LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
ENDOKRINOLOGIJOS KLINIKA
Jurgita Kerpytė
PADINĖS SAUSPLĖVĖS POKYČIAI SERGANT 2 TIPO CUKRINIU
DIABETU
Baigiamasis magistro darbas
Mokslinis vadovas: prof. dr. Rasa Verkauskienė
Darbo konsultantas: doc. dr. Jolita Palubinskienė
2 TURINYS 1. SANTRAUKA ... 3 2. SUMMARY ... 4 3. PADĖKA ... 5 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
6. SANTRUMPOS ... 6 7. SĄVOKOS ... 7 8. ĮVADAS ... 8 9. DARBO TIKSLAS... 9 10. DARBO UŽDAVINIAI ... 9 11. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
11.1. 2 tipo cukrinis diabetas ... 10
11.2. 2 tipo cukrinio diabeto ir diabetinės pėdos patofiziologiniai skirtumai lyginant tarp lyčių ... 10
11.3. Ryšys tarp diabetinės periferinės neuropatijos, pėdos jungiamojo audinio ir diabetinės pėdos opų ... 10
11.3.1 Diabetinės opos patofiziologija ... 12
11.4. Cukrinio diabeto poveikis į TM ... 12
11.5. Padinės sausplėvės histologija ... 13
12. METODIKA ... 13
12.1. Tyrimo planavimas ... 13
12.2. Pacientų atranka ir vertinimo kriterijai ... 13
12.3. Biologinės medžiagos surinkimas ... 14
12.4. Histologinio preparato paruošimas ... 14
12.5. Histologinių duomenų analizė ... 16
13. REZULTATAI ... 16
13.1. Tyrimo dalyvių duomenų vertinimas ... 16
13.2. Sausplėvės morfologinių savybių vertinimas ... 17
13.3. Pado sausplėvės histomorfometrinis vertinimas ... 21
13.4 Ryšys tarp pado sausplėvės histomorfometrinių duomenų, pacientų amžiaus, KMI, CD trukmės ir HbA1c ... 21
14. REZULTATŲ APTARIMAS ... 23
15. IŠVADOS ... 26
3
1. SANTRAUKA
PADINĖS SAUSPLĖVĖS POKYČIAI SERGANT 2 TIPO CUKRINIU DIABETU Darbo autorė: Jurgita Kerpytė
Tyrimo tikslas: įvertinti pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu (CD) histologinius padinės sausplėvės (PS) pokyčius.
Tyrimo uždaviniai:
1. Ištirti pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu PS morfologines savybes.
2. Įvertinti pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu padinės sausplėvės histomorfometrinius duomenis ir nustatyti ryšį su pacientų amžiumi, CD trukme, kūno masės indeksu (KMI) ir metaboline ligos kontrole (pacientų HbA1c rodiklis).
Metodai: Tyrime dalyvavo pacientų sergančių antro tipo cukriniu diabetu (CD) imtis. Diabetinės pėdos amputacijos metu, esant rašytiniam paciento sutikimui, iš pašalintos kojos buvo imamas 4,5x2,0x0,5cm dydžio (neskaitant riebalinio audinio) PS gabalėlis. Mėginys buvo fiksuojamas 10⁒ formalino tirpale penkias dienas kambario temperatūroje. PS supjaustyta išilgai ir 0,5 cm storio audinio gabalėliai buvo įlieti į parafino blokus ir paruošti histologiniam ištyrimui. Histologinės nuopjovos dažytos hematoksilinu ir eozinu, ir PAS reakcija.
Tyrimo rezultatai: Pacientų imtyje buvo 4 vyrai ir 2 moterys. Vidutinis pacientų KMI siekė 29,96 kg/m2 (±SN 4,85). Vidutinė 2 tipo CD trukmė buvo 14,16 metų (±SN 4,95). HbA1c vidutiniškai
siekė 6,95 % (±SN 0,53). Visuose mėginiuose PS buvo matoma kaip lygiagrečiais pluoštais vienoje plokštumoje išsidėsčiusios baltos, storos kolageninės skaidulos, tarp kurių nevienodai tankiai dėstėsi fibrocitai, o kai kuriose PS buvo ir chondrocitų.
Išvados 1. Pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu padinė sausplėvė susideda iš lygiagrečiai viena kitai išsidėsčiusių kolageno skaidulų, tarp kurių matomi fibrocitų branduoliai. Buvo stebimos eilėmis išsidėsčiusios chondrocitų grandinėlės. 2. Nustatyta statistiškai reikšminga regresinė priklausomybė tarp pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu padinės sausplėvės skaidulų storio ir amžiaus (p ≤ 0,05), ir taip pat tarp skaidulų storio ir KMI (p ≤ 0,05).
4
2. SUMMARY
MORPHOLOGICAL CHANGES OF PLANTAR FASCIA IN PATIENTS WITH TYPE 2 DIABETES
Author: Jurgita Kerpytė
Aim of the study: The aim of the study was to evaluate the histological findings of plantar fasciae of patients with type 2 diabetes mellitus.
Objectives:
1. Describe the morphological findings of plantar fasciae of patients with type 2 diabetes mellitus.
2. Evaluate histomorphometric findings of plantar fasciae of patients with type 2 diabetes mellitus and compare it with the data about patients age, duration of diabetes, body mass index and the metabolic control of the diabetes (HbA1c).
Methods: The study involved patients with type 2 diabetes mellitus. Plantar fascia of appr. 4.5x2.0x0.5cm size (excluding the fat tissue) was taken after the surgical amputation of the foot, due to diabetic foot ulcers, with informed written consent of the patient. The sample was fixed in 10 percent neutral formalin solution for up to 5 days at room temperature and then were embedded in paraffin. For routine histology tissue slices were stained with haematoxylin and eosin, and PAS reagent.
Results: Study involved 4 men and 2 women. Average BMI was 29.96 kg/m2 (±SD 4.85). Average time of diabetes was 14.16 years (±SD 4.95). HbA1c on average was 6.95 % (±SD 0.53). In all cases plantar fascia was presented as dense regular connective tissue with collagen fibres arranged along the foot. Chondrocytes were visible in all parts of plantar fasciae.
Conclusions: 1. Plantar fascia is composed of parallel collagen fibres with fibrocyte nuclei located in-between. Chondrocytes arranged in chains were visible. 2. Regression analysis of the data showed statistically significant correlation between the thickness of plantar fascia fibres and patient’s age (p ≤ 0.05), as well as the thickness of fibres and the BMI (p ≤ 0.05).
5
3. PADĖKA
Dėkoju darbo vadovei prof. dr. Rasai Verkauskienei už kiekvieną susitikimą, skirtą dėmesį ir laiką šioms idėjoms išklausyti ir įgyvendinti. Taip pat dėkoju darbo konsultantei doc. dr. Jolitai Palubinskienei už kartu laboratorijoje praleistas dienas, kantrybę ir nuoširdumą dirbant kartu. Dėkoju LSMU MA Histologijos ir embriologijos katedros laboratorijai už techninę pagalbą ruošiant histologinius preparatus.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Atliekant šį mokslinį darbą autoriui interesų konflikto nebuvo.
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
6
6. SANTRUMPOS
AGE produktai (angl. advanced glycation end products) CD – cukrinis diabetas
DPN – diabetinė periferinė neuropatija HbA1c – glikozilintas hemoglobinas KMI – kūno masės indeksas
PS – padinė sausplėvė SN – standartinis nuokrypis TM – tarpląstelinė medžiaga
7
7. SĄVOKOS
AGE produktai (angl. advanced glycation end products) – tai prailgintos hiperglikeminės būklės organizme rezultatas, kai baltymai ir lipidai tampa glikozilinti, veikiant įvairioms biocheminėms organizmo reakcijoms.
Tarpląstelinė medžiaga (TM) – tai į tinklelį panaši tarpląstelinė struktūra susidedanti iš kompleksinių baltymų ir angliavandenių. Tai trijų dimensijų struktūra, kuri aktyviai keisdama savo formą priklausomai nuo vietos organizme, tiesiogiai dalyvauja organizmo homeostazėje.
8
8. ĮVADAS
Cukrinis diabetas (CD) – tai metabolinis sutrikimas, kuriam būdinga persistuojanti hiperglikemija dėl sutrikusios insulino sekrecijos, insulino veikimo arba abiejų veiksnių kartu. Plačiąja prasme CD yra skiriamas į 1 tipo, 2 tipo ir gestacinį, tačiau yra ir kitų, retesnių, diabeto formų. Lėtinė hiperglikemija sergant CD siejama su lėtine organizmo taikinių pažaida, disfunkcija ir organų nepakankamumu. Labiausia nukenčia akys, kepenys, nervai, širdis ir kraujagyslės [3].
CD Lietuvoje ir pasaulyje yra labai ūmi ir didėjanti problema. Vien 2014 metais pasaulyje buvo užfiksuota apie 422 milijonai pacientų sergančiųjų cukriniu diabetu. Palyginus su 1980 m. duomenimis, kai šis skaičius siekė vos 108 milijonus atvejų, matome, kad segamumas padidėjo beveik 4 kartus [4]. 2018 m. Lietuvoje Higienos instituto Sveikatos informacijos centro duomenimis užregistruoti 109162 CD sergantys asmenys, t.y. vienas iš 29 vyrų ir viena iš 23 moterų. 2018 m. Higienos instituto duomenimis komplikacijas dėl CD turėjo 80,5 % suaugusių sergančių 1 tipo CD bei 46,1 % sergančiųjų 2 tipo CD. Per 2018 m. nuo CD ir (arba) jo komplikacijų mirė 528 Lietuvos gyventojai [5].
Apie 20 % pacientų, kuriems naujai diagnozuotas 2 tipo cukrinis diabetas, turi mikrovaskulinių komplikacijų [3]. Viena iš mikrovaskulinių cukrinio diabeto komplikacijų yra distalinė simetrinė sensorimotorinė polineuropatija (angl. distal symmetrical sensorimotor polyneuropathy) taip pat literatūroje dar vadinama diabetine periferine neuropatija (DPN). Daugiau negu pusei sergančiųjų CD pasireiškia DPN. Diabetinė periferinė neuropatija didina diabetinių opų ir pėdos amputacijos riziką [3]. Šiuo metu yra žinoma, kad pėdos skliauto priežiūrai yra reikalingi pėdos aktyvieji (raumenys) ir pasyvieji (padinė sausplėvė (PS) ir raiščiai) elementai [1]. 2003 m. D’Ambrogi ir kiti [2] pademonstravo, kad pacientai sergantys diabetine neuropatija taip pat turi storesnę PS, išmatavimai teigiamai koreliavo su vertikalios jėgos apkrova priekinei pėdos sričiai pacientui einant. Autoriai galvojo, kad padinės sausplėvės sustorėjimas efektyviai didina pėdos skliauto sustingimą, dėl to didėja pėdos skliauto apkrova vaikštant.
Todėl šiam darbui buvo pasirinkta tema, kuri apima asmenų, sergančių 2 tipo CD ir padinės sausplėvės morfologinių pokyčių ryšio nagrinėjimą bei vertinimą taikant šviesinės mikroskopijos metodą.
9
9. DARBO TIKSLAS
Šio darbo tikslas yra įvertinti pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu histologinius padinės sausplėvės pokyčius.
10. DARBO UŽDAVINIAI
1. Ištirti pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu PS morfologines savybes.
2. Įvertinti pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu padinės sausplėvės histomorfometrinius duomenis ir nustatyti ryšį su pacientų amžiumi, CD trukme, kūno masės indeksu (KMI) ir metaboline ligos kontrole (pacientų HbA1c rodiklis).
10
11. LITERATŪROS APŽVALGA
11.1. 2 tipo cukrinis diabetas
2 tipo cukrinis diabetas (CD) tai heterogeninis, kompleksinis, multisisteminis medžiagų apykaitos sutrikimas, sukeliantis daugybinius organų sistemų pažeidimus. 2 tipo CD dažniausiai pasireiškia antroje gyvenimo pusėje ir neretai yra nustatomas atsitiktinai, atliekant rutininius tyrimus arba pasireiškus kardiologinėms problemoms [3]. Gydymas ir komplikacijų prevencija reikalauja daugialypio ir individualaus, į pacientą orientuoto požiūrio [6]. Siekiant užtikrinti naudą visuomenės sveikatai yra taikoma pirminė ir antrinė CD profilaktika. Pirminė CD profilaktika tai informacija bendrai žmonių populiacijai apie gyvenimo būdo pokyčius ir sveiką gyvenseną prieš pasireiškiant CD. Antrinė arba tikslinė CD profilaktika apima laiką po CD diagnozės [35].
11.2. 2 tipo cukrinio diabeto ir diabetinės pėdos patofiziologiniai skirtumai lyginant tarp lyčių
Literatūroje daugėja pavyzdžių įrodančių, kad 2 tipo CD komplikacijos ir ligos eiga koreliuoja su žmogaus lytimi. Tam turi įtakos lyčių socioekonominiai ir kultūriniai skirtumai. Tokie kaip skirtingas moterų ir vyrų elgesys aplinkoje, mitybiniai ir gyvenimo būdo skirtumai, streso lygmuo ir taip pat požiūris į savo ligos eigą ir jos gydymą [7]. Nereikia pamiršti ir su lytimi susijusių biologinių procesų: lytinių hormonų išsiskyrimo, su lytimi susijusios genų raiškos ir gretutinių ligų. Vyrai dažniau susiduria su diabetinės pėdos komplikacijomis ir pėdos amputacija negu moterys [8]. Taip pat Kanadoje atliktas kohortinis tyrimas parodė, kad lyties ir socioekonominiai faktoriai darė didesnę įtaką vyrų populiacijai [9]. Nepriklausomi rizikos veiksniai, bloginantys ligos eigą vyrų tarpe buvo jų amžius, kūno masės indeksas ir sistolinis kraujo spaudimas, tuo tarpu prie moterų rizikos faktorių buvo priskiriami amžius, šlapimo rūgšties koncentracija kraujyje ir insulino terapija [10].
11.3. Ryšys tarp diabetinės periferinės neuropatijos, pėdos jungiamojo audinio ir diabetinės pėdos opų
11 Kadangi daugumoje atvejų 2 tipo CD yra diagnozuojamas atsitiktinai, pacientam jau būna pasireiškusios lėtinės hiperglikemijos komplikacijos. Viena iš tokių komplikacijų yra mikrovaskuliarizacijos sutrikimai, kurie sukelia diabetinę periferinę neuropatiją (DNP). Taip pat DPN gali sukelti periferinis kraujotakos sutrikimas arba abiejų patologijų kombinacija. Diabetinės pėdos opos atsiradimo priežastimi laikoma DPN. DPN paveikia motorinius, sensorinius ir autonominius nervus. Periferijoje šis poveikis sukelia paciento galūnės „savisaugos“ funkcijos sumažėjimą, todėl pacientams didėja fizinės, cheminės ar karščio traumos atsiradimo tikimybė. Motorinė neuropatija gali sukelti pėdos deformaciją, dėl to pakinta pėdos spaudimo pasiskirstymas. Autonominio nervo pažaida sukelia prakaito liaukų sekrecijos sumažėjimą, odos išsausėjimą, dėl to greičiau formuojasi nuospaudos ir sutrūkinėja padų oda [3]. Visos šios priežastys kartu su mikrovaskuliarizacijos sutrikimais sudaro puikias sąlygas atsirasti diabetinės pėdos opoms.
Jungiamojo audinio struktūros, žingsnio metu, sugeba išlaikyti pėdos vientisumą ir palaikyti pastovų kūno judėjimą. Judesio metu padinė sausplėvė veikia kaip „svertas“ (angl. windlass
mechanism), jungiantis kulnikaulį ir padikaulių pirštakaulinius sąnarius (1pav.). Taisyklingo pėdos
tiesimo ir lenkimo metu PS padeda mažinti arba didinti atstumą tarp šių dviejų struktūrų ir užtikrinti pėdos skliauto išlenkimą. Skliautui išsitiesinus, sutrinka pėdos pronacija ir supinacija žingsnio metu, ir tai lemia, kad pėda dirba neefektyviai [25].
Ilgalaikė hiperglikemija turi įtakos jungiamojo audinio struktūroms. 2003 m. D’Ambrogi et al. pademonstravo, kad pacientai sergantys diabetine neuropatija taip pat turi storesnę PS. Jų matavimai teigiamai koreliavo su vertikalios jėgos apkrova, tenkančia priekinei pėdos sričiai pacientui vaikštant. Autoriai svarstė, kad dėl sausplėvės sustorėjimo, pėdos skliautas pasidaro standesnis, ir tai padidina pėdos apkrovą vaikštant [2]. Galvojama, kad diabetinės pėdos žaizdos, dažniausiai atsirandančios priekinėje pėdos dalyje ties padikaulių-pirštakaulių sąnariais, yra nulemtos padidėjusio pėdos spaudimo. Didelis pėdos spaudimas pasireiškia ėjimo metu dėl daugelio faktorių, tokių kaip DPN, pėdos deformacijos, ribota kulkšnies dorsifleksija ir sumažėjęs sausplėvės audinio storis [26]. 2011 metais Ko
et al. pastebėjo, kad asmenys, sergantys 2 tipo CD ir neturintys aiškios periferinės neuropatijos,
pademonstravo žymiai prastesnius ėjimo rezultatus, negu kontrolinė ne diabetinė grupė. Ir tai darosi dar akivaizdžiau, kai einama maksimaliu greičiu [27].
1 pav. Žmogaus pėdos „sverto“ mechanizmas. Didėjant pėdos apkrovai (raudona rodyklė), padinė sausplėvė palaiko pėdos arkos išlenkimą. Atstumas tarp padikaulio ir kulnakaulio mažėja
12 11.3.1 Diabetinės opos patofiziologija
Normalus žaizdos gijimas yra skirstomas į keturias persidengiančias tarpusavyje fazes:
1. Hemostazė 2. Uždegiminė fazė 3. Proliferacijos fazė 4. Remodeliacijos fazė
Žaizdos, kurios neužgyja per dvylika savaičių, yra priskiriamos lėtinėms žaizdoms [11]. Lėtinės diabetinės žaizdos visų pirma prasideda kaip ūminės, tačiau gijimo procesams sutrikus jos tampa lėtinėmis. Augimo faktoriai, citokinai, proteazės taip pat kaip ir neląsteliniai, ir viduląsteliniai komponentai veikia žaizdos gijimą. Pacientų, sergančių diabetu, žaizdų gijimo procesas yra trikdomas hiperglikemijos, lėtinio uždegimo, mikro- ir makrocirkuliacinių sutrikimų, hipoksijos, autonominės ir sensorinės neuropatijos ir sutrikusio neuropeptidinio ryšio [12]. Hiperglikemija gali lemti ne baltyminę kolageno ir kitų baltymų glikaciją ir AGE produktų (angl. advanced glycation end products) formavimąsi. Šie produktai mažina TM tirpumą ir, būdami antigeniškai svetimi, skatina uždegiminį atsaką ir atitinkamus pakitimus, stebimus sergant diabetu [13,14]. Lėtinis uždegimas sergant CD charakterizuojamas kaip užsitęsęs ir padidėjęs uždegiminių citokinų, tokių kaip interleukinas -1 (IL-1), interleukinas – 6 (IL-6) ir tumoro nekrozės faktorius – α (TNF-α) padidėjimas [15,16]. Taip pat fibroblastai, randami diabetinėse žaizdose, silpniau proliferuoja, yra linkę į apoptozę ir yra mažiau judrūs [17,18]. Aprūpinimas deguonimi yra būtinas ląstelių metabolizmui palaikyti ir žaizdoms gyti. Prasta ląstelių ir audinių perfuzija, dėl sutrikusios vaskuliarizacijos, prailgina žaizdos gijimą.
11.4. Cukrinio diabeto poveikis į TM
Žmonių ir gyvūnų sergančių CD tyrimuose buvo nustatyta, kad intersticinė ir perivaskulinė fibrozė yra svarbiausios diabetinės kardiomiopatijos charakteristikos. TM baltymų kaupimasis širdies intersticiume ir skersinių jungčių tarp šių komponentų susidarymas didina miokardo standumą ir gali lemti diastolinę disfunkciją diabeto paveiktame miokarde [19]. In vitro tyrimuose, aukšti gliukozės kiekiai stimuliuoja fibroblastų proliferaciją, skatina miofibroblastų transdiferenciaciją ir aktyvuoja TM baltymų genų raišką, transkripciją ir sekreciją [22, 23, 24]. Taip pat buvo pastebėta, kad pasiekus hiperglikemijos korekciją, su diabetu susijusi ekstrakardialinių audinių fibrozė nesumažėja. Atlikus
13 eksperimentinius tyrimus su streptozitocino sukelto 1 tipo CD žiurkėmis, griežta glikemijos kontrolė nepadėjo išvengti inkstų fibrozės vystymosi [20].
11.5. Padinės sausplėvės histologija
Nors PS iš biomechaninės pusės yra pakankamai gerai ištyrinėta, jos mikroskopinės savybės nėra pilnai žinomos. Elastinių skaidulų sudėtis, TM ypatybės ar specifinė inervacija yra sudėtinga ir pilnai neaprašyta. Ir histologų, ir anatomų PS vadinama aponeuroze dėl to, kad beveik visos I tipo kolageninės skaidulos yra išsidėsčiusios išilgine kryptimi [21]. II tipo kolageninių skaidulų yra randama kulninėje PS dalyje, kur skaidulos dėstosi aplink pavienius chondrocitus. Dažant imunohistochemijos metodu galima matyti Pacini ir Ruffini kūnelius atsakingus už PS sensorinę inervaciją. Autoriai teigia, kad gera PS inervacija yra susijusi su propriorecepcija, kojos stabilumu ir judesiu [21].
12. METODIKA
12.1. Tyrimo planavimasTyrimas buvo pradėtas gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą Nr. BE-2-41, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (toliau – LSMU) Bioetikos centro leidimą Nr. BEC-MF-326. Tyrimas buvo vykdomas LSMU ligoninės Kauno klinikų Endokrinologijos klinikoje, bendradarbiaujant su LSMU Medicinos fakulteto Histologijos ir embriologijos katedra.
12.2. Pacientų atranka ir vertinimo kriterijai
Tyrimo objektas – pacientai, kuriems buvo suplanuota planinė diabetinės pėdos amputacija. Informavus pacientą apie tyrimo eigą ir gavus paciento raštišką sutikimą, operacijos metu buvo renkami biologiniai mėginiai. Iš paciento ligos istorijos buvo renkami su cukriniu diabetu susiję ir reikalingi
14 rezultatų analizei duomenys. Norint užtikrinti tiriamųjų konfidencialumą, visi duomenys nuasmeninti. Buvo pasirinkta vertinti:
1. Pacientų amžių. 2. Pacientų lytį.
3. Pacientų kūno masės indeksą (KMI).
4. Pacientų CD trukmę (kada buvo nustatyta CD).
5. Pacientų metabolinę glikemijos kontrolę, glikozilinto hemoglobino (HbA1c) tyrimo pagalba.
12.3. Biologinės medžiagos surinkimas
Diabetinės pėdos amputacijos metu, esant rašytiniam paciento sutikimui, iš amputuotos kojos buvo imamas 4,5x2,0x0,5cm dydžio (neskaitant riebalinio audinio) biologinis mėginys. Mėginys buvo fiksuojamas 10 % formalino tirpale penkias dienas kambario temperatūroje.
12.4. Histologinio preparato paruošimas
Biologinės medžiagos paruošimo etapai: 1. Fiksavimas
2. Dekalcifikavimas
3. Parafininio bloko formavimas 4. Histologinio pjūvio ruošimas
5. Rutininis dažymas Hematoksilinas + Eozinas, histocheminis dažymas PAS reagentu 6. Mikroskopavimas
7. Histomorfometrija
Fiksavus mėginį 10 % formalino tirpale penkias paras kambario temperatūroje, jis buvo išplaunamas po tekančiu vandeniu ir supjaustomas išilgai 0,5 cm storio juostelėmis (2pav.) ir iš kiekvieno gabalėlio suformuotas parafino blokas. Tam audinio gabalėliai buvo dehidratuojami naudojant didėjančios koncentracijos alkoholius, vėliau jie buvo skaidrinami iš medžiagos šalinant dehidrantą ksilenu. Galiausiai atliekamas medžiagos impregnavimas – skaidrinamoji medžiaga yra pakeičiama
15 standinančiąja medžiaga (parafinu). Iš kiekvieno parafininio bloko buvo mikrotomu atpjaunamos 3 µm storio histologinės nuopjovos, taip užtikrinant, kad ląstelės preparate dėstytųsi vienu sluoksniu ir būtų mažiau artefaktų.
2 pav. PS ruošimas įliejimui. Skalė 10 mm
Parafino pjūviai buvo dedami į vonelę su šiltu vandeniu ir joje išlyginami. Toliau pjūviai buvo patalpinami ant mikroskopinio stiklelio, išdžiovinami, deparafinuojami ir atliekamas rutininis dažymas hematoksilinu ir eozinu. Dažymo tikslas – atskirti ir išryškinti ląstelines ir neląstelines struktūras. Nudažytas ir uždengtas dengiamuoju stikleliu preparatas buvo mikroskopuojamas. Norint nustatyti polisacharidų kiekį sausplėvėje, kituose gretimuose histologiniuose pjūviuose buvo atliekamas histocheminis dažymas PAS (angl. periodic acid-Schiff) reakcija Šifo reagentu.
16 12.5. Histologinių duomenų analizė
Mikroskopuojant preparatus Olympus BX40 mikroskopu, sujungtu su skaitmenine vaizdo kamera, kiekviename preparate buvo imami keturi atsitiktiniai regėjimo laukai išilginiame PS pjūvyje, ir buvo vertinamas PS jungiamasis audinys. Regėjimo lauko plotas 23850,3 m2. Skaičiuojamas fibrocitų branduolių skaičius regėjimo lauke, skaidulų storis išmatuojant atstumą tarp matomų skaidulų bei į chondrocitus panašių ląstelių skaičius. Duomenys fiksuojami CellSens DimentionTM (Olympus Soft
Imaging Solutions, GmbH. Shinjuku, Tokijas, Japonija) programa ir lyginami tarpusavyje.
Statistiniai skaičiavimai atliekami Microsoft Excel programa. Buvo apskaičiuojamas vidurkis ir vidurkio standartinis nuokrypis. Parametrinių dydžių koreliacijos nustatymui buvo naudojamas Pearson’o koreliacijos koeficientas (angl. Pearson correlation coefficient). Duomenų skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingais, jei paklaidos tikimybė p ≤ 0,05. Vertinant atskirų nagrinėjamų požymių tarpusavio priklausomybę buvo atlikta regresinė duomenų analizė. Regresinė analizė taikyta, kai viena imtis buvo laikoma priklausoma, kita– nepriklausoma.
13. REZULTATAI
13.1. Tyrimo dalyvių duomenų vertinimas
Tyrimo metu buvo surinkti šešių pacientų, kurių amžiaus vidurkis 54,66 (±SN 14,92) m., sergančių 2 tipo CD, klinikiniai duomenys. Buvo lyginama pacientų amžius, KMI, CD trukmė metais ir glikemijos kontrolė HbA1c (1 lentelė). Pacientų imtyje buvo 4 vyrai ir 2 moterys. Vidutinis pacientų KMI siekė 29,96 kg/m2 (±SN 4.85), o KMI mediana – 30,1 kg/m2, viena pacientė buvo normalaus kūno
svorio, vienas pacientas turėjo antsvorį (KMI 28 kg/m2), trys pacientai turėjo I laipsnio, ir vienas
pacientas – II laipsnio nutukimą [29]. Vidutinė 2 tipo CD trukmė buvo 14,16 metų (±SN 4,95). Glikemijos kontrolė, vertinama HbA1c rodikliu vidutiniškai siekė 6,95 % (±SN 0,53).
17
1 lentelė. Pacientų sergančių 2 tipo CD duomenų vertinimas.
Rodiklis Vidurkis PS1 PS2 PS3 PS4 PS5 PS6 Amžius (metais) 60 52 57 45 35 79 54,67 Lytis V M V V M V - KMI (kg/m2) 30,2 31,0 28 30,0 22,8 37,8 29,97 CD trukmė (metais) 15 14 20 9 8 19 14,17 HbA1c (%) 6,8 6,8 7,7 7,1 6,1 7,21 6,95
13.2. Sausplėvės morfologinių savybių vertinimas
Visuose paimtuose mėginiuose PS buvo matoma kaip lygiagrečiais pluoštais vienoje plokštumoje išsidėsčiusios baltos, storos kolageninės skaidulos (4 pav.). Sausplėvės kolageno skaidulų pluoštai proksimaliniame jos gale buvo kaip siauresnė ir storesnė plokštelė, o distaline kryptimi eidamos kolageno skaidulos šiek tiek skleidėsi kaip vėduoklė, taigi distalinis PS galas buvo plonesnis ir platesnis (3 pav.).
3 pav. PS glaudaus taisyklingojo jungiamojo audinio gabalėlis su aplinkiniu riebaliniu audiniu, natyvinis preparatas, skalė 10 mm
18
4 pav. Sausplėvės kolageno skaidulų lygiagretūs pluoštai, H-E, skalė 20 m, didinimas 40x
Histologiniuose hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuoe tarp kolageno skaidulų matomi violetiniai, lygiagrečiai skaiduloms išsidėstę fibrocitų branduoliai (5 pav.). Kai kuriuose regėjimo laukuose buvo pastebėta, kad fibrocitų branduoliai išsidėstę nevienodai tankiai, kai kuriuose regėjimo laukuose fibrocitai yra ne pavieniai, bet grupėmis po 2 ar net 4 ląsteles (4 pav.).
19 Kai kurių pacientų PS preparatuose buvo pastebėta apvalių ląstelių, kurių citoplazmoje buvo šviesių lipidinių intarpų, savo išvaizda primenančių chondrocitus. PAS metodu nudažytuose PS preparatuose buvo matomi aplink minėtas ląsteles teritorinėje matricoje išsidėstę glikoproteinai (PAS reakcija teigiama). Taip pat ląstelių citoplazmoje buvo PAS teigiamų granulių, kurios galimai yra glikogenas. Tai yra požymiai, kad šios ląstelės yra chondrocitai (6 pav.). Kai kuriuose preparatuose chondrocitai buvo pavieniai, o kai kuriuose jie dėstėsi grandinėlėmis tarp kolageninių skaidulų, taip kaip jie matomi skaidulinėje kremzlėje.
6 pav. PAS metodu nusidažiusi glikoproteinų turinti chondrocito teritorinė matrica, PAS reakcija, skalė 20 m, didinimas 40x
Kai kuriuose regėjimo laukuose buvo stebimos eilėmis išsidėsčiusios chondrocitų grandinėlės (7 pav.). Ląstelės regėjimo lauke dėstėsi nevienodai tankiai, susitelkdamos tarp kolageninų skaidulų (8 pav.).
20
7 pav. Į chondrocitus panašios ląstelės , H-E, skalė 20 m, didinimas 40x
21 13.3. Pado sausplėvės histomorfometrinis vertinimas
Vertinant fibrocitų branduolių skaičių, visuose preparatuose vidutinis branduolių skaičius regėjimo lauke buvo 13,58 (±SN 8,69). Daugiausia fibrocitų regėjimo lauke buvo PS1, o mažiausiai – PS3, atitinkamai, 19,5 ir 7 fibrocitai. Kolageno skaidulų storis svyravo nuo 9,23µm iki 47,65µm. Vidutinis kolageno skaidulų storis buvo 22,51µm (±SN 11,03). Regėjimo lauke matomų chondrocitų skaičius variavo nuo 0 iki 35 vnt. Tiriamojoje medžiagoje iš PS3 buvo rasta daugiausia chondrocitų, tenkančių vienam regėjimo laukui (2 lentelė).
2 lentelė. Fibrocitų branduolių skaičiaus, kolageno skaidulų storio ir sausplėvės chondrocitų regėjimo lauke kiekio vidurkiai
Tiriamosios medžiagos Nr.
Fibrocitų branduolių skaičius
Skaidulų storis (µm) Chondrocitų skaičius regėjimo lauke PS1 19,5±10,5 39,61 ±12,3 0,5±0,5 PS2 17,75±9,1 18,19±7 0 PS3 7±8,3 16,08±4,6 13,5±15 PS4 12,25±7,1 17,36±5,4 0,75±1,5 PS5 17,5±5,9 15,89±4,3 1,25±2,5 PS6 7,5±5,1 27,87±7,8 5,75±5,1
13.4 Ryšys tarp pado sausplėvės histomorfometrinių duomenų, pacientų amžiaus, KMI, CD trukmės ir HbA1c
Vykdant statistinę analizę buvo vertinamas ryšys tarp tiriamųjų asmenų sergančių 2 tipo CD pado sausplėvės histomorfometrinių duomenų, pacientų amžiaus, KMI, CD trukmės ir HbA1c vertės. Analizuojant gautus rezultatus statistiškai reikšmingas ryšys nebuvo nustatytas. Tačiau nustatytas Pearson‘o koreliacijos koeficientas parodo galimą ryšį tarp fibrocitų branduolių skaičiaus ir HbA1c rodiklio (r = -0,79; p>0,05) bei chondrocitų skaičiaus ir Hb1Ac rodiklio (r = 0,75; p>0,05) (3 lentelė). Tikėtina, kad padidinus tiriamąją imtį bus gautas statistinis patikimumas.
22
3 lentelė. Ryšys tarp pado sausplėvės histomorfometrinių duomenų, pacientų amžiaus, KMI, CD trukmės ir HbA1c
Pearson‘o koeficientas r p reikšmė Fibrocitų branduolių skaičius Amžius -0,51 0,3 KMI -0,43 0,4 CD trukmė -0,59 0,2 HbA1c -0,79 0,06 Skaidulų storis (µm) Amžius 0,56 0,2 KMI 0,43 0,3 CD trukmė 0,3 0,5 HbA1c -0,01 0,9 Chondrocitų skaičius regėjimo lauke Amžius 0,36 0,5 KMI 0,08 0,9 CD trukmė 0,7 0,09 HbA1c 0,75 0,08
Atlikus regresinės priklausomybės skaičiavimus, statistinis reikšmingumas buvo nustatytas tarp skaidulų storio ir pacientų amžiaus (R² = 0,77; p ≤ 0,05) ir taip pat tarp skaidulų storio ir pacientų KMI (R² = 0,79 p ≤ 0,05) (9 pav.).
9 pav. Skaidulų storio ir pacientų amžiaus, ir skaidulų storio bei pacientų KMI reikšmių regresinė analizė
Atlikus regresinės priklausomybės skaičiavimus su padinės sausplėvės histomorfometriniais duomenimis (fibrocitų skaičius ir chondrocitų skaičius) ir pacientų amžiaus, KMI, CD trukmės ir HbA1c rodikliais, statistiškai reikšmingos priklausomybės tarp šių duomenų nenustatyta (p > 0,05) (4 lentelė).
0 50 100 150 200 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 S ka idul ų st oris KMI 0 50 100 150 200 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 S ka idul ų st oris Amžius
23
4 lentelė. Pado sauspplėvės histomorfometrinių duomenų regresinė priklausomybė nuo pacientų amžiaus, KMI, CD trukmės ir HbA1c
R2 p reikšmė Fibrocitų branduolių skaičius Amžius 0,51 0,1 KMI 0,27 0,3 CD trukmė 0,57 0,1 HbA1c 0,73 0,06
Skaidulų storis (µm) Amžius 0.77 0.05
KMI 0,79 0,04 CD trukmė 0,23 0,4 HbA1c 0,04 0,7 Chondrocitų skaičius regėjimo lauke Amžius 0,13 0,4 KMI 0,005 0,8 CD trukmė 0,53 0,09 HbA1c 0,56 0,08
14. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiuo tyrimu norima atkreipti dėmesį į pacientų sergančių 2 tipo CD pirminės ir antrinės profilaktikos svarbą. Norint užkirsti kelią prastai kontroliuojamo CD ir ilgalaikės hiperglikemijos sukeliamiems kraujagyslių pažeidimams ir diabetinės pėdos komplikacijoms, turime įvertinti patofiziologinius ir struktūrinius audinių ir ląstelių pokyčius. Kintančios pėdos struktūros daro įtaką pėdos biomechaninėms savybėms, todėl tik geriau supratus jungiamojo audinio pokyčius sergant cukriniu diabetu, tikėtina, kad galėsime užkirsti kelią diabetinės pėdos atsiradimui.
Šio tyrimo duomenimis, visi pacientai turėjo per didelį KMI, vidutiniškai 14 metų trunkantį CD ir nepakankamai gerai kontroliuojamą hiperglikemiją: HbA1c rodiklis vidutiniškai buvo 6,92 %, o kelių pacientų siekė net 7,7% ir 7,2 %. Pacientams, kurių glikemijos kontrolė anksčiau buvo neadekvati ir esant mikrokraujagyslinėms komplikacijoms, rekomenduojama individuali glikemijos kontrolė yra 6,5 – 7,0 % [36]. Yra žinoma, kad prailginta hiperglikemija pacientams, sergantiems ir 1, ir 2 tipo CD, sukelia padidintą AGE produktų išsiskyrimą, kurie daro įtaką padinės sausplėvės sustorėjimui [30]. PS sustorėjimas yra laikomas viena iš plantarinio fasciito (PS uždegimo) priežasčių. 2017 m. JAV buvo apklausiami pacientai, turintys didesnį KMI (≥ 25 kg/m2) ir esantys vyresnio amžiaus (45–64 metų). Buvo nustatyta, kad tokie pacientai, nepriklausomai nuo fizinio aktyvumo, turėjo didesnę tikimybę
24 susirgti plantariniu fasciitu, negu normalaus kūno svorio asmenys [31]. Pacientams sergantiems CD ir turintiems mikrovaskuliarizacijos komplikacijų, tokių kaip diabetinė retinopatija, buvo apie 80 % tikimybė pasireikšti raumenų ir atraminėje sistemoje riešo kanalo sindromu, diabetine amiotrofija ar periartritu. Diupitreno kontraktūra, diabetinė periferinė neuropatija ir PS sustorėjimas yra dar keletas diabeto komplikacijų, stebimų raumenų ir atraminėje sistemoje [32].
Yak-Nam Wang ir kiti. [33] savo tyrime pateikia PS histomorfologinius tyrinėjimus, kurie yra panašūs ir į šiame tyrime gautus rezultatus. Morfologiškai PS yra sudaryta iš I tipo, išilgine kryptimi išsidėsčiusių, lygiagrečių kolageno skaidulų, o tarp kolageno skaidulų matomi fibrocitai ir fibroblastocitai. Carla Stecco ir kiti [21] teigia, kad kulniniame padinės sausplėvės gale galima rasti ir chondrocitų. Paprastai, raumens sausgyslės tvirtinimosi prie kaulo srityje randama nedaug skaidulinės kremzlės, kuriai ir yra būdingi chondrocitai tarp I tipo kolageno skaidulų. Mūsų tyrime kai kurių pacientų PS chondrocitų nebuvo pastebėta, o kai kurių pacientų PS chondrocitai, pavieniai ir eilėmis, buvo išsidėstę ne tik kulniniame PS segmente, bet ir per visą jos ilgį. Chondrocitų buvimas buvo nustatytas iš morfologinės išvaizdos ir patvirtintas preparatą nudažius PAS metodu. PAS reakcijos metu išryškėjo chondrocito citoplazmoje esančios glikogeno granulės bei chondrocito gaminamos ir jį supančios TM teritorinėje matricoje esantys glikoproteinai. Kulniniame PS gale esantys chondrocitai ir ju pasiskirstymas per visą PS ilgį yra kremzlinės metaplazijos požymis, kuris palaipsniui mažina Achilo kulno ir PS jungtį [34] dėl ko mažėja PS elastingumas.
Mūsų darbe atlikta regresinės priklausomybės analizė, parodė statistinį reikšmingumą tarp skaidulų storio ir pacientų amžiaus (R² = 0,77; p ≤ 0,05) ir taip pat tarp skaidulų storio ir pacientų KMI (R² = 0,79 p ≤ 0,05). Įvertinant šiuos duomenis, galime manyti, kad pacientų amžius ir KMI sukelia padinės sausplėvės ląstelinį atsaką. Mechaniniai veiksniai didina pado apkrovą [31], o senėjimo procesas keičia PS morfologines savybes. Išlieka neaišku ar tokia regresinė priklausomybė būdinga tik pacientams sergantiems CD, ar ir sveikiems asmenims.
Vykdant tolimesnę statistinę analizę buvo vertinamas ryšys tarp tiriamųjų asmenų sergančių 2 tipo CD pado sausplėvės histomorfometrinių duomenų, pacientų amžius, KMI, CD trukmės ir HbA1c vertės. Statistiškai reikšmingas ryšys, analizuojant gautus rezultatus, nustatytas nebuvo. Tačiau nustatytas Pearson‘o koreliacijos koeficientas parodo galimą ryšį tarp fibrocitų branduolių skaičiaus ir HbA1c rodiklio (r = -0,79; p>0,05) bei chondrocitų skaičiaus ir Hb1Ac rodiklio (r = 0,75; p>0,05). Nors mūsų tyrimo imtis buvo nedidelė ir dėl šios priežasties statistiškai reikšmingų išvadų negalime pateikti, tačiau manome, kad net ir šioje nedidelėje imtyje galima matyti tam tikrą ryšį tarp glikemijos kontrolės rodiklio ir fibrocitų branduolių skaičiaus padinėje sausplėvėje. Yra žinoma, kad kremzlėse, taip pat ir skaidulinėje, nėra kraujagyslių ir jų ląstelės gyvena santykinio deguonies ir maisto medžiagų „bado“ sąlygomis. Galvojame, kad dėl mikrocirkuliacijos sutrikimo PS, fibrocitai ima keisti savo fenotipą ir
25 diferencijuojasi į chondrocitus, taigi skaidulinis jungiamasis audinys diferencijuojasi į skaidulinę kremzlę (žr. 6, 7, 8 pav.).
Šiuo tyrimu dar negalima atsakyti, ar PS glaudaus taisyklingojo jungiamojo audinio transformacija į skaidulinę kremzlę yra palankusis ar neigiamai veikiantis pėdos biomechaniką veiksnys. Taip pat negalime daryti pagrįstos išvados, kad tai sukėlė vien tik ilgai trunkanti hiperglikemija, o gal tam dar turėjo reikšmės ir kiti gyvenimo būdo veiksniai bei pačiai pėdai tenkantis krūvis dėl padidėjusio KMI. Vis tik, reikalinga didesnė pacientų imtis, norint įrodyti, kad padinės sausplėvės pokyčiai sergant CD yra susiję su diabeto komplikacijomis. Galėtume teigti, kad anksti diagnozuojamas 2 tipo CD, užtikrinta tinkama gliukozės koncentracijos kraujyje kontrolė ir pacientų KMI rodmenų sekimas, padėtų užkirsti kelią PS histomorfometriniams pokyčiams.
26
15. IŠVADOS
1. Pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu padinė sausplėvė susideda iš lygiagrečiai viena kitai išsidėsčiusių kolageno skaidulų, tarp kurių matomi fibrocitų branduoliai. Buvo stebimos eilėmis išsidėsčiusios chondrocitų grandinėlės.
2. Nustatyta statistiškai reikšminga regresinė priklausomybė tarp pacientų sergančių 2 tipo cukriniu diabetu padinės sausplėvės skaidulų storio ir amžiaus (p ≤ 0,05), ir taip pat tarp skaidulų storio ir KMI (p ≤ 0,05).
27
16. ŠALTINIAI
1. Fiolkowski P, Brunt D, Bishop M, Woo R, Horodyski M. Intrinsic pedal musculature support of the medial longitudinal arch: an electromyography study. J Foot Ankle Surg. 2003;42(6):327-333.
2. D'Ambrogi E, Giurato L, D'Agostino MA, et al. Contribution of plantar fascia to the increased forefoot pressures in diabetic patients. Diabetes Care. 2003;26(5):1525-1529.
3. Rees A, Levy M, Lansdown A. Clinical Endocrinology and Diabetes at a Glance. Hoboken: John Wiley & Sons, Incorporated; 2017.
4. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. 2016.
5. Higienos institutas. Lapkričio 14-oji – Pasaulinė diabeto diena. 2019.
6. Brunton S. Pathophysiology of Type 2 Diabetes: The Evolution of Our Understanding. J Fam Pract. 2016;65
7. Schiebinger L, Klinge I, Sánchez de Madariaga I, Paik H, Schraudner M, Stefanick M. Gendered innovations in science, health, medicine, engineering and environment. 2011–2015.
8. Bruun C, Siersma V, Guassora AD, Holstein P, de Fine Olivarius N. Amputations and foot ulcers in patients newly diagnosed with type 2 diabetes mellitus and observed for 19 years. The role of age, gender and co-morbidity. Diabet Med. 2013;30(8):964-972.
9. Amin L, Shah BR, Bierman AS, et al. Gender differences in the impact of poverty on health: disparities in risk of diabetes-related amputation. Diabet Med. 2014;31(11):1410-1417.
10. Alexandra Kautzky-Willer, Jürgen Harreiter, Giovanni Pacini, Sex and Gender Differences in Risk, Pathophysiology and Complications of Type 2 Diabetes Mellitus, Endocrine
Reviews. 2016;37(3): 278–316,
11. Sheehan P, Jones P, Caselli A, Giurini JM, Veves A. Percent change in wound area of diabetic foot ulcers over a 4-week period is a robust predictor of complete healing in a 12-week prospective trial. Diabetes Care. 2003;26(6):1879-1882.
12. Baltzis, D., Eleftheriadou, I. & Veves, A. Pathogenesis and Treatment of Impaired Wound Healing in Diabetes Mellitus: New Insights. Adv Ther 2014;31: 817–836.
13. Pradhan L, Nabzdyk C, Andersen ND, LoGerfo FW, Veves A. Inflammation and neuropeptides: the connection in diabetic wound healing. Expert Rev Mol Med. 2009;11:e2.
14. Blakytny R, Jude E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabet Med. 2006;23(6):594–608.
28 15. Dinh T, Tecilazich F, Kafanas A, Doupis J, Gnardellis C, Leal E, et al. Mechanisms involved in the development and healing of diabetic foot ulceration. Diabetes. 2012;61(11):2937–47.
16. Ochoa O, Torres FM, Shireman PK. Chemokines and diabetic wound healing. Vascular. 2007;15(6):350–5.
17. Brem H, Tomic-Canic M. Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes. J Clin Investig. 2007;117(5):1219–22.
18. Usui ML, Mansbridge JN, Carter WG, Fujita M, Olerud JE. Keratinocyte migration, proliferation, and differentiation in chronic ulcers from patients with diabetes and normal wounds. J Histochem Cytochem. 2008;56(7):687–96.
19. Russo I, Frangogiannis NG. Diabetes-associated cardiac fibrosis: Cellular effectors, molecular mechanisms and therapeutic opportunities. J Mol Cell Cardiol. 2016;90:84-93.
20. B.R. Conway, B. Betz, T.A. Sheldrake, J.R. Manning, D.R. Dunbar, A. Dobyns,
et al. Tight blood glycaemic and blood pressure control in experimental diabetic nephropathy
reduces extracellular matrix production without regression of fibrosis Nephrology (Carlton), 2014;19;802-813
21. Stecco C, Corradin M, Macchi V, et al. Plantar fascia anatomy and its relationship with Achilles tendon and paratenon. J Anat. 2013;223(6):665-676
22. D.C. Han, M. Isono, B.B. Hoffman, F.N. Ziyadeh High glucose stimulates proliferation and collagen type I synthesis in renal cortical fibroblasts: mediation by autocrine activation of TGF-beta J. Am. Soc. Nephrol., 1999;10:1891-1899
23. P.E. Shamhart, D.J. Luther, R.K. Adapala, J.E. Bryant, K.A. Petersen, J.G. Meszaros, et al. Hyperglycemia enhances function and differentiation of adult rat cardiac fibroblasts Can. J. Physiol. Pharmacol., 2014; 92:598-604
24. H. Aguilar, E. Fricovsky, S. Ihm, M. Schimke, L. Maya-Ramos, N. Aroonsakool, et al. Role for high-glucose-induced protein O-GlcNAcylation in stimulating cardiac fibroblast collagen synthesis Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 2014;306:C794-C804
25. Rosenbaum AJ, DiPreta JA, Misener D. Plantar heel pain. Med Clin North Am. 2014;98(2):339-352.
26. Bowling FL, Reeves ND, Boulton AJ. Gait-related strategies for the prevention of plantar ulcer development in the high risk foot. Curr Diabetes Rev. 2011 May;7(3):159-63.
27. Ko SU, Stenholm S, Chia CW, Simonsick EM, Ferrucci L. Gait pattern alterations in older adults associated with type 2 diabetes in the absence of peripheral neuropathy--results from the Baltimore Longitudinal Study of Aging. Gait Posture.2011 Oct;34(4):548-52.
29 28. Florkowski C. HbA1c as a Diagnostic Test for Diabetes Mellitus - Reviewing the Evidence. Clin Biochem Rev. 2013;34(2):75-83.
29. Nuttall FQ. Body Mass Index: Obesity, BMI, and Health: A Critical Review. Nutr Today. 2015 50(3):117-128. doi:10.1097/NT.0000000000000092
30. Priesand SJ, Schmidt BM, Ang L, et al. Plantar fasciitis in patients with type 1 and type 2 diabetes: A contemporary cohort study. J Diabetes Complications. 2019;33(10):107399. doi:10.1016/j.jdiacomp.2019.06.004
31. Schneider HP, Baca JM, Carpenter BB, Dayton PD, Fleischer AE, Sachs BD. American College of Foot and Ankle Surgeons Clinical Consensus Statement: Diagnosis and Treatment of Adult Acquired Infracalcaneal Heel Pain. J Foot Ankle Surg. 2018;57(2):370-381. 32. Attar SM. Musculoskeletal manifestations in diabetic patients at a tertiary center. Libyan J Med. 2012;7:10.3402
33. Wang YN, Lee K, Shofer JB, Ledoux WR. Histomorphological and biochemical properties of plantar soft tissue in diabetes. Foot (Edinb). 2017;33:1-6.
34. Kim PJ, Martin E, Ballehr L, Richey JM, Steinberg JS. Variability of insertion of the Achilles tendon on the calcaneus: an MRI study of younger subjects. J Foot Ankle Surg. 2011;50(1):41-43.
35. Psaltopoulou T, Ilias I, Alevizaki M. The role of diet and lifestyle in primary, secondary, and tertiary diabetes prevention: a review of meta-analyses. Rev Diabet Stud. 2010;7(1):26-35.
36. Bailey CJ, Aschner P, Del Prato S, et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 2013;10(5):397-409.
