Mikroorganizmų ir mikotoksinų paplitimas kačių sausame ėdale

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Ligija Andrijauskaitė

Mikroorganizmų ir mikotoksinų paplitimas kačių

sausame ėdale

Occurrence of microorganisms and mycotoxins in dry cat

food

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: lektorė dr. Jurgita Jovaišienė

2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Mikroorganizmų ir mikotoksinų paplitimas kačių sausame ėdale“:

1. yra atliktas mano pačios.

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Ligija Andrijauskaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Jurgita Lukošienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas ginti.

Jurgita Jovaišienė

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Prof. dr. Mindaugas Malakauskas

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas Raimundas Lelešius

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1. Kačių sauso ėdalo svarba ir savybės ... 9

1.2. Mikroorganizmai randami sausame kačių ėdale ... 10

1.3. Mikotoksinai ir antriniai metabolitai kačių sausame ėdale ... 13

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS... 16

2.1. Tyrimo objektas ... 16

2.2. Mėginių paėmimas ... 16

2.3. Mikroorganizmų nustatymas ... 17

2.3.1. Bendras mikroorganizmų skaičius ... 17

2.3.2. Mielių ir pelėsinių grybų nustatymas ... 17

2.3.3. Pelėsinių grybų identifikavimas iki genčių ... 17

2.3.4. Enterobakterijų skaičiaus nustatymas ... 17

2.4. Mikotoksinų nustatymas ... 18 3. REZULTATAI ... 20 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27 IŠVADOS ... 29 PADĖKA... 30 5. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 31

4

MIKROORGANIZMŲ IR MIKOTOKSINŲ PAPLITIMAS KAČIŲ SAUSAME ĖDALE Ligija Andrijauskaitė

Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Mikroorganizmai ir mikotoksinai supa žmonių ir gyvūnų gyvenimą. Gyvūnų augintinių šeimininkai renkasi šėrimą sausu ėdalu, todėl buvo tiriamas sauso kačių ėdalo užterštumas mikroorganizmais ir mikotoksinais. Tyrimui mėginiai buvo rinkti 2020 metų sausio – rugsėjo mėnesiais iš įvairių skirtingų gyvūnų prekių parduotuvių. Buvo ištirti 25 skirtingos sudėties sausi kačių ėdalai. Pagal ekonominę klasę, kuri nėra reglamentuota oficialiai, mėginiai suskirstyti: 2 mėginiai priklauso ekonominei klasei, 6 – Premium, 17 – Super Premium klasei. Pagal sudėtį apskaičiuota kiek procentų ėdalo sudaro augalinės kilmės žaliavos (grūdai, ryžiai, kukurūzai, žirniai, bulvės, runkelių minkštimas ir kt.): 4 mėginiuose (16 proc.) – 80proc. augalinės kilmės produktų, 14 mėginių (56 proc.) – 60 proc., 2 mėginiai (8 proc.) – 50 proc., 2 mėginiai (8 proc.) – 30 proc., 3 mėginiai (12 proc.) – 20 proc. Pagal gyvūninės kilmės žaliavas: 19 mėginių (76proc.) – su paukštiena, 6 mėginiai (24 proc.) – su žuvimi. Ėdalo užterštumas enterobakterijomis, bendro mikroorganizmų skaičiaus bei mielėmis ir pelėsinais grybais buvo tiriamas sėjimo ant terpės metodu. Mikotoksinų nustatymui naudota plonasluoksnė chromatografija.

Mėginiuose daugiausia rasta Penicillium (41proc.) ir Aspergillus (28 proc.) genčių pelėsiniais grybais. Ėdale, kurio sudėtyje 30 proc. augalinės kilmės žaliavų, buvo rasta daugiausia enterobakterijų, mielių ir pelėsinių grybų, bei didžiausias bendras mikroorganizmų kiekis. Mėginiuose rasti aflatoksinas B1, deoksinivalenolis, zearalenonas, ochratoksinas A, T – 2 toksinas.

Raktažodžiai: kačių sausas ėdalas, enterobakterijos, mikroorganizmai, pelėsiniai grybai,

5

OCCURRENCE OF MICROORGANISMS AND MYCOTOXINS IN DRY CAT FOOD Ligija Andrijauskaitė

Master‘s Thesis

SUMMARY

Microorganisms and mycotoxins are all around us and animals. Pets‘ owners choose feeding with dry cat food. The aim of this study was to determine cat dry foods‘ contamination with microorganisms and mycotoxins. Samples were collecting from January to September of 2020, from different pet shops. During this study 25 different cat food samples were tested. Samples were different economy class, which is not regulated official: 2 samples of economy class, 6 – Premium, 17 – Super Premium class. It was calculated percent of raw materials of plant origin (wheats, rice, corn, peas, potatoes, beet pulp, etc.) in dry cat food: 4 samples with 80% raw materials of plant origin, 14 samples with 60%, 2 samples with 50%, 2 samples with 30% and 3 samples with 20%. There were 19 samples (76%) – with poultry and 6 samples (24%) with fish. Samples were tested on growth medium for enterobacter, microorganisms and yeast and mould occurance in cat dry food. Mycotoxins were tested with thin layer chromatography.

There were Penicillium (41%) and Aspergillus (28 %) the most. Enterobacter, yeast and molds and microorganizms quantity were the biggest in cat dry food, where raw materials of plant origin was 30%. There was found mycotoxins: aflatoxin B1, deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T - 2 toxin.

6

SANTRUMPOS

AFL B1 - aflatoksinas B1 DON – deoksinivalenolis ES – Europos sąjunga

KSV/g – kolonijas sudarantys vienetai grame OTA – ochratoksinas A PLCh - Plonasluoksnė chromatografija ppb – milijardinė dalis ppm – milijoninė dalis proc. – procentai spp. – rūšis R2 _{– determinacijos koeficientas} T-2 – T-2 toksinas ZEA - zearalenonas l – mikrolitrai

7

ĮVADAS

Šiuolaikiniame pasaulyje gyvūnai augintiniai tampa svarbia žmonių gyvenimo dalimi (1). Vis daugiau žmonių renkasi auginti kates ir rūpinasi, kad jų gyvenimo kokybė atitiktų jų poreikius. Atlikus tyrimą Jungtinėse Amerikos Valstijose, Australijoje, Jungtinėje karalystėje ir Naujojoje Zelandijoje nustatyta, kad dauguma šeimininkų (91 proc.) savo augintiniams renkasi sausą kačių ėdalą (2). Išanalizavus komercinio ėdalo sudėtį pastebėta, kad gyvūninės kilmės baltymai siekia tik 25 proc., kita dalis baltymų yra augalinės kilmės (3). Nors kačių augintojai yra linkę rinktis ėdalą be grūdų, tačiau dažniausiai tokiame ėdale yra bulvių, žirnių ar kitų augalų (04).

Gaminant sausą kačių ėdalą atliekama ekstruzija, produktas veikiamas aukšta temperatūra ir slėgiu, tokie veiksniai turėtų sunaikinti pelėsinius grybus bei jų sporas, tačiau ši tarša taip pat gali atsirasti atidarius pakuotę namuose arba perkant komercinį ėdalą iš atidarytų pakuočių parduotuvėje (5). Dirvožemis ir javai dažnai būna užkrėsti mielėmis ir pelėsiniais grybais, kurie taip pat patenka į ėdalą perdirbimo metu (6). Tiriant kačių ėdalą randama Fusarium ir Aspergillus genčių pelėsinių grybų, kurie išskiria mikotoksinus (6,7). Iš kačių, sergančių grybelinėmis ligomis buvo išskirta atskira pelėsinių grybų rūšis – Aspergillus felis (8).

Pelėsinių grybų antriniai metabolitai yra pavojingį žmonių ir gyvūnų sveikatai (3). Mikotoksinai yra dažniausiai pasitaikantys natūralūs teršalai gyvūnų ėdale (9). Atliekant tyrimus su skirtingu kačių ėdalu, nebuvo rasta priklausomybės tarp užkrėstumo mikotoksinais ir ėdalo klasės, be to nei vienas gamintojas nenurodė mikotoksikozės galimybės (10). Prie pirmos grupės kancerogenų yra priskiriami vieni dažniausiai randamų mikotoksinų – aflatoksinai (11). Nustatant deoksinivalenolio koncentraciją sauso ėdala gamybos metu, buvo nustatyta, kad įvairiais etapais ji nekinta, tai reiškia, kad ekstruzijos veiksniai nesumažina užterštumo šiuo mikotoksinu (12). Toksinas T – 2 priklausantis trichotecenų A grupei paveikia gyvūno virškinamąjį traktą bei imuninę sistemą, zearalenonas veikia reprodukcinius organus, gali paveikti vaisiaus vystymąsi ar sukelti nevaisingumą (13). Europos sąjungos komisija 2016m. išleido rekomendacijas, dėl mikotoksinų kiekių įvairių gyvūnų pašare (14).

Manoma, kad gyvūnai augintiniai, taip pat gali būti reikšmingi antimikrobinių medžiagų atsparumą turinčių bakterijų plitime, dėl gydymo ir artimo kontakto su žmonėmis (15). Ištyrus virškinamojo trakto mikrobiotą nustatyta, kad plonosios žarnos sutrikimus turinčių kačių organizme randama daugiau enterobakterijų, lyginant su sveikais gyvūnais (16). Sausas kačių ėdalas gali būti užkrėstas Salmonella, Listeria,Escherichia coli bakterijomis (17).

8

Darbo tikslas: nustatyti ir įvertinti įvairaus sauso kačių ėdalo užkrėstumą mikroorganizmais bei

mikotoksinais.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti mikroorganizmų (mielių ir pelėsinių grybų, enterobakterijų, bendro mikroorganizmų skaičiaus) paplitimą skirtingos sudėties sausame kačių ėdale.

2. Identifikuoti nustatytus pelėsinius grybus, aptiktus kačių sausame ėdale iki genčių. 3. Nustatyti mikotoksinų koncentracijas sausame kačių ėdale.

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Kačių sauso ėdalo svarba ir savybės

Gyvūnai augintiniai atlieka svarbų vaidmenį dabartiniame žmonių gyvenime, teikdami teigiamą poveikį emocinei ir fizinei būklei (1). Šiomis dienomis gyvūnų augintojai dažnai renkasi komercinį gyvūnų ėdalą, dėl patogaus naudojimo ir ekonomiškumo, tiek sveikam, tiek sergančiam gyvūnui (18). Atlikus tyrimą Jungtinėse Amerikos Valstijose, Australijoje, Jungtinėje karalystėje ir Naujojoje Zelandijoje nustatyta, kad dauguma šeimininkų (91 proc.) savo augintiniams renkasi sausą kačių ėdalą (2). Italijoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad tik ketvirtadalis gyvūnų augintojų konsultuojasi gyvūnų mitybos klausimais su veterinaru, o beveik trečdalis (30,4proc.) pasitiki žinomų gamintojų ėdalu (4). Sausame gyvūnų ėdale yra apie 5-25 proc. gyvūninės kilmės baltymų, kitą jo dalį sudaro kukurūzai, kukurūzų glitimas, kviečiai, kviečių glitimas ar ryžiai (3). Sauso ėdalo gamyboje taikoma ekstruzija, kurios metu, ėdalas veikiamas trumpa (1-2 min) aukšta (±150ºC) temperatūra ir aukštu slėgiu (37atm) bei drėgme (30 proc.) (5). Gyvūnų ėdalo, kaip ir žmonių maisto produktų, gamyboje, dėmesys skiriamas ne tik maistinėms savybėms, bet ir jutiminėms (19). Dažnai gyvūnų ėdalo tyrimai atliekami apklausiant gyvūnų šeimininkus, buvo pastebėta, kad gyvūnų šeimininkai gyvūnui ėdalą taip pat renka pagal jo spalvą bei formą (19). Kačių šeimininkai dažniau linkę kreipti dėmesį į ėdalo išvaizdą ir kvapą, nes katės yra išrankesnės ėdalo fizikinėms savybėms, tuo tarpu šunų šeimininkai labiau kreipia dėmesį į mėsos kiekį ėdale (4). Pastebima, kad pirkėjai linkę rinktis tuos ėdalus, kurių etiketės skelbia, kad ėdalas yra iš natūralių produktų arba be grūdų, nes tai asocijuojasi su sveikumu ir kokybiškesniu gyvūno gyvenimu (4). Buvo nustatyta, kad kačių viršsvoris ar nutukimas, priklauso nuo šeimininkų įpročių ir temperamento, dėl kurio šeimininkai gali netinkamai vertinti katės būklę ir kūno sudėjimą (2). Taip pat buvo atliekamas tyrimas, su skirtingo amžiaus katėmis, norint ištirti, ar kačių maitinimosi įpročiai priklauso nuo jų amžiaus, tačiau tyrimo metu buvo pastebėta, kad tiek jaunos tiek suaugusios katės yra linkusios maitintis kelis kartus per dieną, suėdant mažą kiekį ėdalo ir jo ėdamumas priklausė nuo naudojamų riebalų (20). Tiriant kačiukus buvo nustatyta, kad virškinamojo trakto mikrobiota priklauso nuo jų amžiaus ir mitybos pokyčių (21).

Katės yra mėsėdžiai gyvūnai, jų virškinamasis traktas nėra pritaikytas augalinių maistinių skaidulų virškinimui, ėdalo virškinamumui svarbus mėsos kiekis – kuo daugiau mėsos, tuo geriau virškinamas ėdalas (7). Kaip pagrindinį energijos šaltinį katės naudoja baltymus, todėl jų ėdale baltymų turėtų būti daugiau, nei 26 procentai, taip pat didesnės taurino, arginino ir vitamino A dozės (22). Katėms reikalingas baltymų kiekis yra du – tris kartus didesnis, nei kitiems gyvūnams (23). Begrūdžiame kačių ėdale javai dažniausiai pakeičiami bulvėmis ar runkelių minkštimu (22). Kadangi katės nesuvokia saldaus skonio, didelę svarbą ėdale turi riebalai, kurie suteikia skonio,

10

nors nustatyta, kad nuo riebalų kiekio ėdamumas nėra priklausomas, tačiau riebalų kilmė ir rūšis yra svarbi (20.) Katės linkusios rinktis ėdalą, kuriame daugiau baltųjų riebalų, lyginant su vištienos riebalais ar sviestu (20). Ant kačių ėdalo pakuočių nurodomas pagrindinis gyvūninės kilmės produktas, pavyzdžiui vištiena ar kiauliena, tačiau jie ne visada yra iš mėsos, ėdalo gamyboje taip pat naudojami iš šalutiniai gyvūniniai produktai, kurie nėra tokie naudingi kaip mėsa (24). Didelis augalinių angliavandenių kiekis ėdale katėms gali sukelti nutukimą bei cukrinį diabetą (24). Krakmolas nėra įprastas kačių racione, tačiau komerciniame sausame ėdale angliavandenių yra nuo 30 proc. iki 60 proc., kurių didžioji dalis yra krakmolas (25). Daugumoje sauso kačių ėdalo sudėtyje pagrindinis angliavandenių šaltinis yra ryžiai arba kukurūzai, tokios dietos pasižymi dideliu virškinamumu (25). Daug skaidulų turinčios dietos dažnai turi ir daug krakmolo, todėl yra mažiau suvirškinamos nei riebalų ir baltymų praturtintos dietos (26). Amerikos pašarų kontrolės asociacija sudarė reikalingų elementų sąrašą ir kiekius kačių ir šunų ėdale, išskiriant augančius ir jau suaugusius gyvūnus (27). Įmonės naudoja skirtingas receptūras ir skirtingus metodus sauso ėdalo gamybai (1).

Gyvūnų mityba yra svarbus aspektas kailio ir odos būklei, tačiau šeriant subalansuotu ir tinkamu ėdalu, reikiamų elementų trūkumas nėra dažnas (28). Esant storosios žarnos uždegimui – kolitui, dažniausiai renkamasi eliminacinė, hipoalerginė arba daug skaidulų turinti dieta, tačiau paskutinioji turėjo prasčiausius rezultatus, net ir derinant mitybą su medikamentiniu gydimu (29). Dietos praturtintos žuvų aliejumi turėjo teigiamą poveikį gyvūnams, sergantiems kolitu, sutrumpino ligos laiką bei sumažina tikimybę ligai pereiti į chroninę būseną (29).

Burnos ertmės ligos katėms dažnai yra susijusios su pasirenkama mityba, pasikeitus šėrimo metodams buvo pastebėta, kad dantenų problemos yra retesnės, tačiau vis dar išlieka, taip pat yra pagrįstų įrodymų, kad mityba minkštu, konservuotu ėdalu susijusi su blogesne dantenų būkle (30).

1.2.

Mikroorganizmai randami sausame kačių ėdale

Tiriant bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, daug dėmesio yra skiriama maistui skirtų gyvūnų tyrimams, o gyvūnai – augintiniai, nėra atidžiai tiriami (15). Antimikrobinėms medžiagoms atsparių padermių perdavimas per maisto grandinę yra dažnas reiškinys, tačiau manoma, kad reikėtų daugiau dėmesio skirti kitais būdais plintančioms atsparioms bakterijoms (15). Katės ir šunys gali būti antimikrobinėms medžiagoms atsparių bakterijų šaltiniai, dėl didelio antibiotikų ir kitų preparatų naudojimo bei turimo artimo kontakto su žmonėmis (15). 2018m. Amerikoje buvo pranešta apie gyvūnų ėdalą galimai užterštą Salmonella, Listeria,Escherichia coli bakterijomis (17).Lyginant su šunimis, kačių plonojoje žarnoje vyrauja anaerobinės bakterijos (16).

Plonosios žarnos sutrikimus turinčių kačių organizme randama daugiau enterobakterijų, lyginant su sveikais gyvūnais (16). Atlikus tyrimus veterinarijos klinikose, buvo rasta antibiotikams atsparių

11 Salmonella, Escherichia,Staphylococcus padermių. (15). Plonojoje kačių ir šunų žarnoje buvo rasta

patogeninių enterobakterijų, kurios prisijungusios prie žarnyno gleivinės gali gaminti enterotoksinus, sukelti uždegimą bei diarėją (31). Prebiotikų naudojimas katėms teigiamai veikia žarnyno mikrobiotą, padidėja bifidobakterijų skaičius, sumažėjo E.coli. Tyrimai parodė, kad nors katė yra mėsėdis gyvūnas, žarnyno mikroflora yra panaši į visaėdžių (32).

Gyvūnų ėdale dažniausiai buvo išskiriamos Aspergillus spp. ir A. Niger (6). Mielės ir pelėsiniai grybai yra randami dirvožemyje, vandenyje ir ore, todėl neapdoroti augalinės ar gyvūninės kilmės žaliavos gali būti užteršiami perdirbimo metu (6). Javai įprastai dominuoja sausame ėdale, kad suteiktų tinkamą tekstūrą ir yra pagrindinis pelėsinių grybų šaltinis (7). Javų transportavimas ir sandėliavimas taip pat gali būti tinkama aplinka jų užkrėtimui pelėsiniais grybais, tačiau Vengrijoje atliktais tyrimais nustatyta, kad javai buvo užkrėsti dar pačiame lauke (33). Nors sauso ėdalo gamyboje naudojami veiksniai turėtų sunaikinti pelėsinius grybus bei jų sporas, tačiau ši tarša taip pat gali atsirasti atidarius pakuotę namuose arba perkant komercinį ėdalą iš atidarytų pakuočių parduotuvėje (5).

Pelėsinių grybų augimas aplinkoje sukelia įvairius žmonių sveikatos sutrikimus ir ligas, taip pat alergijas (34).

Ruošiant kačių ir šunų sausą ėdalą galima naudoti inhibitorius, tokius kaip vario sulfatas ar organinės rūgštys, kurie prisidėtų prie pelėsinių grybų augimo slopinimo (6). Įvairių tyrimų metu buvo ieškoma būdų, kaip sumažinti ėdalo taršą mikotoksinais ir pelėsiniais grybais, buvo nustatyta, kad ozonas gali efektyviai veikti Aspergillus flavus sporas ir sumažinti grybo augimą (5).

Veterinarinėse dietose, skirtose sergantiems gyvūnams, susideda iš daug grūdų, kukurūzų, kviečių, kurie dažnai būna užkrėsti Fusarium genties grybais, kurie išskiria mikotoksinus (7). Alerginei aspergiliozei būdinga astma, bronchų obstrukcija, eozinofilija, todėl iš pradžių gali būti įtariama tuberkuliozė (35).

Katės turinčios imunosupresinę būklę, dėl kačių imunodeficito ar kačių leukemijos viruso yra jautresnės aspergiliozei (8). Taip pat daroma prielaida, kad grynaveislės brachicefalinių veislių katės turi paveldėtą polinkį aspergiliozei ir peniciliozei (8). Iš naminių kačių sergančių grybeliniu rinosinusitu buvo išskirta nauja rūšis Aspergillus felis, taip pat ši rūšis išskirta iš šuns turinčio išplitusią invazinę aspergiliozę, bei iš žmogaus, sergančio lėtine invazine plaučių aspergilioze (8).

Aspergillus flavus greitai auga ant agarizuotų terpių, plokščios ir lygios kolonijos. Rūšyje

išskiriami varietetai, kurie skiriasi specifiniais morfologiniais požymiais. Labiau paplitę dirvožemyje ir ant substratų, geriau auga aukštesnėje temperatūroje. Gamina aflatoksinus B1 ir B2, aflavazolį, orizochloriną ir kitus. Stipriai toksiška rūšis, sukelia žmonių, paukščių, gyvūnų ligas, gaminami toksinai pažeidžia kvėpavimo sistemą, centrinę nervų sistemą, kaulus ir raumenis. (36)

12 Aspergillus niger kolonijos formuojasi greitai, dažniausiai panirusios į substratą, spalva ruda ar

rusva. Į aplinką išskiria daug įvairių skirtingų metabolitų, turi galimybę plačiai paplisti aplinkoje, dėl gero įsitvirtinimo į skirtingus paviršius. Buvo rasta savybė, detoksikuoti Aspergillus flavus išskiriamus aflatoksinus. Toksiškas žmonėms ir gyvūnams, buvo nustatyti kiaulių apsinuodijimai grybo gaminamais oksalatais bei raumenų paralyžius triušiams, sukeliamų micelio (36) Aspergillus rūšies grybelių sukeliamos infekcijos yra pavojingos organizmams, turintiems susilpnėjusią imuninę sistemą, konidijos pasiekusios sveiko organizmo alveoles įprastai imuninės sistemos neįveikia (8).

Cladosporium spp. kolonijas nelygios, žalsvai pilko atspalvio. Gana atsparūs aplinkos

sąlygoms, cheminėms medžiagoms, gali augti žemoje temperatūroje, esant šviesos ir maisto medžiagų trūkumui, druskingose vietovėse. Išskiriama nuo dirvožemio, maisto medžiagų, pašarų. Patekę į kvėpavimo sistemą dažnai sukelia alergiją, akyse – ragenos uždegimą, opas (36)

Curvularia lunata kolonijos panašios į medvilnę, tamsios. Daugiausia aptinkami dirvožemyje,

ant augalų liekanų, laikomi augalų parazitais. Sukelia bendrą organizmo apsinuodijimą pelėsiniais grybais gyvuliams (36)

Penicillium spp. jaunos kolonijos šviesios spalvos, atspalvis priklauso nuo rūšies. Dažniausiai

randami dirvožemyje, augalų liekanose, grūduose, vaisiuose, riešutuose. Paukščiai jautrūs šiais grybais užkrėstam lesalui. Išskiria ochratoksiną A, citrininą, patuliną. Kai kurios rūšys išskiria fermentus, kurie skaido sunkiai ardomas medžiagas. Kai kurios rūšys buvo išskirtos iš mėsos ir žuvies (36). Penicillium rūšys yra aerobiniai organizmai, greitai augantys ir formuojantys sausas, oru lengvai plintančias sporas, optimali augimo temperatūra yra apie 25 °C (37).

Rhizopus stalonifer purus, greitai augantis micelis, iš pradžių šviesus, paskui tamsėja. Paplitę

ant įvairių substratų, augalams sukelia šaknų puvinį, pažeidžia vaisius ir daržoves. Kai kurie kamienai toksiški ir patogeniški augalams, gyvūnams ir žmonėms. Randami gyvenamosiose patalpose, todėl užteršia orą, maistą ir aplinką. Gamina T – 2 toksiną, sukeliantį odos nekrozę, gliotoksiną – toksišką triušiams ir graužikams (36).

Verticillium spp. baltos kolonijos su nelygiu paviršiumi. Parazituoja įvairius augalus,

nepasižymi specifiškumu, todėl užkrečia ir kitus augalus, gali sudaryti agresyvias bendrijas su nematodais, pavojingas augalams. Išskiria verticiliną A ir B, pavojingą graužikams (36).

Žmonių ir gyvūnų fuzariozės palyginus retos, labiau siejamos su ragenos grybelinėmis infekcijomis, tačiau dažnai pasižymi dideliu atsparumu priešgrybeliniams preparatams (38).

Fusarium genties pelėsiniai grybai gamina daug toksiškų junginių, iš kurių didžiausias

ekonominis poveikis siejamas su deoksinivalenoliu, tačiau Aspergillus spp. gaminami aflatoksinai daro didesnę žalą žmonių ir gyvūnų sveikatai (39). Fusarium rūšis paveikia ne tik grūdines kultūras,

13

tačiau ir kitus augalus, tokius kaip figos, pašarinės žolės, prieskoniniai ir vaistiniai augalai, šparagai, pistacijos ar sojos (39).

1 lentelė. Aspergiliozės gydymas katėms. (8)

1.3.

Mikotoksinai ir antriniai metabolitai kačių sausame ėdale

Mikotoksinai turi neigiamą poveikį tiek žmonių, tiek gyvūnų sveikatai (3), pavojingi bakterijoms, grybams, augalams, gyvūnams ir žmonėms (7). Tačiau jie taip pat gali būti naudingi ir naudojami medicinoje, pavyzdžiui penicilinas, ciklosporinai, lovastatinai ir kiti (34). Pagal Maisto ir žemės ūkio organizaciją ketvirtadalis viso maisto yra užkrėstas mikotoksinais (3). Užkrėtimas mikotoksinais galimas javų auginimo, nuėmimo ir sandėliavimo metu, tai dažnai gali tapti rizika naminiams gyvūnams, sukeliant mikotoksikozės atvejus ir net mirtį (3) Dažnų mikotoksikozių atvejų katėms nėra nustatyta, tačiau nagrinėjant sauso kačių ėdalo sudėtis pastebima, kad žali baltymai vyrauja iš augalinės kilmės žaliavų bei šalutinių gyvūninių produktų ir tik nedidelė dalis – iš mėsos (3). Mikotoksinai yra dažniausiai pasitaikantys natūralūs teršalai gyvūnų ėdale (9). Nepaisant to, kad gaminant sausą gyvūnų ėdalą naudojamas aukštas slėgis ir temperatūra, žaliavos vis tiek gali būti užkrečiamos mikotoksinais (18). Gyvūnų ėdalo užkrėtimas mikotoksinais gamintojams yra nepalankus dėl ekonominių priežasčių ir reputacijos, toks ėdalas kelia didelę riziką gyvūnų sveikatai, tačiau toksikologinis veikimas šioms rūšims mažai ištirtas (18). Atliekant tyrimus su skirtingu kačių ėdalu, nebuvo rasta priklausomybės tarp užkrėstumo mikotoksinais ir ėdalo

Vaistas Dozė katei aspergiliozės atveju

Amfotericinas B  konservatyvus: : 0,25 mg/kg IV lėta infuzija iki kumuliacinės dozės 4-8 mg/kg

 liposominis : 1 mg/kg/day IV, 3 kartus per savaitę iki 12 kartų. Itraconazolas 2,5 mg/kg kas 12h arba 5 mg/kg kasdien p.o. su ėdalu 15 – 30 dienų Voriconazolas 4–5 mg/kg kas 12h p.o.

Posaconazolas 5 mg/kg kartą per parą

14

klasės, be to nei vienas gamintojas nenurodė mikotoksikozės galimybės (10). Jungtinėse Valstijose aflatoksinai buvo dažniausia ėdalo naikinimo priežastimi, tačiau buvo randama ir kitų mikotoksinų (9). Mikotoksinų poveikis gali būti ūmus arba ilgalaikis, kuris priklauso nuo jų rūšies, kiekio ir koncentracijos bei poveikio laiko, taip pat nuo gyvūno rūšies, amžiaus, lyties ir bendros būklės (10). Mikotoksinai bei jų metabolitai taip pat skirtingai veikia pačias ląsteles, ne tik visą organizmą, jie gali sukelti oksidacinį stresą, transliacijos slopinimą, paveldimosios medžiagos pažeidimus bei apoptozę (11). Toksinis poveikis gali būti sukeliamas teršalų dozę gavus ne tik per virškinamąjį traktą, bet ir jų įkvėpus ar kontaktu per odą (11). Tiriant mikotoksinų poveikį gyvūnams išsiaiškinta, kad kontaktiniu ar respiratoriniu būdu patekę mikotoksinai gali būti pavojingesni, nei patekę per virškinamąjį traktą (34). Šeriant kates mikotoksinais užkrėstu ėdalu, buvo stebimas vėmimas, vėliau suvartojamo ėdalo kiekio sumažėjimas (12).

Pagrindiniai Fusarium genties išskiriami mikotoksinai: fumonizinai, trichotecenai,

zearalenonas (7). Ypatingai svarbu ištirti ėdalus skirtus silpniems, sergantiems gyvūnams, kadangi jiems mikotoksikozės gali stipriai paveikti sveikatą (7).

Tiek katės, tiek šunys yra jautrūs aflatoksinui, vidutinė letali dozė katėms buvo nustatyta 0,55mg/kg. Aflatoksinai yra lipofiliški, lengvai ir greitai absorbuojami, ypač jauniems gyvūnams, dvylikapirštėje žarnoje, labiausiai pažeidžia kepenis, inkstus ir plonąjį žarnyną (9). XXa. viduryje pietryčių Amerikoje aflatoksikozės sukelti kepenų pažeidimai šunims buvo įvardijami kaip „hepatitas X“ ir tik vėliau susieta su šėrimu pelėsiniais grybais užterštu ėdalu (13). Aflatoksinai gyvūnams yra priskiriami prie pirmos grupės kancerogenų (11).

Zearalenono ir deoksinivalenolio poveikis yra pavojingas, dėl jų sinergetinio poveikio, kuris sustiprina toksinį poveikį gyvūnui (10). Gaminant sausą gyvūnų ėdalą iš natūraliai užkrėstų grūdų, buvo nustatyta, kad deoksinivalenolio koncentracija gamybos procesų metu nekinta, tai rodo, kad deoksinivalenolis išlieka stabilus visos ekstruzijos metu (12).

Trichotecenų A grupei priklauso T – 2, HT – 2 toksinai, kurie sukelia apetito praradimą, vėmimą, diarėją, virškinamojo trakto kraujavimą, imuninės sistemos sutrikimus, zearalenonas gali sukelti nevaisingumą, sėklidžių ar kiaušidžių atrofiją, neigiamai paveikti ovuliaciją ir vaisiaus vystymąsi (13). Ochratoksikozei būdingas nefrotoksinis ir hepatotoksinis poveikis (13).

Mikroorganizmų metabolitų, randamų išmatose, kiekį ir įvairovę galima modifikuoti, skiriant kitokių baltymų ar skaidulų praturtintą ėdalą (16).

15

2 lentelė. Komisijos rekomendacija (ES) 2016/1319 2016 m. liepos 29 d. dėl deoksinivalenolio,

zearalenono ir ochratoksino A gyvūnų augintinių ėdale (14)

Mikotoksinas Gyvūnų pašarams skirti produktai

Orientacinė vertė mg/kg (ppm) pašaruose, kurių drėgnis yra 12 % Deoksinivalenolis Pašarinės žaliavos:  Grūdai ir grūdų produktai, išskyrus šalutinius kukurūzų produktus

 Šalutiniai kukurūzų produktai Kombinuotasis pašaras 8 12 5 Zearalenonas Pašarinės žaliavos:  Grūdai ir grūdų produktai, išskyrus šalutinius kukurūzų produktus

 Šalutiniai kukurūzų produktai Kombinuotasis pašaras:

 Paršiukams, kiaulaitėms (jaunoms paršavedėms), šuniukams,

kačiukams, veisimui skirtiems šunims ir katėms

 Suaugusiems ne veisimui skirtiems šunims ir katėms

2 3 0,1 0,2 Ochratoksinas A Pašarinės žaliavos:  Grūdai ir grūdų produktai Kombinuotas pašaras skirtas:

 Katėms ir šunims

0,25

0,01

Fumonizinas B1 + B2

Pašarinės žaliavos:

 kukurūzai ir kukurūzų produktai Kombinuotasis pašaras, skirtas:

 kiaulėms, arkliams (Equidae), triušiams ir gyvūnams

augintiniams

60

5

16

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS

2.1.

Tyrimo objektas

Tyrimui buvo renkami skirtingo sauso kačių ėdalo mėginiai. Mikrobiologiniai tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos, Maisto saugos ir kokybės katedros laboratorijoje. Buvo renkami gyvūnų prekių parduotuvėse parduodami sveriami sauso kačių ėdalo mėginiai, atsižvelgiant į gamintojo skelbiamą ekonominę klasę, skirtingiems gyvūnų poreikiam reikiamą ėdalą, skirtingų javų ir kitų augalų turintys ėdalai. Į terpes atlikti sėjimai giluminiu ir tiesioginiu būdu.

1 pav. Tyrimo schema

2.2.

Mėginių paėmimas

Tyrimui mėginiai buvo rinkti 2020 metų sausio – rugsėjo mėnesiais iš įvairių skirtingų gyvūnų prekių parduotuvių. Visi kačių ėdalai pirkti sveriami, t.y. jau iš atidarytų didelių (10kg) pakuočių arba perpiltų į atskiras talpas. Iš viso buvo surinkti 25 skirtingi mėginiai, iš kurių 4 skirti jauniems kačiukams, 14 suaugusioms katėms, 7 kastruotoms katėms. Pagal ekonominę klasę, kuri nėra reglamentuota oficialiai, mėginiai suskirstyti: 2 mėginiai priklauso ekonominei klasei, 6 – Premium, 17 – Super Premium klasei. 2 Pagal sudėtį apskaičiuota kiek procentų ėdalo sudaro augalinės kilmės žaliavos (grūdai, ryžiai, kukurūzai, žirniai, bulvės, runkelių minkštimas ir kt.): 4 mėginiuose (16 proc.) – 80proc. augalinės kilmės produktų, 14 mėginių (56 proc.) – 60 proc., 2 mėginiai (8 proc.) – 50 proc., 2 mėginiai (8 proc.) – 30 proc., 3 mėginiai (12 proc.) – 20 proc. Pagal gyvūninės kilmės žaliavas: 19 mėginių (76proc.) – su paukštiena, 6 mėginiai (24 proc.) – su žuvimi. Kadangi

17

sauso ėdalo galiojimo laikas ilgas, mėginiai iki tyrimo buvo laikomi gamintojo nurodomomis sąlygomis – kambario temperatūroje, sausoje vietoje.

2.3.

Mikroorganizmų nustatymas

2.3.1. Bendras mikroorganizmų skaičius

Bendras mikroorganizmų skaičius (BMS) nustatomas pagal LST EN ISO 4833-2:2013 (Maisto grandinės mikrobiologija. Bendrasis mikroorganizmų skaičiavimo metodas. 2dalis. Kolonijų skaičiavimo 30°C temperatūroje sėjimo paviršiuje būdu.)(40). Sauso ėdalo mėginys sumalamas malūnėliu, atsveriama 10g malto ėdalo ir suberiama į atskiras kolbutes su 90ml distiliuoto vandens. Siekiant išvengti kryžminės taršos, malūnėlis dezinfekuojamas, naudojamas antro malimo ėdalas. Kolbutės dedamas į kratyklę ir mėginiai maišomi 20min, iš jų sėta po 1ml mėginio į Petri lėkšteles, užpilant Plaint count agar (PCA) terpę. Kiekvienas mėginys sėtas į tris Petri lėkšteles. Mėginiui tolygiai paskirstyti, lėkštelės sukamos ratu prieš ir pagal laikrodžio rodyklę ant stalo po kelis kartus, laukiama kol terpė sustings. Inkubuojama 30 ± 1°C temperatūroje 72 ± 3 valandas.

2.3.2. Mielių ir pelėsinių grybų nustatymas

Sumalama ir atsveriama 10g sauso kačių ėdalo mėginio, suberiama 90ml distiliuoto vandens kolbutėse. Kolbutės kratyklėje maišomos 20min, gauto mėginio 1ml sterilia pipete patalpinama į Petri lėkštelę ir užpilama Sabūro terpe. Lėkštelės maišomos ant stalo sukamais judesiais prieš ir pagal laikrodžio rodyklę kelis kartus. Kiekvienam mėginiui skirtos trys Petri lėkštelės. Lėkštelės inkubuojamos kambario temperatūroje, 72 valandas. Pagal LST ISO 21527-2:2008 (Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis mielių ir pelėsinių grybų skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas produktuose, kurių vandens aktyvumas yra 0,95 arba mažesnis) įvertintos gyvybingų sporų skaičius, suskaičiuotos augančių pelėsinių grybų kolonijos (41).

2.3.3. Pelėsinių grybų identifikavimas iki genčių

Nustatant sauso kačių ėdalo užkrėstumą pelėsiniais grybais tiesioginiu būdu, buvo sėjama po 10 sauso ėdalo grūdelių iš kiekvieno mėginio. Grūdeliai paskirstyti Petri lėkštelėje ant sustingusios Sabūro terpės, dedant vieną grūdelį viduryje ir 9 aplinkui ratu. Lėkštelės inkubuotos 4 paras kambario temperatūroje. Šviesiniu mikroskopu vertinamos užaugusios pelėsinių grybų kolonijos, pagal morfologinius požymius nustatytos gentys bei kai kurios rūšys. Apskaičiuota procentinė užkrėstų grūdelių dalis.

2.3.4. Enterobakterijų skaičiaus nustatymas

Vadovaujantis LST ISO 21528-2:2017 „Maisto grandinės mikrobiologija. Bendrasis enterobakterijų (Enterobacteriaceae) aptikimo ir skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas“ (42). standartu. Į kolbutes su 90ml distiliuoto vandens įberiama 10g sumalto sauso kačių ėdalo mėginio. Kolbutės maišomos kratyklėje 20min. Po 1ml gauto mėginio pilama į Petri lėkštelę ir užpilama

18

ir pagal laikrodžio rodyklę. Terpei sustingus užpilamas antras terpės sluoksnis anaerobinėms sąlygoms sudaryti. Terpei sustingus lėkštelės inkubuojamos 37°C termostate 24h.

2.4.

Mikotoksinų nustatymas

Mikotoksinų koncentracija buvo nustatoma visuose turėtuose sauso kačių ėdalo mėginiuose. Rezultatų dalyje pateikti visi gauti mikotoksinų tyrimų rezultatai. Aflatoksinų B1 (AFL B1), zearalenono (ZEA), deoksinivalenolio (DON) koncentracijos nustatomos naudojant plonasluoksnę chromatografiją (PLCh) pagal Romer LAB (JAV) metodikas. Mėginio paruošimui 25g tiriamojo mėginio sumalama Romer Lab malūnu. 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišinio maišoma dideliu greičiu 3 minutes ir perfiltruojama per popierinį filtrą. Išgryninama naudojant Multisep® 216 kolonėlę. Pritraukiant 10, 20, 40, 60, 80 μl DON standarto ir 80 μl tiriamo mėginio į specialius mikrošvirkštelius nustatoma koncentracija. DON standartas ir tiriamasis mėginys užnešami ant chromatografinės plokštelės. Plokštelė įmerkiama į vonelę su ½ (10 ml/20 ml) toluolo/acetono mišiniu. Plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloride metanolyje, išdžiovinama ore ir pakaitinama 5 min. ant plytelės 150o_{C temperatūroje. Įvertinama DON koncentracija UV spindulių}

fone (360 nm). Toksino koncentracija apskaičiuojama ppm (mg/kg). Tada į specialius mikrošvirkštelius pritraukiama 10, 20, 40, 80 μl ZEA ir AFL B1 standartų ir 80 μl tiriamo mėginio. Ant silikagelio chromatografinės plokštelės užnešama 10, 20, 40, 80 μl ZEA bei AFL B1 standartų ir 80 μl tiriamo mėginio su specialiais mikrošvirkštais. Plokštelė įmerkiama į 9/1 (18 ml/2 ml) chloroformo/acetono mišinio vonelę. Laikoma, kol skystis pakyla iki 1 cm plokštelės viršaus. Po to plokštelė išdžiovinama ore. Įvertinama AFL B1 koncentracija. Plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje, išdžiovinama ore. ZEA koncentracija įvertinama UV spindulių fone. Toksino koncentracija apskaičiuojama ppm (mg/kg).

Plonasluoksnės chromatografijos metodu tiriant T – 2 toksiną, mėginių paruošimas toks pat kaip AFL B1, išgryninimui naudojamos MultiSep® 216 ir MycoSep® 227 valymo kolonėlės. 13 ml išvalyto ekstrakto išgarinta Romer® Evap sistema. Ekstrakto nuosėdos ištirpintos 320 µl 97/3 tolueno/acetonitrilo mišinyje. Į specialius mikrošvirkštus pritraukus 10, 20, 40, 80 µl T-2 toksino standartų (100 µg/ml acetonitrilo) ir 80 µl tiriamo mėginio, PLCh autospoteriu (autospotter) užnešamas standartas ir tiriamasis mėginys ant silicio gelio chromatografinės plokštelės 60°C temperatūroje. Rezultatų išryškinimui T-2 toksino plokštelė įmerkiama 25/15/1 metanolio/vandens/acto rūgšties mišinio. T-2 toksino plokštelė apipurškiama 10 % sieros rūgšties metanolyje, išdžiovinama ore. Toksino koncentracija įvertinama, pakaitinus plokštelę 150°C temperatūroje 5 min. ultravioletinių spindulių (UV) fone (360 nm). DON ir T-2 švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,5. Toksino koncentracija tiriamajame mėginyje matomas ng ir apskaičiuojama ppb (µg/kg). Aptikimo riba T-2 toksino – 10 ppb.

19

Ochratoksino A kiekybiniam nustatymui taip pat naudojamas PLCh analizės modifikuotas metodas pagal Romer Labs metodiką. 25g tiriamojo mėginio sumalama malūnu, ekstrahuojama pilant 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišinio, 30 min. purtoma su purtykle, perfiltruojama popieriniu filtru. 7ml ekstrakto perkeliama į mėgintuvėlį, užpilama 70 μl acto rūgšties ir gerai išmaišoma. Ekstraktas perleidžiamas per MycoSep®229 Ochra kolonėlę. Surenkama 4 ml išvalyto ekstrakto ir perkeliama į švarų mėgintuvėlį. Surinktas ekstraktas išgarinamas naudojant Romer® Evap sistemą. Gautos nuosėdos ištirpinamos 400 μl 99/1 tolueno/acto rūgšties mišinyje. Koncentracijos nustatymas: mikrošvirkštais pritraukiama 100 μl tiriamo mėginio ir 10, 30, 50 μl 1 μl/ml Ochratoksino A darbinio standarto ir užnešama ant silicio gelio chromatografinės plokštelės. Plokštelė įmerkiama į vonelę su 18/1/1 tolueno/metanolio/acto rūgšties mišiniu, po to plokštelė išdžiovinama ore. Ochratoksino A koncentracija vertinama UV spinduliuotės fone, esant ilgiausiai bangai. Ochratoksinas A švyti mėlynai žalia spalva, kai Rf = 0,6. Aptikimo riba: 1 μg/kg.

20

3. REZULTATAI

Buvo ištirti 25, trijų skirtingų ekonominių klasių, sauso kačių ėdalo rūšių mėginiai, kuriuose augalinės kilmės žaliavos sudaro: 20 proc., 30 proc., 50 proc., 60 proc. ir 80 proc. ėdalo sudėties , visuose nustatomi mikotoksinų kiekiai pateikti lentelėje nr.3. Gauti rezultatai palyginti su Europos Sąjungos komisijos rekomendacijomis galimais mikotoksinų kiekiais kačių ėdale. Nustatyta, kad mėginiuose nr.8 ir nr. 19 toksinų T – 2 viršija rekomenduojamą kiekį (0,05 mg/kg). Taip pat, mėginiuose nr.8 ir nr.10 zearalenono kiekis yra du kartus didesnis nei leidžiama norma, jaunų ir veisimui skirtų kačių ėdale. 20proc. mėginių mikotoksinų kiekis siekia didžiausią galimą kiekį, tačiau rekomendacijų neviršija. Kadangi mėginys nr.5 yra iš ėdalo skirto kastruotoms katėms, leidžiamas zearalenono pagal rekomendacijas yra 0,2 mg/kg. 8proc. mėginių (nr.2 ir nr. 24) nebuvo rasta nei vieno mikotoksino.

3 lentelė. Mikotoksinų kiekiai tirtuose sauso kačių pašaro mėginiuose

Mikotoksinai Mėginio nr. Aflatoksinas B1 mg/kg(ppm) Deoksinivalenolis mg/kg(ppm) Zearalenonas mg/kg(ppm) Ochratoksinas A mg/kg(ppm) Toksinas T-2 mg/kg(ppm) 1 0 0,5 0 0,002 0 2 0 0 0 0 0 3 0 0,05 0 0 0,05 4 0 0 0 0,006 0 5 0 0 0,166 0,004 0 6 0,001 0 0 0 0 7 0 0,25 0 0 0 8 0,0017 0,125 0,2 0,002 0,06 9 0 0 0 0,001 0 10 0 0 0,2 0,001 0 11 0 0 0,07 0 0 12 0 0 0,03 0 0 13 0 0 0 0,004 0,05 14 0 0 0 0 0,05 15 0,0017 0 0,050 0 0 16 0,001 0 0 0 0 17 0,0018 0,3 0,067 0 0,05 18 0 0,063 0 0 0 19 0 0 0 0,003 0,09 20 0 0 0 0,003 0 21 0 0,188 0 0,002 0 22 0,001 0,25 0,1 0 0 23 0,001 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 25 0 0 0,1 0,004 0

21

Vertinant pelėsinių grybų genčių įvairovę mėginiuose (pav. 2) daugiausia mėginių buvo užkrėsti

Penicillium ir Aspergillus genties pelėsiniais grybais. 41 proc. mėginių buvo užkrėsti Penicillium spp., 28 proc. mėginių – Aspergillus spp.

2 pav. Pelėsinių grybų genčių įvairovė tirtuose sauso kačių ėdalo mėginiuose

Atlikus sauso kačių ėdalo sudėčių analizę mėginiai sugrupuoti pagal augalinės kilmės žaliavų procentinę dalį ėdale ir įvertintas gabaliukų užkrėstumas procentais mielėmis ir pelėsiniais grybais. Paveiksle nr. 3 pavaizduotas užkrėstumas procentais pagal augalinės kilmės dalį ėdale. Diagramoje matoma, kad ėdale, kurio augalinė dalis 20 – 30 proc., vidutinis užkrėstumas siekia 100 proc. esant didesnei augalinės kilmės žaliavų daliai ėdale – užkrėstumas yra mažesnis. Regresinėje analizėje paveiksle nr. 4 taip pat matoma, kad regresijos koeficientas yra neigiamas, tai rodo, kad mažėjant augalinės kilmės ingredientų daliai ėdale – užkrėstumas mielėmis ir pelėsiniais grybais didėja, kadangi determinacijos koeficientas R2 _{<0,25, negalima teigti, kad regresinė analizė prasminga}

22 3 pav.Užkrėstumas mielėmis ir pelėsiniais grybais užkrėstų gabaliukų procentais, pagal

augalinės kilmės proc. dalį ėdale

4 pav. Užkrėstumo mielėmis ir pelėsiniais grybais ir augalinės kilmės ingredientų dalies ėdale regresinė analizė

23

Paveiksle nr.5 matomas bendro mikotoksinų kiekio pokytis pagal mielių ir pelėsinių grybų log KSV/g skaičių. Regresijos koeficientas silpnai teigiamas (0,079), o R² = 0,114, todėl regresinės analizės nereikėtų laikyti prasminga. Koreliacijos koeficientas tarp mielių ir pelėsinių grybų užterštumo log KSV/g ir bendro mikotoksinų kiekio yra teigiamas, todėl galima teigti, kad daugėjant mielių ir pelėsinių grybų kolonijas sudarančių vienetų – mikotoksinų kiekis didėja nežymiai.

5 pav. Mikotoksinų kiekio mg/kg ir užkrėstumo mielėmis ir pelėsiniais grybais log KSV/g regresinė analizė

24

Vertinant bendrą užterštumą enterobakterijomis, bendrą mikroorganizmų skaičių, mielių ir pelėsinių grybų užterštumą paveiksle nr. 6 ryškiausiai išsiskiria mėginys nr. 22 ir yra labiausiai užterštas mikroorganizmais.

6 pav. Sauso kačių ėdalo mėginių užterštumo enterobakterijomis, mielėmis ir pelėsiniais grybais, bendro mikroorganizmų skaičiaus palyginimas.

Pagal gyvūninės kilmės žaliavas, sausame kačių ėdale su žuvimi, užkrėtimas enterobakterijomis yra didesnis, nei ėdale su paukštiena, 7pav.

7pav. Užkrėstumas enterobakterijomis log KSV/g sausame ėdale su paukštiena (vištiena, kalakutiena) ir žuvimi

25

Nustatytas enterobakterijų kiekis (pav. nr 8) ,bendras mikroorganizmų skaičius (pav. nr 9) ir užkrėstumas mielėmis ir pelėsiniais grybais (pav. nr 10) neturi koreliacijos su augalinės kilmės žaliavų dalimi ėdale, todėl nuo jo nepriklauso. Visų nustatytų mikroorganizmų kiekio skaičiavime išsiskiria ėdalų grupė, kuriuose augalinės kilmės ingredientai sudaro 30 proc.. Šie ėdalai išsiskiria sudėtimi, nes juose yra žirnių, kurių nėra kituose mėginiuose, kas galėtų daryti įtaką didesniam užkrėstumui.

8 pav. Užkrėstumas enterobakterijomis pagal augalinės kilmės žaliavų dalį ėdale

26 10 pav. Užterštumas mielėmis ir pelėsiniais grybais log KSV/g pagal augalinės kilmės žaliavų procentinę dalį ėdale.

27

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Sauso kačių ėdalo gamyboje naudojama daug javų, kurie tampa ėdalo užkrėstumo pelėsiniais grybais šaltiniu (7). Gaminant sausą ėdalą naudojami veiksniai turėtų sunaikinti pelėsinius grybus ir kitus mikroorganizmus, tačiau pelėsiniai grybai gali atsirasti atidarius ėdalo pakuotę namuose arba perkant ėdalą parduotuvėje iš jau atidarytų pakuočių (sveriamą) (5). Gyvūnų ėdale dažniausiai buvo išskiriamos Aspergillus spp. ir A. Niger (6). Fusarium genties grybai buvo rasti veterinarinėse dietose, skirtose sergantiems gyvūnams, kuriose daug grūdų, kviečių, kukurūzų (7), taip pat randama Penicillium spp., Rhizopus spp. ir kitų genčių grybų (3). Santa Marijoje, Brazilijoje atlikto tyrimo metu 40,7 proc. mėginių buvo užkrėsti A. Niger grybu (6). Tyrimo metu buvo tiriami 25 skirtingi sauso kačių ėdalo mėginiai, kuriuose taip pat, kaip ir kitų autorių tyrimuose buvo rasta

Aspergillus spp., Fusarium spp. genčių pelėsiniai grybai. 64 proc. mėginių buvo užkrėsti Penicillium genties grybais, A. Niger buvo rastas dviejuose mėginiuose (8proc.).

Aspergillus, Penicillium ir Fusarium genčių grybų buvo rasta skirtingų klasių ėdaluose

(Premium ir ekonominės) (3). Atliktame tyrime taip pat pelėsiniai grybai buvo rasti visų klasių ėdaluose ir jų pasiskirstymas nuo klasės nepriklausė. Lyginant augalinės dalies procentinį kiekį ėdale ir užkrėstumą mielėmis ir pelėsiniais grybais, ryškios priklausomybės nėra, mažėjant augalinės kilmės žaliavų kiekiui ėdale užkrėstumas yra didelis, toks pokytis gali būti dėl to, kad ėdale, kuriame augalinės kilmės ingredientai sudaro 20 – 30 proc., naudojamos bulvės, saldžiosios bulvės, morkos, cukrinių runkelių minkštimas, kurie gali būti užkrėsti dirvožemyje esančiais pelėsiniais grybais. Leidžiamas mikotoksinų kiekis sausame ėdale yra nurodytas ES komisijos rekomendacijose. Iš visų tirtų mėginių, 12 proc. rasti mikotoksinų kiekiai viršijo ES rekomendacijas, penkiuose mėginiuose siekė maksimalų leidžiamą kiekį, tik dviejuose mėginiuose mikotoksinų iš viso nebuvo aptikta. Rastas mikotoksinų kieki nepriklausė nuo ėdalo klasės ar augalinės kilmės žaliavų kiekio. Brazilijoje atlikto tyrimo metu premium klasės ėdale aflatoksinų, ochratoksino A ir zearalenono buvo rasta daugiau nei ekonominės klasės ėdale (3).

Lenkijoje atliktame tyrime nustatyta, kad gydomuosiuose veterinarinės paskirties ėdaluose dažniausiai randamas mikotoksinas – zearalenonas (ZEA) ir deoksinivalenolis (DON) (7). Mūsų atliktame tyrime dažniau buvo randamas ochratoksina A, tačiau ZEA ir DON rasti didesni kiekiai. Taip pat Lenkijoje atliktame tyrime nustatyta, kad mikotoksinų kiekis nepriklauso nuo augalinės dalies kilmės ėdale ir ėdale gali būti nerandama pelėsinio grybo gaminančio rastą mikotoksiną (7). Mūsų atliktuose tyrimuose matoma, kad mikotoksinų kiekis nepriklauso nuo augalinės kilmės žaliavų dalies esančios ėdale.

Vertinant ėdalo užkrėstumą mikroorganizmais išsiskiria vienas Premium klasės sauso ėdalo mėginys katėms su vištiena, kuriame augalinės kilmės žaliavos sudaro 80 proc., parduotuvėje iš

28

pakuotės perpilamas į parduotuvės talpą, todėl gali būti, kad jo užterštumas susijęs su talpos užterštumu bei dažnu jos atidarymu dėl perkamumo.

Užterštumas enterobakterijomis priklauso nuo augalinės ir gyvulinės kilmės žaliavų. Pagal augalinės kilmės žaliavas, didžiausias užterštumas enterobakterijomis buvo mėginiuose, kuriuose augalinės kilmės ingredientai sudarė 30 proc. ėdalo sudėties. Pagal gyvūninės kilmės žaliavas, enterobakterijomis labiau buvo užkrėsti mėginiai, kurių sudėtyje buvo žuvies, o ne paukštiena.

29

IŠVADOS

1. Enterobakterijų, mielių ir pelėsinių grybų bei bendrą mikroorganizmų kiekis didžiausias mėginių grupėje, kurioje augalinės kilmės žaliavos sudaro 30 proc. sudėties.

2. Nustatytos Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Penicillium, Rhizopus, Verticillium,

Fusarium pelėsinių grybų gentys. Daugiausia Aspergillus (28proc.) ir Penicillium (41 proc.) gentys.

3. Kačių sauso ėdalo tirtuose mėginiuose tik 8 proc. meginių nebuvo rasta nei vieno mikotoksino. Mėginiuose rasti: aflatoksinas B1, deoksinivalenolis, zearalenonas, ochratoksinas A ir toksinas T -2.

30

PADĖKA

Noriu padėkoti savo darbo vadovei lektorei daktarei Jurgitai Jovaišienei už kantrybę, pagalbą ir duotus patarimus atliekant tyrimus bei rengiant baigiamąjį darbą. Taip pat dėkoju docentei daktarei Violetai Baliukonienei bei vyresniajai laborantei Mildai Bulevičienei už pagalbą atliekant tyrimus.

31

5.

LITERATŪROS ŠALTINIAI

1. Swanson, K. S.; Carter, R. A.; Yount, T. P.; Aretz, J.; Buff, P. R. (2013). Nutritional Sustainability of Pet Foods. Advances in Nutrition: An International Review Journal, 4(2), 141– 150. doi:10.3945/an.112.003335

2. Wall, Meredith; Cave, Nick John; Vallee, Emilie (2019). Owner and Cat-Related Risk Factors for Feline Overweight or Obesity. Frontiers in Veterinary Science, 6(), 266– . doi:10.3389/fvets.2019.00266

3. Singh, Sanil D.; Baijnath, Sooraj; Chuturgoon, Anil A. (2017). A comparison of mycotoxin contamination of premium and grocery brands of pelleted cat food in South Africa. Journal of the South African Veterinary Association, 88(), –. doi:10.4102/jsava.v88i0.1480

4. Vinassa, Marica; Vergnano, Diana; Valle, Emanuela; Giribaldi, Marzia; Nery, Joana; Prola, Liviana; Bergero, Domenico; Schiavone, Achille (2020). Profiling Italian cat and dog owners’ perceptions of pet food quality traits. BMC Veterinary Research, 16(1), 131– . doi:10.1186/s12917-020-02357-9

5. Silva, Juliana; Pereira, Marcella Nunes; Scussel, Vildes Maria (2018). Ozone Gas Antifungal Effect on Extruded Dog Food Contaminated with <i>Aspergillus flavus</i>. Ozone: Science & Engineering, (), 1–7. doi:10.1080/01919512.2018.1481361

6. Copetti, M. V., Santurio, J. M., Cavalheiro, A. S., Alves, S. H., Ferreiro, L. Comparison of different culture media for mycological evaluation of commercial pet food, Acta Scientiae Veterinariae 2009, 37(4):P.329-335

7. Witaszak N, Stępień Ł, Bocianowski J, Waśkiewicz A. Fusarium Species and Mycotoxins Contaminating Veterinary Diets for Dogs and Cats. Microorganisms. 2019 Jan 21;7(1):26. doi: 10.3390/microorganisms7010026. PMID: 30669691; PMCID: PMC6352256.

8. Seyedmousavi, S., Guillot, J., Arné, P., de Hoog, G. S., Mouton, J. W., Melchers, W. J. G., & Verweij, P. E. (2015). Aspergillusand aspergilloses in wild and domestic animals: a global health concern with parallels to human disease. Medical Mycology, 53(8), 765– 797. doi:10.1093/mmy/myv067

32

9. Khan, S.N., Hooser S.B., Veterinary clinics of North America Small animal practice, Common toxicologic issues in small animals, Volume 42 – 2

10. Macías-Montes, A., Rial-Berriel, C., Acosta-Dacal, A., Henríquez-Hernández, L. A., Almeida-González, M., Rodríguez-Hernández, Á., Zumbado, M.,Boada, L.D., Zaccaroni, A.,Luzardo, O. P. (2019). Risk assessment of the exposure to mycotoxins in dogs and cats through the consumption of commercial dry food. Science of The Total Environment, 134592. doi:10.1016/j.scitotenv.2019.134592

11. Wen, J., Mu, P., & Deng, Y. (2016). Mycotoxins: cytotoxicity and biotransformation in animal cells. Toxicology Research, 5(2), 377–387.

12. Hughes DM, Gahl MJ, Graham CH, Grieb SL. Overt signs of toxicity to dogs and cats of dietary deoxynivalenol. J Anim Sci. 1999 Mar;77(3):693-700. doi: 10.2527/1999.773693x. PMID: 10229366.

13. Błajet-Kosicka A, Kosicki R, Twarużek M, Grajewski J. Determination of moulds and mycotoxins in dry dog and cat food using liquid chromatography with mass spectrometry and fluorescence detection. Food Addit Contam Part B Surveill. 2014;7(4):302-8. doi: 10.1080/19393210.2014.933269. Epub 2014 Jun 30. PMID: 24919718.

14. Komisijos rekomendacija (ES) 2016/1319 2016 m. liepos 29 d. kuria iš dalies keičiama Rekomendacija 2006/576/EB dėl deoksinivalenolio, zearalenono ir ochratoksino A gyvūnų augintinių ėdale

15. Guardabassi L, Schwarz S, Lloyd DH. Pet animals as reservoirs of antimicrobial-resistant bacteria. J Antimicrob Chemother. 2004 Aug;54(2):321-32. doi: 10.1093/jac/dkh332. Epub 2004 Jul 14. PMID: 15254022.

16. Suchodolski JS. Companion animals symposium: microbes and gastrointestinal health of dogs and cats. J Anim Sci. 2011 May;89(5):1520-30. doi: 10.2527/jas.2010-3377. Epub 2010 Nov 12. PMID: 21075970; PMCID: PMC7199667.

17. Dunham-Cheatham, S. M., Klingler, K., Peacock, M., Teglas, M. B., & Gustin, M. S. (2019). What is in commercial cat and dog food? The case for mercury and ingredient testing. Science of The Total Environment 276-280. doi:10.1016/j.scitotenv.2019.05.337

18. Grandi, M., Vecchiato, C. G., Biagi, G., Zironi, E., Tondo, M. T., Pagliuca, G., … Gazzotti, T. (2019). Occurrence of Mycotoxins in Extruded Commercial Cat Food. ACS Omega, 4(9), 14004–14012. doi:10.1021/acsomega.9b01702

33

19. Gomez Baquero D, Koppel K, Chambers D, Hołda K, Głogowski R, Chambers E 4th. Acceptability of Dry Dog Food Visual Characteristics by Consumer Segments Based on Overall Liking: a Case Study in Poland. Animals (Basel). 2018 May 23;8(6):79. doi: 10.3390/ani8060079. PMID: 29882890; PMCID: PMC6025449.

20. Peachey SE, Harper EJ. Aging does not influence feeding behavior in cats. J Nutr. 2002 Jun;132(6 Suppl 2):1735S-9S. doi: 10.1093/jn/132.6.1735S. PMID: 12042511.

21. Jia J, Frantz N, Khoo C, Gibson GR, Rastall RA, McCartney AL. Investigation of the faecal microbiota of kittens: monitoring bacterial succession and effect of diet. FEMS Microbiol Ecol. 2011 Nov;78(2):395-404. doi: 10.1111/j.1574-6941.2011.01172.x. Epub 2011 Aug 9. PMID: 22092177.

22. Witaszak, N., Waśkiewicz, A., Bocianowski, J., & Stępień, Ł. (2020). Contamination of Pet Food with Mycobiota and Fusarium Mycotoxins—Focus on Dogs and Cats. Toxins, 12(2), 130. doi:10.3390/toxins12020130

23. Russell, K., Murgatroyd, P. R., & Batt, R. M. (2002). Net Protein Oxidation Is Adapted to Dietary Protein Intake in Domestic Cats (Felis silvestris catus). The Journal of Nutrition, 132(3), 456–460.

24. Souza, J. L., Moraes, M. T., Galera, L. A., Abdalla Filho, A. L., Navarro, A. B., Junior, A. A., Mazola, Y. T., Alvarez D. O., Camargo, P.B., Martinelli, L. A. (2020). Identifying the composition of commercial Brazilian cat food with stable isotopes of carbon and nitrogen. Isotopes in Environmental and Health Studies, 1–12. doi:10.1080/10256016.2020.1771331 25. De-Oliveira, L. D., Carciofi, A. C., Oliveira, M. C. C., Vasconcellos, R. S., Bazolli, R. S.,

Pereira, G. T., & Prada, F. (2008). Effects of six carbohydrate sources on diet digestibility and postprandial glucose and insulin responses in cats1. Journal of Animal Science, 86(9), 2237– 2246.

26. Kienzle, E. (2002). Further Developments in the Prediction of Metabolizable Energy (ME) in Pet Food. The Journal of Nutrition, 132(6), 1796S–1798S. doi:10.1093/jn/132.6.1796s

27. Dzanis, D. A. (1994). The Association of American Feed Control Officials Dog and Cat Food Nutrient Profiles: Substantiation of Nutritional Adequacy of Complete and Balanced Pet Foods in the United States. The Journal of Nutrition, 124(suppl_12), 2535S–2539S.

34

28. Watson, T. D. G. (1998). Diet and Skin Disease in Dogs and Cats. The Journal of Nutrition, 128(12), 2783S–2789S. doi:10.1093/jn/128.12.2783s

29. Simpson, J. W. (1998). Diet and Large Intestinal Disease in Dogs and Cats. The Journal of Nutrition, 128(12), 2717S–2722S. doi:10.1093/jn/128.12.2717s

30. Gawor, J. P., Reiter, A. M., Jodkowska, K., Kurski, G., Wojtacki, M. P., & Kurek, A. (2006). Influence of Diet on Oral Health in Cats and Dogs. The Journal of Nutrition, 136(7), 2021S–2023S.

31. Kil, D. Y., & Swanson, K. S. (2011). COMPANION ANIMALS SYMPOSIUM: Role of microbes in canine and feline health1. Journal of Animal Science, 89(5), 1498–1505

32. Grześkowiak, Ł., Endo, A., Beasley, S., & Salminen, S. (2015). Microbiota and probiotics in canine and feline welfare. Anaerobe, 34, 14–23.

33. Sebők, F., Dobolyi, C., Zágoni, D., Risa, A., Krifaton, C., Hartman, M.Cserhati, M., Szoboszlay,S., Kriszt, B. (2016). Aflatoxigenic Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus strains in Hungarian maize fields. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 63(4), 491–502

34. McGinnis, M. R. (2004). Pathogenesis of indoor fungal diseases*. Medical Mycology, 42(2), 107–117. doi:10.1080/13693780410001661473

35. Klich, M. A. (2009). Health effects of Aspergillus in food and air. Toxicology and Industrial Health, 25(9-10), 657–667. doi:10.1177/0748233709348271

36. Lugauskas, A., Paškevičius, A., Repečkienė, J., Patogeniški ir toksiški mikroorganizmai žmogaus aplinkoje, Vilnius: Vaibena, 2002, P. 44 - 78; 128 - 132; 142; 168 - 180; 260 - 294; 312; 386 - 390.

37. Perrone, G., & Susca, A. (2016). Penicillium Species and Their Associated Mycotoxins. Mycotoxigenic Fungi, 107–119. doi:10.1007/978-1-4939-6707-0_5

38. Ma, L.-J., Geiser, D. M., Proctor, R. H., Rooney, A. P., O’Donnell, K., Trail, F., … Kazan, K. (2013). FusariumPathogenomics. Annual Review of Microbiology, 67(1), 399– 416. doi:10.1146/annurev-micro-092412-155650

39. Munkvold, G. P. (2016). Fusarium Species and Their Associated Mycotoxins. Mycotoxigenic Fungi, 51–106. doi:10.1007/978-1-4939-6707-0_4

35

40. Maisto grandinės mikrobiologija. Bendrasis mikroorganizmų skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimas 30 °C temperatūroje sėjimo paviršiuje būdu (ISO 4833-2:2013). Lietuvos standartizacijos departamentas.

41. Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis mielių ir pelėsinių grybų skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas produktuose, kurių vandens aktyvumas yra 0,95 arba mažesnis (tapatus ISO 21527-2:2008).Lietuvos standartizacijos departamentas.

42. Maisto grandinės mikrobiologija. Bendrasis enterobakterijų (Enterobacteriaceae) aptikimo ir skaičiavimo metodas. 2 dalis. Kolonijų skaičiavimo būdas (ISO 21528-2:2017, pataisyta 2018-06-01 versija). Lietuvos standartizacijos departamentas.