės membranos proteinai reikalingi desmoplaziniam atsakui ir žaizdos gyjimui, kuriuos iki diferenciacijos sekretuoja miofibroblastai (20,22,24). Per ilgas TGF poveikis miofibroblastams, gali lemti per didelį aplinkląstelinės matricos kiekį ir fibrozę, primenančią pieno liaukos karcinomos sklerozinį centrą (22).

1.8.8 Epitelio išskirtas

ir desmoplazija

PDGF yra potencialus mezenchiminių ląstelių mitogenas ir chemoatraktantas, funkcionuojantis kaip PDGF-A ir –B polipeptidų homo- ar heterodimeras (PDGF -AA, PDGF -AB, PDGF-BB). Per didelis augimo faktoriaus išskyrimas gali sukelti ląstelių, turinčių giminingų augimo faktorių receptorius, transformaciją (2,6,22,24,25). Ląstelės tampa navikinėmis, kai ląstelės, skleidžiančios PDGF signalus, susijungia su ląstelėmis turinčiomis PDGF receptorius (ypač fibroblastai ir glioblastomos lastelės) (6,22).

Šitokia autokrininė augimo stimuliacija nevyksta karcinomose. PDGF-A ir –B yra išskiriami navikinių epitelinių ląstelių, bet jos pačios neturi PDGF receptorių. Todėl manoma, kad PDGF

19 veikia navikinių ląstelių augimą parakrininiu būdu. Šitaip heterotipinis epitelinių ląstelių PDGF siunčiamas signalas normalioms stromos ląstelėms, kuris aktyvuoja stromą ir skatina naviko augimą (22).

PDGF yra itin reikšmingas pieno liaukos naviko desmoplaziniam atsakui sukelti. Vieno aprašyto bandymo metu, nuo estrogenų priklausančios pieno liaukos navikinės ląstelės buvo suleistos pelėms po oda. Navikai vystėsi sąlyginai ilgai ir sunkiai, bet juose pasirodžiusi desmoplazija visiškai priminė naturaliai pieno liaukos navikuose esančią desmoplaziją. Siekiant nustatyti, ar PDGF išskirtas iš ląstelių tikrai lėmė desmoplaziją, dominuojanti neigiama PDGF-A forma, kuri beveik neišskiria PDGF, buvo panaudota tyrimams. Šį kartą išaugusiuose navikuose nebuvo matoma desmoplazija (22).

Tiek TGF-β, tiek PDGF yra labai svarbūs desmoplazijai, jie skatina stromos atsaką gana skirtingais mechanizmais. PDGF yra mitogeniškas pirminiams fibroblastams, o TGF-β yra slopiklis. PDGF neskatina fibroblastų diferenciacijos į miofibroblastus, o TGF-β1 skatina. Manoma, kad PDGF signalas sukelti desmoplaziją gali netiesiogiai eiti per makrofagus, kurie yra labai chemotaksiški PDGF. Naviko makrofagai gali sekretuoti TGF-β1, kuris lemia raktyviosios stromos vystymasi. Vis dar nėra aišku ar epitelio išskirto PDGF sukelta desmoplazija yra tarpininkaujama tiesioginiu heterotipiniu signalo perdavimu fibroblastams ar netiesioginiu signalu makrofagams, o galbūt siganalas perduodamas abiem būdais (22).

1.8.9 Epitelio išskirtas VEGF ir desmoplazija

Didesniam nei 1-2mm diametro karcinomos augimui reikalingos kraujagyslės, kurios aprūpintų navikines ląsteles maisto medžiagomis, vykdytų dujų apykaita ir šalintų apykaitos produktus. Angiogenezę navike kontroliuoja VEGF ir su juo susiję proteinai (PlGF ir VEGF-B, -C, ir –D), kurie yra endotelinių ląstelių mitogenai (22).

Formuojant naujas kraujagysles navike, VEGF didina kraujagyslinį pralaidumą šitaip skatindamas desmoplaziją ankstyvosiose naviko stadijose (26). Pirmais vystymosi etapais, desmoplazinė stroma susideda iš fibrino ir fibrinogeno. Šią stromą infiltruoja makrofagai, miofibroblastai, bei naujos kraujagyslės. Manoma, kad VEGFdidindamas kraujagyslių pralaidumą pragreitina fibrino ir kitų plazmos proteinų susikaupimą reakcijos vietoje ir šitaip skatina krešulių susiformavimą. VEGF išskirtinai stipriai išreiškiamas tubulinėse ir gana silpnai skiltelinėse karcinomose. Abiejų rūšių navikuose jo aptinkama epiteliniuose dariniuose, bet beveik nerandama stromos ląstelėse (22).

Epitelio sintetinamas VEGF nėra tiesiogiai įtraukiamas į miofibroblastų gamybą ar į desmoplazinę reakciją. Tačiau kai kuriose karcinomose matoma koreliacija tarp VEGF kiekio ir desmoplazijos. Pavyzdžiui tubulinėse karcinomose VEGF yra išreikštas stipriai ir matoma

20 desmoplazija. Priešingai yra su skiltelinėmis karcinomomis, kuriose VEGF išreikštas silpnai, o desmoplazijos beveik nėra. Taip pat yra ir su VEGF receptoriais, kurie stipriai išreikšti tubulinių karcinomų endotelinėse ląstelėse ir mažiau išreikšti skiltelinių karcinomų endotelinėse ląstelėse (22).

1.8.10 Desmoplazija – karcinomos inhibitorius

Manoma, kad naviko stroma nebūtinai skatina naviko augimą, bet gali jį veikti ir priešingai – stabdyti jo augimą. Tuomet desmoplazinis atsakas gali būti aiškinamas kaip organizmo apsauginė reakcija, skirta uždaryti naviką ir sustabdyti jo plitimą. Desmoplazija yra dažniau siejama su sąlyginai nedidelio laipsnio navikais ir gana retai randama labai invazyviuose ir pažengusiuose navikuose (22,26).

Iki šiol sugalvoti tik keli mechanizmai susiję su desmoplazine stroma, kuri veiktų kaip slopiklis navikui augti. Vienas iš jų susijęs su lizolio oksido (LO) sinteze. Tai fermentas pritraukiantis kolageną ir elastiną, kurį išskiria miofibroblastai ir mioepitelinės ląstelės, supančios pieno liaukos karcinomą in situ. Lizolio oksidas stabilizuoja aplinkląstelinę matricą, didindamas jos atsparumą metaloproteinazių sukeliamai degeneracijai. Lizolio oksidas daugiausiai randamas in situ karcinomose, o piktybiškesniuose navikuose randamas retai arba jo išviso nėra (22).

Taip pat desmoplazija gali slopinti naviko augimą, sudarydama barjerą nuo organizmo imuninio atsako (20). Ši hipotezė buvo tikrinama atliekant bandymus su gyvūnais. Pelei po oda buvo suleista navikinių ląstelių kultūra ir po kurio laiko toje vietoje išaugo navikas. Ankstyvos stadijos navikui buvo pašalinta fibrininė kapsulė. Be jos navikas sėkmingai toliau augo. Tačiau pašalinus kapsulę nuo vėlesnės stadijos naviko, buvo stebima jo visiška regresija. Tai galima paaiškinti tuo, kad pelės su vėlesnės stadijos naviku jau turėjo susiformavusį imuninį atsaką prieš navikines ląsteles, kurį užstojo fibrininė desmoplazinė stroma (22). Be to, kad sudaro fizini barjerą nuo imuninio atsako, desmoplazinė stroma taip pat turi faktorių, kurie slopina makrofagų aktyvumą. Desmoplazinio atsako metu imuninis atsakas sumažinamas išskiriant didelius TGF-β kiekius, kurie kaupiasi naviko epitelinių ląstelių aplinkląstelinėje matricoje. TGF-β turi imunosupresinių požymių, galinčių sumažinti leukocitų ir uždegiminių ląstelių proliferaciją, bei aktyvaciją (20,22).

Pieno liaukos karcinomose, desmoplazija metastazėms susidaryti netrukdo. Priešingai yra literatūroje aprašytoje melanomoje. Tyrimais nustatyta, kad slopinant kolageno sintezę melanomoje sumažėja miofibroblastų skaičius, susilpnėja desmoplazija, stiprėja navikų invazija ir metastazių kiekis. Todėl galima manyti, kad desmoplazija suteikia apsauginį sluoksnį tik tam tikros rūšies navikams. Kitą vertus, fibrozinės kapsulės barjeras neleistų navikinėms ląstelėms plisti ir sudaryti metastazes (17).

21

2. Tyrimo metodai ir medžiagos

2.1 Navikų mėginių paėmimas

Kalių pieno liaukos navikų mėginiai buvo renkami nuo 2017 m. birželio mėn. iki 2017 m. lapkričio mėn. atsitiktinai iš vienos Kauno ir dviejų Vilniaus smulkių gyvūnų veterinarijos klinikų. Iš viso buvo atrinkta 19 kalių pieno liaukos navikų mėginių po chirurginio gydymo. Šunims, kuriems pasireiškė daugybiniai pieno liaukos navikai, mėginys paimtas iš labiausiai progresavusio naviko. Jeigu navikas nedidelis, apie 1cm skersmens, tyrimui buvo naudojamas visas, bet jeigu jis didesnis nei 3cm skersemens – išpjaunama tik jo dalis taip, kad į ją patektų ir kapsulė ir nekrozės zona. Mėginio fiksavimui buvo naudojamas 10 proc. formalino tirpalas. Operacijos metu paimtas mėginys fiksuojamas formaline buvo greičiau nei per 1 val. Navikas ar jo dalis buvo atpjauta aštriais įrankiais stengiantis nesutraiškyti. Naudojamo fiksatoriaus kiekis visada buvo 15-20 kartų didesnis nei mėginio. Taip pat surinkti duomenys apie gyvūno amžių, veislę, navikų kiekį bei lokalizaciją.

2.2 Mėginių paruošimas mikroskopiniam tyrimui

Navikų mėginiai paruošti histopatologiniam tyrimui naudojant automatinį audinių procesorių (Shandon Pathcentre, UK, 2004). Mėginių gabalėliai sudedami į kasetes, ant kiekvienos užrašomas identifikacijos numeris ir užliejami parafinu, naudojant atitinkamą prietaisą (CD 100, Italy, 2004). Parafino blokai supjaustomi 4μm storio pjūviais pusiau automatiniu mikrotomu (Shandon Finesse ME, UK, 2004). Atpjautas audinio mėginio pjūvis talpinamas į 39°C vandens vonelę ir džiovinami termostate (Jouan Innovens, France, 2004) 12 valandų 37°C temperatūroje. Toliau mėginio pjūvis dažomas standartiniu hematoksilino – eozino dažymo būdu.

2.3 Mikroskopinis tyrimas

Mikroskopinė analizė atlikta naudojant šviesinį mikroskopą. Įvertinamas naviko histologinis tipas ir desmoplazijos laipsnis. Desmoplazija vertinama apžiūrint 5 laukus ir nustačius desmoplazijos pasireiškimą, nuo + iki +++, išvedamas vertintų laukų vidurkis. Silpnai pasireiškianti desmoplazija žymima vienu ,,+“, į šią kategoriją įskaitomi ir navikai, kuriuose desmoplazija nepasireiškė. Dviem ,,+“ žymimi navikai kuriuose desmoplazija pasireiškė vidutiniškai, o trimis ,,+“ – stipriausiai. Taip pat mikroskopuojant įvertinama ar yra nekrozės židinių, bei leukocitų ir plazmocitų infiltracija.

22

2.4 Duomenų apsakičiavimas

Statistinė analizė atlikta naudojant statistinę programą ,,Microsoft Office Excel 2007“. Suskirsčius desmoplazijos pasireiškimą į silpną(+), vidutinį(++) ir stiprų(+++) atitinkamai priskirti balai nuo 1 iki 3. Todėl skaičiuojant bendrą desmoplazijos vidurkį yra sudedami kiekvienam navikui priskirti balai ir padalinami iš navikų skaičiaus.

23

3. Tyrimo rezultatai

karcinoma + Nėra Nėra 1

2 Biglis 10 Tubuliopapilinė _karcinoma - Yra Yra 2

3 Samojedas 10 Tubuliopapilinės-cistinės karcinomos kompleksas ++/+++ Nėra Yra 1 4 Mišrūnas 8 Kompleksinė ir tubulopapilinė karcinoma + Yra Nėra 1 5 Jorkšyro terjeras 9 Tubulinė ir mioepitelinė karcinoma + Nėra Nėra 2 6 Jorkšyro

terjeras 8 Solidinė karcinoma + Yra Yra 1

7 Mišrūnas 10 Tubuliopapilinė

karcinoma ++ Yra Yra 1

8 Mišrūnas 10 Mikropapilinės – scirotinės adenomos kompleksas - Yra Nėra 1 9 Mišrūnas 9 Solidinė

karcinoma, +/++ Yra Nėra 2

10 Nykštukin_{is pinčeris} 8 Tubuliopapilinė

karcinoma +++ Nėra Yra 4

11 Pudelis 13 Tubulinė

karcinoma + Yra Yra 2

12 Mišrūnas 14 Solidinė ir mišraus

tipo karcinoma. +/++ Nėra Yra 3

13 Mišrūnas 7 Tubulinė-solidinė

karcinoma - Nėra Nėra 2

14 Jorkšyro

terjeras 9

Tubuliopapilinė

karcinoma +/++ Yra Nėra 1

15 Mišrūnas 9 Tubulinė – solidinė

karcinoma ++ Nėra Nėra 2

16 Mišrūnas 7 Tubulinė,

karcinoma +/++ Nėra Yra 1

17 Nykštukin_{is pinčeris} 8 Tubulinė – solidinė

karcinoma + Nėra Yra 2

18 Mišrūnas 8 Tubulinė – solidinė

karcinoma + Nėra Yra 4

19 Pudelis 12 Tubulinė-solidinė

karcinoma +/++ Nėra Yra 2

24 2 pav. Desmoplazijos pasiskirstymas pagal pasireiškimą

Ištyrus visus mėginius (n=19) desmoplazija pasireiškė 84,2 proc. atvejų (n=16). Iš jų nustatyta, kad dažniausiai navikuose pasireiškia silpna desmoplazija, net 10 atvejų. Rečiau tyrimo metu buvo aptinkama vidutinio stiprumo desmoplazija (n=7), o rečiausiai pasireiškė stipri desmoplazija (n=2) (2 pav.).

3 pav. Silpnas desmoplazijos pasireiškimas pagal histologinį tipą

Silpnas desmoplazijos pasireiškimas dažniausiai aptinkamas tubulinėje – solidinėje karcinomoje, 30 proc. atvejų (n=3). Likusiuose navikuose silpna desmoplazija pastebėta tik po vieną kartą, 10 proc. atvejų (3 pav.).

25 4 pav. Vidutinio stiprumo desmoplazijos pasireiškimo dažnis pagal histologinį tipą

Vidutinio stiprumo desmoplazija dažniausiai pasireiškė tubulinėje – solidinėje ir tubuliopapilinėje karcinomose, po 28,6 proc. atvejų (n=2). Rečiau ji pasireiškė tubulinėje, solidinėje ir mišraus tipo, bei solidinėje karcinomose (n=1), po 14,3 proc. (4 pav.).

Didelio stiprumo desmoplazija pasireiškė tik tubuliopapilinėje karcinomoje ir tubuliopapilinės – cistinės karcinomos komplekse (n=1). Likusiuose navikuose tokio stiprumo desmoplazijos nebuvo aptikta.

5 pav. Vidutinis desmoplazijos pasireiškimas pagal naviko histologinį tipą

Taip pat buvo apskaičiuoti navikų desmoplazijos laipsnių vidurkiai. Tad vidutiniškai didžiausias desmoplazijos laipsnis (+++) pasireiškė tubuliopapilinėje – cistinėje karcinomoje, o vidutiniškai mažiausias desmoplazijos laipsnis (+) pasireiškė kompleksinėje – tubuliopapilinėje, mikropapilinėje – scirotinėje ir tubulinėje – solidinėje karcinomose (5 pav.).

26 6 pav. Silpnas desmoplazijos pasireiškimas pagal pažeistų pieno liaukų skaičių

Silpna desmoplazija dažniausiai buvo matyti navikuose, kurie pažeidė 2 – 3 pieno liaukas - 50 proc. atvejų (n=5), o rečiau navikuose, kurie pažeidė vieną pieno liauką - 40 proc. atvejų (n=4). Rečiausiai silpna desmoplazija buvo matoma navikuose, pažeidusiuose daugiau nei 3 pieno liaukas – 10 proc. atvejų (n=1) (6 pav.). Koreliacijos tarp navikų pažeistų liaukų skaičiaus ir desmoplazijos stiprumo nepastebėta.

7 pav. Vidutinio stiprumo desmoplazijos pasireiškimas pagal pažeistų pieno liaukų skaičių

Lyginant vidutinio stiprumo desmoplazijos pasireiškimą dažniausias pasikartojimas taip pat buvo matyti navikuose, kurie pažeidė 2 – 3 pieno liaukas (n=4) (57,1 proc.). Navikų su vidutinio stiprumo desmoplazija ir pažeidusių daugiau nei 3 pieno liaukas nebuvo, o pažeidusių 1 pieno liauką (n=3) buvo 42,9 proc. (7 pav.).

27 8 pav. Vidutinis desmoplazijos pasireiškimas pagal pažeistų pieno liaukų skaičių

Desmoplazijos vidurkis lyginant navikus pagal pažeistų pieno liaukų skaičių, taip pat koreliacijos nerodo. Vidutiniškai stipriausiai desmoplazija pasireiškė (2 balai) navikuose pažeidusiuose daugiau nei 3 pieno liaukas. O vidutiniškai silpniausia desmoplazija (1,4 balai) – 2-3 pieno liaukas (8 pav.).

Koreliacijos koeficientas yra 0,15, tai reiškia kad desmoplazijos stiprumas nuo pažeistų pieno liaukos skaičiaus koreliuoja labai silpnai.

9 pav. Desmoplazijos pasireiškimas priklausomai nuo imuninio atsako

Desmoplazijos priklausomybės nuo imuninio atsako taip pat nėra. Silpna desmoplazija pasireiškia dažniausiai – 26,3 proc. atvejų, nepriklausomai nuo to ar imuninis atsakas yra ar ne (n=5). Stirpi desmoplazija pasireiškia tik kai imuninis atsakas navike yra – 10,5 proc. (n=2). O vidutinio stiprumo desmoplazija pastebima dažniau, kai imuninio atsako nėra – 21 proc. (n=4), nei kai jis yra – 15,9 proc. (n=3) (9 pav.).

28 10 pav. Desmoplazijos laipsnis priklausomai nuo nekrozės

Desmoplazijos priklausomybės nuo nekrozės nėra. Silpna desmoplazija navikuose matoma lygiai taip pat dažnai kai nekrozė navikuose yra ir kai jos nėra – 26,3 proc. atvejų (n=5). Bet stipri desmoplazija matoma tik 10.5 proc atvejų (n=2), kai nekrozės navike nėra. Vidutinio stiprumo desmoplazija šiek tiek dažniau pasireiškia navikuose, kuriuose nekrozė yra – 21 proc atvejų (n=4), nei navikuose be nekrozės židinių – 15.9 proc. (n=3) (10 pav.).

11 pav. Vidutinis desmoplazijos pasireiškimas pagal amžių

Aiškios desmoplazijos priklausomybės nuo amžiaus nepastebėta, tačiau bendrai pasižiūrėjus vyresnių šunų vidutinis desmoplazijos pasireiškimo stiprumas yra didesnis nei jaunesnių šunų, išskyrus vieną 13 metų šunį, kurio desmoplazija buvo išreikšta silpniausiai (11 pav.).

Koreliacijos koeficientas yra 0,17, tai reiškia, kad desmoplazijos pasireiškimas nuo amžiaus koreliuoja labai silpnai.

29

Nuotraukos

12 pav. Desmoplazija su limfocitų – plazmocitų židiniu

13 pav. Desmoplazija su nekrozės židiniu

30

Rezultatų aptarimas

Šio darbo tikslas buvo įvertinti desmoplazijos pasireiškimą piktybiniuose pieno liaukos navikuose. Išytrus navikus histologiškai desmoplazija buvo aptikta 84,2 proc. visų mėginių. Remiantis kitų autorių atliktais tyrimais desmoplazijos pasireiškimo stiprumas visiškai nepriklauso nuo to ar navikas piktybinis ar gerybinis (15). Šiame darbe atlikto tyrimo metu beveik visi (n=18), išskyrus vieną, navikai buvo piktybiniai. Dažniausiai, 53 proc. atvejų (n=10), buvo aptinkama silpna desmoplazija. Šiek tiek rečiau, 37 proc. atvejų (n=7), buvo randama vidutinio stiprumo desmoplazija. Ir rečiausiai, 10 proc. atvejų (n=2), randama stipri desmoplazija.

Nagrinėjant mokslinius straipsnius nerasta aprašytos desmoplazijos priklausomybės nuo naviko histologinio tipo. Tačiau dauguma autorių tikina, kad desmoplazija reiškia tik blogesnę navikinio proceso eigą (4,6,20,21). Šiame darbe aprašyto tyrimo metu taip pat nerasta desmoplazijos intensyvumo priklausomybės nuo histologinio tipo. Vienuose navikuose desmoplazija pasireiškė dažniau nei kituose. Tubulinėje – solidinėje karcinomoje silpna desmoplazija (+) buvo aptinkama dažniausiai – 30 proc. atvejų (n=3). Tubulinėje – solidinėje ir tubuliopapilinėje karcinomose dažniausiai pasireiškė vidutinio stiprumo desmoplazija – 28,6 proc. atvejų (n=2). O stipri desmoplazija rasta tubuliopapilinėje karcinomoje (n=1) ir tubuliopapilinės – cistinės karcinomos komplekse (n=1).

Literatūroje rašoma, kad standūs ir lygūs kolageno pluoštai sudaro kelius kuriais į naviką gali patekti imuninės ląstelės (25). Taip pat teigiama kad desmoplazija sudaro ne tik fizinį barjerą nuo imuninio atsako, bet ir veikia imunosupresiškai sumažindamas imuninių ląstelių proliferaciją bei aktyvaciją (16,24). Tačiau tyrimo metu nebuvo nustatyta imuninio atsako priklausomybė nuo desmoplazijos pasireiškimo. Nepriklausomai nuo to ar imuninis atsakas buvo ar ne, silpna desmoplazija pasireiškė vienodai dažnai, 26,3 proc. atvejų (n=5). Vidutinio stiprumo desmoplazija dažniau pasireiškė, kai imuninio atsako nėra (n=4), nei kai jis yra (n=3). Stipri desmoplazija pasireiškė, tik kai imuninis atsakas yra (n=2), o kai jo nėra – nepasireiškė.

Fibroblastai, gaminantys kolageną, taip pat sintetina ir fibronektiną. Fibronektinas skatina naujų navikų susidarymą, todėl, anot kai kurių autorių, padidėjęs kolageno kiekis pirminiame navike tiesiogiai lemia didesnę tikimybę navikų metastazėms atsirasti (25). Atlikus šį tyrimą tiesioginės koreliacijos nepastebėta, bet navikas, kurio metastazės organizme pažeidė daugiau nei tris pieno liaukas, vidutiniškai turėjo stipriausią desmoplazijos pasireiškimą. Silpnesnė desmoplazija buvo pastebėta navikų, kurie pažeidė tik vieną pieno liauką. O pažeidusių 2-3 pieno liaukas, navikų desmoplazija buvo išreikšta silpniausiai.

Nekrozė dažniausiai parodo, jog navikas yra jau gan stirpriai progresavęs. Desmoplazijos priklausomybė nuo nekrozės atsiradimo navike galėtų parodyti, kad desmoplazijos aptikimas yra

31 blogas ženklas diagnozuojant naviko progresyvumą. Tačiau šiame darbe, tiriant navikus histologiškai, koreliacija nepastebėta. Silpna desmoplazija tiek pat kartų buvo matyti navikuose, kuriuose yra nekrozė ir kuriuose jos nėra – 26,3 proc. atvejų (n=5). Vidutinio stiprumo desmoplazija pasireiškia 5,1 proc. dažniau kai nekrozė navike yra. O labai stipri desmoplazija buvo randama navikuose, kuriuose nekrozės nebuvo.

Išnagrinėjus literatūrą nebuvo pastebėta jokio ryšio tarp gyvūnų amžiaus ir desmoplazijos pasireiškimo. Tačiau atlikus tyrimą, buvo matyti kad tokia priklausomybė yra. Kuo senesni šunys, tuo vidutinis desmoplazijos laipsnis buvo didesnis, nuo 1,25 iki 2 balų. Buvo tik vienas 13 metų šuo, kurio naviko desmoplazija įertinta 1 balu.

32

Išvados

1. Iš visų ištirtų mėginių (n=19) desmoplazija pasireiškė 84,2 proc. atvejų (n=16).

2. Dažniausiai navikuose pasireiškia silpna desmoplazija, net 53proc. atvejų (n=10), rečiau tyrimo metu buvo aptinkama vidutiniškai pasireiškianti desmoplazija – 37 proc. atvejų (n=7), o rečiausiai pasireiškė stipri desmoplazija – 10 proc. atvejų (n=2).

3. Silpnas desmoplazijos pasireiškimas (+) dažniausiai buvo aptinkamas tubulinėje – solidinėje karcinomoje, 30 proc atvejų (n=3). Vidutinio stiprumo desmoplazija (++) dažniausiai aptikta tubulinėje – solidinėje ir tubuliopapilinėje karcinomose, 28,6 proc. atvejų (n=2). O didelio stiprumo desmoplazija aptinakama tik tubuliopapilinėje karcinomoje (n=1) ir tubuliopapilinės – cistinės karcinomos komplekse (n=1).

4. Literatūroje aptarta, kad didelis kolageno kiekis pieno liaukos naviko aplinkląstelinėje membranoje yra tiesiogiai proporcingas imuninių ląstelių skaičiui navike. Atlikto tyrimo metu ši priklausomybė nenustatyta.

5. Fibroblastų išskirtas kolageno kiekis gali būti tiesiogiai proporcingas metastazavusių navikų skaičiui. Bet atlikto tyrimo metu šios priklausomybės nebuvo pastebėta, nors ir didžiausia desmoplazija pasireiškiantis navikas buvo pažeidęs daugiausiai pieno liaukų.

33

Literatūros sąrašas

1. Kishor, T. K., Rao, S., Satyanarayana, M. L., Narayanaswamy, H. D., Byragowda, S. M., Nagaraja, B. N., Purushotham, K. M. and Kavaya, N. Classification and staging of canine mammary gland tumours, Journal of Cell and Tissue Research Vol. 16(3), 2016

2. James E. Zachary, Pathologic basis of veterinary disease 6th edition, p.1191-1195, 2016 3. Donald J. Meuten, Tumors in domestic animals, p. 575-584, 2008

4. W. Schfirch, T.A. Seemayer, and R. Lagac, Stromal myofibroblasts in primary invasive and metastatic carcinomas, Virchows Arch 391, p. 125-139, 1981

5. A. Case, B. K. Brisson, A. C. Durham, S. Rosen, J. Monslow, E. Buza, P. Salah, J. Gillem, G. Ruthel, S. Veluvolu, V. Kristiansen, E. Pure, D. C. Brown, K. U. Sørenmo, S. W. Volk, Identification of prognostic collagen signatures and potential therapeutic stromal targets in canine mammary gland carcinoma. PLoS ONE journal, 2017

6. Abbas, O. & Mahalingam, M., Desmoplasia: not always a bad thing. Histopathology 58, p. 643–659, 2011

7. Kumar, Abbas, Fausto, Robbins and Cotran Pathologic basis of disease, 7th edition, p. 75, 2005

8. K.U. Sorenmo, V. M. Kristiansen, M. A. Cofone, F. S. Shofer, A.-M.Breen, M. Langeland, C. M. Mongil, A. M. Grondahl, J. Teige and M.H. Goldschmidt. Canine mammary gland tumours; a histological continuum from benign to malignant; clinical and histopathological evidence.Veterinary and Comparative Oncology, 7, 3, 162–172, 2009

9. J. Dobson, D. Lascelles, BSAVA Manual of Canine and Feline Oncology, 3rd Edition, p.237-246, 2011

10. N. Juodžiukynienė Citologinis tyrimas. Šunų ir kačių navikų citologija, p. 70-76, 2013 11. K. U. Sorenmo, R. Rasotto, V. Zappulli and M. H. Goldschmidt, Development, Anatomy,

Histology, Lymphatic Drainage, Clinical Features, and Cell Differentiation Markers of Canine Mammary Gland Neoplasms. Sage journals, Veterinary Pathology 48(1) 85-97 2011 12. D. Šimkus, A. Pockevičius, P. Mačiulskis, V. Šimkienė, L. Zorgevica-Pockeviča,

Pathomorfologycal analysis of the most common canine skin and mammary tumors. Veterinarija ir zootechnika T.69(91). 2015

13. H.Y. Lim, K.S. Im, N.H. Kim, H.W. Kim, J.I. Shin, J.Y. Yhee, and J.H. Sur, Effects of Obesity and Obesity-Related Molecules on Canine Mammary Gland Tumors, Sage Journals, Vol. 52(6) 1045-1051, 2015

14. A. Ežerskytė, G. Zamokas, A. Grigonis, N. Juodžiukynienė, The retrospective analysis of mammary tumors in dogs, Vet Med Zoot. T. 53 (75). 2011

34 15. G. Gunnes, K. S. Borge and F. Lingaas, A statistical assessment of the biological relationship between simultaneous canine mammary tumours. John Wiley & Sons Ltd, Veterinary and Comparative Oncology, 15, 2, p. 355–365, 2015

16. S. Kaushik & M. W. Pickup & V. M. Weaver, From transformation to metastasis: deconstructing the extracellular matrix in breast cancer. Springer journals 35 p. 655–667, (2016)

17. E. W. Thompson, M. Yu, J. Bueno, L. Jin, S. N. Maiti, F. L. Palao-Marco, H. Pulyaeva, I. J. W. Tamborlane, R. Tirgari, I. Wapnir and H. Azzam, Collagen induced MMP-2 activation in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment 31: 357-370, 1994

18. M. G. Maxie, Jubb, Kennedy, and Palmer’s Pathology of domestic animals vol 1 p.563, 2008

19. Jung Il Lee, Jean S. Campbell, Role of cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma, Journal of Hepatology vol. 61, p.432-434, 2014

20. M. Zippi, G. De Toma, G. Minervini, C. Cassieri, R. Pica, D. Colarusso, S. Stock, P. Crispino, Desmoplasia Influenced Recurrence of Disease and Mortality in Stage III Colorectal Cancer within Five Years after Surgery and Adjuvant Therapy. Saudi Journal of Gastroenterology, Volume 23, Number 1, p. 39-44, 2016

21. O. Koperek, C. Scheuba, M. Cherenko, N. Neuhold, C. De Micco, K. W. Schmid, B. Niederle & K. Kaserer, Desmoplasia in medullary thyroid carcinoma: a reliable indicator of metastatic potential. Histopathology, 52, p. 623–630, 2008

22. B. Elenbaas, R. A. Weinberg, Heterotypic signaling between Epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Ideal library journals, Experimental cell research 264, p. 169-184, 2001

23. T. Marsh, K. Pietras, S. S. McAllister, Fibroblasts as architects of cancer pathogenesis. Biochimica et Biophysica Acta 1832 (2013) 1070–1078

24. M. Schober, R. Jesenofsky, R. Faissner, C. Weidenauer, W. Hagmann, P. Michl, R. L. Heuchel, S. L. Haas and J. M. Löhr. Desmoplasia and Chemoresistance in Pancreatic Cancer. Cancers — Open Access Oncology Journal, 6, p. 2137-2154, 2014

25. A. M. Hammer, G. M. Sizemore, V. C. Shukla, A. Avendano, S. T. Sizemore, J. J. Chang, R. D. Kladney, M. C. Cuitino, K. A. Thies, Q. Verfurth, A. Chakravarti, L. D. Yee, G. Leone, J. W. Song, S. N. Ghadiali and M. C. Ostrowski, Stromal PDGFR-α activation enchances matrix stiffness, impedes mammary ductal development and accelerates tumor growth. Neoplasia. vol 6, p. 496-508, 2017

35 26. A. Caporale, S. A. Bonapasta, M. Scarpini, A. Ciardi, A. Vestri, M. Ruperto, and A. Giuliani, Quantitative Investigation of Desmoplasia as a Prognostic Indicator in Colorectal Cancer. Journal of Investigative Surgery, 23, p. 105–109, 2010