LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas Vainius VrubliauskasVaistinių augalų ekstraktų
virucidinio poveikio
paukščių koronavirusams
tyrimai
Studies on the virucidal
effect of medicinal plant
extracts on avian
coronaviruses
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
2 DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Vaistinių augalų ekstraktų virucidinio poveikio paukščių koronavirusams tyrimai“:
1.yra atliktas mano paties (pačios).
2.nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3.nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ
Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
Raimundas Lelešius
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
Raimundas Mockeliūnas
(aprobacijos data) (MVI vadovo vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(parašas)
Algirdas Šalomskas
3
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Paukščių infekcinis bronchitas ir jo apibūdinimas ... 10
1.2. IBV klasifikacija ir struktūra ... 10
1.3. Paplitimas ir geografinis pasiskirstymas ... 12
1.4. Prevencija ir kontrolė ... 13
1.5. IBV vakcinos ... 13
1.5.1. Gyvos susilpnintos vakcinos. ... 13
1.5.2. Inaktyvuotos vakcinos. ... 14
1.5.3. Viruso vektoriaus pagrindu veikiančios vakcinos. ... 14
1.5.4. Subvienetų ir peptidų pagrindu pagamintos vakcinos. ... 15
1.5.5. Plazmidžių DNR vakcinos. ... 15
1.5.6. Atvirkštinės genetinės vakcinos. ... 16
1.6. Vaistiniai augalai ... 16
1.7. Dujų chromatografija – masių spektrometrija ... 17
1.8. Realaus laiko PGR ... 18
2. TYRIMŲ METODIKA ... 19
2.1. Tyrimų schema ... 19
2.2. Virusai, padermė ... 20
2.3. Ląstelių kultūra ... 20
2.4. Virusų adaptacija ir pagausinimas... 20
2.5. Virusų kiekio nustatymas ... 21
2.6. Adsorbuotų ir neadsorbuotų per valandą IBV kiekio ir santykio bei jų dinamikos nustatymas ir palyginamasis įvertinimas ... 21
2.7. Augalai ir jų ekstraktai ... 22
2.8. Augalų ekstraktų citotoksiškumo tyrimai ... 23
2.9. Augalų ekstraktų koncentracijų virucidiniams tyrimams parinkimas ... 23
2.10. Virucidinių savybių vertinimas ... 24
2.11. Dėmių metodas... 24
4
2.13. Statistiniai metodai ... 25
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 26
3.1. Koronavirusų adaptacija ... 26
3.2. Augalų ekstraktai... 32
3.3. Augalų ekstraktų citotoksiškumo įvertinimas ... 32
3.4. Dėmių metodo ir LKID50 palyginimas ... 34
3.5. Augalų ekstraktų frakcijų virucidinis poveikis ... 37
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 39
IŠVADOS ... 42
5
Vaistinių augalų ekstraktų virucidinio
poveikio paukščių koronavirusams tyrimai
Vainius Vrubliauskas Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Paukščių infekcinis bronchitas yra aktuali paukštininkystėje virusinė liga. Šį susirgimą sukelia paukščių koronavirusai. Profilaktiškai nuo infekcinio bronchito vištos yra vakcinuojamos, tačiau paukščių koronavirusai labai kinta, tad sveikatingumą užtikrinti vien specifinėmis profilaktikos priemonėmis neįmanoma, ieškoma kitų nespecifinės prevencijos priemonių prieš paukščių koronavirusus. Viena iš tokių priemonių gali būti vaistiniai augalai.
Darbo tikslas: įvertinti pipirmėtės (Mentha piperita L.), vaistinės melisos (Melissa officinalis L.) ir vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris L.) skirtingų ekstraktų ir frakcijų virucidinį poveikį paukščių koronavirusams in vitro.
Augalų ekstraktų virucidinis poveikis buvo vertintas taikant dėmių (tik etanolio ekstraktams) ir LKID50 nustatymo metodus. CO2 ekstraktai pasižymėjo silpnesniu (P<0,05) virucidiniu poveikiu
nei 40,0 proc. etanolio ekstraktai. Esant koncentracijai ≤4,17 mg/ml, etanolio ekstraktai pasižymėjo stipriu virucidiniu poveikiu (inaktyvavo ≥99.99 proc. virusų), kai tuo tarpu CO2 ekstraktai – silpnu (inaktyvavo 90,0-99,0 proc. virusų) arba nereikšmingu (inaktyvavo ≤90 proc. virusų).
Pipirmėtės ekstrakto koncentracija 0,68 mg/ml visiškai inaktyvavo koronavirusus, čiobrelio – 1,56 mg/ml, o melisos – 2,95 mg/ml. Dėmių metodu nustatyta, kad pipirmėtės ekstrakto koncentracija 0,68 mg/ml, melisos ekstrakto – 1,48 mg/ml, o čiobrelio – 1,56 mg/ml, sumažino DSV skaičių 99,99 proc.
Augalų etanolio ekstraktų I ir II frakcijos (koncentracija ≤4,17 mg/ml) nereikšmingai veikė koronavirusus (inaktyvavo ≤90 proc. koronavirusų), o III frakcija - stipriai (inaktyvavo ≥99.99 proc.) esant 2,1 mg/ml koncentracijai.
6
Studies on the virucidal effect of medicinal plant extracts on avian coronaviruses
Vainius Vrubliauskas Master’s thesis
SUMMARY
Infectious avian bronchitis is a viral disease relevant to poultry farming. This disease is caused by coronaviruses. As a prophylaxis against infectious bronchitis, chickens are vaccinated, however, avian coronaviruses are highly variable and therefore specific preventive measures alone cannot ensure health. As a result, other non-specific prevention measures against avian coronavirus are being sought. One such remedy may be medicinal plants.
Work objective: to evaluate the in vitro virucidal effect of different extracts and fractions of peppermint (Mentha piperita L.), lemon balm (Melissa officinalis L.) and medicinal thyme (Thymus
vulgaris L.) on avian coronaviruses.
The virucidal effect of plants extracts was evaluated using plaque reduction (ethanol extracts only) and TCID50 assays. CO2 extracts had a weaker (P<0.05) virucidal effect than 40.0% ethanol
extracts. At concentrations ≤4.17 mg/ml, ethanol extracts had a strong virucidal effect (inactivated ≥99.99% of viruses), while CO2 extracts showed a weak virucidal effect (inactivated 90.0-99.0% of
viruses) or insignificant (inactivated ≤90.0% of viruses).
Concentrations of peppermint extract at 0.68 mg/ml completely inactivated coronaviruses, thyme at 1.56 mg/ml and lemon balm at 2.95 mg/ml. Plaque reduction assay, concentration of extracts at which plaque forming units were reduced by 99.99% were 0.68 mg/ml for peppermint, 1.48 mg/ml for lemon balm and 1.56 mg/ml for thyme.
Fractions I and II of plant ethanol extracts (concentration ≤4.17 mg/ml) had indicative effect on coronaviruses (inactivated ≤90.0% of coronaviruses), but fraction III had a high effect (inactivated ≥99.99% of viruses) at a concentration of 2.1 mg/ml.
7
SANTRUMPOS
Ad - adsorbuoti
CPE – citopatogeninis efektas
DMEM - Dulbecco’s modifikuota Eagle’s terpė DNR – deoksiribonukleorūgštis
DSV – dėmes sudarantys vienetai FBT – fosfatinis buferinis tirpalas FVS – fetalinis veršelių serumas IB – infekcinis bronchitas
IBV – infekcinio bronchito virusas
LKID50 – 50 procentė ląstelių kultūrų infekcinė dozė
M. officinalis – Melissa officinalis, vaistinė melisa M. piperita – Mentha piperita, pipirmėtė
MTT - (3-(4,5-dimetiltiazolis-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) Nead - neadsorbuoti
PGR – polimerazinė grandininė reakcija S1 – spyglio glikoproteinas
8
ĮVADAS
Paukščių infekcinis bronchitas (IB) yra ūmi ir labai užkrečiama virusinė liga, sukelianti dideles ekonomines pasekmes paukštininkystei (1). IB sukėlėjas (IBV) pirmiausia buvo nustatytas paukščiams, sergantiems kvėpavimų takų ligomis, o vėliau buvo išskirtasiš daugelio ne su kvėpavimo organais nesusijusių audinių, tokių kaip inkstai, skirtingos kiaušintakių dalys ir virškinamosis traktas (2). IBV infekuotuose pulkuose, sergamumas gali siekti 100 proc., tačiau mirtingumas priklauso nuo antrinių infekcijų, pulkų amžiaus, imuniteto, aplinkos veiksnių. Jaunų viščiukų mirtingumas dažniausiai yra 25-30 proc., bet gali siekti ir iki 80 proc., priklausomai nuo padermės virulentiškumo. Visų amžiaus grupių viščiukai yra imlūs IBV, tačiau jautriausi iki 4 savaičių amžiaus viščiukai (1).
Schalk ir Hawn pirmieji aprašė IB JAV-e 1931m., kaip naują jaunų viščiukų kvėpavimo takų ligą (3). Pirmasis IBV izoliatas buvo Beaudette padermė (4) – ta pati padermė, kuri buvo naudota atliekant tolimesnius šio darbo tyrimus. Europoje tik 30 proc. izoliatų buvo serologiškai artimi žinomiems Šiaurės Amerikos serotipams. Didžioji dalis padermių buvo susietos su keturiomis Olandų padermėmis – D207, D212, D3128 ir D3896 (5). Nuo laiko, kuomet virusai buvo atrasti ir aprašyti, svarbūs IBV variantai, tokie kaip 793B arba QX, per trumpą laiką paplito Azijoje, Europoje ir Afrikoje, tačiau nebuvo fiksuoti JAV arba Australijoje. Svarbi JAV padermė Arkansas nebuvo nustatyta kitose šalyse. Yra panašu, kad geografinė izoliacija ir griežtos kontrolės priemonės pasitelktos šalyse, kenčiančiose nuo vienos ar kitos IBV padermės ar jų grupių, turi stiprų poveikį naujų variantų atsiradimo tose šalyse (6).
Esant labai didelei IBV įvairovei ir mutacijoms bei naujų padermių atsiradimams, užtikrinti vištų sveikatingumą vien vakcinuojant neįmanoma, todėl labai svarbu nuolat ieškoti naujų prevencijos metodų, kuriais galima būtų apsisaugoti nuo virusinių ligų.
Ankstesni tyrimai su IBV in vitro parodė, kad Lietuvoje auginami vaistiniai augalai pasižymi antivirusinėmis savybėmis. Kai kurių augalų etanoliniai ekstraktai pasižymėjo stipresniu antivirusiniu poveikiu prieš paukščių koronavirusus. Ekstraktai pasižymi ne tik antivirusiniu poveikiu, bet ir citotoksiškumu ląstelėms. Didelis citotoksiškumas dažnai gali riboti preparatų panaudojimo galimybes. Ekstraktų sudėtyje yra įvairių junginių, kurių vieni galimai pasižymi didesniu citotoksiškumu, o kiti antivirusiniu ar virucidiniu poveikiu. Ekstrakcijos metodai panaudojant skirtingus tirpiklius ar technologijas gali lemti ekstrakto mažesnį ar didesnį citotoksiškumą, stipresnes ar silpnesnes antivirusines ir virucidines savybes. Todėl darbo tikslas buvo nustatyti augalų atskirų ekstrakcijos frakcijų ir CO2 ekstrakcijos metodu išskirtų superkritinių skysčių
virucidines savybes. Tyrime buvo pasirinkti augalai, kurių ekstraktai, eteriniai aliejai, vandeniniai ekstraktai ar hidroalkoholiniai ekstraktai turi žinomų antivirusinių savybių. Pipirmetė (Mentha
9 (H3N2) ir A/PER/8 (H1N1) virusus (8), HSV-1 ir HSV-2 (9). Vaistinė melisa (Melissa officinalis L.) pasižymi antivirusinėmis savybės prieš HSV-1 (10,11), HSV-2 (11), HIV-1 (7), ekotropinį pelių leukemijos virusą (12) Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris L.) pasižymi antivirusinėmis savybės prieš HSV-1 ir HSV-2 (13), HIV-1 (7), tymus ir kiaulytės ligos virusus (13).
Darbo tikslas: Įvertinti pipirmėtės (Mentha piperita L.), vaistinės melisos (Melissa officinalis L.) ir vaistinio čiobrelio (Thymus vulgaris L.) skirtingų ekstraktų ir frakcijų virucidinį poveikį paukščių koronavirusams in vitro.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti adaptuojamų paukščių koronavirusų Beaudette padermės reprodukcinių savybių in vitro tyrimą.
2. Nustatyti etanolio ir CO2 ekstraktų ekstrakcijos įtaką pipirmetės, vaistinės melisos ir vaistinio
čiobrelio virucidiniam poveikiui prieš paukščių koronavirusus in vitro.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Paukščių infekcinis bronchitas ir jo apibūdinimas
IB yra paplitusi, stipriai užkrečiama, ūmi ir ekonomiškai svarbi koronavirusų sukeliama vištų liga (14). Paukščiai užsikrečia įkvėpdami arba tiesioginiu kontaktu su užsikrėtusiais viščiukais, arba netiesiogiai su kraiku, įranga arba kitomis užkratą pernešančiomis medžiagomis. IB neperduodama vertikaliu būdu, tačiau virusai gali būti ant besiritančių kiaušinių paviršiaus, kurie ten patenka kiaušiniui keliaujant per kiaušintakius ar iš virškinamojo trakto (2). Liga pasireiškia visose vištas auginančiose šalyse. Naujų nežinomų IBV serotipų ir variantų šaltinis yra suaugę paukščiai, dažniausiai dedeklės. IBV nesukelia žmonėms susirgimų.
Jauniems viščiukams IBV sukelia respiratorinę ligą. Sergančių mėsinių viščiukų broilerių priesvoris ir pašarų (lesalų) įsisavinimas sumažėja. Infekcija taip pat predisponuoja broilerių oro maišų bakterinį uždegimą, perikarditą ir hepatitą. Mirtingumas iki 30 proc., pasiekia piką 5-6 savaičių amžiaus broilerių grupėje t.y. likus gyventi apie dvi savaites (1). Imunosupresija toliau paaštrina ligą ir didina mirtingumą. Mirtingumas yra daug mažesnis (<1 proc.) ir atsigavimas daug greitesnis, kai susirgimus sukelia mažiau virulentiškos padermės - tokiu atveju retesnės bei lengvesnės bakterijų antrinių infekcijų komplikacijos. Kai kurios IBV padermės yra nefropatogeniškos – pažeidžia inkstus ir sukelia mirtis. Jautriuose būriuose dėl inkstų pažeidimų mirtingumas gali siekti 25 proc. (2).
IB įtakoja vištų dėslumą, kiaušinių kokybę, viščiukų išsiritimo procentą. IBV gali replikuotis kiaušintakyje ir sukelti negrįžtamus pažeidimus pakaitinėms vištaitėms, dėl ko sumažėja jų dėslumas (5). Kiaušinių lukštai dažnai deformuoti ir labiau jautrūs lūžiams dėl suplonėjusio lukšto. Vištų veislės, kurios paprastai deda pigmentuotus kiaušinius, gali dėti šviesesnius kiaušinius. Albuminai iš paveiktų kiaušinių gali būti vandeningesnės konsistencijos. Dėslumas gali atsistatyti į būrį įvedus skiepytų dedeklių, bet gali ir likti negrįžtamai sumažėjęs jautriuose būriuose.
Koronavirusai su labai panašiomis baltymų variacijomis į IBV buvo izoliuoti iš fazanų, kalakutų, perlinių vištų (15).
1.2. IBV klasifikacija ir struktūra
IBV priklauso Coronaviridae šeimai, Nidovirales būriui. Virusai apvalūs arba pleomorfinės formos. Jie turi gaubtą, kuris yra maždaug 120 nm diametro su lazdelės formos paviršiaus projekcijomis (spygliais), kurių ilgis maždaug 20 nm .
11 į poliproteiną. Šis poliproteinas, pirmtakas virusinės replikazės, dėl ko atsiranda 15 nestruktūrinių baltymų (Nsp2-16). Likęs genomas koduoja keturis struktūrinius baltymus: spyglio (S) glikoproteiną, mažajį apvalkalo baltymą (E), membranos (M) glikoproteiną ir nukleokapsidės (N) baltymą, taip pat ir penkis mažus nestruktūrinius pridėtinius baltymus – 3a, 3b, 3c, 5a ir 5b, kurie nėra reikalingi in
vitro replikacijai, tačiau turi vaidmenį patogenezėje (16).
S genas susidaro iš vieno atviro skaitymo rėmo, šis koduoja spyglio
glikoproteiną (S), kuris po
transliacijos yra suskaidomas į subvienetus amino-galutinis S1 (92-kDa) ir karboksil-galutinis S2 (84-kDa), susidedančių iš maždaug 500 ir 600 aminorūgščių, atitinkamai. Subrendusiame virione S2 susijęs su S1 ir veikia lyg inkaras tempdamas S1
baltymą iki membranos, kad
suformuotų multimerinį spiralės formos S baltymą (1). N genas turi
vieną atviro skaitymo rėmą, koduojantį nukleobaltymą, kuris kartu su genominiu RNR suformuoja spiralinę nukleokapsidę. Šis baltymas yra itin pastovus, tarp skirtingų IBV izoliatų skiriasi tik 2-6 proc., lyginant jų aminorūgštis (16).
IBV S ir N baltymai turi svarbias biologines ir imunologines funkcijas. S glikoproteinas gali būti padalintas į tris struktūrines sritis: didelę išorinę sritį, kuri yra toliau padalinta į dvi subsritis S1 ir S2, transmembraninė sritis ir trumpa karboksil-galutinė sritis. S1 seka yra labiau kintanti ir mutacijos šioje sekoje buvo siejamos su pakitusiu IBV padermių audinių tropizmu ir antigeniškumu (17). S1 sekos iš skirtingų padermių gali stipriai skirtis, dažniausiai tarp 2-25 proc. aminorūgščių lygmeniu, tuo tarpu S2 subvienetas yra pastovesnis. Biologiškai S1 glikoproteinas yra pagrindinis virusą neutralizuojančių induktorių ir reguliuoja kai kurias kitas svarbias funkcijas – susijungimą su ląstelėmis, viruso apvalkalo susiliejimą su ląstelės membrana. IBV nukleokapsidės baltymas yra fosfoproteinas iš 409 aminorūgščių ir yra gana pastovus tarp skirtingų IBV padermių, taip pat svarbus ląsteliniam imunitetui. Jis sukuria apsauginį apvalkalą, kuriame supakuojamas visas viruso RNR ir, manoma, kad nukleokapsidės baltymas dalyvauja virusinės RNR replikacijoje ir transkripcijoje (18).
1 pav. Koronaviruso schema
12
1.3. Paplitimas ir geografinis pasiskirstymas
Pirmą kartą IBV aprašytas 1931 m. kaip naujas kvėpavimo takų susirgimas jaunuose viščiukuose. Pirmasis IBV izoliatas buvo Beaudette padermė. Vėliau Massachusetts 41 padermė buvo izoliuota Šiaurės Dakotoje ir nustatyta, jog ji serologiškai artima Beaudette padermei. Šio serotipo padermės buvo vienos pirmųjų, panaudotų gyvoms vakcinoms gaminti (19).
„T“ buvo pirmoji padermė Australijoje, izoliuota 1962 m. Daugelis skirtingų IBV variantų išskirti nuo to laiko ir aprašyti, o patys virusai evoliucionavo nepriklausomai nuo kitų šioje šalyje, dėl jos geografinės izoliacijos (20).
Kaip jau minėta anksčiau, Europoje tik apie 30 proc. izoliatų buvo serologiškai artimi žinomiems Šiaurės Amerikos izoliatams. Kitos padermės buvo susietos su olandų padermėmis D207, D212, D3128 ir D3896 (21). Daugelis britiškų IBV padermių, izoliuotų 1981-1983 m., buvo glaudžiai artimos olandų padermėms. Ir, nors virusai sukėlė kvėpavimo takų ligas ir vištų dėslumo sumažėjimą, jie nebuvo susieti su prasta kiaušinių kokybe. Vėliau daug IBV variantų buvo izoliuoti ir kitose Europos šalyse – Prancūzijoje, Belgijoje, Italijoje, Lenkijoje, Ispanijoje. Jose didžiausią tarptautinę reikšmę turėjo 793B variantas, kuris plito praėjusio amžiaus paskutiniame dešimtmetyje, o vėliau greitai paplito ir po visą pasaulį. Brazilijoje, nepaisant vietinių padermių, buvo izoliuotos ir artimos padermės Šiaurės Amerikos ar Europos virusams (2).
2002 m. naujo IBV genotipo seka, pavadinto Italy 02, kuri turėjo ekonominę svarbą, buvo įvesta į GenBank nukleotidų duomenų bazę. IBV neutralizacijos tyrimai parodė, kad Italy 02 ir kiti naudoti IBV serotipai yra labai mažai antigeniškai panašūs. Padaryta išvada, kad Italy 02 tikriausiai yra naujas serotipas (22). Vėliau Italy 02 buvo apibrėžtas kaip trečia dažniausiai sutinkama IBV padermė Vakarų Europoje. Šios padermės kilmė yra nežinoma, tačiau ji daugiausia plinta Europoje.
XX a. paskutinio dešimtmečio viduryje paskelbta daugybė straipsnių apie įvairių IBV sukeliamas ligas skirtingose Kinijos vietovėse. Kinijos QX variantas turi didžiausią reikšmę. Jis išplito Rusijoje, o vėliau iš jos pateko ir į Europą (23). QX variantas daugiausiai paveikia kvėpavimo takus ir reprodukcijos sistemą (24). QX variantas, izoliuotas Nyderlanduose, sukėlė inkstų ligas ir sutrikdė dėslumą. Jungtinėje Karalystėje į QX panašus serotipas izoliuotas iš broilerių gūžių.Šie broileriai pasižymėjo mažu priesvoriu, prastai įsisavino pašarus, turėjo kvėpavimo sutrikimo simptomų (2).
Kitas IBV genotipas, Q1, kuris genetiškai ir serologiškai yra tolimas klasikinėms IBV padermėms, buvo aptiktas Kinijoje XX a. pabaigoje. Vėliau Q1 padermė identifikuota Europoje bei Pietų Amerikoje, Viduriniuose Rytuose ir Indijos subkontinente (2).
13 Arkansas padermė beveik nebuvo aptinkama už JAV ribų. Patogeninė padermė D1466, kuri endeminė kai kuriose Vakarų Europos šalyse jau bent tris dešimtmečius, beveik nebuvo aptikta už Europos ribų. Galima teigti, jog geografinės izoliacijos ir apsaugos priemonės, įdiegtos šalyse, turi labai didelę svarbą apribojant naujų IBV variantų atsiradimą (6).
1.4. Prevencija ir kontrolė
Nuo pat ligos atsiradimo, ankstesnės ir dabartinės ligos suvaldymo priemonės nesugebėjo jos visiškai pažaboti. Taip yra dėl daugybės egzistuojančių IBV padermių ir nuolatinio naujų padermių atsiradimo. Dėl tokios įvairovės yra vis sudėtingiau suvaldyti infekciją šiuo metu prieinamomis gyvomis ir inaktyvuotomis vakcinomis. Kartu su biosauga bei valdymo tobulėjimu, šios vakcinos yra naudojamos visame pasaulyje. Dėl natūralios rekombinacijos, nauji variantai pasirodo nuolat. Ir, nors dauguma naujų variantų greitai išnyksta, dalis jų užsibūna ir sukelia ligą, kurios pasekmės – produkcijos sumažėjimas (6). Taip yra dėl šiuo metu prieinamų vakcinų ar vakcinacijų programų suteikti visapusę apsaugą nuo atsirandančių padermių. Pastaruoju metu IBV QX tapo didžiule grėsme paukštininkystei, nepaisant aukšto ir tinkamo IBV vakcinacijų pritaikymo Vakarų Europoje. Galima daryti išvadą, jog dabartinės vakcinacijos strategijos sugebėjo sumažinti žalą – ligos pasireiškimo dažnį ir produkcijos sumažėjimą, tačiau nesustabdė skirtingų padermių plitimo.
Geriausia IBV kontrolės strategija - vakcinų padermių, panašių randamoms konkrečioje vietovėje ar ūkyje, naudojimas. Vietovėse, kur tai nėra įmanoma, arba kur nėra vakcinų dominuojančioms padermėms, reiktų naudoti vakcinacijos schemas, kuriose vakcinuojama nuo kelių padermių, tokiu būdu stiprinant paukščių apsaugą. Sėkmės procentas priklauso nuo genetinių skirtumų tarp vakcinos virusų ir virusų esančių aplinkoje (24).
Gyvos vakcinos daugiausiai suduodamos purškiant arba su geriamuoju vandeniu (17), bet dėl geresnio imunogeniškumo rekomenduojama skiepyti intraokuliariai arba intranasaliai. Ilgai gyvenančių paukščių, reproduktorių ir dedeklių, apsaugai naudojamos inaktyvuotos vakcinos. Vakcinuojama į raumenį arba po oda, didelių skaičių humoralinių antikūnų indukcijai, kurie apsaugo nuo IBV ir apsaugo kiaušinių kokybę. Taip vakcinuojant veislines vištas užtikrinamas motininių antikūnų perdavimas besiritantiems viščiukams. Motininiai antikūnai svarbūs apsaugai nuo virulentiškų IBV (25,26).
1.5. IBV vakcinos
14 gyvenimo savaitę. Kadangi imuniteto trukmė naudojant gyvas susilpnintas vakcinas neilga, papildomos vakcinacijos vykdomos su ta pačia vakcina arba su kitomis IBV padermėmis praėjus 2-3 savaitėms po pirminės vakcinacijos (17). Daugelis vakcinų gaminamos iš virulentiškų padermių, tokių kaip Massachusetts 41 serotipas, olandų H52 ir H120, tačiau kai kurios padermės, turinčios regioninę ar vietinę reikšmę, naudotos įvairiuose pasaulio kraštuose (14).
Gyvos vakcinos dažniausiai naudojamos broileriams ir kaip pakartotinės vakcinos reproduktoriams. Europoje ir JK dažnai naudojamos Massachusetts 41, 4/91 ir CR88 padermės. Nyderlanduose dažnai vakcinuoja naudojant D274 ir D1466 padermes. Dėl logistinių ir ekonominių priežasčių dabar plačiai naudojamos polivalentės vakcinos nuo IB, Niukastlio, Mareko ir Gamboro ligų. Šių vakcinų sudėtyje naudojami gyvi susilpninti IBV (27). Nėra iki galo išsiaiškinta, ar šios vakcinos iššaukia atsaką kombinuotam antigenui.
Gyvų susilpnintų vakcinų trūkumai – galimi audinių pažeidimai ir virulentiškumo pakitimai. Audinių pažeidimai dėl gyvų vakcinų gali sukelti patologinių sutrikimų ar antrinių infekcijų, ypatingai vienos dienos amžiaus viščiukams (28). Įrodyta, kad net ir stengiantis sumažinti virulentiškumą naudojant iš 52 arba 120 ištraukų pagaminti H52 ir H120 IBV vakcinas, jos gali sukelti nemenkų patologijų trachėjoje ir galiausiai sukelti protrūkį bandoje. Antrasis gyvų susilpnintų vakcinų trūkumas - vakcinose esančios padermės ir bandoje esanti virulentiška padermė gali rekombinuotis tarpusavyje ir sukurti naują serotipą. Spręsdami vakcinų virulentiškumo padidėjimo problemą, mokslininkai išbando atvirkštinės genetikos technologijas siekdami sukurti apatogenišką nešiotojui vakciną, pasižyminčią antigeniškumu ir imunogeniškumu. Tai buvo parodyta Beaudette virusų atveju, kurie turėjo virulentiškų Massachusetts 41 IBV padermių S1 geną (29).
1.5.2. Inaktyvuotos vakcinos. Inaktyvuotos vakcinos naudojamas atskirai arba kartu derinyje su gyvomis susilpnintomis vakcinomis. Jos dažniausiai suduodamos injekcijos būdu 13-18 savaičių amžiaus dedeklėms ir reproduktoriams. Inaktyvuoti virusai nesidaugina, todėl patologinių sutrikimų tikimybė yra labai maža. Lyginant su gyvomis susilpnintomis vakcinomis, inaktyvuotos vakcinos pasižymi trumpesniu ir silpnesniu imuniniu atsaku – susidaro antikūnai, tačiau neiššaukiamas T ląstelių atsakas. Taigi, inaktyvuotos vakcinos daugeliu atvejų reikalauja pirminės vakcinacijos su gyvomis susilpnintomis vakcinomis, didelių adjuvanto dozių ir kelių vakcinacijų, todėl gali padidėti tokių vakcinacijų ekonominė našta (30). Kadangi jos suduodamos injekcijos būdu, dideliuose ūkiuose tai labai nepraktiška ar netgi neįmanoma. Taip pat injekcijos vietos gali mažinti produkcijos vertę (21).
15 įterpti ir išreikšti skirtingus imunogeninius baltymų subvienetus vektoriaus pagrindu veikiančiose vakcinose nenaudojant viso patogeno. Eksperimentinės rekombinantinės vakcinos buvo sukurtos prieš IBV. Šios vakcinos sukėlė stiprų imuninį atsaką ir apsaugojo nuo infekcinio bronchito (31).
Nors pasiekimai virusinių vektorių vakcinose ir atrodo daug žadantys suteikiant efektyvų imuninį atsaką ir mažinant problemas, susijusias su RNR mutacijomis gyvose susilpnintose vakcinose, ši technologija turi trūkumų. Vienas iš jų – problema su jau egzistuojančiu imunitetu arba motininiu imunitetu, kurie kliudo gyvam vektoriui ir sumažina antigeną pristatančių ląstelių antigeno pasisavinimą, dėl ko sumažinama transgeninė išraiška ir specifinis imuninis atsakas (32). Rekombinuotų adenovirusų su IBV-S1-glikoproteinu vakcinos sukėlė stiprų imuninį atsaką ir apsaugojo 90-100 proc. paukščių nuo trachėjos pažeidimų.
1.5.4. Subvienetų ir peptidų pagrindu pagamintos vakcinos. Ši technologija reikalauja segmentų arba viruso baltymo dalių sukelti specifinį imuninį atsaką. Subvienetų vakcinos pagamintos iš patogeno baltymo arba polisacharido, o peptidų vakcinos - iš patogeno peptidų, koduojančių imunogeninį epitopą. Epitopas ties S1- ir N-genu yra taikinys antikūnų neutralizacijos indukcijai ir citotoksinių T limfocitų atsakams, atitinkamai. Pavyzdžiui, tyrimai pademonstravo, kad sintetinis epitopinis peptidas atitinkantis S20-S255 gerai reagavo su polikloniniais antikūnais prieš įvairias IBV padermes, taip parodydamas potencialų pritaikymą IB vakcinai (33).
Nors eksperimentinėse kūrimo stadijose sintetinės ir peptidų vakcinos parodė perspektyvą kontroliuojant IBV, kai kurie mokslininkai susikoncentravo sukurti daugiaepitopinio peptido vakciną, kurią būtų galima panaudoti prieš didelį spektrą IBV serotipų. Buvo sukurta IBV vakcina, paremta daugeliu epitopų iš S1- ir N-baltymo genų (34). Imunizacijos tyrimai naudojant sukurtą sintetinį peptidą parodė reikšmingą humoralinį ir ląstelinį imuninį atsakus. Biologinio bandymo metu pavyko apsaugoti >80 proc vakcinuotų paukščių, apkrėstų virulentiškais virusais. Kitame tyrime
Lactococcus lactis bakterinė sistema panaudota pristatyti peptidų vakcinas oraliai ir šis metodas
sukėlė mukozinį imuninį atsaką.
16 DNR vakcinos turi trūkumų, vienas iš jų – sudavimo būdas. Kadangi dauguma DNR vakcinų suduodama injekcijos būdu, jas pritaikyti dideliuose paukščių ūkiuose beveik neįmanoma arba labai sudėtinga. Tačiau tokie iššūkiai gali būti apeinami pasinaudojus DNR vakcinų sudavimą in ovo būdu peryklose, suduodant vakciną su geriamu vandeniu, arba purškiant. DNR perdavimas, pasitelkiant nano daleles, padės apsaugoti vakciną nuo fermentinės degradacijos ir sustiprins mukozinį atsaką. Kadangi DNR vakcinos gali būti naudojamos dar veikiant motininiam imunitetui, jų naudojimas paukštininkystėje gali padėti išvengti iššūkių, siejamų su jaunų viščiukų vakcinavimu nuo IB. Kiti DNR vakcinos privalumai – antikūnų ir T ląstelių imuninio atsako indukcija, saugumas, gebėjimas išreikšti keletą baltymų, termostabilumas ir gamybos kaina. Jos gali būti pagaminamos per trumpą laiką, todėl galima greitai reaguoti su kylančia IB grėsme (14).
1.5.6. Atvirkštinės genetinės vakcinos. Atvirkštinės genetinės vakcinos susijusios su nauja technologija, kuri gali manipuliuoti vienu arba daugiau virusinių genų. Ši technologija buvo naudota modifikuoti ir parinkti IBV padermes efektyvesnių vakcinų sukūrimui (36). Pavyzdžiui, rekombinantinė BeauR-IBV vakcina buvo pagaminta pakeičiant antigeninį S1-glikoproteiną nepatogeniškos Beau-IBV padermės su kitu S1-genu iš patogeninio Massachusetts 41 ir europinio 4/91 padermių, atitinkamai (37). Šie pakitimai sukėlė apsauginį imuninį atsaką nepaverčiant naujos BeauR padermės patogeniška. Svarbi atvirkštinių genetinių vakcinų ateitis, nes jos potencialiai gali spręsti gyvų vakcinų sudėtyje esančių susilpnintų koronavirusų virulentiškumo reversijos problemą. Vis dėlto reikia daugiau tyrimų, kad išsiaiškintume, ar šios naujos kartos vakcinos sumažins, ar padidins mutacijos galimybes (14).
1.6. Vaistiniai augalai
Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris L.) – 15 – 30 cm aukščio puskrūmis, pilkai žaliais 8 x 2,5 mm dydžio lapeliais, linijinės ar eliptinės struktūros. Žiedai balti arba blyškiai violetiniai. Augalas paplitęs nuo vakarinių Viduržemio regionų iki pietų Italijos. Aromatinga, antiseptinėmis ir priešgrybelinėmis savybėmis pasižyminti žolelė. Naudinga žarnyno infekcijoms gydyti, nes aktyvi medžiaga timolis labai efektyvi prieš kokcidijas. Plačiai naudojamas kvėpavimo takų profilaktikai ir gydymui. Vaistinio čiobrelio eterinis aliejus yra gausus oksigenuotų monoterpenų (56,6 proc.), ir mažiau monoterpeno angliavandenilių (28,7 proc.), seskviterpeno angliavandenilių (5 proc.) ir oksigenuotų seskviterpenų (1,8 proc.). Dominuojantis junginys tarp eterinio aliejaus komponentų yra timolis (51,3 proc.), o visi kiti junginiai sudaro mažiau nei 19 proc. (38).
beta-17 kariofilenas, kurie sudaro maždaug 96 proc. eterinio aliejaus sudėties. Apie 48 proc. sudėties sudaro citralai (geraniolis ir neralis), apie 39 proc. citronelalis ir apie 2,4 proc. kariofilenas. Medicinoje naudojamas nerviniams sutrikimams, virškinimo sutrikimams, depresijai ir nerimui gydyti ir profilaktikai (39).
Pipirmėtė (Mentha piperita L.) – daugiametis žolinis augalas lygiais, lancetiniais maždaug 8 cm ilgio lapeliais. Pipirmetė yra M. aquatica ir M. spicata hibridas. Ji užauga 30-90 cm aukščio. Eterinis aliejus pasižymi antivirusinėmis, antibakterinėmis, priešgrybėlinėmis, radioprotekcinėmis, antiedeminėmis ir analgezinėmis savybėmis. Pipirmetės eteriniame aliejuje daugiausia randamas mentolio (53,3 proc.), mentilo acetato (15,1 proc.), mentofurano (11,2 proc.) ir 1,8 cineolo (6,7 proc.). Randama ir kitų medžiagų, tačiau jos sudaro mažiau nei 3 proc. (alfa-pinenas, mentonas, neomentolis, germakrenas D) (40).
1.7. Dujų chromatografija – masių spektrometrija
Dujų chromatografija yra labai plačiai pritaikomas metodas. Tačiau pirmasis ir pagrindinis - daugiakomponenčių mišinių analizė ir atskyrimas, tokių kaip eteriniai aliejai, angliavandeniliai ir tirpikliai (41). Iš esmės, panaudojant liepsnos jonizacijos detektorių ir elektronų sugavimo detektorių (jie yra labai aukšto jautrumo), dujų chromatografija geba kiekybiškai nustatyti labai mažų koncentracijų medžiagas. Šis metodas plačiai pritaikomas taršos tyrimuose, teismo ekspertizėse ir pėdsakų analizėse. Dėl savo paprastumo, jautrumo ir efektyvumo atskiriant mišinių komponentus, dujų chromatografija yra vienas iš svarbiausių įrankių chemijoje. Ji plačiai naudojama kokybinėms ir kiekybinėms mišinių analizėms, junginių gryninimui ir nustatymui (42). Žinios apie chemines augalų sudedamąsias dalis reikalingos ne tik norint atrasti naujas gydomąsias medžiagas, tačiau ir todėl, kad tokia informacija gali labai pasitarnauti atskleidžiant naujus fitojunginių šaltinius, naudojamus sudėtingų cheminių medžiagų sintezei, bet ir atrasti tikrąjį liaudies medicinos poveikį. Aukštesnieji augalai, kaip bioaktyvių junginių šaltinis, vis dar atlieka vieną svarbiausių vaidmenų sveikatos srityje. Žalieji augalai – efektyvių chemoterapinių vaistų rezervuarai, kurie yra ne fitotoksiniai, o sisteminiai ir lengvai suyrantys (43). Dėl šios priežasties prasidėjo kruopštus augalinių vaistų nagrinėjimas, kaip nauja mokslo šaka, pabrėžianti ir prioritetizuojanti natūralių vaistų ir produktų standartizaciją. Dujų chromatografijos - masės spektrometrijos tyrimai taikomi medicininių augalų analizei, nes šis metodas įrodė savo naudą nepolinių komponentų ir lakių eterinių aliejų, riebalų rūgščių, lipidų ir alkaloidų analizei (44).
18 Dujų chromatografijos - masės spektrometrijos įrangos kaina smarkiai sumažėjo, o patikimumas išaugo, todėl šį tyrimą galima pritaikyti įvairiose strityse. Šiuo metodu yra labai patogu tirti ir nustatyti chlorofenolius vandenyje ir dirvožemyje, policiklinius aromatinius angliavandenilius, bešvinį benziną, dioksinus, dibenzofuranus, organochlorino pesticidus, herbicidus, fenolius, halogenizuotus pesticidus, sierą ore. Taip pat gali būti atlikta dekacikleno, ovaleno analizė ir netgi C60 karbamazepino ir jo metabolitų degradacijos analizė valytame kanalizacijos vandenyje (45).
Dujų chromatografija - masės spektrometrija naudojama aptikti ir išmatuoti teršalus ir maisto, aliejaus, sviesto falsifikavimą arba sugedimą. Taip pat naudojama analizuojant piperiną, šaltmėtės aliejų, levandų aliejų, eterinį aliejų (46).
1.8. Realaus laiko PGR
Realaus laiko PGR (polimerazinė grandininė reakcija), greitai išpopuliarėjo dėl plataus panaudojimo ir pritaikymo galimybių įvairiose mokslo šakose. Realaus laiko PGR sujungia paprastą PGR su galimybe aptikti ir nenutraukiamai stebėti reakcijos produktų kaupimąsi po kiekvieno ciklo. Realaus laiko PGR gali aptikti specifinių nukleininių rūgščių sekų buvimą ir kiekį, taip pat nustatyti ar egzistuoja tų sekų variacijos. Norint padidinti specifiškumą, jautrumą ir bendrą naudingumą realaus laiko PGR, galima naudoti fluorescentiškai pažymėtus oligonukleotidų zondus, kad aptiktume pagausintus PGR produktus. Nukleorūgšties pagausinimas ir aptikimas atliekamas sandariuose PGR mėgintuvėliuose, todėl mažėja mėginių kontaminacijos tikimybė, greitėja nenutrūkstamas duomenų surinkimas ir trumpėja laikas, reikalingas rezultatų gavimui (47).
Realaus laiko PGR turi keletą pranašumų prieš tradicinius PGR metodus. Realaus laiko PGR yra tikslesnė, nei paprasta, nes aptinka mažesnes variacijas tikslinėse kopijose. Pagausinti produktai yra matuojami po kiekvieno ciklo (realiu laiku) su kiekybiniu aptikimo diapazonu. Šis pranašumas, lyginant su tradiciniais metodais, kurių pagausinti produktai bus matomi tik atlikus elektroforezę (48).
19
2. TYRIMŲ METODIKA
Darbas buvo atliktas LSMU VA VF MVI virusologinių tyrimų laboratorijoje 2018-2020 metais.
2.1. Tyrimų schema
IBV adaptacija ir gausinimas Vero ląstelėse
IBV adaptacijos vertinimas: skirtingų pasažų LKID50 nustatymas ir pasažo tyrimams parinkimas
Adsorbuotų ir neadsorbuotų per valandą bei bendro IBV titro (LKID50) ir jo dinamikos įvertinimas
Augalų etanolio ekstraktų citotoksiškumo Vero ląstelėms tyrimai.
Augalų etanolio ir CO2ekstraktų koncentracijos parinkimas virucidinio poveikio tyrimams
Dėmių ir titravimo metodų palyginimas naudojant etanolio ekstraktus.
Etanolio ir CO2ekstraktų virucidinio poveikio palyginimas naudojant titravimo metodą
Etanolio frakcijų virucidinio poveikio palyginimas naudojant titravimo metodą
20
2.2. Virusai, padermė
Tyrimams buvo naudota IBV Beaudette padermė, kurią suteikė dr. M. H. Verheije iš Utrechto universiteto (Nyderlandai). Gauto IBV Beaudette virusų titras (EID50/ml) krečiant vištų kiaušinių
embrionus į alantojį buvo 7,23×107.
Beaudette padermės virusai prisitaikę replikuotis Vero ląstelėse ir joms sukelia citopatogeninį efektą (CPE). CPE buvo nustatomas šviesinio mikroskopo pagalba, aptinkant virusų sinticijas.
Virusai buvo laikomi -80°C temperatūroje gilaus šaldymo šaldiklyje.
2.3. Ląstelių kultūra
Vero lastelės (ATCC CCL-81) buvo gautos iš Dr. I. Jacevičienės iš Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto virusologinių tyrimų skyriaus. Tyrimams naudotos 29-35 pasažo ląstelės kultivuotos Dulbecco‘s modifikuotame Eagle‘s terpėje (DMEM) papildytoje 10 proc. fetaliniu veršelių serumu (FVS) 37 °C temperatūroje 5 proc. CO2 termostate. Nistatinas (100 vnt./ml)
(Gibco, JAV) ir gentamicinas (50 μg/ml) (Gibco, JAV) naudoti siekiant išvengti mikrobinio užterštumo.
2.4. Virusų adaptacija ir pagausinimas
Virusų pagausinimas buvo atliekamas krečiant Vero ląsteles užaugintas 25cm2 ląstelių kultūrų
indeliuose (TPP, Šveicarija).
21
2.5. Virusų kiekio nustatymas
Virusų kiekis buvo vertintas nustatant 50 proc. ląstelių kultūrų infekcinę dozę - LKID50 96
duobučių ląstelių kultūrų plokštelėje (TPP, Šveicarija). Tuo tikslu į kiekvieną duobutę buvo sėjama po 104 ląstelių/100 l su DMEM terpe, turinčia 10 proc. FVS, bei taip sudarant ≈3 mm terpės sluoksnį. Po 24 valandų auginimo, esant ≈90 proc. monosluoksniui, ląstelės buvo krečiamos virusu, nutitruotu nuo 10-1 iki 10-8. Prieš krėtimą ląstelės buvo plaunamos FBT 2 kartus. Titravimui naudota DMEM terpė be serumo, krėsta 100 l iš kiekvieno atskiedimo į aštuonias duobutes. Apkrėtus inkubuojama vieną valandą. Praėjus valandai, buvo pridedama 100 l DMEM terpės su 4 proc. FVS – taip gaunama 200 l DMEM terpės su 2 proc. FVS ir sudaromas ≈6 mm terpės sluoksnis. Po apkrėtimo ląstelės stebimos 7 dienas ir žymimas jų CPE. Apskaičiuojamas virusų titras pasitelkiant Karberio – Spearmano skaičiuoklę.
2.6. Adsorbuotų ir neadsorbuotų per valandą IBV kiekio ir santykio bei jų
dinamikos nustatymas ir palyginamasis įvertinimas
Adsorbuotų ir neadsorbuotų per valandą koronavirusų kiekis ir santykis bei jų dinamika buvo vertinama titruojant 11 pasažo virusus ir krečiant Vero ląstelės 96 duobučių ląstelių kultūrų plokštelėse (TPP, Šveicarija). Bandymas atliktas du kartus, kiekvieną kartą naudojant tris plokšteles. Pirma plokštelė naudota adsorbuotų per valandą virusų kiekio nustatymui, antra – neadsorbuotų per valandą, bet adsorbuotų vėliau, o trečia bendro virusų kiekio, išreikšto LKID50, nustatymui.
Trys plokštelės buvo užsėjamos ląstelėmis su DMEM terpe, turinčia 10 proc. FVS, tą pačią dieną.
Po 24 valandų nuo persėjimo esant ≈90 proc. monosluoksniui pirmos ir trečios plokštelės ląstelės buvo krečiamos virusu, titruotu nuo 10-1 iki 10-8 – po 8 duobutes iš kiekvieno atskiedimo.
Prieš krėtimą ląstelės buvo plaunamos FBT du kartus. Virusai buvo skiedžiami DMEM terpe be serumo, ląstelių krėtimui į kiekvieną duobutę buvo naudota 100 µl skysčio. Po ląstelių apkrėtimo buvo inkubuojama 1 val. +37 ºC temperatūroje.
Po valandos į trečios plokštelės duobutes buvo pridedama 100 µl DMEM terpės, turinčios 4 proc. FVS. Inkubuojama termostate ir stebima 7 dienas paeiliui.
Tuoj pat antros plokštelės ląstelės buvo plaunamos du kartus su FBT. Tada iš pirmosios plokštelės kiekvienos duobutės 100 µl tirpalo su neadsorbuotais virusais buvo perkeliama į antros plokštelės atitinkamą duobutę. Į pirmosios plokštelės duobutes pridedama 200 µl DMEM terpės turinčios 2 proc. FVS, inkubuojama termostate ir stebima 7 dienas paeiliui.
22 Po apkrėtimo kiekvieną dieną 7 dienas paeiliui buvo stebimos ląstelės ir pažymimas CPE. CPE buvo žymimas tik esant aiškiems ląstelių pakitimams, kai buvo matomos sincitijos, ir esant dalies ar viso monosluoksnio pažeidimams. Esant neaiškiems ląstelių pakitimams CPE buvo vertinamas ir žymimas kitą dieną. Virusų titras, išreikštas log10 LKID50, apskaičiuotas naudojant
Karberio - Spearmano skaičiuoklę.
Adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų kiekis, išreikštas log10 LKID50, skaičiuotas 7 dienas.
Adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų titrai palyginti, stebėta jų dinamika. Adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų LKID50 procentinio santykio palyginimui apskaičiuoti log10 verčiami natūraliais skaičiais.
Bendras virusų kiekis naudojamas kontrolei.
2.7. Augalai ir jų ekstraktai
Tyrimui naudoti augalai – pipirmėtė (Mentha piperita L.), vaistinė melisa (Melissa officinalis L.), ir vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris L.) buvo užauginti Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sode. Džiovinimas buvo naudojamas surinkti visiems skirtingų augalų bandiniams, kurie buvo paimti intensyvaus žydėjimo tarpsnyje, vienalaikiam biologinio aktyvumo nustatymui, turint omenyje, kad skirtingi medicininiai augalai skiriasi biologiškai aktyvių medžiagų kaupimo dinamiškumu, vegetacija, o kartu ir grynos žaliavos gavimu.
Augalų ekstraktai buvo paruošti Vytauto Didžiojo universiteto Gamtos mokslų fakulteto Instrumentinės analizės atviros prieigos centre. Tirpiklis etanolis buvo atskiestas su steriliu du kartus distiliuotu vandeniu iki 40 proc. koncentracijos. Džiovintų augalų medžiaga iš kiekvieno augalo (500 μg) išgauta su 10 ml tirpiklio. Išgavimas buvo atliekamas orbitinėje maišyklėje 24 valandas kambario temperatūroje (20°C). Kiekvienas ekstraktas buvo filtruojamas per popierinį filtrą, o tada per polivinilinį difluorido membraninį filtrą su 0.22 μm skylutėm. Ekstraktų koncentracija buvo 50 mg/ml, lyginant su pirmine medžiaga. Visi pagaminti augalų ekstraktai buvo laikomi šaldytuve 4 °C temperatūroje.
Skirtingos ekstraktų frakcijos (I, II ir III) buvo pagamintos panaudojant skirtingas etanolio tirpalo koncentracijas – 10 proc. , 50 proc. ir 90 proc., atitinkamai.
CO2 ekstrakcijai augalų žaliava sumalama ir sudedama į ištraukimo indą. CO2 dujos
veikiamos aukštos temperatūros ir aukšto slėgio. Taip susidaro superkritinis CO2, kuris siurblio
23
2.8. Augalų ekstraktų citotoksiškumo tyrimai
Ekstraktų ir frakcijų citotoksiškumas buvo tiriamas naudojant MTT testą. Superkritinių skysčių citotoksiškumo tyrimai nebuvo atliekami.
Pirmiausia, ląstelės persėjamos po 1 × 104 ląstelių į duobutę 96 duobučių ląstelių kultūrų
plokštelėje (TPP, Šveicarija) ir auginamos 37 °C temperatūroje 24 valandas.
Visos tirtos medžiagos buvo titruojamos naudojant DMEM terpę be serumo 8 eilutėse dukartiniais atskiedimais plokštelėjė be ląstelių nuo 1:2 iki 1:256 (nuo 1 iki 8 stulpelio) ir po 100 l perkeliama į plokštelę su du kartus FBT nuplautomis ląstelėmis. Inkubuojama termostate ir po valandos du kartus nuplaunama FBT. Tada užpilama DMEM terpės su 2 proc. FVS bei inkubuojama 72 val. Po to į kiekvieną duobutę įpilta po 10 μl (5 mg/ml) MTT reagento tirpalo (Sigma-Aldrich, JAV) ir inkubuota 4 valandas 37 °C temperatūroje. Po inkubacijos terpė atsargiai nusiurbiama ir į kiekvieną duobutę įpilta 100 μl dimetil sulfoksido, DMSO, (Carl Roth, Vokietija). Tada plokštelės buvo 5 minutes purtomos. Kiekvienos duobutės optinis tankis buvo matuojamas 620 nm bangos ilgiu spektrofotometru (Multiskan™ FC Microplate Photometer, JAV). Pagal optinį tankį buvo apskaičiuotas gyvybingų ląstelių procentas, o tada, naudojantis IC50 skaičiuokle, esančia tinklapyje
http://ic50.tk/, buvo apskaičiuotos CC50 reikšmės.
2.9. Augalų ekstraktų koncentracijų virucidiniams tyrimams parinkimas
Augalų ekstraktų koncentracija virucidiniams tyrimams parinkta atsižvelgiant į jų citotoksiškumo (CC50) tyrimus ir jo sudėtyje esančio etanolio poveikį koronavirusams. Tirta viena
superkritinių skysčių koncentracija.
Tyrimams 8,33 mg/ml koncentracija ruošta tik etanolinius ekstraktus maišant 1 dalį (20 l) su 5 dalims (100 l) IBV.
Tyrimams 4,16 mg/ml koncentracija gauta maišant 1 dalį (10 l) ekstrakto, frakcijos ar superkritinio skysčio su 11 dalių (110 l) IBV.
Atinkamai, 2,08 mg/ml koncentracija gauta maišant po 1 dalį (5 l) ekstrakto ar frakcijos (superkritinis skystis netirtas) ir DMEM terpės bei 22 dalis (110 l) IBV.
Atinkamai, 1,04 mg/ml koncentracija gauta maišant 1 dalį (2,5 l) ekstrakto ar frakcijos (superkritinis skystis netirtas), 3 dalis (7,5 l) DMEM terpės bei 44 dalis (110 l) IBV. Po to kambario temperatūroje tamsoje laikoma 1 val.
24 CC50 koncentracijos buvo paruoštos pagal kiekvieno augalo CC50 skiedžiant su DMEM.
Pirmiausia buvo paruošta 1 CC50 koncentracija, toliau atliekant dukartinius paruošimus 0,5 CC50,
0,25 CC50 ir 0,125 CC50.
Po atskiedimo su medžiagomis virusai buvo laikomi kambario temperatūroje 1 val. tamsoje. Tada nutitruojami dešimtkartiniais atskiedimais ir krečiamos ląstelės.
2.10. Virucidinių savybių vertinimas
Virucidinių savybių tyrimui naudoti 11 pasažo koronavirusai.
Paveiktų virusų ir kontrolinių virusų titras nustatytas naudojant 96 duobučių ląstelių kultūrų plokšteles. Gauti IBV titrai palyginti, įvertintas virucidinis poveikis apskaičiuojant antikūnų titrų sumažėjimą, išreikštą log10.
Virusai vertinti 1-oje lentelėje nurodytais kriterijais. 1 lentelė. Virusų titro pokyčio vertinimas
Sumažėjimas Virusų kiekio sumažėjimo apibūdinimas
nereikšmingas silpnas vidutinis stiprus
log10 ≤1 1-2 2-4 ≥4
proc. ≤90,0 90,0-99,0 99,0-99,99 ≥99,99
kartais ≤10 10-100 100-10000 ≥10000
2.11. Dėmių metodas
Dėmių metodas naudotas virusų kiekio pokyčio po paveikimoaugalų ekstraktais nustatymui, o taip pat palyginamajam įvertinimui su titravimo 96 duobučių plokštelėse metodu. Bandymas atliktas du kartus. Bandymo metu buvo tiriami kiekvieno mėginio duplikatai. Naudota neigiama IBV ir etanolio kontrolė.
Dėmių metodui naudotos 6 duobučių (9,03 cm2) ląstelių kultūrų plokštelės (TPP, Šveicarija).
Po 24 valandų užaugusios ląstelės buvo plaunamos du kartus su FBT ir krečiamos 1 ml DMEM su 11 pasažo virusu (paveiktu ir nepaveiktu) titruotu nuo 10-1 iki 10-5. Po vienos valandos skystis buvo
25 mikroskopiją. Virusų titras išreiškiamas log10. Virusų kiekio pokytis buvo vertinamas lyginant
paveikto ir nepaveikto (kontrolinio) virusų kiekį, išreikštą log10.
2.12. Titravimas ir LKID50 nustatymas
LKID50 nustatymas naudojant 96 duobučių ląstelių kultūrų plokšteles buvo pagrindinis
metodas visų ekstraktų virucidinio poveikio įvertinimui. Kaip ir dėmių metodui, buvo naudoti 11 pasažo IBV. Jie buvo veikti medžiagomis įvairiomis koncentracijomis kambario temperatūroje 1 val., tada nutitruoti dešimtkartiniais atskiedimais ir panaudoti ląstelių krėtimui.
Į kiekvieną duobutę buvo sėjama po 104 ląstelių su 100 µl DMEM terpes su 10 proc. FVS ir
taip sudarant ≈3 mm terpės sluoksnį. Po 24 valandų auginimo, esant ≈90 proc. monosluoksniui ląstelės buvo krečiamos virusais (paveiktais ar nepaveiktais), nutitruotais nuo 10-1 iki 10-8. Prieš
krėtimą ląstelės buvo plaunamos FBT 2 kartus. Titravimui naudota DMEM terpė be serumo, krėsta 100 l iš kiekvieno atskiedimo į aštuonias duobutes. Apkrėtus inkubuojama vieną valandą. Praėjus valandai buvo pridedama 100 l DMEM terpės su 4 proc. FVS – taip gaunama 200 l DMEM terpės su 2 proc. FVS ir sudaromas ≈6 mm terpės sluoksnis.
CPE vertintas po 3 dienų, o 4-7 dieną patvirtintas. CPE buvo žymimas esant ląstelių pakitimams, sincitijoms, dalies ar viso monosluoksnio pažeidimams. Virusų titrai apskaičiuoti naudojant Karberio - Spearmano metodą (Kärber, 1931).
2.13. Statistiniai metodai
Virusų titras apskaičiuojamas pasitelkiant skaičiuoklę „TCID50 calculator“ (v2.1 - 20-01-2017_MB). Šią skaičiuoklę sukūrė Marco Binde, kuris panaudojo Karberio - Spearmano metodą LKID50 paskaičiuoti. Skaičiuoklė yra www.klinikum.uni-heidelberg.de tinklalapyje.
Vidurkių ir standartinių nuokrypių Mσ apskaičiavimai buvo panaudoti vertinant skirtumų statistinį patikimumą T-testu. Tai buvo atlikta specialios skaičiuoklės pagalba, kurią galima rasti
26
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Koronavirusų adaptacija
Paukščių koronavirusai, Beaudete padermė, buvo adaptuojami atliekant 11 pasažų Vero ląstelėse. Adaptacijai įvertinti buvo nustatytas ir palygintas 4-11 pasažų virusų titras LKID50.
Virusų titravimas atliktas per 4 kartus t.y. tą pačią dieną ląstelės buvo krečiamos naudojant 4-ą ir 5-4-ą, 6-4-ą ir 7-4-ą, 8-4-ą ir 9-4-ą, bei 10-4-ą ir 11-4-ą pasažus.
2 pav. IBV Beaudette 6-as pasažas - Vero ląstelės po vienos dienos
Matosi, kad po vienos dienos ląstelės dar ganėtinai gyvybingos, nors monosluoksnio nebesudaro, stebimas virusų poveikis yra nedidelis
3 pav. IBV Beaudette 6-as pasažas - Vero ląstelės po dviejų dienų
Matosi, kad po dviejų dienų ląstelės beveik nebegyvybingos
Iš tyrimo duomenų matome, jog mažiausias virusų titras buvo ketvirtojo pasažo – 4,50±0,13 log2. Šio pasažo titras didėjo stabiliai, tačiau piką pasiekė jau trečią tyrimo dieną - 4,88±0,18 log2
(p<0,05). Penktojo pasažo virusų titras pirmąją dieną buvo aukštesnis, lyginant su ankstesniu pasažu ir buvo 4,63±0,13 log2. Šio pasažo titras kilo stabiliai ir piką pasiekė trečią tyrimo dieną ir buvo
5,00±0,19 log2 (p<0,05). Tuomet buvo vertinti šeštas ir septintas pasažai. Šeštajame pasaže pirmąją
dieną virusų titras buvo toks pats kaip ir ankstesniajame pasaže pirmąją dieną (4,63±0,13 log2).
Virusų titro pikas buvo pasiektas trečią dieną ir nei kiek nesiskyrė, lyginant su penktuoju pasažu - 5,00±0,19 log2 (p<0,05). Septintojo pasažo virusų titras pirmąją tyrimo dieną siekė 4,88±0,18log2.
Titras stabiliai didėjo ir piką pasiekė trečią tyrimo dieną - 5,13±0,19 log2 (p<0,05). Tuomet buvo
27 tyrimo dieną buvo 4,63±0,13 log2. Titras kilo stabiliai ir piką pasiekė trečią tyrimo dieną - 5,00±0,19
log2 (p<0,05). Tada buvo vertinami paskutiniai - dešimtas ir vienuoliktas - pasažai. Dešimto pasažo
virusų titras pirmą tyrimo dieną buvo 4,88±0,18 log2, didėjo stabiliai ir piką pasiekė trečią dieną -
5,13±0,19 log2 (p<0,05). Vienuolikto pasažo virusų titras pirmą bandymo dieną buvo 4,88±0,18 log2.
Kilo stabiliai ir piką pasiekė tik penktą tyrimo dieną - 5,25±0,19 log2 (p<0,05).
2 lentelė. Skirtingų pasažų virusų titras, 50 procentės ląstelių kultūrų infekcinės dozės skirtingomis dienomis
Skaičius laipsnio vietoje parodo vidugrupinį statistiškai patikimą skirtumą (p<0,05), jeigu skaičiai skiriasi, o jeigu jie vienodi – statistiškai nepatikimą skirtumą (p>0,05). Raidės laipsnio vietoje nurodo tarpgrupinius skirtumus – statistiškai patikimus (p<0,05), jeigu raidės skirtingos, o jei raidės vienodos - statistiškai nepatikimus (p>0,05).
4 pav. Virusų poveikis Vero ląstelėms – ląstelės prieš krėtimą (kairėje) ir po 24 valandų. Toks CPE buvo stebimas pirmą - antrą dienomis po apkrėtimo duobutėse, kuriose ląstelės krėstos mažesniu virusų (didesnis atkiedimas) kiekiu.
Virusų pasažas
Virusų titras, LKID50, dienos
28 5 pav. Virusų poveikis Vero ląstelėms – neapkrėstos ląstelės (kairėje) ir apkrėstos virusais po 48 valandų. Toks CPE buvo stebimas antrą (retai pirmą) dieną po apkrėtimo duobutėse, kuriose ląstelės krėstos didesniu virusų (mažesnis atskiedimas) kiekiu ir trečią bei vėlesnėmis kuriose ląstelės krėstos mažesniu virusų (didesnis atkiedimas) kiekiu – tik šiuo atveju ląstelių monosluoksnio pažedimai buvo matomi nedideliuose plotuose.
Apskaičiavę bendrą virusų kiekį LKID50 toliau nustatėme ir palyginome adsorbuotų ir
neadsorbuotų virusų kiekius. Lentelėje matome adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų kiekį, jų santykį ir palyginimą su bendru virusų kiekiu.
Pirmą tyrimo dieną, adsorbuotų ir neadsorbuotų kiekis buvo toks pats – 23988, jų santykis 50:50. Antrą tyrimo dieną adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų kiekiai buvo tokie pat kaip ir pirmą dieną, todėl ir jų santykis (50:50) išliko toks pats. Trečią dieną adsorbuotų virusų buvo 31623, o neadsorbuotų – 23988, santykiu 57:43. Ketvirtą dieną buvo pasiektas pikas, adsorbuotų virusų buvo 56234, o neadsorbuotų – 42658, santykiu 57:43. Penktą, šeštą ir septintą dienomis, rezultatai išliko identiški kaip ir ketvirtą tyrimo dieną – adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų santykis buvo 57:43.
29 tik penktą dieną (211349 virusai), ketvirtą dieną bendras virusų skaičius jau lenkė virusų skaičiaus piką pirmojo bandymo metu – 134896 virusai.
3 lentelė. Adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų titras, santykis ir bendras virusų titras
Dienos LKID50 skaičius
I bandymas II bandymas
Ad Nead Ad:Nead Bendras Ad Nead Ad:Nead Bendras
1 239881a 239881a 47976 (50:50) 316231 426581a 562341a 98892 (43:57) 758581 2 239881a 239881a 47976 (50:50) 426582 426581a 758581b 118516 (36:64) 1000001,2 3 316232a 239881b 55661 (57:43) 562342 562341,2a 758581,2a 132092 (43:57) 1000001,2 4 562343a 426582a 98892 (57:43) 1000003 758582a 1000002a 175858 (43:57) 1348962,3 5 56234 42658 98892 (57:43) 100000 75858a 100000a 175858 (43:57) 2113493 6 56234 42658 98892 (57:43) 100000 75858 100000 175858 (43:57) 211349 7 56234 42658 98892 (57:43) 100000 75858 100000 175858 (43:57) 211349
Skaičius laipsnio vietoje parodo vidugrupinį statistiškai patikimą skirtumą (p<0,05), jeigu skaičiai skiriasi, o jeigu jie vienodi – statistiškai nepatikimą skirtumą (p>0,05). Raidės laipsnio vietoje nurodo tarpgrupinius skirtumus – statistiškai patikimus (p<0,05), jeigu raidės skirtingos, o jei raidės vienodos - statistiškai nepatikimus (p>0,05).
Ad – adsorbuotų per 1 valandą IBV skaičius; NeAd – neadsorbuotų per 1 valandą, bet adsorbuotų vėliau IBV skaičius; Ad:Nead – Ad ir Nead – Ad ir Nead suma (Ad ir Nead santykis)
Adsorbuotų per valandą virusų titras buvo vertinamas kiekvieną dieną, septynias dienas (6 paveikslas). Grafike matosi, kad pirmo ir antrojo bandymo metu titrai skyrėsi. Antrojo bandymo metu titras buvo aukštesnis (4,63 log2), nei pirmojo bandymo metu (4,38 log2), pirmąją bandymo dieną.
30 6 pav. Adsorbuotų virusų per valandą titro pokyčiai ir vidurkis 7 dienų laikotarpyje
Neadsorbuotų per valandą virusų titras buvo vertinamas kiekvieną dieną, septynias dienas (7 paveikslas). Grafike matosi, kad pirmo ir antrojo bandymo metu, titrai skyrėsi. Antrojo bandymo metu titras buvo aukštesnis (4,75 log2), negu pirmojo bandymo metu (4,38 log2), pirmąją bandymo
dieną. Neadsorbuotų virusų titrai kilo kiekvieną dieną ir aukščiausią titrą pasiekė po keturių dienų ir pirmojo ir antrojo bandymo virusų titrai – 4,63 log2 ir 5,0 log2, atitinkamai.
7 pav. Neadsorbuotų virusų per valandą titro pokyčiai ir vidurkis 7 dienų laikotarpyje
Bendras virusų titras buvo vertinamas kiekvieną dieną, septynias dienas (8 paveikslas). Grafike matosi, kad pirmojo ir antrojo bandymo metu, titrai skyrėsi. Antrojo bandymo metu titras buvo didesnis (4,88 log2), negu pirmojo bandymo (4,5 log2), pirmąją bandymo dieną. Virusų titrai
4.38 4.38 4.5 4.75 4.75 4.75 4.75 4.63 4.63 4.75 4.88 4.88 4.88 4.88 4.5 4.5 4.63 4.82 4.82 4.82 4.82 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5
1 diena 2 dienos 3 dienos 4 dienos 5 dienos 6 dienos 7 dienos Pirmas bandymas Antras bandymas Vidurkis
4.38 4.38 4.38 4.63 4.63 4.63 4.63 4.75 4.88 4.88 5 5 5 5 4.57 4.63 4.63 4.82 4.82 4.82 4.82 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1
31 abiejų bandymų kilo kiekvieną dieną. Pirmojo bandymo bendras virusų titras buvo didžiausias po keturių dienų – 5,0 log2, o antrojo bandymo metu – po penkių dienų – 5,25 log2.
8 pav. Bendro virusų titro pokyčiai ir vidurkis 7 dienų laikotarpyje
Stebint adsorbuotų, neadsorbuotų ir bendro virusų titro vidurkius (9 paveikslas), matoma, kad bendras virusų titras buvo didesnis už adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų titrą visomis tyrimo dienomis. Aukščiausią tašką bendras virusų titras pasiekė po penkių dienų. Adsorbuotų virusų kiekis po pirmos tyrimo dienos buvo žemesnis, nei lyginant su neadsorbuotais virusais, tačiau ir adsorbuotų ir neadsorbuotų virusų titrai buvo lygūs po trijų dienų, o aukščiausią savo lygį abudu pasiekė po keturių dienų.
9 pav. Adsorbuotų, neadsorbuotų ir bendro virusų titro kitimo dinamika 7 dienų laikotarpyje 4.5 4.63 4.75 5 5 5 5 4.88 5 5 5.13 5.25 5.25 5.25 4.69 4.82 4.88 5.07 5.13 5.13 5.13 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4
1 diena 2 dienos 3 dienos 4 dienos 5 dienos 6 dienos 7 dienos Pirmas bandymas Antras bandymas Vidurkis
4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4
32
3.2. Augalų ekstraktai
Augalų ekstraktų sudėtis buvo ištirta Vytauto Didžiojo universiteto Gamtos mokslų fakulteto Instrumentinės analizės atviros prieigos centre. Jų sudėtis vertinta pagal 3 kriterijus – fenolinių junginių kiekį, flavonoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą. M. piperita sudėtyje – 5,48 mg/ml fenolinių junginių, 2,23 mg/ml flavonoidų, o antioksidacinis aktyvumas – 8,72 mg/ml. M. officinalis sudėtyje – 8,02 mg/ml fenolinių junginių, 0,79 mg/ml flavonoidų, o antioksidacinis aktyvumas – 13,21 mg/ml. T. vulgaris sudėtyje – 5,50 mg/ml fenolinių junginių, 1,51 mg/ml flavonoidų, o antioksidacinis aktyvumas – 9,18 mg/ml. Didžiausia fenolinių junginių koncentracija ir antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo melisos ekstraktas, o didžiausią flavanoidų koncentraciją turėjo pipirmetės ekstraktas.
4 lentelė. Augalų etanolio ekstraktų cheminė sudėtis ir citotoksiškumas
Augalas Etanolio ekstraktai, mg/ml Etanolio
ekstrakto CC50 mg/ml Fenoliniai junginiai Flavonoidai Antioksidacinis aktyvumas Mentha piperita L. 5,48 2,23 8,72 2,73 Melissa officinalis L. 8,02 0,79 13,21 6,33 Thymus vulgaris L. 5,50 1,51 9,18 5,90
3.3. Augalų ekstraktų citotoksiškumo įvertinimas
33 10 pav. Ląstelių gyvybingumo priklausomybė nuo pipirmetės ekstrakto koncentracijos
11 pav. Ląstelių gyvybingumo priklausomybė nuo melisos ekstrakto koncentracijos
12 pav. Ląstelių gyvybingumo priklausomybė nuo čiobrelio ekstrakto koncentracijos
M. piperita pasižymėjo didžiausiu citotoksiškumu (4,2±0,07 log2). M. officinalis ir T. vulgaris
ląsteles citotoksiškai veikė silpniau, tačiau jų abiejų citotoksiškumai panašūs – 3,08±0,17 log2 ir
2,98±0,09 log2, atitinkamai. Etanolio citotoksiškumas buvo mažesnis nei vaistinių žolelių ekstrakto
34 13 pav. Etanolio ir augalų ekstraktų citotoksiškumas
3.4. Dėmių metodo ir LKID50 palyginimas
Augalų ekstraktų koncentracijos, kurių reikėjo inaktyvuoti virusams ir sumažinti DSV kiekį ≥4 log10, pateiktos 14.1 paveiksle. M. piperita koncentracija, inaktyvavusi virusus ir ≥4 log10 sumažinusi
DSV skaičių, buvo 0,68 mg/ml. M. officinalis ir T. vulgaris koncentracijos, inaktyvavusios virusą buvo 2,1 mg/ml ir 1,56 mg/ml, atitinkamai. Melisos ekstrakto koncentracija, kuri ≥4 log10 sumažino
DSV skaičių – 1,48 mg/ml, o čiobrelio – 1,56 mg/ml. Veikiant melisos ekstraktu, dėmės sudarančių vienetų skaičius buvo 0,15 log10, prie 1,48 mg/ml koncentracijos, kuomet pipirmetės ir čiobrelio
ekstraktai prie optimalios kocentracijos dėmių nebesudarė. Visos augalų koncentracijos sudarė 0,25 IC50.
14.1 pav. Augalų ekstraktų koncentracijos (mg/ml), 100 proc. inaktyvavusios virusą ir sumažinusios dėmės sudarančių vienetų skaičių ≥4 log10
2.37 4.2 3.08 2.98 0 1 2 3 4 5
Etanolis Pipirmėtė Melisa Čiobrelis Ekstraktas 0.68 0.68 2.1 1.48 1.56 1.56 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Koncentracija, inaktyvavusi virusą Koncentracija, sumažinusi ≥4 log10 dėmes sudarančių vnt. skaičių.
35 14.2 pav. Augalų ekstraktų koncentracijos (mg/ml), 100 proc. inaktyvavusios virusą ir
sumažinusios ≥4 log10 TCID50
Stebimos dėmės (15 ir 16 pav.) dažniausiai buvo 7-12 mm2 dydžio, 3-4 mm skersmens.
15 pav. matome tyrimus duplikatais trijuose stulpeliuose. Pirmame stulpelyje viršutinėje ir apatinėje duobutėje matomos atitinkamai 14 ir 11 dėmių, kurios susidarė po kontakto su 1000 kartų atskiestais virusais. Antrame stulpelyje atskiedus virusus 10000 kartų matome po 1 dėmę, o trečiame - ląstelių kontrolė, čia dėmių nėra. Šios plokštelės tyrimas rodytų, kad titravimui skirtame 1 ml medžiagos buvo 12500 (4,1 log10) DSV. Tačiau šis skaičius nerodo galutinio DSV, nes titrui nustatyto krėsta
daugiau duobučių.
15 pav. Dėmių metodas
16 pav. matome tyrimus duplikatais trijuose stulpeliuose – kai kiekviename stulpelyje tirti skirtingais ekstraktais paveikti virusai. Pirmame stulpelyje viršutinėje ir apatinėje duobutėje matomos atitinkamai 15 ir 12 dėmių, kurios susidarė po kontakto su 100 kartų atskiestais virusais. Šios
0.68 0.68 2.95 1.48 1.56 1.56 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Koncentracija, inaktyvavusi virusą Koncentracija, sumažinusi ≥4 log10 dėmes sudarančių vnt. skaičių.
36 plokštelės tyrimas rodytų, kad titravimui skirtame 1 ml medžiagos buvo 1350 (3,13 log10) DSV.
Antrame stulpelyje, atskiedus virusus 100 kartų, matome po 1 ir 5 dėmes – tai rodytų, kad titravimui skirtame 1 ml medžiagos buvo 300 (2,47 log10) DSV. Tačiau šiuo atveju DSV skaičius buvo
vertinamas pagal dėmių skaičių atskiedus virusą 10 kartų. Trečias stulpelis rodo, kad paveikus trečia medžiaga dėmių nematyti. Šiuo atveju reikėtų stebėti rezultatus, matomus plokštelėje, kur virusų atskiedimas 10 kartų mažesnis.
16 pav. Dėmių mažėjimo metodas
Augalų CO2 ekstraktų A ir B poveikis virusų ląstelių kultūrų infekcinėms dozėms buvo tirtas
(5 lentelė), vertinant LKID50 sumažėjimą. Paveikus M. piperita ekstraktu A LKID50 buvo 3,75 log10,
sumažėjimas buvo 95,8 proc. kuomet kitų augalų ekstraktų – M. officinalis ir T. vulgaris buvo vienodas – 97,7 proc. Naudojant CO2 ekstraktą B stebėtas šiek tiek menkesnis sumažėjimas,
pipirmėtės ir čiobrelio – 4,25 log10 LKID50, sumažėjo 86,6 proc. o melisos – 4 log10, sumažėjo 92,6
proc. Rezultatai vertinami pagal 6 lentelėje pateiktus kriterijus.
5 lentelė. Augalų CO2 ekstraktų poveikis koronavirusų LKID50
Augalas CO2 ekstraktai, 4,17 mg/ml A B LKID50, log10 LKID50 skaičiaus sumažėjimas LKID50, log10 LKID50 skaičiaus sumažėjimas
log10 proc. log10 proc.
Mentha piperita 3,750,16a 1,38 95,8 4,250,16a 0,88 86,6
Melissa officinalis 3,500,0b 1,63 97,7 4,000,19b 1,13 92,6
Thymus vulgaris 3,500,0b 1,63 97,7 4,250,16a 0,88 86,6
37
3.5. Augalų ekstraktų frakcijų virucidinis poveikis
Pirmoji augalų ekstraktų frakcija buvo ruošiama su 10 proc. etanoliu. Buvo tiriamas dviejų koncentracijų ekstraktų virucidinis poveikis– 8,33 mg/ml ir 4,17 mg/ml. M. piperita I frakcijos virusų LKID50 buvo 4,25 log10 veikiant 8,33 mg/ml koncentracija, kuomet, veikiant 4,17 mg/ml
koncentracija, virusų LKID50 buvo 5,00 log10. Sumažėjimas buvo 90 proc. ir 43,8 proc., atitinkamai.
Veikiant M. officinalis I frakcijos ekstraktu, virusų LKID50 prie 8,33 mg/ml buvo 4,25 log10, o prie
4,17 mg/ml – 5,17 log10. Sumažėjimas 90,0 proc. ir 29,9 proc., atitinkamai. Veikiant T. vulgaris I
frakcijos ekstraktu, virusų LKID50 prie 8,33 mg/ml koncentracijos buvo 4,25 log10, o prie 4,17 mg/ml
– 5,17 log10. Sumažėjimas 90,0 proc. ir 29,9 proc., atitinkamai.
6 lentelė. Augalų ekstraktų I frakcijos poveikis virusams
Augalas I frakcijos koncentracija mg/ml LKID50, log10 LKID50 skaičiaus sumažėjimas log10 proc. Mentha piperita L. 8,33 4,250,251a 1,0 90,0 4,17 5,000,292a 0,25 43,8 Melissa officinalis L. 8,33 4,250,251a 1,0 90,0 4,17 5,170,332b 0,08 29,9 Thymus vulgaris L. 8,33 4,250,251a 1,0 90,0 4,17 5,170,332b 0,08 29,9
Skaičius laipsnio vietoje parodo vidugrupinį statistiškai patikimą skirtumą (p<0,05), jeigu skaičiai skiriasi, o jeigu jie vienodi – statistiškai nepatikimą skirtumą (p>0,05). Raidės laipsnio vietoje nurodo tarpgrupinius skirtumus – statistiškai patikimus (p<0,05), jeigu raidės skirtingos, o jei raidės vienodos - statistiškai nepatikimus (p>0,05).
Antra frakcija buvo ruošiama su 50 proc. etanoliu. Buvo tiriamas tik vienos koncentracijos – 4,17 mg/ml poveikis virusų LKID50 (7 lentelė). Šios koncentracijos yra didesnės, nei 1 CC50 tų augalų.
Koncentracijos buvo 2,4 CC50, 5,2 CC50, 7 CC50, pipirmėtės, melisos ir čiobrelio, atitinkamai. M.
piperita II frakcijos ekstraktas sumažino virusų LKID50 iki 4,17 log10, sukėlė 53,2 proc. sumažėjimą.
M. officinalis II frakcijos ekstraktas sumažino virusų LKID50 iki 3,83 log10, sukėlė 78,6 proc.
sumažėjimą. T. vulgaris II frakcijos ekstraktas sumažino virusų LKID50 iki 4,17 log10, sukėlė 53,2
proc. sumažėjimą.
7 lentelė. Augalų ekstraktų II frakcijos (koncentracija 4,17 mg/ml) poveikis paukščių koronavirusams
Augalas CC50
mg/ml
II frakcija
CC50 LKID50,
log10
LKID50 skaičiaus sumažėjimas
log10 proc.
Mentha piperita 1,7 2,4 CC50 4,17±0,21a 0,33 53,2
Melissa officinalis 0,8 5,2 CC50 3,83±0,21b 0,67 78,6
Thymus vulgaris 0,6 7,0 CC50 4,17±0,21a 0,33 53,2
38 Augalų III frakcija buvo ruošiama su 90 proc. etanoliu. III frakcijos koncentracija, kuri 100 proc. inaktyvavo virusus, buvo vienoda visų trijų augalų ekstraktų – 2,1 mg/ml. Tačiau skyrėsi jų CC50 koncentracijos. Pipirmėtės – 0,33 CC50, melisos – 0,25 CC50 ir čiobrelio – 0,34 CC50.
17 pav. III frakcijos augalų ekstraktų poveikis virusams 0.33 0.26 0.34 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Pipirmėtė Melisa Čiobrelis CC50 koncentracija, kuri inaktyvavo virusus
2.1 2.1 2.1 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Pipirmėtė Melisa Čiobrelis
Lo
g10
