LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
MARGARITA KARPINA
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ NOKIMO METU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis
KAUNAS, 2015
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ NOKIMO METU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Data Margarita Karpina
Data
KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Obelų (Malus L.) genties augalų charakteristika, morfologiniai požymiai ir cheminė sudėtis 10 1.1.1. Obelų (Malus L.) genties apibūdinimas ir paplitimas ... 10
1.1.2. Obelų (Malus L.) genties augalų morfologiniai požymiai ... 10
1.1.3. Obuolių cheminė sudėtis ... 11
1.2. Fenolinių junginių biologinė svarba ... 13
1.2.1. Antioksidantinis poveikis ... 13
1.2.2. Priešvėžinis poveikis ... 15
1.2.3. Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 16
1.2.4. Antimikrobinis poveikis ... 18
1.2.5. Uždegimą slopinantis poveikis ... 20
1.2.6. Antidiabetinis poveikis ... 20
1.2.7. Neuroprotekcinis poveikis ... 21
1.3. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.2. Naudoti reagentai ... 24
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės ... 24
2.4. Tyrimo metodai ... 25
2.5. Duomenų statistinis įvertinimas ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų veislių obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 30
3.1.1. Bendro fenolinių junginių kiekio sudėties įvairavimas obuolių nokimo metu ... 30
3.1.2. Bendro flavonoidų kiekio sudėties įvairavimas obuolių nokimo metu ... 33
3.1.3. Bendro proantocianidinų kiekio sudėties įvairavimas obuolių nokimo metu ... 34
3.2. Askorbo rūgšties kiekinės sudėties įvairavimo nustatymas obuolių ėminių ekstraktuose titrimetriniu metodu ... 36
3.3. Obuolių ėminių antioksidantinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu ... 38
3.3.1. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas obuolių ėminių ekstraktuose DPPH radikalų surišimo metodu ... 39
3.3.2. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas obuolių ėminių ekstraktuose FRAP redukciniu metodu ... 40
3.3.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas obuolių ėminių ekstraktuose TFPH radikalų- katijonų surišimo metodu ... 42
3.4. Fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų suminių kiekių ir ekstraktų antioksidantinio aktyvumo koreliacinių ryšių įvertinimas ... 44
3.5. Tyrimų rezultatų apibendrinimas ... 45
4. IŠVADOS ... 46
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48
7. PRIEDAI ... 53
SANTRAUKA
M. Karpinos magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. habil. dr. V. Janulis;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas obuolių nokimo metu.
Tyrimo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą jų nokimo metu ir įvertinti jų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Tyrimo uždaviniai: 1. Nustatyti obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą jų nokimo metu. 2. Nustatyti obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių askorbo rūgšties kiekinės sudėties įvairavimą jų nokimo metu. 3. Ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių etanolinių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą DPPH, FRAP ir TFPH metodais. 4. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp ‘Connel Red’ ir 'Ligol' veislių obuolių ekstraktų sudėtyje esančių fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo.
Tyrimo objektas ir metodai: Obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių ėminiai skinti skirtingais fenologiniais tarpsniais 2013 metais birželio–lapkričio mėnesiais. Bendras fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekis obuolių ėminiuose nustatytas UV spektrofotometriniu metodu., askorbo rūgšties kiekis – titruojant 2,6-dichlorfenolindofenolio natrio druskos tirpalu.
Obuolių ekstraktų antioksidantinis aktyvumas nustatytas DPPH, FRAP ir TFPH metodais.
Rezultatai: Obuolių vystymosi ir nokimo tarpsnio metu bendras fenolinių junginių kiekis obuolių ėminių ekstraktuose varijavo nuo 7,20 mg GAE/g iki 77,23 mg GAE/g 'Connel Red' ir nuo 8,12 mg GAE/g iki 80,26 mg GAE/g 'Ligol' veislėse. Bendras flavonoidų kiekis varijavo nuo 0,81 mg RE/g iki 3,27 mg RE/g 'Connel Red' ir nuo 0,63 mg RE/g iki 3,61 mg RE/g 'Ligol' veislėse. Bendras proantocianidinų kiekis varijavo nuo 3,10 mg/g iki 18,00 mg/g 'Connel Red' ir nuo 2,67 mg/g iki 18,13 mg/g 'Ligol' veislėse. Askorbo rūgšties kiekis varijavo nuo 0,029 proc. iki 0,058 proc. 'Connel Red' ir nuo 0,031 proc. iki 0,058 proc. 'Ligol' veislėse. Didžiausios TE reikšmės ('Connel Red' – 735,27
± 25,38 μmol TE/g, 'Ligol' – 715,63 ± 24,19 μmol TE/g) nustatytos ištyrus obuolių ėminių etanolinius ekstraktus FRAP metodu. Stipriausi koreliaciniai ryšiai (0,963 – 0,997) nustatyti tarp fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekių ir FRAP metodu įvertinto obuolių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo.
Išvados: Obuolių vystymosi ir nokimo tarpsnio metu didžiausi fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų ir askorbo rūgšties kiekiai nustatyti jų vystymosi tarpsnio pradžioje (birželio 17 d.), todėl šiuo tarpsniu metu rekomenduojame vykdyti obuolių paruošas ekstraktų gamybai ar individualių junginių išskyrimui.
SUMMARY
M. Karpina final master’s thesis/ research supervisor prof. habil. dr. V. Janulis; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis.-Kaunas.
Title: Variation of quantitative composition of phenolic compounds in apples during ripening.
The aim of the research – to investigate variation of quantitative composition of phenolic compounds in Lithuania grown apples cultivars 'Connel Red' and 'Ligol' in apples during ripening and to evaluate the antioxidant activity of these extracts.
The objectives of the research: 1. To determine variation of total content of phenolic compounds in apple cultivars 'Connel Red' and 'Ligol' apples during ripening. 2. To determine variation of quantitative composition of ascorbic acid in apple cultivars 'Connel Red' and 'Ligol' apples during ripening. 3. To investigate antioxidant activity of ethanolic apple extracts by performing DPPH, FRAP and TFPH methods of Lithuania grown apples cultivars 'Connel Red' and 'Ligol'. 4. To evaluate correlation between 'Connel Red' and 'Ligol' cultivars of apple extracts containing quantitative composition of phenolic compounds, flavonoids, proanthocyanidins and antioxidant activity.
Object and methods: Apple fruits samples of cultivars 'Connel Red' and 'Ligol' were collected in 2013 on different phonological stages from June to November. The total content of phenolic compounds, flavonoids and proanthocyanidins in apples samples was performed using UV- VIS spectrophotometric method, ascorbic acid - titration with 2,6-dichlorphenolindophenol sodium salt solution. Antioxidant activity was assessed by DPPH, FRAP and TFPH spectrophotometric methods.
Results: Total content of phenolic compounds in apples samples ethanolic extracts during ripening period varied from 7,20 mg GAE/g to 77,23 mg GAE/g in 'Connel Red' cultivar and from 8,12 mg GAE/g to 80,26 mg GAE/g in 'Ligol' cultivar. Total content of flavonoids varied from 0,81 mg RE/g to 3,27 mg RE/g in 'Connel Red' cultivar and from 0,63 mg RE/g to 3,61 mg RE/g in 'Ligol' cultivar. Total content of proanthocyanidins varied from 3,10 mg/g to 18,00 mg/g in 'Connel Red' cultivar and from 2,67 mg/g to 18,13 mg/g in 'Ligol' cultivar. Content of ascorbic acid varied from 0,029 percent to 0,058 percent in 'Connel Red' cultivar and from 0,031 percent to 0,058 percent in 'Ligol' cultivar. The highest TE values ('Connel Red' – 735,27 ± 25,38 μmol TE/g, 'Ligol' – 715,63 ± 24,19 μmol TE/g) in apple samples ethanol extract was assessed FRAP method. The strongest correlation (0,963 – 0,997) between phenolic compounds, flavonoids and proanthocyanidins content and antioxidant activity was estimated using FRAP method.
Conclusion: During development and ripening stages of apples major phenolic compounds, flavonoids, proanthocyanidins and ascorbic acid were determined at the beginning of their stage of development (17 June). Therefore at this stage we recommend to carry out the set-ups of apple extracts production or extraction of individual compounds.
SANTRUMPOS
COX – ciklooksiginazė
DMCA – 4-dimetilaminocinamaldehidas;
DNR – deoksiribonukleorūgštis;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas FRAP – trivalentės geležies jonų redukcijos jėga LOX – lipooksigenazės
MMP – matrikso metaloproteinazė
NADH – nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma
NADPH – nikotinamido adenino dinukleotido fosfato redukuota forma NO – azoto oksidas
NOS – azoto oksido sintazė RNR – ribonukleorūgštis
ROS – reaktyvios deguonies formos TE – trolokso ekvivalentas
TFPH – trifluorperazino dihidrochlorido radikalo-katijonas TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas
UDP – uridin-difosfatas
ĮVADAS
Pastaruoju metu suintensyvėjo vaistinių augalų tyrinėjimai ir vaistinės augalinės žaliavos panaudojimas medicinoje, odontologijoje, farmacijos, kosmetikos bei maisto pramonėje. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, apie 35 – 40 proc. vaistinių preparatų pasaulyje yra gaminama iš vaistinės augalinės žaliavos. Augaliniai vaistiniai preparatai pasižymi farmakologinio poveikio įvairove, paprastai yra geriau toleruojami ir rečiau sukelia nepageidaujamą poveikį nei cheminiai vaistai [1]. Vaistiniai augalai kaupia biologiškai aktyvius junginius, kurie pasižymi įvairiais biologiniais poveikiais. Svarbu nustatyti biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus augalų vegetatyviniuose ir generatyviniuose organuose, cheminės sudėties įvairavimą, priklausanti nuo žaliavos rinkimo datos bei įvertinti augalų augimo vietoves, augimo ir laikymo sąlygas. Šiuo metu didelis mokslininkų dėmesys yra skiriamas augalinių žaliavų cheminės įvairovės tyrimams. Tyrimų metu gauti rezultatai sudaro galimybę naudoti maisto produktus su žinoma chemine sudėtimi sveikatinimo tikslams.
Obuoliai yra vieni iš labiausiai auginamų ir plačiausiai vartojamų vaisių visame pasaulyje, kurie užima svarbią vietą žmogaus mitybos racione. Juose gausu organinių rūgščių, monosacharidų, pektinų, skaidulinių medžiagų, vitaminų, mineralinių medžiagų ir įvairių biologiškai aktyvių junginių [2, 3]. Obuoliuose nustatyti biologiškai aktyvūs junginiai – fenoliniai junginiai, kurie pasižymi antioksidantinėmis, priešvėžinėmis, antimikrobinėmis bei širdies ir kraujagyslių sistemą stiprinančiomis savybėmis [4]. Atlikti epidemiologiniai tyrimai įrodė, kad kasdien vartojant vaisius, uogas ir daržoves, kuriuose gausu fenolinių junginių, sumažėja riziką susirgti kai kuriomis vėžio formomis, širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis, cukriniu diabetu bei degeneracinėmis ligomis [5, 6].
Skirtingų obuolių veislių fitocheminė sudėtis tirta tiek Lietuvoje, tiek kitose šalyse, tačiau biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumai nokstant obuoliams Lietuvoje nėra tyrinėti, o kitose šalyse tirti mažai. Tokio pobūdžio tyrimus yra aktualu atlikti Lietuvoje moksliniu ir praktiniu požiūriu, siekiant įvertinti obuolių cheminės sudėties įvairavimą vaisių nokimo metu, nustatyti laikotarpį, kada sukaupiamas didžiausias biologiškai aktyvių junginių kiekis bei kada geriausiai vykdyti obuolių paruošas. Tyrimu metu gauti rezultatai gali būti naudingi vertinant obuolių naudą žmogaus sveikatai bei potencialų panaudojimą vaistinių preparatų, maisto papildų ar kosmetikos produktų gamyboje.
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą jų nokimo metu ir įvertinti jų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą jų nokimo metu ir įvertinti jų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą jų nokimo metu.
2. Nustatyti obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių askorbo rūgšties kiekinės sudėties įvairavimą jų nokimo metu.
3. Ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių 'Connel Red' ir 'Ligol' obuolių etanolinių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą DPPH, FRAP ir TFPH metodais.
4. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp 'Connel Red' ir 'Ligol' veislių obuolių ekstraktų sudėtyje esančių fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Obelų (Malus L.) genties augalų charakteristika, morfologiniai požymiai ir cheminė sudėtis
1.1.1. Obelų (Malus L.) genties apibūdinimas ir paplitimas
Karalystė: Augalai (lot. Plantae)
Skyrius: Magnolijūnai (lot. Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (lot. Magnoliopsida) Poklasis: Erškėčiažiedžiai (lot. Rosidae) Eilė: Erškėtiečiai (lot. Rosales)
Šeima: Erškėtiniai (lot. Rosaceae) Pošeimis: Obeliniai (lot. Maloideae) Gentis: Obelis (lot. Malus) [7].
Obelų (Malus L.) genties augalai priklauso obelinių (lot. Maloideae) pošeimiui, erškėtinių (lot. Rosaceae) šeimai [1]. Manoma, kad šie augalai yra kilę iš Centrinės Azijos, Kazachijos kalnų regionų, o iš ten plito po kitus kraštus [8].
Obelų gentyje priskaičiuojama apie 35 rūšys, kurios yra paplitusios Europoje (išskyrus arktines ir subarktines sritis), vidutinio klimato Azijoje, Šiaurės Amerikoje. Ypač daug rūšių Kryme, Kaukaze, Centrinės Azijos kalnų lapuočių miškuose ir krūmynuose. Lietuvoje savaime paplitusi 1 rūšis – miškinė obelis (Malus sylvestris L.), kitos rūšys ir veislės auginamos [9].
1.1.2. Obelų (Malus L.) genties augalų morfologiniai požymiai
Obelis – vidutinio aukščio medis, kartais krūmas. Šakos dažniausiai rausvai rudos spalvos.
Pumpurai pražanginiai, buki, rausvai rudi, 3-8 mm ilgio, padengti 2-6 spirališkai išsidėsčiusiais žvyneliais, kurių viršūnė aiškiai tridantė. Lapai paprasti, pražanginiai, ištisiniai arba skiautėti, kotuoti, su greitai nukrentančiais prielapiais. Žiedai dvilyčiai, sukrauti skėčiuose arba skėtiškose kekėse bei šluotelėse. Taurėlapių ir vainiklapių po 5. Vainiklapiai balti, rožiniai, raudoni arba purpuriniai, su ryškiu nageliu, mažai plaukuoti. Kuokelių 18-50. Mezginė apatinė, su 3-5 lizdais. Liemenėliai 3-5,
kartais labiau, kartais mažiau tarpusavyje suaugę. Netikrasis vaisius – rutuliškas arba pailgas obuolys – su 3-5 lizdais ir 2 (3) sėklomis lizde. Minkštimas paprastai be sukietėjusių ląstelių. Sėklos pailgai arba plačiai kiaušiniškos, rudos arba pilkos [9, 10].
Skirtingų obelų veislių obuoliai prinoksta skirtingu laiku ir skirstomos į vasarines, rudenines ir žiemines. Kiekvienoje iš šių grupių išskiriami pogrupiai: ankstyva vasarinė, vasarinė, vėlyva vasarinė ir t.t. Obuoliai priklausomai nuo veislės būna įvairaus dydžio, spalvos ir skonio. Obelų vaisiai skirstomi į 7 dydžio grupes: labai smulkūs – iki 26 g, smulkūs – 26-50 g, smulkesni už vidutinius – 51- 75 g, vidutiniai – 76-100 g, stambesni už vidutinius – 101-125 g, stambūs – 126-175 g, labai stambūs – daugiau kaip 175 g [11].
Daugumos veislių obuolių odelė būna skirtingos spalvos: viena spalva, paprastai šviesesnė – žalia, žalsvai gelsva, gelsva, šviesiai geltona, auksinė, vadinama pagrindinė, o kita, paprastai ryškesnė – rausva, raudona, oranžinė, purpurinė, vadinama papildomąja. Vaisiaus minkštimas gali būti baltas, kreminis, gelsvas, žalsvas, rausvas ar raudonas, o taip pat yra traškus ar minkštas, sausas ar labai sultingas, švelnus, tirpstantis burnoje, vidutinio sultingumo ar visai nesultingas, smulkiai arba stambiai grūdėtas. Obuolių skonį apsprendžia jų sudėtyje esantis organinės rūgštys ir angliavandeniai. Jie būna saldūs, rūgštūs, saldžiai rūgštūs, rūgščiai saldūs ir kt. [12].
Dauginasi sėklomis, nors pasitaiko ir vegetatyvinio dauginimosi šaknų atžalomis atvejų.
Obelis žydi balandžio – gegužės mėnesiais, vaisiai prinoksta rugsėjo – spalio mėnesiais [9]. Obelis yra atsparus sausrai ir šalčiui, pakenčia pavėsį, bet geriausiai auga derlingame arba vidutinio derlingumo, puriame, laidžiame, priemolio dirvožemyje, pH 6–7, saulės apšviestose ir lengvai vėjo prapučiamose sodybos vietose [13].
1.1.3. Obuolių cheminė sudėtis
Obuolių cheminė sudėtis kinta jų vystymosi ir nokimo metu. Cheminės sudėties įvairavimą įtakoja šie veiksniai: obuolių veislė, augimo regionas, medžių amžius bei jų fiziologinė būklė, klimatinės sąlygos (drėgmė, šviesa), dirvožemis, sunokimo laipsnis, derliaus nuėmimo laikas, laikymo sąlygos bei laikymo trukmė [14, 15].
Obuoliuose yra nustatyta įvairių biologiškai aktyvių junginių grupių, iš kurių svarbiausi yra fenoliniai junginiai [3, 16]. Pagrindinės obuoliuose nustatytos fenolinių junginių grupės yra flavan-3- oliai (19,6–55,8 mg), flavonoliai (17,7–33,1 mg), fenolinės rūgštys (10,6–80,3 mg), dihidrochalkonai (1,0–9,3 mg) ir antocianinai (0,1–6,5 mg) [17]. Obuoliuose nustatyti flavan-3-olių monomerai: (+)- katechinas ir (-)-epikatechinas), dimerai: proantocianidinai (procianidinas B1 ir B2), oligomerai:
procianidinas C1, flavonoliai – kvercetinas ir jo glikozidai: kvercetino-3-O-rutinozidas (rutinas),
kvercetino-3-O-galaktozidas (hiperozidas), kvercetino-3-O-gliukozidas (izokvercitrinas), kvercetino-3- O-ksilozidas (reinotrinas), kvercetino-3-O-ramnozidas (kvercitrinas), kvercetino-3-O-arabinozidas (avikuliarinas), fenolinės rūgštys – hidroksicinamono rūgštys: chlorogeno, p-kumaro, kavos, ferulo bei sinapo ir hidroksibenzo rūgštis: galo, dihidrochalkonai: floretino-2’-O-ksilogliukozidas ir floridzinas, antocianinai: cianidino glikozidai, ypač cianidino-3-galaktozidas [18, 19].
Ceymann ir kt. ištyrę 104 Šveicarijoje užaugintų obuolių rūšis, nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis obuoliuose varijuoja nuo 52 iki 379 mg/100 g [2]. Tsao ir kt. ištyrę 8 obuolių veislių žieveles ir minkštimus, nustatė, kad bendras fenolinių junginių kiekis minkštime varijuoja nuo 17,74 iki 93,36 mg/100 g, žievelėje – nuo 101,65 iki 235,04 mg/100 g [20]. Obuolių žievelėje flavan-3-olių monomerai ir polimerai sudaro apie 60 proc. viso fenolinių junginių kiekio, po flavonolių (18 proc.), hidroksicinamono rūgščių (9 proc.), dihidrochalkonų (8 proc.) ir antocianinų (5 proc.). Obuolių minkštime esantys procianidinai sudaro apie 56 proc. viso fenolinių junginių kiekio, po hidroksicinamono rūgščių (40 proc.) ir dihidrochalkonų (4 proc.) [21]. Mokslinės literatūros šaltiniuose nurodoma, kad ženkliai didesni kvercetino glikozidų kiekiai nustatyti obuolių žievelėje nei minkštime, o chlorogeno rūgšties kiekiai didesni yra obuolių minkštime nei žievelėje [22]. Obuolių žievelėje taip pat nemažai yra lipofilinių triterpenoidų, kurie kaupiasi vaškiniame obuolių žievelės sluoksnyje ir turi potencialų antioksidantinį aktyvumą. Ursolo ir oleanolo rūgštys yra dominuojantys triterpenai obuolių žievelėje [16, 23]. Obuolių sėklose aptinkama 0,6 proc. glikozido - amigdalino, riebiojo aliejaus ir jodo [13].
Obuoliuose yra apie 85 proc. vandens, pektinų (vidutiniškai – 5 mg/g), fitosterolų (12 mg), angliavandenių (vidutiniškai – 14 mg/g): fruktozės, gliukozės, sacharozės, maltozės, galaktozės, ribozės, ksilozės, krakmolo ir kt [3, 13]. Nustatyta organinių rūgščių (bendras kiekis – 75-100 mg/g):
obuolių, vyno, citrinos, gintaro, maleino, fumaro, chinino [3]. Identifikuotos riebiosios rūgštys:
palmitino, stearino, palmitoleino, oleino, linolio, linoleno, eikozano, arachido, arachidono bei aminorūgštys: asparagino, arginino, alanino, fenilalanino, cisteino, glicino, glutamino, histidino, izoleucino, leucino, lizino, serino, metionino, prolino, treonino, triptofano, tirozino, valino [3, 13].
Obuoliuose nustatyta mineralinių medžiagų kalio (107-144 mg/g), kalcio (6-7 mg/g), fosforo (11-12 mg/g), magnio (5-6 mg/g), geležies (0,12 mg), mangano (0,035 mg), natrio (1 mg), vario (0,027 mg), cinko (0,04 mg) druskų pavidalu [13, 15]. Nustatyta ir vitaminų – askorbo rūgšties (vidutiniškai – 4-12 mg/g), B grupės vitaminų, iš jų daugiausia piridoksino (vitamino B6) ir PP vitamino, filochinono (vitamino K1), mažesni kiekiai retinolio (vitamino A) ir tokoferolio (vitamino E) [13].
Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad neprinokusiuose obuoliuose yra daugiau krakmolo, obuolių rūgšties, ląstelienos, pektinų, raugų, o fenolinių junginių, proantocianidinų ir flavonoidų yra 10 kartų daugiau negu sunokusiuose obuoliuose [24].
1.2. Fenolinių junginių biologinė svarba
Fenoliniai junginiai – antriniai augalų metabolitai, kurie yra plačiai paplitę augaluose. Jų daugiausia susikaupia vaisiuose, uogose, daržovėse bei riešutuose, kuriuos žmogus vartoja maistui [25, 26]. Fenolinių junginių svarba žmogaus mitybai ir ligų profilaktikai patvirtinta moksliniais tyrimais.
Nustatyta, kad kasdien vartojant didelį kiekį vaisių, daržovių ir neskaldytų grūdų, kuriuose gausu šių junginių, sumažėja daugeliu lėtinių ligų: vėžio, širdies ir kraujagyslių, nutukimo, cukrinio diabeto bei degeneracinių ligų išsivystymo riziką [5].
Fenoliniai junginiai pasižymi plačiu farmakologinio poveikio spektru – antioksidantiniu, priešuždegiminiu, antialerginiu, priešvėžiniu [27], antimikrobiniu (antibakteriniu, priešgrybeliniu, antivirusiniu), vazodilataciniu, antisklerotiniu, antitrombiniu, diuretiniu [28, 29], spazmolitiniu, antiopiniu, estrogeniniu [28], neuroprotektiniu, hepatoprotektiniu, imunomoduliuojamu poveikiais [29]. Tyrimais nustatyta, kad fenolinės rūgštys ir flavonoidai pasižymi ir antidiabetiniu poveikiu.
Nustatyta, kad fenolinės rūgštys skatina tulžies išsiskyrimą, mažina cholesterolio kiekį kraujyje bei pasižymi antioksidantiniu ir antimikrobiniu aktyvumu [25]. Flavonoidai normalizuoja kraujagyslių pralaidumą, padidina jų elastingumą bei sudaro kompleksus su sunkiųjų metalų jonais, todėl gali būti vartojami apsinuodijus sunkiaisiais metalais [18].
1.2.1. Antioksidantinis poveikis
Antioksidantai – junginiai, kurie slopina ar sustabdo oksidacijos procesus, neutralizuoja laisvuosius radikalus ir tokiu būdu padeda apsaugoti organizmo ląsteles nuo žalingo oksidacinio streso poveikio. Oksidacinis stresas – pusiausvyros sutrikimas tarp laisvųjų radikalų susidarymo ir organizmo apsauginės antioksidantinės sistemos veikimo. Oksidacinis stresas sukelia fermentų, baltymų, DNR ir lipidų oksidacinius pažeidimus bei skatina lėtinių ligų atsiradimą ir vystymąsi [30]. Fenoliniai junginiai yra stipraus poveikio antioksidantai, apsaugantys fermentus ir vitaminus nuo oksidacinio streso, kuri sukelia reaktyvios deguonies/azoto radikalų formos. Fenoliniai junginiai neutralizuoja žalingus laisvuosius radikalus atiduodami elektroną ar vandenilio atomą. Pastaraisiais metais atlikti moksliniai tyrimai pagrindžia fenolinių junginių vaidmenį lėtinių ligų prevencijoje, ypač vėžio, širdies ir kraujagyslių bei neurodegeneracinių ligų [5]. Nustatyta, kad fenolinių rūgščių ir flavonoidų antioksidantinė galia yra daug didesnė nei vitamino C, E ir karotinoidų [25, 30, 31].
Fenolinių junginių (fenolinių rūgščių ir flavonoidų) antioksidantines savybes galima paaiškinti keliais mechanizmais:
1) Vienas svarbiausių fenolinių junginių antioksidantinio poveikio mechanizmų yra jų gebėjimas surišti ir inaktyvuoti laisvuosius radikalus. Dėl savo mažo oksidacijos-redukcijos potencialo, fenoliniai junginiai gali efektyviai surišti hidroksilo, vandenilio peroksido, superoksido, alkoksilo, peroksilo, azoto oksido ir peroksinitrilo radikalus [25, 31, 32].
2) Fenoliniai junginiai skatina antioksidantiniu poveikiu pasižyminčių fermentų išsiskyrimą. Jie gali aktyvuoti II fazės detoksifikuojančių NAD(P)H-kvinono oksidoreduktazės, glutationo S- transferazės ir UDP-gliukuronoziltransferazės, kurie yra pagrindiniai gynybos fermentai prieš elektrofilinius toksinus ir oksidacinio streso sukeltus pažeidimus, ir genų, koduojančių antioksidantinių glutationo peroksidazės, katalazės ir superoksido dismutazės fermentų ekspresiją [5, 21, 31]. Efektyviausi aktyvintojai yra flavonoidai, kurie C žiede C3 padėtyje turi hidroksilo grupę, pavyzdžiui, kvercetinas [28].
3) Fenoliniai junginiai slopina fermentus, inicijuojančius uždegimus, kurių metu didėja laisvųjų radikalų gamyba. Jie slopina oksidazių, tokių kaip ksantino oksidazės ir baltymų kinazės C, kurios sukelia superoksido anijono radikalų susidarymą, azoto oksido sintazės, gaminančios azoto oksido radikalus, mieloperoksidazės, lemiančios hipochloritinės rūgšties (HOCl) susidarymą, aktyvumą. Flavonoidai taip pat gali slopinti ciklooksigenazes, lipoksigenazes, mikrosominę monooksigenazę mitochondrijų sukcinoksidazę, NADH oksidazę, kurie dalyvauja laisvųjų radikalų susidaryme [31, 32].
4) Fenoliniai junginiai pasižymi gebėjimu surišti metalų jonus (ypač Fe2+ ir Cu+). Jie sudaro kompleksinius junginius su metalų jonais, taip nutraukia Fentono ir Haberio-Veiso reakcijas ir tokiu būdu apsaugo ląsteles nuo oksidacijos, kuria sukelia reaktyvūs laisvieji radikalai [5].
Įrodyta, kad kvercetinas sudaro kompleksinius junginius su dvivalenčiu kadmiu ir pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu in vitro tyrimuose, todėl gali būti potencialus priešnuodis apsinuodijus kadmiu [31].
5) Fenoliniai junginiai gali apsaugoti kitus antioksidantus nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio. Fenoliniai junginiai pasižymi gebėjimu regeneruoti α-tokoferolį iš α-tokoferolio radikalo vandenilio atomų atidavimo reakcijos metu. Pavyzdžiui, kvercetinas gali apsaugoti vitaminą E, esantį mažo tankio lipoproteinuose, surišdamas laisvuosius radikalus [31].
Fenolinių junginių antioksidantines savybes lemia jų molekulinė struktūra [16]. Fenolinių rūgščių ir jų esterių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus ir padėties molekulėje atsižvelgiant į karboksilo grupę. Didėjant hidroksilo grupių skaičiui jų molekulėje, didėja ir jų antioksidantinis aktyvumas. Galo rūgštis turinti tris hidroksilo grupes pasižymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis. Hidroksilo grupių pakeitimas metoksi grupe fenolio žiedo C3- ir C5- padėtyse mažina antioksidantinį aktyvumą. Nustatyta, kad hidroksicinamono rūgščių antioksidantinis aktyvumas yra stipresnis nei hidroksibenzenkarboksirūgščių. Tai aiškinama tuo, kad hidroksicinamono
rūgščių molekulėje yra CH=CH-COOH grupė, kurios dėka užtikrinamas didesnis vandenilio atomo atidavimas bei radikalų stabilizavimas nei –COOH grupė hidroksibenzenkarboksirūgštyse [33].
Flavonoidų molekulinė struktūra paprastai yra sudėtingesne nei fenolinių rūgščių [33].
Flavonoidų struktūros ypatumai, kurie apsprendžia efektyvų radikalų surišimą ir didesnį antioksidantinį aktyvumą, yra: 1) orto-dihidroksi grupė B žiede (katecholio struktūra); 2) dviguba jungtis tarp 2 ir 3 anglies atomų, sujungtos su C4-okso grupe C žiede; 3) C3 ir C5 hidroksilo grupės, sujungtos su C4-okso grupe A ir C žiede [30, 31]. Flavonoliai, kurių sudėtyje yra daug hidroksilo grupių pasižymi stipriomis radikalus surišančiomis savybėmis. Pavyzdžiui kvercetinas, rutinas ir kvercitrinas yra žinomi kaip stipraus poveikio antioksidantai [16].
Atlikta tyrimų, kurių dėka buvo siekta išaiškinti šviežių obuolių poveikį oksidacijos procesams žmogaus organizme. Turkijoje atliktas tyrimas su 15 senyvo amžiaus žmonėmis (vidutinis amžius 72 m., 8 moterys, 7 vyrai), kurie valgė šviežių obuolių 2 g/kg per parą. Tyrimo rezultatai buvo lyginami prieš ir po tyrimo siekiant įvertinti dalyvių eritrocitų ir plazmos antioksidantinį aktyvumą.
Nustatyta, kad obuolių vartojimas padidina antioksidantinių fermentų, įskaitant superoksido dismutazes ir glutationo peroksidazes, aktyvumą eritrocituose ir bendrą antioksidantinį potencialą plazmoje. Fermentų padidėjimas rodo, kad kasdieninis obuolių vartojimas mažina oksidacijos procesus organizme [34].
1.2.2. Priešvėžinis poveikis
Fenolinių junginių priešvėžinis poveikis yra siejamas su jų antioksidantinėmis savybėmis.
Tyrimais nustatyta, kad valgant fenolinių rūgščių ir flavonoidų turinčių vaisių ir daržovių sumažėja tikimybė susirgti daugelio vėžio formomis [25]. Fenoliniai junginiai slopina vėžinių ląstelių augimą, matrikso metaloproteinazių (MMP) sekreciją, navikinių ląstelių proliferaciją, inhibuoja baltymų kinazės aktyvumą, pasižymi antiangiogeninėmis savybėmis bei skatina vėžinių ląstelių apoptozę [35].
Nustatyta, kad galo rūgštis kaip natūralus antioksidantas pasižymi selektyviu citotoksiniu poveikiu prieš vėžines ląsteles ir neturi poveikio sveikoms ląstelėms. Chlorogeno ir kavos rūgštys in vitro slopina mutageniniu ir kancerogeniniu poveikiu pasižyminčių junginių susidarymą. Literatūroje yra duomenų, jog fenolinės rūgštys gali slopinti krūties, plaučių ir skrandžio navikinių ląstelių augimą [16].
Flavonoidai slopina karcinogenezę ir mutagenezę. Nustatyta, kad flavonoidai – apigeninas, fizetinas ir liuteolinas yra vėžinių ląstelių proliferacijos inhibitoriai [28]. Nustatyta, kad kvercetinas ir apigeninas inhibuoja melanomos augimą [28, 36]. Išskirti iš braškių polifenoliai (kemferolis, kvercetinas, antocianinai, kumarino ir elago rūgštys) slopina žmogaus krūties (MCF-7), burnos ertmės
(KB, CAL-27), storosios žarnos (HT-29, HCT-116) ir prostatos (LNCaP, DU-145) vėžinių ląstelių augimą ir dalijimąsi. Tyrimo rezultatai patvirtino ankstesniuose tyrimuose gautus rezultatus su žaliąja arbata ir vynuogių ekstraktu [25]. Tyrimai in vitro ir su gyvūnais parodė, kad stipriausiu priešvėžiniu aktyvumu pasižymi kvercetino grupės flavonoliai. Kvercetinas dėka savo antioksidantinių savybių, neleidžia reaktyvioms deguonies formoms sukelti DNR pažeidimų ir taip apsaugo nuo mutacijų [36].
Atlikti tyrimai su gyvūnais įrodo, kad obuoliai gali apsaugoti nuo odos, krūties ir storosios žarnos vėžio, o epidemiologiniai tyrimai parodė, kad kasdien valgant bent vieną obuolį sumažėja rizika susirgti plaučių ir storosios žarnos vėžiu [17].
Tyrimų su žiurkėmis metu buvo siekiama nustatyti obuolių ekstraktų poveikį žiurkių krūties vėžinėms ląstelėms bei išsiaiškinti, ar obuolių ekstraktai slopina krūties vėžinių ląstelių proliferaciją ir veikia apoptozę in vivo. 24 savaites trukusio tyrimo metu žiurkėms buvo duodama maža (3,3 g/kg kūno masės), vidutinė (10 g/kg) ir didelė (20 g/kg) obuolių ekstrakto dozė, kuriuos atitinkamai prilygsta žmogaus suvalgomam vienam, trims ir šešiems obuoliams per dieną. Gauti rezultatai parodė, kad obuolių ekstraktas geba mažinti navikinių ląstelių veiklumą ir slopinti žmogaus krūties vėžio ląstelių proliferaciją bei apoptozę. Buvo įrodyta fenolių ir flavonoidų, obuoliuose bei kituose vaisiuose ir daržovėse, svarba [37].
Lenkijos mokslininkai, Jogailos universiteto Medicinos koledže atliko tyrimą, kurio metu nustatyta, kad reguliariai valgant obuolius sumažėja tikimybė susirgti storosios ir tiesiosios žarnos vėžiu. Tyrime dalyvavo 592 onkologiniai ligoniai ir 765 sveiki asmenys. Sergantieji kasdien vidutiniškai suvalgydavo po devynis obuolius, o sveikieji po vienuolika obuolių. Gauti rezultatai parodė, kad obuolius valgę tyrimo dalyviai sumažino riziką susirgti žarnyno vėžiu daugiau nei 50 proc.
Mokslininkai teigia, kad obuoliai šiai dienai yra vienas iš nedaugelio vaisių, kurie tiesiogiai gali apsaugoti nuo vėžio [38].
1.2.3. Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
Tyrimais nustatyta, kad obuolių vartojimas yra siejamas su mažesne rizika susirgti širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis. Suomijoje atliktas tyrimas parodė, kad moterims, kurios valgė 71 g ir daugiau obuolių per dieną, 43 proc. sumažėjo mirtingumas nuo koronarinės širdies ligos, lyginant su moterimis, kurios nevalgė obuolių. Vyrams, rizika sumažėjo 19 proc. valgant 54 g ir daugiau obuolių per dieną, lyginant su vyrais, kurie jų nevalgė. Tyrimas patvirtinto rezultatus, kurie buvo gauti ir paskelbti ankstesniuose tyrimuose [34]. Obuoliai pasižymi šiomis savybėmis, dėl juose esančių biologiškai aktyvinių junginių – fenolinių junginių (kvercetino, katechino, floridzino, chlorogeno rūgšties).
Flavonoidai apsaugo kraujagyslių endotelio ląsteles, didina azoto oksido išsiskyrimą, atpalaiduoja kraujagysles, mažina kraujospūdį bei pagerina arterijų standumą [6, 39].
Endotelio disfunkcija ir sumažėjęs išsiskiriančio azoto oksido kiekis yra vieni svarbiausių ir anksčiausiai atsirandančių aterosklerozės ir širdies ir kraujagyslių ligų patogenezės veiksnių [29].
Literatūroje aprašyti 2 pagrindiniai flavonoidų poveikio mechanizmai, kurie turi teigiamą poveikį endotelio funkcijai. Pirmas, flavonoidai patekę į organizmą yra metabolizuojami į fenolines rūgštis, kurios pasižymi radikalus neutralizuojančiu poveikiu. Kitas jų poveikio mechanizmas yra tai, kad flavonoidai yra oksidazių inhibitoriai, kurios sukelia superoksido anijono radikalų susidarymą.
Flavonoidai ir jų metabolitai turi priešuždegiminį ir antioksidantinį aktyvumą, sumažina reaktyvių deguonies/azoto formų gamybą ir tokiu būdu sustiprina endotelio funkciją [40].
Fenoliniai junginiai pasižymi antihipertenziniu poveikiu, kuris gali būti paaiškinamas ne tik azoto oksido kiekio padidėjimu, bet ir gebėjimu tiesiogiai slopinti angiotenziną konvertuojantį fermentą [6]. Atlikti eksperimentiniai tyrimai su žiurkėmis parodė, kad fenoliniai junginiai mažina arterinį kraujospūdį ir padidina vazodilatacinį procesą [29]. Nustatytas tiesioginis flavonoido – kvercetino antihipertenzinis poveikis. Kvercetinas slopina fermentą fosfodiesterazę, dėl šio slopinimo padidėja inkstų filtracija, su šlapimu pasišalina daugiau vandens ir mažėja arterinis kraujospūdis [36].
Flavonoidai mažina mažo tankio lipoproteinų oksidaciją, padidina jautrumą insulinui ir mažina protrombozinių ir proaterosklerozinių molekulių ekspresiją, tokiu būdu lėtindami ankstyvą aterosklerotinių plokštelių susidarymą širdies vainikinėse kraujagyslėse [6]. Epidemiologinių tyrimų ir tyrimų su gyvūnais dėka nustatyta, kad flavonoidai mažina aterosklerozės vystymąsi [6, 39]. Tyrimo rezultatai su pelėmis parodė, kad po trijų mėnesių granatų sulčių vartojimo, aterosklerozę pavyko sumažinti net iki 44 proc. Šį poveikį apsprendė sulčių sudėtyje esantys antocianidinai ir proantocianidinai [39].
Atlikti tyrimai su gyvūnais ir žmonėmis parodė, kad kasdieninis obuolių vartojimas mažina bendro cholesterolio, mažo tankio lipoproteinų ir didina didelio tankio lipoproteinų koncentraciją kraujo plazmoje. Suomių mokslininkai, analizuodami mitybos duomenis, apibendrino daugiau nei 28 metus tirtų vyrų ir moterų duomenis ir išsiaiškino, kad tie, kurie valgė (> 47 g/d) obuolius rečiau patyrė miokardą infarktą. Šias obuolių savybes apsprendžia flavonoidai ir pektinai, kurie kartu ar atskirai veikia lipidų metabolizmą taip sumažina padidėjusio cholesterolio kiekį kraujyje. Mokslininkai nustatė, kad per dieną reikia suvalgyti maždaug tris obuolius, tokiu būdu cholesterolio kiekį sumažinsime 5-8 proc. [41]. Japonijoje atliktas tyrimas įrodė atvirkštinę koreliaciją tarp flavonoidų suvartojimo ir bendro cholesterolio kiekio [29].
Tyrimais įrodytas flavonoidų antitrombozinis poveikis, kuris paaiškinamas tuo, kad flavonoidai suriša lipidų peroksidų ir deguonies laisvuosius radikalus, išlaiko prostaciklino ir azoto oksido koncentraciją endotelyje [28, 29]. Flavonoidai gali mažinti agregaciją skatinančio tromboksano
A2 sintezę [6]. Tai gali būti naudinga siekiant išvengti miokardo infarkto ir insulto [40]. Įrodyta, kad flavonoliai - kvercetinas, kemferolis ir miricetinas pasižymi išreikštu antitrombiniu veikimu [28, 29].
Pavyzdžiui, mažesni kvercetino kiekiai (0,03-0,05 μM) slopina trombocitų agregaciją kolageno skaidulose [42].
Naujausių tyrimų duomenimis nustatyta, kad flavonoidai gali apsaugoti širdį nuo lėtinio kardiotoksinio poveikio, kuri sukelia citostatinis vaistas – doksorubicinas [29].
1.2.4. Antimikrobinis poveikis
Flavonoidai ir fenolinių rūgščių esteriai pasižymi antibakteriniu, priešgrybeliniu ir antivirusiniu aktyvumu. Visi jie yra aktyvūs prieš gramteigiamų bakterijų, grybelių bei kai kurių virusų padermes [29].
Antibakterinis aktyvumas. Daugelis fitocheminių preparatų, turinčių didelį kiekį flavonoidų, pasižymi antibakteriniu aktyvumu. Tyrimais nustatyta, kad antibakterinėmis savybėmis pasižymi apigeninas, galanginas, pinocembrinas, ponciretinas, naringeninas, kvercetinas ir jo glikozidai, liuteolinas, kemferolis ir jų dariniai. Antibakterinėmis savybėmis pasižymi ir įvairūs flavonai, flavonoliai, flavononai, chalkonai ir jų glikozidai. Literatūros šaltiniuose aprašyta keletas flavonoidų antibakterinio poveikio mechanizmų:
1) Fenoliniai junginiai slopina nukleorūgščių sintezę. Tyrimais nustatyta, kad flavonoidai slopina Proteus vulgaris padermių DNR sintezę, o RNR sintezė labiau slopina Staphylococcus aureus bakterijų padermėse. Flavonoidai – robinetinas, miricetinas ir (-)epigalokatechinas slopina bakterijų padermių baltymų ir lipidų sintezę. Manoma, kad hidroksilo grupės esančios flavonoidų B žiede sudaro vandenilinius ryšius su nukleorūgščių bazėmis ir tokiu būdu yra paaiškinamas DNR ir RNR sintezės slopinimas. Literatūroje yra duomenų, kad 14 skirtingos struktūros flavonoidų slopina E.coli padermių DNR girazę ir antibakteriškai veikia prieš Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Stenotrophomonas maltophilia bakterijų padermes [26]. Nustatyta, kad kvercetinas stabdo Staphylococcus aureus padermių augimą [28] ir pasižymi antibakteriniu aktyvumu beveik prieš visas bakterijų padermes, kurios sukelia kvėpavimo, virškinamo trakto, odos ir šlapimo takų ligas [36].
2) Fenoliniai junginiai slopina citoplazmos membranos funkciją. Flavan-3-oliai labiau slopina gramteigiamų nei gramneigiamų bakterijų citoplazmos membranas. Tyrimais nustatyta, jog katechinai gali prasiskverbti pro bakterijų citoplazmos membranos lipidų dvisluoksnį ir taip sutrikdyti membranos barjero funkciją bei sukelti intramembraninių medžiagų nutekėjimą ir irimą.
Paskelbti duomenys, kad propolio sudėtyje esantis kvercetinas sukėlė bakterijų vidinės membranos skvarbos padidėjimą [26].
3) Fenoliniai junginiai slopina bakterijų energijos metabolizmą. Mokslininkai nustatė, kad flavonoidai efektyviai slopina bakterijų NADH-citochromo c reduktazę, bet ne citochromo c oksidazę ar NADH-CoQ reduktazę. Dėl šio slopinimo inhibuojama elektronų pernaša kvėpavimo grandinėje ir bakterijų energijos metabolizmas [26].
Priešgrybelinis aktyvumas. Flavonoidai slopina grybelių padermes dėl jų gebėjimo sudaryti kompleksus su grybelio ląstelėje esančiais baltymais ir grybelio ląstelių sienelės komponentais. Labiau išreikštomis lipofilinėmis savybėmis pasižymintys flavonoidai gali suardyti grybelių padermių membranas [43]. Įrodyta, kad propolio sudėtyje esantys flavonoidas – galanginas yra aktyvūs prieš Candida albicans, Aspergillus tamarii, Aspergillus flavus, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum ir Penicillium italicum padermes [26].
Antivurisinis aktyvumas. Flavonoidų antivirusinis aktyvumas buvo nustatytas 1940 metais.
Tyrimais įrodyta, kad kvercetinas, dihidrokvercetinas, rutinas, morinas, apigeninas, katechinas ir hesperidinas turi išreikštą antivirusinį poveikį 11 tipo virusų padermėms [29]. Flavonoidai slopina Herpes simplex, paragripo viruso, kvėpavimo sincitinio viruso bei adenoviruso augimą. Įrodyta, jog flavonoidų glikozidai labiau slopina rotaviruso padermes negu anglikonai [28, 36]. Nustatyta, kad flavonoliai aktyviau nei flavonai slopina Herpes simplex viruso 1 tipą [29]. Flavonoidų antivirusinio poveikio savybės siejamos su virusų polimerazių ir virusų nukleorūgščių slopinimu bei virusų kapsidės baltymų surišimu. Įrodyta, kad propolyje esantys flavonoidai chrizinas ir kemferolis slopina HSV viruso padermes, žmogaus koronaviruso ir rotaviruso padermių replikaciją [26]. Flavonoidai taip pat geba slopinti žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) vystymąsi. Atlikti in vitro tyrimai įrodė, kad flavonoidai slopina ŽIV-1 viruso infekciją ir replikaciją, taip pat ŽIV-1 atvirkštinę transkriptazę [26, 28]. Nustatyta, kad robinetinas, miricetinas ir kvercitinas inhibuoja ŽIV-1 integrazę, o kai kurie flavonoidai, įskaitant demetilintą gardeniną A – slopina ŽIV-1 proteinazę [26].
Atliktas tyrimas, kurio metu buvo siekiama ištirti 'Royal Gala' ir 'Granny Smith' obuolių žievelių antimikrobinį poveikį prieš žmogaus patogenines bakterijas. Nustatyta, kad 'Granny Smith' obuolių žievelių ekstraktai turėjo didesnį kiekį fenolinių junginių ir flavonoidų negu 'Royal Gala' ekstraktai bei turėjo stipresnį antimikrobinį poveikį prieš Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Euterococcus faecalis ir Listeria monocytogenes padermių mikroorganizmus. Labiausiai atsparios padermės buvo Escherichia coli. Gauti rezultatai įrodė tiesioginį ryšį tarp fenolinių junginių ekstraktų ir antimikrobinio poveikio. Atliktas tyrimas parodė, kad obuolių fenoliniai junginiai pasižymi antibakterinėmis savybėmis ir gali būti naudojami siekiant užkirsti kelią mikroorganizmų sukeliamoms ligoms [44].
1.2.5. Uždegimą slopinantis poveikis
Fenoliniai junginiai pasižymi uždegimą slopinančiu veikimu, todėl buvo pasiūlyti kaip alternatyva lėtinių uždegiminių ligų gydymui ir profilaktikai [45]. Tyrimais įrodyta, kad flavonoidai moduliuoja arachidono rūgštį metabolizuojančių fermentų ciklooksiginazės (COX), 5-lipooksigenazės (LOX) ir fosfolipazės A2, veikimą, azoto oksidą (NO) gaminančio fermento veiklą ir azoto oksido sintazę [46]. Šių fermentų slopinimas sumažina uždegimo mediatorių – arachidono rūgšties, prostaglandinų ir leukotrienų sintezę bei azoto oksido kiekį [28, 46]. Atlikti tyrimai parodė, kad flavonoidai ciklooksigenazės-2 (COX-2) aktyvumą slopina labiau ir turi mažą selektyvumą ciklooksigenazei-1 (COX-1). Tai yra labai svarbu uždegimo slopinamajai terapijai, nes selektyvesnis poveikis yra susijęs su mažesne nepageidaujamų reakcijų rizika [46]. Nustatyta, kad kvercetinas ir kemferolis slopina COX-2 žiurkių makrofaguose. Flavonoliai (kemferolis, kvercetinas, morinas, miricetinas) yra aktyvesni lipooksigenazės inhibitoriai negu flavonai, todėl mažina leukotrienų gamybą [6]. Flavonoidai pasižymi gebėjimu slopinti neutrofilų suirimą ir tai sumažina arachidono rūgšties išsiskyrimą iš neutrofilų ir kitų imuninių ląstelių [28].
Mokslinės literatūros šaltiniuose aprašomas flavonoidų poveikis endotelio NOS (eNOS), neuronų NOS (nNOS) ir indukuojamo NOS (iNOS) fermentų aktyvumui [30]. Flavonoidai mažina azoto oksido (NO) gamybą. Sumažėjęs azoto oksido kiekis mažina oksidacinius ląstelių pažeidimus [6, 30].
In vitro tyrimai parodė, kad obuolių sulčių ekstraktas žymiai slopina NF-kB reguliuojamų prouždegimo genų (TNF-α, IL-1β, CXCL 9, CXCL 10) ekspresiją, uždegimo atitinkamų fermentų (COX-2, CYP3A4) ir transkripcijos faktorių ekspresiją (STAT1, IRF1) [13].
1.2.6. Antidiabetinis poveikis
Nustatyta, kad flavonoidai (ypač kvercetinas) pasižymi hipoglikeminiu veikimu. Vessal ir kt.
autoriai praneša, kad kvercetinas sukelia kasos salelių regeneraciją ir didina insulino išsiskyrimą žiurkėms, sergančioms cukriniu diabetu. Hif ir Howell pastebėjo, kad kvercetinas stimuliuoja insulino išsiskyrimą ir padidina Ca2+ jonų įsisavinimą iš izoliuotų salelės ląstelių. Autoriai mano, jog flavonoidai gali būti efektyvi profilaktikos ir gydymo priemonė asmenims, segantiems 2 tipo cukriniu diabetu [29]. Paskelbtais duomenimis kvercetinas yra fermento aldozės reduktazės inhibitorius, kuris konvertuoja gliukozę (cukrų) į sorbitolį (cukraus alkoholį) žmogaus organizme [36].
Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad obuoliai mažina 2 tipo cukrinio diabeto riziką.
Moterų sveikatos studijos paskelbė, kad moterims, kurios suvalgydavo 2-6 obuolius per savaitę, arba 1 obuolį per dieną, atitinkamai 27 ir 28 proc. sumažėjo rizika susirgti 2 tipo cukriniu diabetu, lyginant su tomis, kurios nevalgydavo obuolių. Obuoliai buvo priskirti prie flavonoidais turtingų apsauginių maisto produktų [34].
Tyrimais nustatyta, kad vandeniniai obuolių minkštimo ekstraktai eksponuoja didelį α- amilazės ir α-gliukozidazės slopinamąjį veikimą [13].
1.2.7. Neuroprotekcinis poveikis
Naujausi moksliniai duomenys rodo, kad neurodegeneracines ligas lydi oksidacinis stresas, uždegimas, metalų kaupimasis bei mitochondrijų pažeidimai. Žinoma, kad fenoliniai junginiai apsaugo nuo oksidacinio streso poveikio ir mažina neurodegeneracinių ligų, tokių kaip Alzheimerio ir Parkinsono ligos, insultas, išsėtinė sklerozė, riziką. Nustatyta, kad fenoliai gali prasiskverbti pro smegenų hematoencefalinį barjerą. Jie pasižymi puikiu multipotentiniu gebėjimu kontroliuoti ir diferencijuoti/moduliuoti ROS, metalų toksiškumą, uždegimą, apoptozę, signalų perdavimą, jonų kanalus ir neurotransmiterius. Ypač stiprūs neuroprotektoriai yra resveratrolis, kvercetinas ir baikaleinas [47].
Naujausių tyrimų duomenimis nustatyta, kad flavonoidai pasižymi ypač galingu poveikiu žinduolių pažinimo funkcijai bei gali sulėtinti su amžiumi susijusią atminties ir mokymosi problemą.
Tyrimai rodo, kad maistas turtingas flavanoliais, antocianinais ir flavanonais pagerina pažinimo procesus. Nustatyta, jog flavonoidai pasižymi gebėjimu apsaugoti neuronus nuo pažeidimų ir sustiprinti esamų neuronų struktūros funkciją. Įrodyta, kad kvercetino neuroprotekcinis poveikis pasireiškia mikroglijų aktyvacijos slopinimu [48].
Atlikto tyrimo metu buvo siekiama nustatyti, ar didesnis flavonoidų suvartojimas yra susijęs su mažesne rizika susirgti Parkinsono liga. Buvo stebėta 49,281 vyrų ir 80,336 moterų daugiau nei du dešimtmečius, kurie valgydavo uogas, obuolius, apelsinus bei gerdavo arbatą, raudoną vyną ir apelsinų sultis. Viso tyrimo eigoje, Parkinsono liga susirgo 805 dalyvių (438 vyrų ir 367 moterų). Pastebėta, kad antocianinai ir jų turintys maisto produktai - obuoliai ir uogos (mėlynės), žymiai sumažino riziką vyrams ir moterims susirgti Parkinsono liga. Nustatyta, kad antocianinai gali pereiti pro hematoencefalinį barjerą ir taip patekti į smegenis. Gauti rezultatai parodė, kad flavonoidų vartojimas gali sumažinti Parkinsono ligos riziką, ypač vyrų, tačiau mokslininkai mano, kad reikalingi tolimesni tyrimai siekiant ištirti flavonoidų neuroprotekcinį poveikį, nes įtakos galėjo turėti ir kitos maisto augalų sudedamosios dalys [49].
1.3. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Obuoliai yra vieni dažniausiai vartojamų vaisių visame pasaulyje, kuriuos žmonės gali vartoti ištisus metus. Obuoliuose kaip ir kituose vaisiuose nemažai kaupiasi vitaminų ir mineralinių medžiagų, tačiau domėjimąsi obuolių chemine sudėtimi skatina tai, kad juose nustatyti fenoliniai junginiai yra stiprūs antioksidantai. Tyrimais įrodyta, kad antioksidantai žmogaus organizmo ląsteles gali apsaugoti nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio bei sumažinti oksidacinį stresą, kuris yra pagrindinė daugelio lėtinių ligų priežastis. Pastaruoju metu fenolinių junginių biologinės savybės tapo mokslinio susidomėjimo objektu, ypač didelis dėmesys yra skiriamas jų antioksidantinėms savybėms. Obuoliai šiuo metu gana plačiai tyrinėjami dėl savo plataus biologinio poveikio žmogaus sveikatai, nes jie yra nebrangūs, prieinami kiekvienam, puikus natūralių antioksidantų šaltinis bei perspektyvi augalinė maisto papildų žaliava. Todėl svarbu nustatyti ne tik vartojimo brandą pasiekusių skirtingų veislių obuolių sudėtį bet ir jų cheminės sudėties pokyčius vaisių vystymosi ir nokimo metu.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tirtos obelų veislės – 'Connel Red' ir 'Ligol' auginamos Lietuvoje, Kauno rajone, Babtuose, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslo centro filiale Sodininkystės ir daržininkystės instituto eksperimentiniame sode. Obuolių ėminiai skinti skirtingais fenologiniais tarpsniais 2013 metais birželio – lapkričio mėnesiais (1 lentelė). Fenologiniai tarpsniai nurodyti pagal Meier, 2001 [50].
1 lentelė. Obuolių ėminių skynimo laikas
Nr. Obelų veislė Skynimo laikas Fenologinis tarpsnis
1. Connel Red Birželio 17 d.
Vaisių vystymasis
2. Connel Red Liepos 15 d.
3. Connel Red Rugpjūčio 12 d.
4. Connel Red Rugsėjo 9 d.
5. Connel Red Rugsėjo 16 d.
6. Connel Red Rugsėjo 23 d.
Vaisių nokimas (vaisių branda)
7. Connel Red Rugsėjo 30 d.
8. Connel Red Spalio 7 d.
9. Connel Red Spalio 14 d.
10. Connel Red Lapkričio 4 d.
11. Ligol Birželio 17 d.
Vaisių vystymasis
12. Ligol Liepos 15 d.
13. Ligol Rugpjūčio 12 d.
14. Ligol Rugsėjo 9 d.
15. Ligol Rugsėjo 16 d.
16. Ligol Rugsėjo 23 d.
Vaisių nokimas (vaisių branda)
17. Ligol Rugsėjo 30 d.
18. Ligol Spalio 7 d.
19. Ligol Spalio 14 d.
20. Ligol Lapkričio 4 d.
2.2. Naudoti reagentai
Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai, tirpikliai ir standartai: etanolis (96,3 proc.
V/V) (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), Folin-Ciocalteu fenolio reagentas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Šveicarija), natrio karbonatas (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija), acto rūgštis (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Šveicarija), aliuminio (III) chlorido heksahidratas (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Vokietija), heksametilentetraminas (Lachema, Čekija), natrio acetato trihidratas (Scharlau, Ispanija), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas (Vaseline-Fabrik Rhenania, Bonn, Vokietija), DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazilas) (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Buchs, Šveicarija), TFPH (trifluorperazino dihidrochloridas) (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Vokietija), Trolox® (troloksas) 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2- karboksilinė rūgštis (Fluka, Seelze, Vokietija), sieros rūgštis (95 proc. V/V) (Chempur, Lenkija), natrio 2,6-dichlorfenolindofenoliatas (Sigma-Aldrich Chemie, Buchs, Šveicarija), natrio hidroksidas gautas (Chempur, Lenkija); indikatorius fenolftaleinas (Sigma-Aldrich Chemie, Buchs, Šveicarija). Analizei naudotas išgrynintas vanduo.
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės
Obuoliai supjaustyti į vienodo dydžio griežinėlius (iki 1 cm storio), pašalinant kotelius ir sėklas ir užšaldyti -35°C temperatūroje šaldiklyje su oro cirkuliacija ir džiovinti liofilizatoriuje
„Zirbus“ (Vokietija). Liofilizacija vykdyta 0,01 mbar slėgyje, kondensoriaus temperatūra -85°C.
Liofilizuoti obuolių griežinėliai sumalti į miltelius, naudojant elektrinį malūną Retsch 200 (Vokietija).
Ėminiai laikyti sandariai uždarytuose induose, tamsoje.
Augalinė žaliava sverta analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius“ (Götingen, Vokietija), ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ (Berlin, Vokietija). Filtracija atlikta vakuuminiu siurbliu „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor WELCH“ (Skokie, JAV), naudoti filtro popierėliai „Filtrak GmbH“ (Niederschlag, Vokietija), mikropipetės „Eppendorf Research“
(JAV).
Nuodžiūviui nustatyti buvo naudota vakuuminė džiovinimo spinta „SPT-200. Vacuum Drier“
(Krakow, Lenkija). Bendras fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekis ir antioksidantinis aktyvumas buvo nustatyti spektrofotometru „Beckman DU-70 Spectrophotometer“ (JAV).
2.4. Tyrimo metodai
Nuodžiūvio nustatymas. Nuodžiūvis nustatytas Europos farmakopėjos reikalavimus atitinkančiu metodu [51]. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai liofilizuotai žaliavai.
Obuolių ėminių ekstraktų paruošimas. Atsveriama 2,5 g (tikslus svėrinys) liofilizuotų obuolių miltelių, užpilama 30 ml 70 proc. (V/V) etanoliu ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min.
40°C temperatūroje sandariai uždarytuose stikliniuose buteliukuose. Ultragarso stipris – 480 W, dažnis – 35000 Hz. Gautas obuolių ekstraktas filtruojamas per popierinį filtrą, obuolių liofilizatas esantis ant filtro du kartus praplaunamas po 10 ml 70 proc. (V/V) etanolio į 50 ml matavimo kolbutę ir paskiedžiama 70 proc. (V/V) etanoliu iki žymės [52].
Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriškai, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą [53].
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Imama 0,2 ml tiriamojo ekstrakto ir praskiedžiama 4 ml 96 proc. (V/V) etanoliu, sumaišoma. Į praskiestą ekstraktą įpilama 5 ml Folin – Ciocalteau reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo.
Palyginamasis tirpalas ruošiamas tokiu pat būdu, tik vietoj 0,2 ml ekstrakto įpilama distiliuoto vandens. Pagaminti tirpalai gerai sumaišomi ir paliekami tamsioje vietoje. Po 60 min.
spektrofotometru matuojamas tirpalų šviesos absorbcijos dydis esant 765 nm bangos ilgiui.
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas pagal galo rūgšties kalibracijos lygtį:
y = 0,2027x -0,0001 R2 = 0,9992
Galo rūgšties koncentracijos ribos 0 – 5 mg/ml.
Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g), perskaičiuotas galo rūgšties ekvivalentu, apskaičiuojamas pagal formulę:
C = c × V m⁄ , mg/g
C – bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais, mg/g;
c – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml;
V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
m – ekstrakcijai atsvertas tikslus augalinės žaliavos kiekis, g.
Bendro flavonoidų kiekio nustatymas. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriškai, atliekant reakciją su aliuminio (III) chlorido tirpalu rūgščioje aplinkoje [54].
