LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Viktor Skorobogatko
ATSPARIŲ ANTIBIOTIKAMS BAKTERIJŲ PAPLITIMAS
TVENKINIUOSE AUGINAMOSE ŽUVYSE
PREVALENCE OF ANTIBIOTIC RESISTANT BACTERIA IN
FISH FROM FARMING PONDS
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: lekt. Lina Merkevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Atsparių antibiotikams bakterijų paplitimas tvenkiniuose auginamose žuvyse“.
1. Yra atliktas mano paties;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė)
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPOS ...6
ĮVADAS ...8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...10
1.1. Bakterijų atsparumas antibiotikams... 10
1.1.1 Pagrindiniai bakterijų atsparumo mechanizmai... 10
1.1.2 Bakterijų atsparumas antibiotikams skirtingose pasaulio šalyse ... 11
1.2 Bakterijų atsparumas antibiotikams gyvūnų pasaulyje... 12
1.3 Bakterijų atsparumas antibiotikams maisto pramonėje ... 13
1.4 Bakterijų atsparumas antibiotikams vandens telkiniuose ... 14
1.5 Antibiotikams atsparių bakterijų išskirtų iš žuvų rūšinė įvairovė ir jų keliami pavojai ... 15
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ...17
2.1 Tyrimo vieta ir objektai ... 17
2.2 Medžiagos paėmimas ir pristatymas į laboratoriją ... 18
2.3 Bakterijų išskyrimas. Sėjimas į mitybines terpes ... 18
2.4 Išskirtų bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymas ... 19
2.4.1 Kokybinis jautrumo tyrimo metodas ... 19
2.4.2 Kiekybinis jautrumo tyrimo metodas ... 22
2.5 Išskirtų padermių paruošimas molekuliniams tyrimams ... 23
2.6 Molekuliniai tyrimai ... 23
2.7 Tyrimų duomenų statistinis vertinimas ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI...25
3.1 Bakterijų išskirtų iš pramoniniuose ir natūraliuose vandens telkinuose auginamų žuvų rūšinė įvairovė ... 25
3.2 Pramoniniuose ir natūraliuose vandens telkiniuose žuvis kontaminuojančių bakterijų jautrumas ir atsparumas antibiotikams ... 30
3.2.1 Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramneigiamų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 31
3.2.2 Enterobakterijų išskirtų iš tvenkininių žuvų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms . 32 3.2.3 Pseudomonas spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 33
3.2.4. Chryseobacterium spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 34
3.2.5 Aeromonas spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 35
3.2.6. Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramteigiamų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 36
3.2.7. Iš natūralių tvenkinių žuvų išskirtų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 37
4. REZULTATŲ APTARIMAS...38
IŠVADOS ...41
4 SANTRAUKA
Atsparių antibiotikams bakterijų paplitimas tvenkiniuose auginamose žuvyse Viktor Skorobogatko
Magistro baigiamasis darbas
Darbas parengtas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute.
Darbo apimtis: 45 puslapiai, 9 lentelės, 17 paveikslų, panaudota 50 literatūros šaltinių.
Bakterijų atsparumas antibiotikams – pakankamai nauja, bet jau daug žalos sukėlusi problema Lietuvos, bei kitų pasaulio šalių akvakultūroje.. Tvenkinių vanduo dažnai tikrinamas siekiant nustatyti patogeninių mikroorganizmų įvairovę bei koncentraciją, tačiau duomenų, dėl potencialiai pavojingų žmogaus sveikatai bakterijų atsparumo antibiotikams paplitimo, mes neturime.
Tyrimo metu iš skirtingų Lietuvos pramoninių tvenkinių buvo surinkti 28 žuvų mėginiai iš kurių buvo išskirtos 196 atsparios bent vienam antibiotikui padermės, 123 iš kurių buvo atrinktos tolimesniems tyrimams. Papildomai iš 33 natūralių vandens telkinių žuvų išskirtos 100 skirtingų padermių, iš kurių tyrimams atrinktos 31 bakterijų padermės. Tyrimo metu sekoskaitos būdu buvo identifikuotos tokios bakterijų padermės: iš pramoninių tvenkinių dažniausiai buvo išskirtos Pseudomonas spp. 55,4 proc., Aeromonas spp. 11,4 proc., Chyseobacterium spp. 11,4 proc, o iš natūralių vandens telkinių – Aeromonas spp. 25,8 proc., Pseudomonas spp. 16,1 proc.
Kokybiniu metodu (Kirby – Bauer) nustatytas padermių atsparumas septyniems antibiotikams. Kiekybiniu metodu nustatyta mažiausioji slopinančioji antibiotiko koncentracija (MSK), kurioje tiriamų padermių augimas sustabdomas. Nustatytas bakterijų iš pramoninių tvenkinių žuvų atsparumas: gramteigiamos bakterijos - tetraciklinui 57,1 proc., penicilinui 56,8 proc., ciprofloksacinui ir gentamicinui po 42,8 proc.; Pseudomonas spp. - piperacilinui, piperacilinui/tazobaktamui ir tobramicinui po 100 proc., tikarcilinui su klavulano rūgščiai 98,1 proc., ampicilinams ir cefuroksimui po 96,2, ampicilinui sulbaktamui 92,4 proc., aztreonamui 90,7 proc.; Aeromonas spp. - ampicilinams 81,8 proc., ampicilinui ir sulbaktamui 72,7 proc., tikarcilino klavulanatui 72,7 proc.; Chyseobacterium spp. - aztreonamui 100 proc., cefazolinui 84,6 proc., ampicilinams ir ampicilinui/sulbaktamui po 84,6 proc. Iš natūralių vandens tvenkinių išskirtų padermių - ampicilinui 100 proc., cefpodoksimui 46,3 proc., imipinemui 43,9 proc., chloramfenikoliui 36,5 proc. Rezultatai interpretuoti pagal CLSI ir EUCAST rekomendacijas įvertinant klinikinius lūžio taškus.
Remiantis atlikto tyrimo duomenimis galima teigti, kad atsparumas antibiotikams yra paplitęs bakterijose išskirtose iš žuvų skirtinguose Lietuvos vandens tvenkiniuose.
Raktažodžiai: akvakultūra, antibiotikai, antibiotinis atsparumas, Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Chryseobacterium spp.
5 SUMMARY
Prevalence of antibiotic resistant bacteria in fish from farming ponds Viktor Skorobogatko
Master‘s Thesis
The master‘s thesis was made at the Institute of Microbiology and Virology of the Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences.
Scope of work: 45 pages, 9 tables, 17 pictures, 50 references used.
Antibiotic resistance in bacteria is a relatively new problem that has caused a lot of damage in the aquaculture of Lithuania and other countries. There are no certain studies in this field in Lithuania. Tank water is often tested for the purpose of determining the diversity and concentration of pathogenic microorganisms, but there is no data on antibiotic resistance in bacteria that are potentially infectious to human health.
In the study, 28 fish samples were collected from different industrial ponds in Lithuania, out of which 196 strains were resistant to at least one antibiotic, 123 of which were selected for further studies. In addition, 100 different strains were isolated from 33 natural water fish, of which 31 strains of bacteria were selected for future research. The following bacterial strains were identified in the study by isolation and sequencing the most commonly: from industrial ponds - Pseudomonas spp. (55.4%), Aeromonas spp. (11.4%), Chyseobacterium spp. (11.4 %). From natural water ponds - Aeromonas spp. (25.8%) and Pseudomonas spp. (16.1%)
The qualitative method (Kirby-Bauer) determined the resistance of the strains to seven antibiotics. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC), in which the growth of the strains stops, was examined by a quantitative method. Was determined the resistance of gram-positive bacteria from industrial ponds to these different antibiotics - 57.1% of bacteria to tetracycline, 56.8% to penicillin, 42.8% to ciprofloxacin and gentamicin. Pseudomonas spp. - to piperacillin, piperacillin / tazobactam and tobramycin (100%), ticarcillin with clavulanic acid (98.1%), ampicillin and cefuroxime (96.2%), ampicillin sulbactam (92.4%), aztreonam (90.7%). Aeromonas spp. – to ampicillins (81.8%) and ampicillin sulbactam (72.7%), ticarcillin clavulanate (72.7%). Chyseobacterium spp. – to aztreonam (100%), cefazolin (84.6%), ampicillin and ampicillin sulbactam (84.6%). Bacteria from natural water ponds – to ampicillin (100%), cefpodoxime (46.3%), imipinem (43.9%), chloramphenicol (36, 5%). Results were interpreted according to the CLSI and EUCAST breakpoint guidelines.
According to the results of the study, it can be stated that the resistance to antibiotics is common in bacterial fish isolates from different Lithuanian water ponds.
Key words: aquaculture, antibiotics, antibiotical resistance, Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Chryseobacterium spp.
6
SANTRUMPOS
A/S – ampicilinas/sulbaktamas AMI – amikacinas AMP – ampicilinas AXO – ceftriaksonas AZT – aztreonamas C – chloramfenikolis CIP – ciprofloksacinasCLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas CN ir GEN – gentamicinas
DNR – dezoksiribonukleino rūgštis
EUCAST – Europos jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimų komitetas FAZ – cefazolinas FEP – cefepimas FOX – cefoksitinas FUR – cefuroksimas GAT – gatifloksacinas IMI – imipenemas LEVO – levofloksacinas LZD – linezolidas MERO – meropenemas
MHA – Mueller Hinton agaras
MSK ir MIC - mažiausioji slopinančioji antibiotiko koncentracija NIT – nitrofuratoinas
OXA – oksacilinas + 2%NaCl P/T – piperacilinas/tazobaktamas PEN – penicilinas
PGR – polimerazės grandininė reakcija PIP – piperacilinas
POD ir PX – cefpodoksimas
PSO - Pasaulio sveikatos organizacija RIF – rifampinas
SXT – trimetoprimas/sulfametoksazolis TAZ – ceftazidimas
7 TE – tetraciklinas
TIM – tikarcilinas/klavulano rūgštis VAN – vankomicinas
8
ĮVADAS
Per pastarąjį dešimtmetį visame pasaulyje buvo pripažintas atsparumo antibiotikams padidėjimas, o klinikinėje praktikoje buvo pastebėtas dažnesnis izoliatų atsparumas daugeliui vaistų. Be to, terminas "ekstremalus atsparumas vaistui" buvo taikomas tiems izoliatams, kuriems nėra jokių gydymo galimybių (1).
Veterinarijoje antibiotikų naudojimas apima naminius, ūkinius ir akvakultūros gyvūnus. Akvakultūra – viena iš 4 pagrindinių žuvininkystės sektoriaus šakų, turinti ekonominės, socialinės, rekreacinės ir netgi aplinkosauginės reikšmės, padedanti plėsti žuvų asortimentą. Lietuvoje labiausiai vystoma tvenkininė akvakultūra. Daugelis įmonių realizuoja šviežią produkciją gyvų žuvų pavidalu. Pramoniniu būdu auginant žuvis, užkrečiamų ligų kontrolei yra naudojami antibiotikai.
Ūkiniams gyvūnams antibiotikai naudojami gydymui ir profilaktikai, augimo ir penėjimo efektyvumui didinti. Pagrindinės užkrečiamos ligos yra enterinės ir plaučių infekcijos, odos ir organų abscesai bei mastitas. Veterinarinėje ir žmonių medicinoje yra naudojami šie antibiotikai: penicilinai, cefalosporinai, tetraciklinai, chloramfenikoliai, aminoglikozidai, spektinomicinas, linkozamidas, makrolidai, nitrofuranai, nitroimidazoliai, sulfonamidai, trimetoprimas, polimiksinai ir chinolonai. Iš daugiau nei 1 milijono tonų antibiotikų, išleistų į biosferą per pastaruosius 50 metų, apskaičiuota, kad maždaug 50 proc. antibiotikų patenka į veterinarijos ir žemės ūkio sritis (2).
Antibiotikams atsparūs organizmai į aplinkos vandenis patenka iš žmonių ir gyvūninės kilmės šaltinių. Šios bakterijos gali platinti savo genus į vietinius vandenų mikrobus, kurie taip pat turi savo atsparumo genus. Kita vertus, daug antibiotikų, kurie cirkuliuoja vandenyje yra pramoninės kilmės ir jie potencialiai gali sukelti pokyčius mikrobų ekosistemose. Yra pradedamos diskusijos apie antibiotikų ir jiems atsparių bakterijų vandenyje rizikos įvertinimo protokolus, kurie būtų paremti geresnėmis antibiotikų nustatymo ir antibiotikų atsparumo mikrobų šaltinio sekimo sistemomis (3).
Aeromonas spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp. ir Flavobacterium spp. šeimų bakterijos, dėl jų sukeliamų ligų, yra tikras iššūkis žuvininkystės ūkiams. Tradicinėje sausumos gyvulininkystės produkcijoje, daugumoje šalių yra įregistruotas asortimentas antibiotikų, skirtų bakterijų sukeliamų ligų kontrolei, tačiau dėl susirūpinimo dėl jų poveikio žmonių sveikatai, kai kuriose šalyse jau nebeleidžiama registruoti produktų ne terapiniais tikslais, tokiais kaip augimo skatinimas (4).
Yra stiprių epidemiologinių ir molekulinių įrodymų, rodančių, kad žuvų patogenai, tokie kaip Aeromonas spp., gali perduoti ir dalytis determinantais antibiotikų atsparumui su tokiais patogenais, kaip iš žmonių išskirtos Escherichia coli bakterijos (5).
9 Dėl pernelyg didelio antibiotikų panaudojimo pramoninėje akvakultūroje buvo sukelta kita problema - antibiotikų liekanos komercinių žuvų ir vėžiagyvių produktuose. Ši problema sukėlė nepastebėtą žuvų vartotojų antibiotikų suvartojimą, kuris galėjo sukelti potencialų jų normalios floros pokytį ir padidinti jų jautrumą bakterinėms infekcijoms ir antibiotikams atsparių bakterijų pasirinkimą (5).
Darbo tikslas: Išskirti antibiotikams atsparias bakterijas ir nustatyti jų rūšinę sudėtį iš tvenkiniuose auginamų žuvų.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti antibiotikams atsparias bakterijas iš tvenkiniuose auginamų žuvų.
2. Nustatyti išskirtų bakterijų rūšinę sudėtį pritaikant optimalius identifikacijos metodus. 3. Nustatyti išskirtų bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bakterijų atsparumas antibiotikams
1.1.1 Pagrindiniai bakterijų atsparumo mechanizmaiPer pastarąjį dešimtmetį įvairiose pagrindinėse organizacijose, įskaitant Amerikos užkrečiamųjų ligų draugiją, Ligų kontrolės ir prevencijos centrus, Pasaulio sveikatos organizaciją (PSO) ir Pasaulio ekonomikos forumą, buvo skirtas ypatingas dėmesys temai apie atsparumą antibiotikams. PSO paskelbė, kad problema kelia grėsmę šiuolaikinės medicinos pasiekimams. Post-antibiotikų era, kurioje gali paprasta infekcija arba smulkios traumos pasibaigti mirtimi, yra labai didelė problema XXI amžiuje (6).
Atsparumas antibiotikams yra plačiai paplitęs mikrobų karalystėje ir gerai aprašytas įvairiose komensalinėse ir patogeninėse bakterijose. Tyrimai apie antibiotikų veikimo ir atsparumo procesus papildė žinias apie ląstelių struktūras ir jų funkcijas. Atsparumas gali būti platinamas vienu ar keliais skirtingais genų perdavimo mechanizmais. Reikėtų išskirti keletą atsparumo tipų, parodančių sunkumus išlaikant veiksmingą antibiotikų aktyvumą, atsižvelgiant į genetinį ir biocheminį bakterijų lankstumą (7).
Nuo 1937 metų, kai buvo įvesti sulfonamidai - pirmosios veiksmingos antimikrobinės medžiagos, specifinių atsparumo mechanizmų atsiradimas trukdė jų terapiniam naudojimui. Iš pradžių atsparumas sulfonamidui buvo užfiksuotas 1930-ųjų pabaigoje, tie patys mechanizmai veikia praėjus ir 70 metų. Peniciliną atrado Aleksandras Flemingas 1928 metais, o 1940 metais kelerius metus prieš penicilino įvedimą kaip terapinės antimikrobinės medžiagos, net du penicilinų tyrimų grupės nariai atrado bakterijų penicilinazę. Šiais laikais bakterinės penicilinazės nustatymas prieš vartojant antibiotiką gali būti labai vertingas atsižvelgiant į naujus duomenis apie tai, kad daugybė antibiotikų atsparumo genų yra natūralių mikrobų populiacijų sudedamosios dalys (7).
Kad taptų atsparios antimikrobinėms medžiagoms bakterijos naudoja skirtingus mechanizmus, įskaitant natūralias ir inžinerines strategijas (8). Į natūralų atsako būdą įeina kitų bakterijų atsparių genų naudojimas, genų variacija arba kitaip mutacija ankstesniuose genuose arba įgytuose genuose. Kai kurioms iš šių strategijų reikalingi inžineriniai procesai, kuriuose dalyvauja skirtingos genetinės platformos, naudojamos svetimų atsparumo genų mobilizavimui, įsigijimui ir surinkimui. Be šių mechanizmų, bakterijų augimas bioplevelėse taip pat gali padidinti atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, tai yra vadinama fiziologiniu atsaku (9).
Yra keturios pagrindinės genetinės grupės, kuriose atsiranda atsparumas antibiotikams. Pirmą grupę sudaro žmogaus ir gyvūnų mikrobiota, kurią sudaro daugiau kaip 500 bakterijų. Antra grupė apima ligonines, ilgalaikes priežiūros įstaigas, ūkius ar bet kurią kitą vietą, kurioje gali vykti
11 bakterijų perdavimas. Trečią grupę sudaro nuotekos ir kiti biologiniai likučiai, įskaitant lagūnas, nuotekų valymo įrenginius ar kompostuojančius tualetus, kuriuose daugelio skirtingų individų bakterijų organizmai turi galimybę maišytis ir genetiškai reaguoti vieni su kitais. Ketvirta grupė yra dirvožemis ir paviršiaus ar gruntiniai vandenys, kur iš ankstesnių grupių kilę mikroorganizmai turi kontaktą su aplinkos organizmais. Vanduo yra svarbus veiksnys visuose keturiuose genetinėse grupėse. Galimybė sumažinti atsparumo antibiotikams vystymąsi priklauso nuo žmonių gebėjimo kontroliuoti aktyvių antimikrobinių medžiagų, bakterijų klonų ir genetiškai pagrįstos biologinės informacijos srautą kartu su šiomis genetinėmis grupėmis (10).
Bakterijos gali turėti įgimtą arba įgytą atsparumą vienai ar kelioms antimikrobinių medžiagų grupėms. Įgytas atsparumas atsiranda dėl chromosomų mutacijų, sukeliančių kryžminį atsparumą, taip pat dėl genų konjugacijos arba transformacijos plazmidžių dėka iš vienos bakterijos kitai, transpozonus, integronus arba bakteriofagus. Kai atsparumo veiksniai yra plazmidėse, jie greitai paplinta tarp genų net ir nesusijusiose bakterijose. Kai atsparumas yra susijęs su genais chromosomose, atsparūs mikroorganizmai pasklinda lėčiau (11, 12). Kai bakterija gauna atsparių genų, kad apsisaugotų nuo įvairių antimikrobinių medžiagų, bakterijos gali naudoti keletą biocheminių atsparumo mechanizmų tipų: antibiotikų inaktyvaciją, tai yra interferenciją su ląstelių sienelių sinteze, pvz., atsparumas Β-laktamams ir glikopeptidams; tikslinė modifikacija, kitaip vadinama baltymų sintezės slopinimu, pvz., atsparumas makrolidams ir tetraciklinams; nukleino rūgščių sintezės trikdymas, pvz., atsparumas fluorchinolonams ir rifampinui. Sekantis naudojamas mechanizmas yra pralaidumo pakeitimas - išorinės membranos pokyčiai, pvz., atsparumas aminoglikozidams; nauji membranų transporteriai, pvz., atsparumas chloramfenikoliui; metabolinio kelio slopinimas, pvz., atsparumas trimetoprimasulfametoksazolui (13).
Bakterijų atsparumas antibiotikams yra natūralus reiškinys, o bakterijos vystėsi pasipriešinant natūraliam antimikrobinių medžiagų poveikiui per milijardus metų. Šiais laikais atsparumo atsiradimo ir pasipriešinimo mechanizmų tyrimai turi būti privalomi ankstyvame vaistų kūrimo etape. Žinios apie įmanomo atsparumo atsiradimą ir mechanizmą, galimą sąveiką tarp skirtingų antimikrobinių medžiagų derinių gali padėti sumažinti atsparumo atsiradimą dabartiniams ir naujiems antibiotikams ir padidinti jų efektyvumą (14).
1.1.2 Bakterijų atsparumas antibiotikams skirtingose pasaulio šalyse
Išsivysčiusiuose šalyse, kuriose aukštas gyvenimo lygis - didelis antibiotikų kiekio vartojimo ligoninėse, bendruomenėje ir žemės ūkyje lygis, kasdien atsiranda vis naujesnės bakterijų padermės, pasižyminčios multi-rezistentiškumu. Tai priverčia palaipsniui pereiti prie brangesnių ir plačiau vartojamų - naudojamų antibiotikų (15).
Ekonominė ir žmogiškoji atsparumo antibiotikams kaina jau yra pernelyg didžiulė. Pavyzdžiui, 2007 m. Europoje infekcijų, kurias sukėlė daugeliui vaistinių preparatų atsparios
12 bakterijos skaičius, buvo 400 000, o mirčių skaičius buvo 25 000 (16). Dėl antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų, Jungtinės Amerikos Valstijos kasmet duoda papildomai 20 milijardų dolerių sveikatos priežiūros išlaidoms ir 35 milijardus dolerių visuomenės sveikatos išlaidoms (17).
Išaugo vankomicinui atsparių enterokokų atsiradimas JAV ir kai kuriose Europos šalyse per pastaruosius 5 metus. Izoliatai iš JAV buvo žymiai atsparesni vankomicinui, palyginant su pacientais iš kitų geografinių regionų. Nustatyta, kad maždaug 25 proc. enterokokines infekcijas, sukeliančios bakterijų padermės išskirtos intensyviosios terapijos skyriuje yra atsparios vankomicinui (18). Vankomicinui atsparios infekcijos taip pat siejamos su papildomu sergamumu ir mirtingumu, ypač pas pacientus, turinčius pavojingų sveikatos rizikos veiksnių dėl sumažėjusio kiekio alternatyvių gydymo metodų (19).
Pietryčių Azijos regione dar nebuvo imtasi sisteminių pastangų rinkti duomenis apie antimikrobinio atsparumo epidemiologiją. Tačiau informacija ir duomenys apie pasirinktas ligas ir organizmus rodo, kad antimikrobinis atsparumas yra sparčiai auganti ir dažnai pamirštama problema (20). Kinija - išskirtinė situacija. Šalis paruošė gerus skiriamuosius pasipriešinimo modelius ir suderintas atsakas galėtų iš esmės padėti kontroliuoti atsparumo plitimą, bet dėl gamybos masto, problema nekontroliuojama (21).
Informacija apie realųjį antibiotikų atsparumo problemos mastą Afrikos regione yra ribota, nes atsparumo vaistams stebėjimas atliekamas tik keliose šalyse. Taip pat trūksta informacijos apie daugelį įprastų ir rimtų infekcinių ligų, tokių kaip meningitas, pneumonija ir krauju plintančios infekcijos (20).
Daugelyje besivystančių šalių antibiotikų vartojimas/naudojimas yra gana nekontroliuojamas. Paprastai antimikrobiniai preparatai šiose šalyse yra palyginti nebrangūs (22).
Nepaisant riboto laboratorinio pajėgumo kontroliuoti antibiotinį atsparumą, turimi duomenys rodo, kad Afrikos regionas turi tendenciją rezistentiškumui vystytis. Išskirtos kelios multi-rezistentiškos bakterijos, kurios gali būti užkrečiamos ne tik ligoninėse, bet ir bendruomenėje (20).
1.2Bakterijų atsparumas antibiotikams gyvūnų pasaulyje
Laukiniai gyvūnai – vienas iš atsparumo antibiotikams lemiančių genų plitimo biologinių mechanizmų. Žmogaus veiklos sąsajos su laukine fauna įtakoja žinduolių, tankiai gyvenančiu apgyvendintose bakterijomis buveinėse, žarnyno bakterijų atsparumą antibiotikams.
90 proc. bakterijų izoliatų iš pelių, tirtu Anglijos provincinėje dalyje, buvo atsparūs β-laktaminiams antibiotikams (23). Priešingai, Suomijos laukinių briedžių ir elnių išmatose aptiktos enterobakterijos nepasižymėjo atsparumu (24). Atsižvelgiant į tai kad Suomijoje yra mažiau gyventojų nei Anglijoje, galima teigti, kad tyrimų rezultatams galėjo turėti įtakos ir žmogaus veikla, nors kiti veiksniai įtakojantys atsparumą negali būti atmetami. Taip pat E. coli izoliatų tyrimas iš
13 laukinių gyvūnų Meksikoje ir Australijoje nustatė didesnį atsparumo antibiotikams laipsnį Meksikoje (25). Pasak, straipsnio autoriaus, tai yra siejama su demografijos rodikliais šalyse ir blogai kontroliuojamu antibiotikų naudojimu Meksikoje. Kitas tyrimas rodo panašią asociaciją, Afrikos babuinai ir beždžionės, kurios kontaktuoja su žmonėmis, turi daugiau antibiotikams atsparių enterinių bakterijų nei tos, kurios gyvena srityse nutolusiose nuo žmogaus (26).
Laukiniai paukščiai – rezervuaras antibiotikams atsparioms bakterijoms, kurios gali būti platinamos ilgu nuotoliu. Paukščiai ir ypač migruojantys vandens paukščiai gali keliauti dideliais atstumais ir gyventi įvairiose aplinkose - nuo žemės ūkio lagūnų iki nutolusių kalnų ežerų, pakeliui platindami antibiotikams atsparias bakterijas. Sąsajos su žmogaus veikla padidina antibiotikams atsparių bakterijų skaičių. Žuvėdrų ir žąsų lizduose aptiktuose šalia atliekų ir žemės ūkio tvenkinių daugiau atsparių E. coli bakterijų, negu lizduose šalia neužterštų vandens tvenkinių (27, 28). Atrodo, kad antibiotikai taip pat veikia atsparumą migruojančių paukščių populiacijose: arktiniuose paukščiuose nustatyta, kad 8 proc. E. coli izoliatų yra atsparūs bent vienam iš 17 ištirtų antibiotikų ir 4 izoliatai yra atsparūs 4 ar daugiau antibiotikams. Vienas izoliatas, panašus į klinikinę padermę buvo atsparus cefadroksilui, cefuroksimui ir cefpodoksimui. Daug paukščių veisiasi Arktikoje ir migruoja į visus šešis žemynus, tai iliustruoja didelius geografinius atstumus, kuriuos gali keliauti bakterijos su atspariais antibiotikams genai (29).
2007 metais skirtinguose Lietuvos regionuose buvo paimti mėginiai iš sergančių ir nugaišusių paukščių siekiant išskirti atsparias antibiotikams E.coli padermes. E. coli, išskirtos iš naminių paukščių patologinės medžiagos, buvo labai atsparios įvairioms antimikrobinėms medžiagoms, ypač tetraciklinams, cefalotinui, ampicilinui ir nalidikso rūgščiai (30).
1.3 Bakterijų atsparumas antibiotikams maisto pramonėje
Tiek išsivysčiusiose, tiek besivystančiose šalyse antibiotikai plačiai naudojami kaip ūkinių gyvūnų auginimo papildai (31, 32). Apskaičiuota, kad 80 proc. JAV parduodamų antibiotikų yra naudojami gyvūnams, visų pirma siekiant skatinti augimą, bei infekcijų prevencijai (29). Yra manoma, kad gyvūnų gydymas antimikrobinėmis medžiagomis gerina jų bendrą sveikatą, gamina aukštesnės kokybės ir didesnį produkcijos kiekį (33).
Ūkiniuose gyvūnuose naudojami antibiotikai yra suvartojami žmonių, kai jie valgo gyvūninės kilmės maistą. Atsparių bakterijų perdavimas iš ūkio gyvūnų žmonėms pirmą kartą buvo pastebėtas daugiau nei prieš 40 metų, kai buvo atrasti aukšti atsparumo rodikliai abiejų, gyvūnų bei ūkininkų, žarnyno mikrofloroje (32). Pastaraisiais metais molekulinio aptikimo metodai parodė, kad atsparios bakterijos iš ūkiuose auginamų gyvūnų mėsos produktų pasiekia vartotojus (32). Tai įvyksta keliais būdais:
14 1) antibiotikų vartojimas gyvūnams, gaminantiems maistą, žudo arba slopina jautrias bakterijas, leidžiant antibiotikams atsparias bakterijas klestėti;
2) atsparios bakterijos perduodamos žmonėms per maistą;
3) bakterijos gali sukelti žmonių infekcijas, kurios gali sukelti nepageidaujamą poveikį sveikatai (31).
Žemės ūkyje naudojami antibiotikai taip pat veikia aplinkos mikrobiotą. Iki 90 proc. antibiotikų, skirtų gyvūnams, išsiskiria su šlapimu ir išmatomis, po to plačiai pasiskiria su trąšomis, požeminiais vandenimis ir paviršinėmis nuotėkomis (31,32). Be to, tetraciklinais ir streptomicinu yra apipurškiami vaismedžiai, kad jie veiktų kaip pesticidai vakarų ir pietų JAV. Nors toks panaudojimas sudaro mažą bendro antibiotikų naudojimo dalį, tačiau geografinis pasiskirstymas gali būti didelis. Šis naudojimo būdas didina aplinkos mikroorganizmų ekspoziciją augimą slopinantiems vaistams, keisdamas aplinkos ekologiją didinant atsparių mikroorganizmų proporciją jautrių mikroorganizmų atžvilgiu (33).
Antibakterinės higienos arba valymo priemonės taip pat gali prisidėti prie mikroorganizmų atsparumo problemos, nes jos gali riboti vaikų ir suaugusiųjų imunitetą aplinkos antigenams (34). Dėl to pažeidus imuninės sistemos universalumą, gali padidėti sergamumas ir mirtingumas dėl infekcijų, kurios paprastai nebūtų virulentiškos (34).
1.4 Bakterijų atsparumas antibiotikams vandens telkiniuose
Kaip ir sausumos gyvūnų auginimo atveju, antibiotikai taip pat naudojami akvakultūroje, kad kontroliuoti bakterijų sukeliamas ligas. Pagrindinė problema atsiranda, kai šie junginiai yra naudojami reguliariai, net jei nėra jokių akivaizdžių ligų. Platus ir dažnas antibiotikų naudojimas akvakultūroje praeityje sukūrė akvakultūros patogenų atsparumą. Šiuo metu antibiotikai tam tikrais atvejais yra visiškai neefektyvūs gydant bakterijų sukeliamas ligas (35).
Vandens bakterijos vandenyje gali būti vietinės kilmės, arba egzogeninės, tranzitinės ir retkarčiais patenkančios į vandenį iš gyvūnų, augalų ar nuo dirvožemio paviršiaus. Daugiau nei 90 proc. bakterijų padermių, kilusių iš jūros vandens, yra atsparūs daugiau nei vienam antibiotikui, o 20 proc. yra atsparūs mažiausiai penkioms skirtingoms antibiotikų rūšims (36).
Šiuo metu yra rengiamos ir išbandomos priemonės, kuriomis siekiama apsaugoti akvakultūrą nuo patogeninių bakterijų, nenaudojant antimikrobinių medžiagų. Ilgainiui, holistinis požiūris, kuris apima patogeną, šeimininką ir aplinką, turėtų būti veiksmingiausias (35).
Neseniai buvo įrodytas atsparumo antibiotikams genų pasikeitimas tarp bakterijų akvakultūros ir sausumos aplinkose, įskaitant gyvūnų bakterijas ir žmonių patogenus. Egzistuoja stiprūs epidemiologiniai ir molekuliniai įrodymai, rodantys, kad žuvų patogenai, tokie kaip
15 Aeromonas spp., gali perduoti ir dalytis atsparumo antibiotikams veiksniais su tokiomis iš žmonių izoliuotomis bakterijomis, kaip Escherichia coli (37).
Kita problema, kurią sukelia pernelyg didelis antibiotikų naudojimas pramoninėje akvakultūroje, yra antibiotikų liekanų buvimas komercinėse žuvyse. Nepastebimas antibiotikų vartojimas maiste gali sukelti alergines ir toksiškumo problemas, kurias sunku diagnozuoti dėl ankstesnės informacijos trūkumo apie antibiotikų vartojimą (38).
Neapsaugotiems akvakultūros pramonės darbuotojams gali būti sukelta alergija antibiotikams, naudojant didelius kiekius antibiotikų, kurie liečiasi su oda, patenka į žarnyną ir kvėpavimo takus, kai darbuotojai naudoja vaistines medžiagas maiste, maisto gamyklose ar žuvyse (39).
1.5 Antibiotikams atsparių bakterijų išskirtų iš žuvų rūšinė įvairovė ir jų
keliami pavojai
Pseudomonas aeruginosa yra įprasta hospitalinių infekcijų priežastis, įskaitant pneumoniją, kraujotakos, šlapimo takų ir chirurginių vietų infekcijas (40). Daugiau nei 6000 (13 proc.) iš 51 000 su P. aeruginosa sveikatos priežiūros susijusių infekcijų, kurias kasmet patiria JAV, yra keliems antibiotikams atsparūs štamai. Ši infekcija iššaukia beveik 400 mirčių per metus. Kai kurie keliems antibiotikams atparūs P. aeruginosa štamai yra atsparūs beveik visiems antibiotikams, įskaitant aminoglikozidus, cefalosporinus, fluorhinolonus ir karbapenemus (41).
Kalbant apie intrahospitalines infekcijas, Pseudomonas aeruginosa išsivystė iš nudegiminių žaizdų infekcijos į hospitalinę bakteriemiją. Šitoje situacijoje atsparumo antibiotikams mechanizmai išsivystė atsitiktinai, pradėjus taikyti naujus antibiotikų darinius, atrandant efektyviausius gydymo būdus (pvz. laktamus ir aminoglikozidus). Pseudomonas aeruginosa kelią didelį nerimą pacientams, sergantiems cistine fibroze; patogenas yra labai patvarus ir gali išvengti žmogaus imuninės sistemos apsaugos mechanizmų. Atsparumo atsiradimas yra susijęs su cistine fibroze sergančių pacientų ilgu gydymo antibiotikais kursu (7).
Chryseobacterium rūšys yra gramneigiamos bakterijos, plačiai paplitusios dirvožemyje ir vandenyje. Ligoninės aplinkoje šios bakterijos buvo išgaunamos iš vandens sistemų ir drėgnų paviršių. Chryseobacterium indologenes yra nebūdingas žmonių patogenas.
Keletas Flavobacteriaceae rūšių, įskaitant Chryseobacterium indologenes, yra natūraliai atsparūs laktaminiams antibiotikams (įskaitant karbapenemus) dėl pastovios MBL (metalo β-laktamazė) gamybos. Ši bakterija jautri piperacilinui ir tazobaktamui ir atspari norfloksacinui, ciprofloksacinui, ceftazidimui, cefotaksimui, imipenemui, aztreonamui, gentamicinui, amikacinui, tobramicinui, kolistinui ir polimiksinui. Metalo β-laktamazė buvo nustatyta dvigubo disko
16 sinergijos metodu, naudojant imipenemą ir imipenemą su EDTA. Taip pat buvo nustatytas jautrumas vankomicinui (42).
C. indologenes gali sukelti įvairių tipų infekcijas, tokias kaip bakteremija, pneumonija, meningitas ir dirbtinio šunto infekcija. Chryseobacterium spp. pasižymi atsparumu aminoglikozidams, tetraciklinams, chloramfenikolui, eritromicinui, klindamicinui ir teicoplaninui. Dauguma Chryseobacterium izoliatų taip pat yra atsparūs kolistinui (43).
Aeromonas spp. - tai gramneigiami aerobai ir fakultatyvus anaerobai. Tai oksidazei teigiamos judrios bakterijos, kurios gyvena vandens aplinkoje ir sveikų žuvų virškinamajame trakte. Aeromonas yra visur vandenyje, gali formuoti bioplėveles ir vėliau kolonizuoti vandens sistemas (44). Heterotrofinų plokštelių skaičiaus nustatymo testu buvo apskaičiuota, kad Aeromonas gali sudaryti 1-27% visų galutinių geriamojo vandens mėginių bakterijų, galinčių geriamąjį vandenį paversti galimu infekcijos šaltiniu (45). Su Aeromonas bakterijomis gastroenterito susijusių atvejų skaičius vasaros mėnesiais didėja, šis rezultatas turi tiesioginę koreliaciją su padidėjusiu Aeromonas skaičiumi vandens sistemose. Aeromonas sp. buvo apibūdintas kaip įvairių infekcijų sukėlėjas, o dažniausiai susijusi liga yra gastroenteritas. Kai kuriais atvejais užsikrėtus šia bakterija gali išsivystyti infekcija, sukelianti peritonitą, kolitą ir cholangitą. Antrasis labiausiai paplitęs infekcijos tipas, susijęs su Aeromonas bakterijomis, yra žaizdų infekcijos. Aeromonas spp sukeltos žaizdų infekcijos paprastai atsiranda sveikiems žmonėms dėl susižalojimo vandenyje arba dirvožemyje, kur yra didelis skaičius Aeromonas bakterijų (46).
17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimo vieta ir objektai
Darbas atliktas 2015-2017 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Mikrobiologijos ir virusologijos institute, Mikrobiologijos tyrimų laboratorijoje (1 pav.). Atliekant šiuos tyrimus buvo prisijungta prie mokslininkų grupės, kurie vykdo nacionalinį projektą „Intensyvaus ūkininkavimo įtaka antibiotikams ir biocidams atsparių bakterijų atsiradimui, išsilaikymui ir plitimui dirvožemyje, bei vandenyje“, kuris yra remiamas Lietuvos mokslo tarybos (projekto numeris SIT-6/2015).
1 pav. Mikrobiologijos tyrimų laboratorija.
Tyrimai buvo atliekami su Lietuvos įvairiose tvenkiniuose paplitusiomis žuvimis. Tiriamoji medžiaga – žuvų mėginiai, buvo renkami iš skirtingų vandens telkinių. Tyrimo metu ištirtos 28 pramoniniu būdu tvenkiniuose auginamos žuvys ir 33 iš natūralių vandenų. Tvenkinių žuvys iš 6 pramoniniu būdu auginimo vietų, o natūralių vandenų iš 5 vietų. Pramoniniu būdu auginamų žuvų mėginiai buvo renkami iš Išlaužo, Bartžuvės, Šalčininkų, Šilavoto, Karpynės, Laukystos tvenkinių. Natūralių šaltinių žuvys pagautos Kuršių mariose, Skriaudžių ežere, Nemune, Dusioje. Tirtų žuvų rūšinė įvairovė pateikta 1 lentelėje.
1 lentelė. Tirtų žuvų rūšinė įvairovė
Žuvų rūšių įvairovė iš pramoninių vandens tvenkinių (n=28)
1. Paprastieji karpiai (Cyprinus carpio)2. Margieji plačiakakčiai (Aristichthys nobilis) 3. Margieji upėtakiai(Salmo trutta fario) 4. Lynai (Tinca tinca)
18
Žuvų rūšių įvairovė iš natūralių vandens tvenkinių (n=33)
1. Stintos(Osmerus eperlanus) 2. Ešeriai(Perca fluviatilis) 3. Kuojos(Rutilus rutilus)
4. Sykas (Coregonus lavaretus holsatus) 5. Srovinė aukšlė (Alburnoides bipunctatus) 6. Lydekos (Esox lucius)
7. Plakiai (Blicca bjoerkna) 8. Strepetys (Leuciscus leuciscus) 9. Šapalas (Leuciscus cephalus) 10. Karšiai (Abramis brama) 11. Ūsorius (Barbus barbus) 12. Žiobris (Vimba vimba) 13. Gružliai (Gobio gobio)
14. Menkė (Gadus morhua)
2.2 Medžiagos paėmimas ir pristatymas į laboratoriją
Kiekvienas žuvies mėginys buvo imamas steriliais vienkartiniais tamponėliais, kurie iš karto po medžiagos paėmimo buvo patalpinami į transportinę TRANSWAB terpę, tuomet sunumeruojamas ir pažymimas vandens telkinys iš kurio žuvis sugauta ar įsigyta. Medžiaga imta iš žiaunų ir kloakos arba skrodimo metu iš žarnų. Mėginiai buvo pristatomi į Mikrobiologijos laboratoriją tą pačią dieną, arba laikomi šaldytuve (+2° - +7° temperatūroje) iki pristatymo.
2.3 Bakterijų išskyrimas. Sėjimas į mitybines terpes
Į Mikrobiologijos laboratoriją pristatyti mėginiai buvo sunumeruojami unikaliu identifikaciniu numeriu pagal kurį galima buvo nustatyti žuvies rūšį, tvenkinio pavadinimą ir mėginio ėmimo būdą. Pagal sunumeruota eiliškumą bakteriologinė medžiaga iš transportinių terpių buvo sėjama į mitybines terpes. Buvo pasirinktos bendro naudojimo Sojos (Liofilchem, Italija) terpė su antibiotiko priedais. Tyrime buvo naudoti šie antibiotikai: ampicilinas, tetraciklinas, gentamicinas, kanamicinas, kolistinas, trimetoprimas/sulfametoksazolis, ciprofloksacinas chloramfenikolis, eritromicinas, vankomicinas, cefaleksinas. Taip pat medžiaga buvo sėjama į selektyvines diferencines terpes: MDR, CxESBL, CxmSCARBA, CRE (E&O Laboratories limited, Škotija). Terpės buvo inkubuojamos termostate (2 pav.) 30 ºC temperatūroje 48 valandos.
19
2 pav. Termostatas (Memmert, Vokietija).
2.4 Išskirtų bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymas
2.4.1 Kokybinis jautrumo tyrimo metodasIšskirtoms bakterijoms iš skirtingų žuvų rūšių buvo atliktas Kirby – Bauer jautrumo antibiotikams tyrimo metodas. Tyrimai atlikti sėjant grynas kultūras į Mueller Hinton agarą (toliau – MHA), (Liofilchem, Italija). Naudotos terpės storis lėkštelėje 4 mm. Vertinant jautrumą antibiotikams buvo paruošiama 0,5 McFarland standarto tankio bakterijų fiziologiniame tirpale, panaudotas McFarland Densitometer analizatorius 3 pav. (Biosan, Olandija). Toliau gauta suspensija tolygiai paskirstoma ant terpės, naudojant sterilias vatines lazdeles ir tolygiai paskirstyta po visą lėkštelės paviršių. Antibiotikų diskams uždėti ant agaro naudojamas specialus dispenseris 4 pav. (Oxoid, Jungtinė Karalystė). Šiuose diskuose esančios antimikrobinių medžiagų koncentracijos parinktos pagal bakterijų jautrumo antibiotikams Klinikinių ir laboratorinių standartų instituto (CLSI) ir Europos jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimų komiteto (EUCAST) rekomendacijas klinikiniams lūžio taškams nustatyti (2-5 lentelės). Terpės su antibiotiniais diskais patalpinamos į termostatą +37° temperatūroje ir po 24 valandų rezultatai vertinami išmatuojant liniuote (su milimetrinemis padalomis) zonas aplink diskus, kuriuose buvo slopinamas bakterijų dauginimasis. Rezultatai vertinami kaip „jautri padermė“, „vidutiniškai jautri padermė“ ir „atspari“ padermė.
20
3 pav. McFarland Densitometer analizatorius (Biosan, Olandija).
4 pav. Dispenseris (Oxoid, Jungtinė Karalystė).
2 lentelė. Naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir atsparumo
Enterobakteriacea spp. interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm) Antimikrobinė medžiaga Koncentracija
diske, μg
Klinikinė reikšmė (CLSI), sterili zona Jautri, ≥ mm Vidut. jautri, mm Atspari, ≤ mm Sulfametoksazolis/trimeto primas 1,25/23, 75 16 11-15 10 Gentamicinas 10 15 13-14 12 Ciprofloksacinas 5 21 16-20 15 Imipinemas 10 23 20-22 19 Aztreonamas 30 21 18-20 17 Ampicilinas 10 17 14-16 13 Tetraciklinas 30 15 12-14 11
21
3 lentelė. Naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir Pseudomonas
spp. atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm)
Antimikrobinė medžiaga Koncentracija diske, μg
Klinikinė reikšmė (EUCAST), sterili zona
Jautri, ≥ mm Vidut. jautri,
mm Atspari, ≤ mm
Aztreonamas 30 50 - 16
Ciprofloksacinas 5 25 - 22
Imipenemas 10 20 - 17
Gentamicinas 10 15 - 15
4 lentelė. Naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir Acinetobacter
spp. atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm) Antimikrobinė medžiaga Koncentracija
diske, μg
Klinikinė reikšmė (CLSI), sterili zona Jautri, ≥ mm Vidut. jautri,
mm Atspari, ≤ mm Sulfametoksazolis/trimeto primas 1,25/23,75 16 11-15 10 Gentamicinas 10 15 13-14 12 Ciprofloksacinas 5 21 16-20 15 Imipinemas 10 22 19-21 18 Tetraciklinas 30 15 12-14 11
5 lentelė. Naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir Aeromonas spp.
atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm) Antimikrobinė medžiaga Koncentracija
diske, μg
Klinikinė reikšmė (CLSI), sterili zona Jautri, ≥ mm Vidut. jautri, mm Atspari, ≤ mm Sulfametoksazolis/trimeto primas 1,25/23,75 16 11-15 10 Gentamicinas 10 15 13-14 12 Ciprofloksacinas 5 21 16-20 15 Imipinemas 10 23 20-22 19 Aztreonamas 30 21 18-20 17 Tetraciklinas 30 15 12-14 11
22 Padermės, atsparios bent vienos klasės antibiotikui, buvo toliau tiriamos nustatant atsparumą antibiotikams serijinių skiedimų metodu. Taip pat šios atrinktos atsparios padermės užšaldytos gilaus šaldymo šaldiklyje ir iš jų paruošta medžiaga molekuliniams tyrimams.
2.4.2 Kiekybinis jautrumo tyrimo metodas
Išskirtoms bakterijoms iš skirtingų žuvų rūšių buvo atliktas MSK – mažiausioji slopinančioji antibiotiko koncentracijos metodas. Tyrimas atliktas panaudojus kompanijos TREK Diagnostic Systems plokštelės „Sensititre“ ir Thermo Scientific kompanijos aparatu ARIS 2X (5 pav.). Antimikrobinio atsparumo tyrimai atlikti vadovaujantis gamintojo aprašytomis metodikomis ir vadovaujantis CLSI standartu. Tyrimui atlikti naudotos plokštelės su skirtingomis įvairių antibiotikų koncentracijomis.
Kiekybiniam gramteigiamų bakterijų jautrumui tirti naudotos antimikrobinės medžiagos ir jų koncentracijų intervalai: eritromicinas 0,25-4 mg/L; klindamicinas 0,12-2 mg/L; kvinupristinas/dalfopristinas 0,12-4 mg/L; daptomicinas 0,5-8 mg/L; vankomicinas 1-128 mg/L; tetraciklinas 2-16 mg/L; ampicilinas 0,12-16 mg/L; gentamicinas 2-16 mg/L ir 500mg/L (enterokokams); levofloksacinas 0,25-8 mg/L; linezolidas 1-8 mg/L; ceftriaksonas 8-64 mg/L; streptomicinas 1000 mg/L (enterokokams); penicilinas 0,06-8 mg/L; rifampinas 0,5-4 mg/L; gatifloksacinas 1-8 mg/L; ciprofloksacinas 0,5-2 mg/L; trimetoprimas/sulfametoksazolis 1/19-4/76 mg/L; oksacilinas 0,25-8 mg/L.
Kiekybiniam gramneigiamų bakterijų jautrumui tirti naudotos antimikrobinės medžiagos ir jų koncentracijų intervalai: amikacinas 8-64 mg/L; ampicilinas 4-32 mg/L; ampicilinas/sulbaktamas 4/2-32/16 mg/L; aztreonamas 4-32 mg/L; cefazolinas 4-32 mg/L; cefepimas 4-32 mg/L; cefalotinas 2-16 mg/L; meropenemas 1-8 mg/L; ertapenemas 2-16 mg/L; cefuroksimas 4-32 mg/L; gentamicinas 2-16 mg/L; ciprofloksacinas 0,5-4 mg/L; piperacilinas/tazobaktamas 6/4-128/4 mg/L; cefoksitinas 4-32 mg/L; trimetoprimas/sulfametoksazolis 0,5/9,5-4/76 mg/L; cefpodoksimas 2-16 mg/L; ceftazidimas 2-32 mg/L; tobramicinas 4-8 mg/L; tigeciklinas 1-8 mg/L; tikarcilinas/klavulano rūgštis 16/2-32/2 mg/L; ceftriaksonas 1-64 mg/L; tetraciklinas 0,5-16 mg/L.
23
5 pav. „Sensititre“ plokštelės (TREK Diagnostic Systems, JAV) ir ARIS 2X (Thermo
Scientific, Jungtinė Karalystė)
2.5 Išskirtų padermių paruošimas molekuliniams tyrimams
Šiame tyrimo etape buvo išskiriamos DNR iš atsparių bakterijų išskirtų iš žuvų. Keletas bakterijų kolonijų augančių standžioje terpėje resuspenduojama 200μl dejonizuoto vandens. Suspensija virinama 5 minutes vandens vonioje, laikoma ant ledo kelias minutes, o po to centrifuguojama 10 000 g greičiu (Thermo Scientific, Jungtinė Karalystė) 6 pav. Supernatantas nutraukiamas ir laikomas šaldiklyje -18ºC.
6 pav. Laboratorinė centrifuga (Thermo Scientific, Jungtinė Karalystė)
2.6 Molekuliniai tyrimai
Molekuliniai tyrimai (polimerazės grandininė reakcija, toliau PGR) panaudoti nustatant bakterijų gentį ar rūšį. PGR atlikti naudoti šiai reakcijai būtini komponentai: polimerazės, magnio jonų tirpalas, deoksinukleotidų mišiniai, atitinkami pradmenys, tiriamųjų bakterijų genominė DNR. Reakcija atlikta (BOECO, Vokietija) termocikleryje.
24
7 pav. Termocikleris (BOECO, Vokietija)
Atlikus PGR, toliau valymas atliekamas su rinkiniu DNA Clean& ConcentratorT M - 25 (Zymo
Research, USA). Kiekvienos bakterijos DNR mėginys užpilamas 500 µlb Binding Buffer ir perpilamas į rinkinyje esančias kolonėles. Po centrifugavimo 30s 15000g greičiu plaunama du kartus su 200 µl DNR Wash Buffer centrifuguojant. Po antro centrifugavimo į kolonėlę lašinama 25 µl švaraus (DNA‘se/RNA/se free) vandens. Po centrifugavimo mėgintuvėlyje esantis skystis užšaldomas. Sekoskaita atlikta ABI3730XL sekų nuskaitymo įrenginiu. Gautos sekos buvo išanalizuotos naudojant kompiuterinę programą „Molecular Evolutionary Genetic Analysis software“ (MEGA, version 7). Bazinių lokalių išsidėstymų įrankio (BLAST) pagalba buvo palygintos sekos su sekomis, esančiomis nacionalinio biotechnologijos informacijos centro (NCBI, JAV) duomenų bazėse esančiomis sekomis. Viso sekvenuota 123 pramoninių tvenkininių žuvų bakterijų DNR – 117 gramneigiamų ir 6 gramteigiamos bei 31 bakterijų iš natūralių vandens telkinių.
2.7 Tyrimų duomenų statistinis vertinimas
Atliekant statistinę analizę buvo iškelti tikslai nustatyti mikroorganizmų paplitimo dažnumą atsižvelgiant į tirtų žuvų grupes. Mikroorganizmų paplitimas palygintas naudojant tikslųjį Fišerio „χ2“ kriterijų.
Tyrimo metu buvo analizuojami išskirtų bakterijų padermių atsparumas ir jautrumas skirtingoms antimikrobinėms medžiagoms. Buvo sudaromi statistiniai modeliai, naudojant lenteles ir diagramas, parodantys tyrimų eigoje gautus rezultatus. Tyrimų rezultatai ir jų statistinės vertės apskaičiuotos „Microsoft Excel 2016 programa“.
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Bakterijų išskirtų iš pramoniniuose ir natūraliuose vandens telkinuose
auginamų žuvų rūšinė įvairovė
Tyrimo metu išskirtos iš pramoninių tvenkinių žuvų atsparios antibiotikams 196 bakterijų padermės. Tolimesniems tyrimams atrinktos 117 gram neigiamos ir 6 gram teigiamos bakterijos ir jos buvo identifikuotos sekoskaitos būdu. Viso sekvenuota 154 bakterijų mėginių iš pramoninių ir natūralių vandens telkinių. Rūšinė visų atrinktų bakterijų įvairovė iš pramoninių vandens telkinių
pavaizduota 6 - 7 lentelėse ir 8 paveiksle.
6 lentelė. Iš pramoninių žuvų išskirtų gram neigiamų bakterijų rūšinis pasiskirstymas.
Gram neigiamų bakterijų įvairovė iš pramoninių tvenkinių žuvų
Izoliatas Kiekis Acinetobacter calcoaceticus 1 Acinetobacter johnsonii 2 Acinetobacter spp. 1 Wautersiella falsenii 1 Kluyvera cryocrescens 2 Citrobacter freundii 2 Citrobacter brakii 1 Chryseobacterium oncorhychi 7 Chryseobacterium carnis 1 Chryseobacterium lathyri 1 Chryseobacterium gambrini 2 Chryseobacterium nahagawai 1 Chryseobacterium ureolyticum 2 Escherichia coli 1 Pseudomonas reactans 1 Pseudomonas azotoformans 5 Hafnia alvei 2 Sphingobacterim spp. 1 Shewanella putrefaciens 2 Shewanella glacialipiscicola 2 Stenotrophomonas maltophia 1 Flavobacterium spp 2 Rahnela aquatillis 1 Myroides 1 Aeromonas australiensis 1 Aeromonas veronii 2
26 Aeromonas sobria 7 Aeromonas salmonici 1 Aeromonas hydrophylla 2 Aeromonas allosacharophilla 1 Pseudomonas grimontii 1 Pseudomonas gessardii 2 Pseudomonas mendocina 1 Pseudomonas fragii 8 Pseudomonas fulva 2 Pseudomonas fluorescens 2 Pseudomonas anquilliseptica 2 Pseudomonas koreensis 1 Pseudomonas spp. 22 Pseudomonas putida 8 Pseudomonas syringae 2 Pseudomonas migulae 1 Pseudomonas jessenii 2 Pseudomonas extremaustralis 2
Pseudomonas simae, antarctica ar salmonii 1
Pseudomonas taiwanensis 1
Halomonas spp. 1
Shewanella spp. 1
Viso : 117
7 lentelė. Iš pramoninių žuvų išskirtų gram neigiamų bakterijų rūšinis pasiskirstymas.
Gram teigiamų bakterijų įvairovė iš pramoninių tvenkinių žuvų
Izoliatas Kiekis Carnobacterium divergens 1 Aerococcus urinaeequi 1 Carnobacterium maltaromaticum 1 Streptococcus parauberis 1 Staphylococcus lentus 1 Microbacterium phyllosphaerae 1 Viso: 6
8 pav. Iš pramoninių žuvų išskirtos antibiotikams atsparios bakterijų gentys ir rūšys (n=123)
Kaip matyti iš 8 paveikslėlyje pateiktos diagramos, iš pramoninių vandens tvenkinių išskirtų bakterijų, dominavo gramneigiamos bakterijos. Dažniausiai vyravo Pseudomonas genčiai priklausančios bakterijos, kurios buvo išskirtos daugiau nei pusėje tyriamų mėginių. Iš pramoninių žuvų išskirtų atsparių antibiotikams gramneigiamų bakterijų, šešiasdešimt keturios identifikuotos kaip Pseudomonas spp.55,6 proc., po keturiolika padermių buvo identifikuotos kaip Aeromonas spp. 11,38 proc. ir Chryseobacterium spp. 11,38 proc. Likusios bakterijų padermės pasitaikė pavienės arba po kelis kartus ir sudarė 21,64 proc.
Tyrime nustatyta šešių rūšių gramteigiamos bakterijos. Rūšinė sudėtis buvo įvairi:, Carnobacterium divergens, Aerococcus urinaeequi, Carnobacterium maltaromaticum, Streptococcus parauberis, Staphylococcus lentus, Microbacterium phyllosphaerae.
Iš natūralių gamtinių vandenų žuvų mėginių išaugo 100 skirtingų bakterijų kolonijų. Po kokybinio atsparumo antibiotikams tyrimo (Kirby-Bauerio metodu), tolimesniems tyrimams atrinkta 29 gramneigiamų ir 2 gramteigiamos bakterijų padermės. Rūšinė visų atrinktų bakterijų įvairovė pateikta 8-9 lentelėse ir 9 paveiksle.
4 14 14 64 2 1 2 1 1 5 1 2 1 1 3 1 2 1 1 1 1 0 10 20 30 40 50 60 70 A c in e to b a c te r sp p . Ae ro m o n a s sp p . C h ry se o b a c te r iu m s p p . P se u d o m o n a s s p p . H a fn ia s p p . E sc h e ri c h ia c o li K lu y v e ra s p p . W a u te rs e ll a f a ls se n ii S p h in g o b a c te ri u m s p p . S h e w a n e ll a sp p . S te n o tr o p o m o n a s sp . F la vo b a c te ri u m s p p . R a h n e la a q a ti li s M y ro id e s C it ro b a c te r g a le n ii H a lo m o n a s sp p . C a rn o b a c te ri u m s p p . Ae ro c o cc u s u ri n a e e q u i M ic ro b a c te r iu m s p . S tr ep to co c c u s p a r a u b e ri s S ta p h y lo c o c c u s le n tu s Rūšių skaičius (vnt.)
28
8 lentelė. Iš natūralių gamtinių vandenų žuvų išskirtų gram neigiamų bakterijų rūšinis
pasiskirstymas
Gram neigiamų bakterijų įvairovė iš natūralių gamtinių vandenų žuvų
Izoliatas Kiekis Rahnella aquatilis 1 Pseudomonas spp. 3 Klebsiella oxytoca 1 Sphingobacterium alimentarium 1 Sphingobacterium sp. 1 Citrobacter gallenii 2 Enterobacter asburiae 1 Bruvendimonas bullata 1 Chryseobacter joostei 1 Chryseobacter spp. 2 Enterobacter asburica 1 Aeromonas rivipollensis 1 Aeromonas sp. 1 Aeromonas cavia 1 Aeromonas veronii 2 Aeromonas media 2 Aeromonas salmonici 1 Myroides odoratimi 1 Pseudomonas fluorescens 1 Pseudomonas monteilli 1 Moellerella wisconsensis 2 Wautersiella falsenii 1 Viso: 29
9 lentelė. Iš natūralių gamtinių vandenų žuvų išskirtų gram teigiamų bakterijų rūšinis
pasiskirstymas
Gram teigiamų bakterijų įvairovė iš natūralių gamtinių vandenų žuvų
Izoliatas Kiekis
Arthrobacter sp. 1
Bacillus subtilis 1
29
9 pav. Iš naturalių gamtinių vandenų žuvų išskirtos antibiotikams atsparios bakterijų gentys ir
rūšys (n=31)
Kaip matome 9 diagramoje - iš natūralių vandenų žuvų išskirtos įvairios bakterijos. Daugiausiai buvo Aeromonas spp. genties bakterijų, viso 8 padermės, kurios buvo išskirtos kas ketvirtame mėginyje ir tai sudarė 25,8 proc. tarp visų izoliatų. Po dvi padermes nustatytos kaip Aeromonas veronii ir Aeromonas media. Taip pat buvo identifikuotos 5 padermės Pseudomonas spp. genties bakterijų 12,9 proc. Trys padermės buvo identifikuotos, kaip Chryseobacterium spp. 9,7 proc. Nustatyta viena Myroides odoratum padermė.
Identifikuotų gramteigiamų izoliatų rūšinė sudėtis - Arthrobacter ir Bacillus genčiai priklausančios bakterijos. 1 3 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 2 1 1 1 0 1 2 3 4 R ahn e ll a a qua ti li s P se udo m ona s s pp. Kl e bs ie la ox yt oc a Sphi ngobac te ri um s p. S. al im e nt ar ium Ci tr oba c te r ga le ni i E nt er oba ct e r as bur iae B ruv e ndi m ona s bul lat a Chr ys eobac te r j oos te i Chr ys eobac te r s pp. E nt er obac te r as bur ic a A e rom ona s r iv ipol le ns is A e rom ona s s p. A e rom on as c av ia A e rom onas v er oni i A e rom onas m e di a A e rom ona s s al m oni ci My roi de s od or at im i P se ud om on as f luo re sc e ns P se ud om on as m on te il li Moe ll er el la wi sc ons ens is Wa ut e rs ie ll a f al se ni i A rt hr oba ct er s p. B ac il lus s ubt il li s Rūšių skaičius (vnt.)
30
3.2 Pramoniniuose ir natūraliuose vandens telkiniuose žuvis kontaminuojančių
bakterijų jautrumas antibiotikams
Bakterijos augusios ant terpių su antibiotikais ir parodžiusios atsparumą Kirby-Bauer metodu analizuotiems antibiotikams (pvz. 10 pav. iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramneigiamų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms), buvo testuotos automatizuotame inkubatoriuje ARIS 2X (JAV).
10 pav. Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramneigiamų bakterijų kokybinis atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms(proc.)
Iš 10 paveikslo galima teigti, kad gramneigiamos bakterijos iš pramoninių tvenkinių žuvų atsparios cefpodoksimui 73,7 proc., sulfametoksazoliui/trimetoprimui 57 proc., cloramfenikoliui 42,1 proc. Vidutinis atsparumo lygis nustatytas tetraciklinui 16,7 proc., gentamicinui 15,8 proc., imipenemui 7,9 proc. ir ciproflokscinui 3,5 proc.
TE CIP C CN PX SXT IMI 0 10 20 30 40 50 60 70 80 16.7 3.5 42.1 15.8 73.7 57 7.9
31 3.2.1 Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramneigiamų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Atliekant kiekybinį jautrumo tyrimą, nustatant MSK buvo gauti rezultatai, kurie pateikti 11 paveiksle.
11 pav. Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramneigiamų bakterijų atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms proc. (n=117)
Remiantis kompiuterine programa SWIN (versija 3.2) buvo gauti rezultatai, kurie parodė bakterijų padidėjusį atsparumą beveik visoms tyrime analizuotoms antimikrobinėms medžiagoms.
11 paveikslo duomenimis, kiekybinis tyrimas parodė, kad pramoninių tvenkinių žuvų bakterijų padermės labai atsparios ampicilinui 82,7 proc., ampicilinui sulbaktamui 76,3 proc., aztreonamui 75,3 proc., cefalosporinams, nitrofurantionui 47,3 proc., sulfametoksazoliui trimetoprimui 33,3 proc.,meropinemui 32,2 proc.,imipinemui 27,9 proc., rečiau atsparios ceftazidimui 15,3 proc. ircefepimui 9,6 proc. Vertinant rezultatus matome, kad tik dalinai atsparumas buvo nustatytas amikacinui 4,4 proc., ciprofloksacinui ir gentamicinui po 5,4 proc., piperacilinui sutazobaktamu 3,3 proc. ir gatifloksacinui 3,2 proc.
Kiekybinio tyrimo metu 10 antimikrobinių medžiagų buvo atsparus Halomonas spp.
5.6 82.7 76.3 75.3 87 9.6 72 78.6 15.1 76.3 77.4 5.4 3.2 5.5 27.932.2 3.3 47.3 11.9 33.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A M I A M P A /S A ZT FA Z FE P FO X P O D T A Z A X O FU R C IP G A T CN IM I M E R O P /T NIT PIP SX T
32 3.2.2 Enterobakterijų išskirtų iš tvenkinių žuvų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Tyrime iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtos enterobakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms pateiktas 12 paveiksle.
12 pav. Kitų enterobakterijų išskirtų iš tvenkininių žuvų atsparumas antimikrobinėms
medžiagoms (proc.)
Kaip matome iš 12 paveikslo, iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtos Enterobacteriacae bakterijos dažniausiai buvo atsparios cefazolinui 92 proc., aztreonamui 76 proc., cefpodoksimui 76 proc., ceftriaksonui ir cefuroksimui po 76 proc., ampicilinams 64 proc., ampicilinui sulbaktamui 48 proc., meropenemui 52 proc., imipinemui 40 proc. Kiekybinis tyrimas parodė, kad mažiau atsparios bakterijų padermės buvo amikacinui, piperacilinui ir gentamicinui po 16 proc., ceftazidimui 12 proc., ciproflokscinui, piperacilinui/tazobaktamui ir nitrofurantoinui - visi po 8 proc.
16 64 48 76 92 20 48 76 12 76 76 8 16 40 52 8 8 16 16 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A M I A M P A /S A ZT FAZ FEP FO X P O D T A Z A X O FU R C IP CN IM I M E R O P /T NIT PIP SX T
33 3.2.3 Pseudomonas spp. atsparumas antimikrobinė ms medžiagoms
Vertinant atliktą kiekybinį tyrimą su identifikuotomis Pseudomonas spp. padermėmis buvo gauti rezultatai, kurie pavaizduoti 13 paveiksle.
13 pav. Pseudomonas spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (proc.)
Remiantis 13 paveikslu, kiekybinio tyrimo būdu nustatyta, kad identifikuota Pseudomonas spp. bakterijų grupė pasižymėjo atsparumu piperacilinui, piperacilinui/tazobaktamui ir tobramicinui po 100 proc., tikarcilinui su klavulano rūgščiai atsparumas buvo 98,1 proc. Dažnas atsparumas Pseudomonas spp. bakterijų buvo ampicilinams ir cefuroksimui po 96,2, ampicilinui sulbaktamui 92,4 proc., aztreonamui 90,7. Pagal SWIN programa nustatytas aukštas rezistentiškumas aztreonamui 70,3 proc. ir ceftriaksonui 48,1 proc.. Taip pat kai kurios Pseudomonas padermės vidutinį atsparumą turėjo ceftazidimui 20,5 proc, mažiau atsparios buvo imipenemui 16,7 proc. ir meropenemui 11,1 proc. Tik kelios iš bakterijų buvo atsparios amikacinui 3,8 proc. ir ciprofloksacinui 1,9 proc. Pseudomonas spp. bakterijų paplitimas pramoniniuose tvenkiniuose auginamose žuvyse laikomas statistiškai reikšmingu lyginant su kitų bakterijų gentimis (p<0,001).
3.8 96.2 92.4 90.7 27.9 48.1 96.2 1.9 16.7 11.1 100 98.1 100 0 20 40 60 80 100 120 A M I A M P A /S A ZT T A Z A X O FU R C IP IM I M E R O P /T T IM PIP
34 3.2.4. Chryseobacterium spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Vertinant atliktą kiekybinį tyrimą su identifikuotomis Chryseobacterium spp. padermėmis buvo gauti rezultatai, kurie pavaizduoti 14 paveiksle.
14 pav. Chryseobacterium spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Iš aukščiau pateikto paveikslo matome, identifikuotos Chryseobacterium spp. bakterijos atlikus kiekybinį tyrimo metodą ir interpretavus rezultatus, buvo atsparios aztreonamui 100 proc., cefazolinui 84,6 proc., ampicilinams ir ampicilinui/sulbaktamui po 84,6 proc. Daugelis padermių pasižymėjo aukštu atsparumu imipenemui 38,4 proc., ceftiaksonui 30,7 proc., piperacilinui 23,1 proc. Mažiau tirtos padermės buvo atsparios amikacinui, cefepimui ir gentamicinui po 15,4 proc. Chryseobacterium spp. bakterijų paplitimas pramoniniuose tvenkiniuose auginamose žuvyse laikomas statistiškai reikšmingu lyginant su kitų bakterijų gentimis (p<0,001).
15.4 84.6 84.6 100 84.6 15.4 30.7 15.4 38.4 15.4 23.1 7.7 0 20 40 60 80 100 120 A M I A M P A /S A ZT FAZ FEP A X O CN IM I P /T PIP SX T
35 3.2.5 Aeromonas spp. atsparumas antimikrobinė ms medžiagoms
Vertinant atliktą kiekybinį tyrimą su identifikuotomis Aeromonas spp. padermėmis buvo gauti rezultatai, kurie pavaizduoti 15 paveiksle.
15 pav. Aeromonas spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Kaip matyti iš 15 paveikslo, Aeromonas spp. buvo atsparūs mažesniam antibiotikų kiekiui. Nustatytas dažnas atsparumas ampicilinams 81,8 proc. ir ampicilinui sulbaktamui 72,7 proc., tikarcilino klavulanatui 72,7 proc. Mažiau atsparios Aeromonas spp. padermės buvo cefazolinui 36,3 proc. ir tobramicinui 27,3 proc. Dalis padermių buvo atsparios aztreonamui ir cefoksitinui po 18,1 proc., trimetoprimui su sulfametaksozoliu 9,1 proc. Padermės daugeliui plokštėse esantiems antibiotikams buvo jautrios, net esant mažiausiom slopinančioms koncentracijoms. Aeromonas spp. bakterijų paplitimas pramoniniuose tvenkiniuose auginamose žuvyse laikomas statistiškai reikšmingu lyginant su kitų bakterijų gentimis (p<0,001).
81.8 72.7 18.1 36.3 18.1 27.3 9.1 72.7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A M P A /S A ZT FA Z FO X T O B SX T T IM
36 3.2.6. Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramteigiamų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Vertinant atliktą kokybinį ir kiekybinį tyrimą su identifikuotomis iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtomis gramteigiamomis padermėmis buvo gauti rezultatai, kurie pavaizduoti 16 paveiksle.
16 pav. Iš pramoninių tvenkinių žuvų išskirtų gramteigiamų bakterijų atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms proc. (n=6)
Iš pramoninių tvenkinių žuvų atsparių antimikrobinėms medžiagoms gramteigiamų bakterijų buvo išskirta labai nedaug. Jų atsparumas antibiotikams pavaizduotas 16 paveikslėlyje. Pusė tirtų padermių buvo atsparios tetraciklinui 57,1 proc., penicilinui 56,8 proc., ciprofloksacinui ir gentamicinui po 42,8 proc.. Vertinant atskirai išskirtas padėrmes išskirti galima būtų Carnobacterium divergens, kuri kokybinio tyrimo metu buvo atspari tetraciklinui, cefpodoksimui, sulfametoksazoliui trimetoprimui, o kiekybinio tyrimo metu – penicilinui, tetraciklinui, ceftriaksonui, sulfametoksazoliui trimetoprimui.
14.2 42.8 14.2 42.8 14.2 14.2 56.8 57.1 28.4 28.4 14.2 14.2 0 10 20 30 40 50 60 A M P C IP G A T CN LE V O LZ D P EN TET SXT RIF V A N G A T
