LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS ONKOLOGIJOS INSTITUTAS Gabrielė Plungytė 6 kursas, 17 grupė
MIKRO-RNR RAIŠKA, SERGANČIŲ GALVOS IR KAKLO NAVIKAIS
BEI SĄSAJA SU LIGOS PROGNOZE
BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS Medicinos vientisųjų studijų programa
Mokslinis vadovas: Dr. V. Rudžianskas
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 3 2. SUMMARY ... 4 3. PADĖKA ... 5 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 55. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
6. SANTRUPOS ... 6
7. ĮVADAS ... 7
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
9. LITERATŪROS ANALIZĖ ... 9
9.1. Galvos ir kaklo navikai ... 9
9.1.1 Galvos ir kaklo navikų epidemiologija ir kilmė ... 9
9.1.2 Ląstelės ciklo reguliacijos genų vaidmuo galvos ir kaklo navikų kancerogenzėje ... 10
9.1.3 TP53 ir ląstelės ciklo reguliavimas ... 11
9.1.4 PI3K-PTEN-AKT-mTOR kelias ... 11
9.1.5 Genai, koduojantys tirozino kinazės receptorių (RTK) ir MAPK kelius ... 12
9.2 Mikro-RNR biogenezė ir vaidmuo galvos ir kaklo navikų onkogenezėje ... 13
9.2.1 Mikro-RNR reikšmė ... 13
9.2.2 Mikro-RNR biogenezė ir brendimas ... 14
9.2.3 Sutrikusios Mikro-RNR reikšmė ... 14
9.2.4 Nenormali miRNR ekspresija... 15
9.2.5 MikroRNR galvos ir kaklo vėžio atveju ... 17
10. TYRIMO METODIKA ... 19
10.1 Tyrimo objektas ... 19
10.2 Metodai ... 19
10.2.1 Visuminės RNR ir miRNR išskyrimas ... 19
10.2.2 MiR raiškos pokyčių nustatymas tikro laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodu ... 21
10.2.3 Statistinė analizė ... 23
11. REZULTATAI ... 24
11.1 Mikro-RNR raiška galvos ir kaklo navikuose ... 24
11.2 miR-141 raiškos koreliacija su patologija bei klinika. ... 24
11.3 miR-200a raiškos koreliacija su patologija bei klinika. ... 25
11.4 miR-375 raiškos koreliacija su patologija bei klinika. ... 25
11.5 miR-141 ir miRNR-200a raiškos sumažėjimas ir ligos eiga. ... 25
12. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27
13. IŠVADOS ... 29
14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 30
15. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 31
3
1. SANTRAUKA
Autorė: Gabrielė Plungytė. Vadovas: dr. V. Rudžianskas.
Darbas atliktas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos fakultetas, Onkologijos institutas. Darbo pavadinimas: Mikro-RNR raiška, sergančių galvos ir kaklo navikais bei sąsaja su ligos prognoze.
Tyrimo tikslas: Nustatyti mikro-RNR-141, mikro-RNR-200a ir mikro-RNR-375 raišką galvos ir kaklo biopsijos ir operacinės medžiagos navikiniame ir nenavikiniame audinyje bei ištirti sąsajas su ligos prognoze.
Tyrimo uždaviniai: 1) Įvertinti mikro-RNR-141 raiškos profilį ir nustatyti ryšį su ligos prognoze. 2) Įvertinti 200a raiškos profilį ir nustatyti ryšį su ligos prognoze. 3)Įvertinti mikro-RNR-375 raiškos profilį ir nustatyti ryšį su ligos prognoze.
Metodika: Tyrime dalyvavo 27 pacientai vyresni nei 18 metų, sergantys galvos ir kaklo plokčialąsteline karcinoma, geros funkcinės būklės (ECOG – 0-1), kuriems numatytas standartinis kompleksinis gydymas (chemospindulinis arba biospindulinis gydymas). Raiškai nustatyti buvo atliktas mikro-RNR išskyrimas iš biopsinės ar operacinės medžiagos bei kraujo mėginių bei tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (TL-PGR). Statistinė analizė atlikta naudojant „SPSS 26.0 for Windows“ statistinį paketą. Koreliacijai tarp kintamųjų nustatyti remtasi ANOVA bei t-test kriterijais, ryšiui su prognoze – sudaryti Kaplan-Mieir grafikai ir ROC kreivės. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. Rezultatai ir išvados: Stebėtas platus reikšmių diapozonas nuo sumažėjusios raiškos iki padidėjusios. Vyravo sumažėjusios miRNR raiškos, labiausiai – miRNR-375. Vienintelė stebėta koreliacija, kuri buvo statistiškai reikšminga - RECIST kriterijais įvertintas ligos progresas ir miRNR-141 bei miRNR-200a raiškos sumažėjimai. Tokie rezultatai sudaro prielaidą teigti, jog abi miRNR galvos ir kaklo navikų kancerogenezėje dalyvauja kaip tumoro supresoriai. Stebėta didesnės miRNR-141 ir miRNR-200a raiškos ryšys su DFS, lyginant su mažesne raiška, tačiau statistiškai reikšminga buvo tik miRNR-141 raiška. Tinkamiausias biožymuo iš tirtų – miRNR-141 raiška, kurios AUC = 0.839, pasižyminti 83.3% jautrumu, 86.7% specifiškumu. Artimi rezultatai buvo ir miRNA-200a - AUC = 0.756, pasižyminiti 75% jautrumu, tačiau 53,3% specifiškumu. Labai skirtingi tiriamųjų anatominės srities ėminiai, galėjo būti dalis priežasties kodėl gauti rezultatai taip plačiai pasiskirstė.
4
2. SUMMARY
Author: Gabrielė Plungytė.
Academic supervisor: dr. V. Rudžianskas.
Work was done: Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of medicine, Institute of Oncology. Title: Micro-RNA expression in head and neck cancer patients and its association with disease progression.
Objective: To determine the expression of micro-RNA-141, micro-RNA-200a and micro-RNA-375 in tumor and non-tumor tissue of head and neck biopsies and surgical materials also to investigate the relationships between the prognosis of the disease.
Tasks: 1) To evaluate the expression profile of micro-RNA-141 and to determine the relationship between the prognosis of the disease. 2) To evaluate the expression profile of micro-RNA-200a and determine the relationship with disease prognosis. 3) To evaluate the expression profile of micro-RNA-375 and determine the relationship with disease prognosis.
Methodology: The study included 27 patients over 18 years of age with squamous cell carcinoma of the head and neck in good functional condition (ECOG - 0-1) who received standard combination therapy (chemoradiation or bioradiation). Isolation of micro-RNA from biopsy or operative material and blood samples also real-time polymerase chain reaction (TL-PCR) were performed to determine expression. Statistical analysis was performed using “SPSS 26.0 for Windows“ statistical package. The ANOVA and t-test criteria were used to determine the correlation between the variables, the Kaplan-Mieir plots and ROC curves were constructed for the relationship between the prognosis. Results are considered statistically significant at p <0.05.
Rezults and conclusion: A wide range of values from decreased to increased expression was observed. Decreased miRNA expression predominated, most notably - miRNA-375. The only correlation observed, which was statistically significant, was disease progression and decreases in miRNA-141 and miRNA-200a expression as assessed by RECIST. Such results suggest that both miRNAs are involved in the carcinogenesis of head and neck tumors as tumor suppressors. An association of higher miRNA-141 and miRNA-200a expression with DFS was observed compared to lower expression, but only miRNA-141 expression was statistically significant. The most suitable biomarker from the studied ones was miRNA-141 expression with AUC = 0.839, with sensitivity of 83.3% and specificity of 86.7%. Similar results were also of miRNA-200a with AUC = 0.756, with 75% sensitivity but 53.3% specificity. The very different samples in the anatomical area of the subjects may have been part of the reason why the results obtained were so widely distributed.
5
3. PADĖKA
Dėkoju darbo vadovui dr. Viktorui Rudžianskui, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno Klinikų Onkologijos ir hematologijos klinikos gydytojui, už suteiktą pagalbą ruošiantis šio darbo atlikimui, bei skirtą laiką pagalbai ir konsultacijoms atliekant baigiamąjį magistro darbą.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Leidimas išduotas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro 2019- 05- 15, leidimo Nr. BEC- MF- 394.
6
6. SANTRUPOS
AUC – plotas po kreive (angl. area under the curve); CCND1 – cyklinas D 1;
CDKN2A – nuo ciklinių priklausančios kinazės inhibitorius 2A (angl. cyclin-dependent kinase
inhibitor 2A);
DFS – išgyvenamumas be ligos (ang. disease free survival); DNR – deoksiribonukleorūgštis;
EBV – Epštein-Baro virusas;
ECOG – rytų kooperatinės onkologijos grupė (angl. Eastern Cooperative Oncology Group); EGFR – epidermio augimo veiksnio receptorius (angl. epidermal growth factor receptor); ETS – E26 transformacijai specifinių (angl. E26 transformation-specific);
GKN – Galvos ir kaklo navikai;
iRNR – informacinė ribonukleino rūgštis; kDNR – kopijinė DNR;
MAPK – mitogenu aktyvuojama baltymų kinazė (angl. mitogen-activated protein kinase) miRNR/miR – mikro-RNR (angl. micro-RNA);
mRNR – matricinė ribonukleino rūgštis;
PIK3CA –fosfoinozitido 3 kinazės alfa catalizinis subvienetas (angl. phosphoinositide 3-kinase
catalytic subunit alpha);
PI3K/AKT/mTOR – fosfoinozitido 3 kinazės / baltymo kinazės B / žinduolių rapamicino taikinio (angl. phosphoinositide 3-kinase / protein kinase B / mammalian target of rapamycin );
PSO – Pasaulio sveikatos organizacija;
RECIST – angl. Response Evaluation Criteria in Solid Tumors;
RISC –RNR aktyvinamas slopinimo kompleksas (angl. RNA-induced silencing complex); ROC –sprendimus priimančiojo ypatybių kreivė (angl. Receiver operating characteristic); SNP – vieno nukleotido polimorfizmas (angl. single nucleotide polymorphisms);
TCGA – vėžio genomo atlasas (angl. The cancer genome atlas); TL-PGR – tikro laiko PGR (polimerazės grandininė reakcija); TP53 – genas koduojantis baltymą p53
TRAF3 – angl. TNF receptor-associated factor;
VEGFA – kraujagyslių endotelio augimo faktorius A (angl. vascular endothelial growth factor A); YAP1 – angl. yes-associated protein 1;
7
7. ĮVADAS
Galvos ir kaklo vėžys sudaro apie 6 proc. diagnozuotų onkologinių susirgimų pasaulyje, o Europos Sąjungos šalyse kasmet nustatoma apie 90 000 naujų šios ligos atvejų. Pastaruoju metu stebimas ženklus susirgimų skaičiaus didėjimas: nuo 17,5 (2001-2005 m.) iki 26,5 (nuo 2006 m.) susirgimų 100 000 gyventojų. Nors diagnostikos technologijos nuolat tobulėja, 60 proc. pacientų galvos ir kaklo vėžys diagnozuojamas vėlyvose stadijose (III ar IV). Naujų biožymenų, susijusių su atsaku į gydymą ir ligos prognoze, nustatymas būtinas individualizuotos medicinos progresui klinikinėje praktikoje.
Mikro-ribonukleino rūgštys (miRNR) – trumpos viengrandės, nekoduojančios 18-25 nukleotidų RNR, kurios atlieka svarbų vaidmenį beveik visuose biologiniuose procesuose žinduolių ir kitų daugialąsčių organizmuose po-transkripciniu lygiu. Nors jos sudaro tik labai nedidelę išreikšto genomo dalį, mikroRNR yra pagrindiniai vystymosi ir ląstelių homeostazės reguliatoriai, kontroliuojantys įvairius ląstelių procesus, įskaitant proliferaciją, diferenciaciją, apoptozę ir morfogenezę. Atitinkamai miRNR turi įtakos onkogenezės procesuose, tokiuose kaip proliferacija, ląstelių ciklo kontrolė, apoptozė, migracija ir metabolizmas. MiRNR gali veikti tiek kaip tumoro-supresoriai, tiek kaip onkogenai. Kadangi šios molekulės stabiliai cirkuliuoja žmogaus organizmo skysčiuose, jie puikūs ateities biožymenys, siekiant neinvazinio ankstyvojo skryningo. Taip pat, jos gali būti pritaikytos kaip prognostiniai biomarkeriai, nes pastebima padidėjusios ir sumažėjusios raiškos koreliacija su specifinio vėžio fenotipu.
Šio tyrimo metu bus tiriami mikro-RNR-141, mikro-RNR-200a bei mikro-RNR-375 raiškos profiliai pacientų, sergančių galvos-kaklo vėžiu, biopsijos ir operacinės medžiagos navikiniame ir aplinkiniame nenavikiniame audinyje. Tyrimo metu tikimasi nustatyti, šių naujų biožymenų prognozinę vertę.
8
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Nustatyti mikro-RNR-141, mikro-RNR-200a ir mikro-RNR-375 raišką galvos ir kaklo biopsijos ir operacinės medžiagos navikiniame audinyje bei ištirti sąsajas su ligos prognoze.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti mikro-RNR-141 raiškos profilį ir nustatyti ryšį su ligos prognoze. 2. Įvertinti mikro-RNR-200a raiškos profilį ir nustatyti ryšį su ligos prognoze. 3. Įvertinti mikro-RNR-375 raiškos profilį ir nustatyti ryšį su ligos prognoze.
9
9. LITERATŪROS ANALIZĖ
9.1. Galvos ir kaklo navikai
9.1.1 Galvos ir kaklo navikų epidemiologija ir kilmė
Galvos ir kaklo navikai – gana paplitusi vėžio forma, PSO duomenimis užimanti 7 vietą tarp visų navikų 2018m. pasaulyje (9,5 atvejų 100 tūkst. gyventojų per metus) [1]. Nepaisant įvairių anatominių sričių (nosiaryklė, burnos ertmė, gerklos, gerklaryklė ir kt.) apie 90 proc. yra plokščiųjų ląstelių karcinomos [2]. Tipiškai tokiems navikams būdingas regioninis augimas, todėl diagnozavus ankstyvose stadijose, dažniausiai taikomas gydymo būdas yra rezekcija kartu su radioterapija ar chemoterapija, tikintis radikaliai pašalinti auglį sveiko audinio ribose. Visgi pirminiai galvos ir kaklo navikai iki 60 proc. linkę recidyvuoti, nepaisant mikroskopiškai ir makroskopiškai patvirtintos radikalios rezekcijos [3,4]. PSO duomenimis 2016m. tokie vėžiniai susirgimai sukeltų mirčių skaičiumi užėmė 13 vietą tiek pasaulyje, tiek Europoje (pasaulyje – 4,5/100000, Europoje – 6,2/100000 per metus) [5].
Epidemiologiniai tyrimai rodo, kad GKN būdingesni vyriškai lyčiai santykiu nuo 2:1 iki 4:1, priklausomai nuo geografinės padėties ir rizikos veiksnių. Svarbiausi iki šiol identifikuoti rizikos veiksniai – rūkymas bei alkoholio vartojimas, kurie taip pat gali turėti sinergistinį poveikį [6,7]. Taip pat įrodyta, jog GKN, ypač burnaryklės, riziką didina ir ŽPV infekcija [8]. Ir nors paskutiniu dešimtmečiu Europoje šių navikų atvejų skaičius lėtai mažėja, ką būtų galima sieti su didesne alkoholio ir tabako kontrole, visgi stebimas didėjantis burnos, liežuvio ir burnaryklės regionų paplitimas, galimai susijęs su didėjančiu ŽPV infekcijų skaičiumi. Ryškesnė EBV infekcijos įtaką rizikai susirgti galvos ir kaklo vėžiu stebima Azijoje ir labiau siejama su nosiaryklės navikais [9]. Be paminėtų rizikos veiksnių dar išskiriama: Fanconi anemija, profesinė ekspozicija (pvz.: darbas su asbestu, pesticidais, medienos ar tekstilės fabrikuose), tam tikri predisponuojantys genetiniai faktoriai (pvz.: DNR genų reparacijos polimorfizmas ir variacijos kitose keliuose, turinčius įtakos kancerogenezei) [10].
Dažniausiai navikas aptinkamas burnos ertmėje (~42,1 proc.) ir gerklose (~21,1 proc.), rečiau nosiaryklėje (~15,7 proc.), burnaryklėje (~11,6 proc.) ir gerklaryklėje (~9,5 proc.) [1].
Perversmą GKN tyrimuose sukėlė 2011m. publikuota pirmoji pilno egzomo seka. [11]. Daugiau įžvalgų apie genetinę galvos ir kaklų navikų kilmę pateikė 2014m. Vėžio Genomo Atlaso Tyrimų Tinklas (angl. the Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network), atlikęs integruotą genomo analizę 279 galvos ir kaklo navikuose, įskaitant genomo sekvenavimą, kopijų skaičiaus ir heterozigotiškų rinkinių praradimą, viso genomo metilinimą bei RNR sekvenavimą[12]. Tiriamieji buvo toliau išskirstyti į ŽPV-teigiamus ir ŽPV-neigiamus. Mažiau mutacijų pastebėta ŽPV - teigiamuose
10 navikuose, kuriuose dažniau pasireiškė PIK3CA aktyvavimo mutacijomis ir amplifikacijomis, tačiau TP53 mutacijos buvo beveik iškirtinai būdingos ŽPV-neigiamiems navikams. [11,12,13].
9.1.2 Ląstelės ciklo reguliacijos genų vaidmuo galvos ir kaklo navikų kancerogenzėje
Genų ekspresija žinduolių organizmuose apima DNR transkripciją į pre-mRNR, branduolio pre-mRNR splaisingą ir subrendusios RNA transportavimą į citoplazmą ir endoplazminį tinklą, bei mRNR transformaciją į baltymus ribosomose. Šį procesą toliau modifikuoja mRNR sąveika su mikroRNR (miR), apdorota DICER komplekso, kuris veda prie mRNR sunaikinimo ir vėlesnio baltymų gamybos praradimo. DNR transkripciją labai modifikuoja epigenetiniai pokyčiai, ypač promotoriaus metilinimas, kuris yra labai svarbus galvos ir kaklo vėžio etiologijai.
Onkogenai ir tumoro supresoriai kontroliuoja ląstelių proliferaciją. Onkogenas –tai mutavusi proto-onkogeno forma, kurios raiška yra perdėtai padidėjusi. Tokia transformacija gali įvykti dėl įvairiausių priežasčių, įskaitant chromosomines translokacijas, genų amplifikacijas bei aminorūgčių pokyčius dėl „aktyvuojamųjų“ mutacijų. Tumoro supresorių genų funkciją – normalios genetinės informacijos palaikymo, diferenciacijos, sąveikos tarp ląstelių ir apoptozės kontrolė. Priešingai nei proto-onkogenai, jiems būdingesnės funkcijos praradimo mutacijos, todėl esant jų inaktyvacijai, stebimi audinių hemostazės pakitimai. GKN dažniausiai matyti genų, reguliuojančių ląstelių ciklą, pokyčiai. Dauguma tokių mutacijų inaktyvuojamosios ir apima rėmo poslinkius, nonsense mutacijas ir splaisingo vietos pakitimus.
Genominiai struktūriniai pokyčiai paprastai matomi GKN nepriklausomai nuo ŽPV būsenos. Tiek ŽPV teigiamuose, tiek ŽPV-neigiamuose navikuose stebimos amplifikacijos 1q, 3q, 5p, 8q ir delecijos 3p, 5q, 11q regionuose[11, 14]. ŽPV neigiamų navikų 9p21.3 regionas dažniausiai ištrintas, o 11q13, kuriame randasi CCND1, ir 11q22, kuriame yra BIRC2 ir YAP1 - amplifikuoti [14]. Priešingai, ŽPV + navikuose dažniausiai 9p21.3, turintis CDKN2A, nepažeistas, o pasikartojančios delecijos dažnesnes 11q regione ir TRAF3. Taip pat šių potipių navikuose mažiau išreikštas 7p regionas, kuriame yra EGFR.
Biologiniu požiūriu, pasikartojančios CDKN2A delecijos ir CCND1 amplifikacijos (matomos ŽPV- navikuose) rodo, kad ląstelių ciklo reguliavimo praradimas yra esminis GKN kancerogenezės mechanizmas. Pasikartojančios TRAF3 delecijos (stebimos ŽPV+ tumoruose) indikuoja, kad sutrikęs imuninis atsakas, taip pat prisideda prie šio proceso. EFGR amplifikacija rodo, kad mitogeninio aktyvinto proteino kinazės (MAPK) kelio, o PI3KCA amplifikacija - PI3K-PTEN-AKT-mTOR aktyvinimas abiejuose ŽPV ir ŽPV-neigiamuose navikuose yra svarbus biologinis GKN variklis.
11 9.1.3 TP53 ir ląstelės ciklo reguliavimas
ŽPV-neigiamuose navikuose randamos TP53 mutacijos 80–87% atvejų, o CDKN2A genų pokyčiai matyti 32–57% [14, 15]. CDKN2A taip pat gali būti užslopintas promotoriaus hipermetilinimu [16], ir pažymėtina, kad CDKN2A ekspresija prarandama beveik visuose ŽPV-neigiamuose GKN [17]. Kita vertus, TP53 ir CDKN2A genų pokyčiai ŽPV+ navikuose stebimi retai.
TP53 – labiausiai ištirtas bei dažniausiai mutuojantis GKN supresorius, kuris pirmiausia veikia kaip transkripcijos faktorius ir reguliuoja šimtų tikslinių genų ekspresiją, reaguodamas į įvairius ląstelių stresorius [14, 18]. Jis sudarytas iš 393 aminorūgščių ir turi 4 domenus, įskaitant ir konservuotą DNR surišimo domeną (DBD). Šis naviko supresorius atlieka svarbų vaidmenį daugelyje kritinių ląstelių funkcijų: dalyvauja atsake į DNR pažaidą ir onkogeninį stresą. DNR pažeidimas sukelia p53 aktyvaciją, kuri savo atžvilgiu, skatina ląstelių ciklo sustabdymą ir bandymą ištaisyti žalą, kuri, jei neužbaigta, gali sukelti apoptozę arba senėjimą. Manoma, kad TP53 mutacijos yra įgyjamos ankstyvoje GKN patogenezėje (G1 – S ciklo fazėse) ir yra pasireiškusios prieš piktybinius pakitimus, o tai rodo svarbų vaidmenį ankstyvojoje onkogenezėje [7]. Nors dauguma TP53 missence mutacijų pasireiškia DBD, rėmo poslinkio ir nonsense mutacijos vienodai pasiskirsto gene.
Galimybė panaudoti TP53 kaip prognostinį biožymenį kiek kontraversiška, ankstyviesiems tyrimams rodant prieštaringus rezultatus. Šie ankstesni tyrimai buvo apriboti priklausomybe nuo imuninės būklės, kuri dažnai neatitinka mutacijos būsenos, ir nesugebėjimo sekvenuoti viso TP53 geno ilgio [19]. Naujausia ir išsamesnė sekos nustatymo analizė rodo, kad funkcinės mutacijos lemia gerokai prastesnes išeigas [20]. Pavyzdžiui, Poeta ir kolegos tirdami 420 pacientų, gydytų chirurgiškai ir radioterapija, nustatė, kad TP53 mutacijos buvo susijusios su blogesniu bendru išgyvenimu. Pacientams, kurių DNR surišimo domenoje buvo sutrumpinimo arba sutrikdymo mutacijos (angl. truncating mutations or disrupting mutations), bendras išgyvenamumas buvo žymiai blogesnis, tuo metu nefunkcinės mutacijos nebuvo statistiškai susijusios su blogesniais rezultatais. Kadangi p53 atlieka neatskiriamą vaidmenį sprendžiant genotoksinį stresą, keletas grupių nustatė, kad TP53 mutacija sukelia blogesnius rezultatus pacientams, vienodai gydomiems radioterapija arba pooperacine radioterapija.[20].
12 PIK3CA dažniausiai mutuojantis onkogenas ir, manoma, kad šio kelio pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį vėžio ląstelių augimo, išgyvenimo ir metabolizmo procese [21,22]. 21 proc. TCGA tiriamųjų turėjo PIK3CA mutaciją, o 25% pacientų taip pat turėjo PIK3CA amplifikaciją [14]. Kartu su kitais genų pakeitimais, PI3K-PTEN-AKT-mTOR kelio reguliacija sutrinka ~ 30% GKN [14, 15, 23]. Šis kelias ypač svarbus ląstelės ciklo reguliacijai, tačiau esant PIK3CA mutacijai sutrinka jo aktyvinimas ir valdymas dėl ko pakinta ląstelės ciklo eiga, skatinama proliferacija ir slopinama apoptozė.
PI3K kinazių šeima susideda iš trijų klasių, iš kurių IA klasė dažniausiai dalyvauja onkogenezės procese. PI3K aktyvinimas sukelia fosfatidilinozitolių fosforilinimą ir vėlesnį AKT aktyvavimą, kuris yra vienas iš pagrindinių PI3K signalizacijos veiksnių [22]. Tokios aktyvuotos AKT formos buvo nustatytamos daugumoje galvos ir kaklo navikų. AKT toliau aktyvuoja mTOR, kuris atsakingas už ląstelių signalų perdavimą apie maistinių medžiagų kiekį, ląstelių energijos kaupimą ir stresą.
Vienas PI3K aktyvacijos galvos ir kaklo navikuose mechanizmas yra tirozino kinazių receptorių, tokių kaip EGFR. Nors EGFR negali tiesiogiai aktyvinti PI3K, jei EGFR dimerizuojasi su ERBB3, jis vėliau gali aktyvuoti PI3K signalizaciją [21, 23]. Padidėjusi EGFR ekspresija pasireiškė> 90% HNSCC ir susijusi su prasta prognoze [24]. EGFR pokyčiai aptinkami ~ 15% pacientų, turinčių HNSCC, daugiausia HPV-neigiamų navikų [14, 25].
Kitas PI3K kelio aktyvavimo šiuose navikuose mechanizmas apima mutacijas, atsirandančias PI3K kataliziniame subvienete, p110a (koduoja PIK3CA genas). Šios mutacijos dažniau pasitaiko ŽPV-teigiamuose navikuose, palyginti su ŽPV-neigiamais navikais [26]. Be to, PIK3CA yra amplifikuojamas 20% galvos ir kaklo navikuose.
PTEN mutacijos arba delecijos yra matomos ~ 11% ŽPV teigiamose ir 5% ŽPV neigiamose GKN [7, 27]. PTEN koduoja fosfatazę, kuri išjungia PI3K signalizaciją, defosforilindama PIP3 į PIP2. Genominiai pokyčiai kitose PI3K kelio dalyse paprastai būna mažesni nei 5%.
9.1.5 Genai, koduojantys tirozino kinazės receptorių (RTK) ir MAPK kelius
Epiderminio augimo faktoriaus receptorius (EGFR) - tai RTK priklausantis HER / erbB(epidermio augimo veiksnio) šeimai [28]. Tai yra transmembraninių receptorių šeima, kurie išorinius signalus perduoda į ląstelę. Šis baltymas reguliuoja ląstelių proliferaciją, išgyvenamumą ir diferenciaciją [29].Aktyvuojant jo ligandą, EGFR dimerizuojasi, ko pasėkoje kinta jo konformacija ir , galiausiai, vyksta transfosforilinimas [28, 29] Tai gali sukelti pasroviui kylančių signalizacijos
kaskadų, įskaitant mitogenais aktyvinamos baltymo kinazės / užląstelinio signalo reguliuojamos
13 fosfoinozitido 3 kinazės / baltymo kinazės B / žinduolių rapamicino taikinio (angl. phosphoinositide
3-kinase / protein 3-kinase B / mammalian target of rapamycin (PI3K/AKT/mTOR)) signalinių kelių
aktyvinimą. Šie keliai yra svarbūs proliferacijos, invazijos, angiogenezės ir metastazių reguliacijai [29].
Patebėta, kad esant tokiai mutacijai pakinta MAPK/ERK signalinio kelio veikimas. Padidėjęs ERK aktyvinimas skatina ETV1 baltymo raišką. ETV1 – vienas svarbiausių transkripcijos veiksnių, priklausiantis E26 transformacijai specifinių (angl. E26 transformation-specific (ETS)) baltymų šeimai. Normaliai šis baltymas dalyvauja esminiuose ląsteliniuose procesuose (ląstelės ciklo reguliacija, diferencijacija, proliferacija ir kiti), tačiau esant ETV1 raiškos sutrikimams – inicijuojamas ląstelių piktybėjimas ir vėžio progresija.
EGFR yra išreikštas daugumos GKN bei stebėta, kad EGFR amplifikacijos pasireiškia rečiau ŽPV teigiamiems pacientams, nors priežastys išlieka neaiškios. ŽPV-teigiami ir ŽPV-neigiami navikai turi skirtingų dažnių pokyčius genuose, koduojančiuose RTK ir MAPK kelius. EGFR
dažniausiai pasireiškia ŽPV- teigiamuose navikuose [14]. MAPK kelio mutacijos, daugiausia ŽPV mutacijos ŽPV-neigiamuose navikuose ir KRAS mutacija ŽPV teigiamuose navikuose, yra matomos ~ 6% šiuose navikuose [14,25].
9.2 Mikro-RNR biogenezė ir vaidmuo galvos ir kaklo navikų onkogenezėje
9.2.1 Mikro-RNR reikšmė
Mažosios RNR – tai trumpos viengrandės, nekoduojančios 18-25 nukleotidų RNR, kurios atlieka svarbų vaidmenį beveik visuose biologiniuose procesuose žinduolių ir kitų daugialąsčių organizmuose po-transkripciniu lygiu. Be ilgio, šios molekulės taip pat apibrėžiamos sąsaja su argonautų šeimos baltymais (angl. argonaute protein family (AGO)) [30]. 1993 metais, Viktoro Ambros identifikuota pirmoji mažoji RNR Caenorhabditis elegans nematode, sukėlė proveržį mažųjų RNR tyrimuose. Šiandien šios molekulės skirstomos į 3 šeimas: miRNR, siRNR ir piRNR. Somatiniuose audiniuose dažniausiai stebima miRNR geriausiai ištirta. Oficialiosios miRNR duomenų bazės miRBase naujausiais duomenimis, šių molekulių žmogaus organizme identifikuoti 1917 lokusai [31,32].
Nors jos sudaro tik labai nedidelę išreikšto genomo dalį, mikroRNR yra pagrindiniai vystymosi ir ląstelių homeostazės reguliatoriai, kontroliuojantys įvairius ląstelių procesus, įskaitant proliferaciją, diferenciaciją, apoptozę ir morfogenezę. Atitinkamai miRNR turi įtakos onkogenezės procesuose, tokiuose kaip proliferacija, ląstelių ciklo kontrolė, apoptozė, migracija ir metabolizmas [33,34]. MiRNR gali veikti tiek kaip tumoro-supresoriai, tiek kaip onkogenai. Kadangi šios molekulės
14 stabiliai cirkuliuoja žmogaus organizmo skysčiuose, jie puikūs ateities biožymenis, siekiant neinvazinio ankstyvojo skryningo. Taip pat, jos gali būti pritaikytos kaip prognostiniai biomarkeriai, nes pastebima tiek padidėjusios, tiek sumažėjusios raiškos koreliacija su specifinio vėžio fenotipu.[35].
9.2.2 Mikro-RNR biogenezė ir brendimas
MikroRNR biogenezė vyksta keliais etapais: procesas prasideda branduolyje, kur miRNR yra nurašoma ir įgyja tarpinę struktūrą. Ją koduojantys genai yra daug ilgesni nei apdorotų brandžių mikroRNR molekulių. Pirmiausia RNR polimerazė II arba III (Pol II, PolIII) transkribuoja pirminės RNR kaip pri-miRNR, kurią sudaro kepurėlę ir poli-A uodega [36]. Tokios molekulės suformuoja segtuko formos antrines struktūras.
Toliau mikroRNR apdorojama į trumpas 80-100 nukleotidų grandines, žinomas kaip pre-miRNR, ląstelių branduolyje. Žmogaus organizme šį procesą vykdo baltymų kompleksas, sudarytas iš nukleazės DROSHA ir dvigrandės RNR jungiančio baltymo PASHA (kofaktorius) [37-38]. Tuomet pro branduolio poras šis tarpinis produktas Exportino-5 (Exp5; Ran transportavimo receptorių šeimos narys) transportuojamos į citoplazmą [39], kur yra suskaldomos Dicer (RNazė III ), kad susidarytų trumpos dvigubos krypties mikroRNR: mikroRNR dupleksas, sudarytas iš ~22 nukleotidų [40,41]. Toks dupleksas yra išsukamas helikazės į dvi atskiras grandis: viena jungiasi su Argonauto baltymo, kita - degraduojama.
Galiausiai, brandi viengrandė miRNR prisijungusi prie Argonauto (Ago) baltymų, sudaro RNR sukeltą slopinimo kompleksą (angl. RNA-induced silencing complex (RISC)), kuris reguliuoja papildomos informacinės RNR (angl. messenger RNR(mRNR)) transliaciją [39]. Tik toks miRNR - RISC kompleksas geba vykdyti genų raiškos slopinimą. Brandus miRNR atpažįsta savo komplementines sekas jų tikslinėse iRNR 3'-transliacijos regione (UTR) per „pamatinę“ (angl. seed) seką, esančią 5‘ gale. Prisijungusi prie iRNR, miRNR reguliuoja genų taikinių raišką potranskripciniu lygiu (pvz., keisdama iRNR stabilumą citoplazmoje arba slopindama transliaciją) [42,43,44].
Kadangi šio proceso reguliacijai nereikalingas didelis komplementariškumas, viena miRNR gali turėti iki kelių šimtų tikslinių iRNR, o pati iRNR – veikiama skirtingų miRNR, susidarant reguliaciniams tinklams, valdantiems genų raišką, todėl atsirandanti klaidinga miRNR ekspresija gali paveikti daugybę transkriptų, turinčių įtaką su vėžiu susijusiems signalizacijos keliams.
15 MikroRNR tiesiogiai nedalyvauja baltymų sintezėje, tačiau manoma, kad kontroliuoja daugiau kaip trečdalio žmogaus genomo baltymų koduojančių genų ekspresiją. Tik subrendusi, tai yra susijungusi su specifiniais baltymais į kompleksą, miRNR geba keisti genų taikinių raišką [45].
Keli tyrimai indikuoja, kad daugiau nei pusė miRNR genų lokalizuojasi su vėžiu susijusiose genomo regionuose arba trapiose jo vietose. Mažųjų kompleksų ekspresijos duomenys iš didelio vėžio audinių / ląstelių spektro parodė, kad klaidinga miRNR ekspresija yra taisyklė, o ne išimtis. Šiandien jau nebepaneigiama miRNR įtaka daugelyje vėžio rūšių, įskaitant krūtinės, gaubtinės žarnos, skrandžio, plaučių, prostatos ir skydliaukės tumorus [46-48].
Klaidinga miRNR ekspresija stebima beveik visuose navikų tipuose [49]. Šių klaidingai išreikštų miRNR funkcinė analizė rodo, kad jie gali veikti tiek kaip onkogenai, tiek kaip tumoro supresoriai. [50-53]. Onkogeniniai miRNR, dar vadinami „oncomiR“ - paprastai skatina naviko vystymąsi, slopindami tumoro supresorių genus ir (arba) genus, kontroliuojančius ląstelių diferenciaciją ar apoptozę. Priešingai, yra daug miRNR, kurios gali būti laikomos naviko supresoriais vėžyje. Šie miRNA yra vadinami „TSmiRs“ ir gali veikti slopindami onkogenus ir (arba) genus, kurie atitinkamai slopina ląstelių diferenciaciją arba apoptozę [54,55]. Sutrikęs miRNR ekspresijos reguliavimas dažnai atsiranda dėl genetinių mutacijų ir (arba) epigenetinių pokyčių, sukeliamų delecijų, amplifikacijos, taškinės mutacijos ir DNR metilinimo. Šių su vėžiu susijusių mikroRNR reguliavimo sutrikimas prisideda prie onkogenezės iniciacijos ir progresavimo, skatinant nekontroliuojamą proliferaciją, palaikant išgyvenimą, slopinant diferenciaciją ir (arba) didinant invazinį elgesį [56,57].
9.2.4 Nenormali miRNR ekspresija
Vis daugėja pranešimų, įrodančių platų miRNR ekspresijos lygio sutrikimą daugelyje ligų. Vėžiniuose audiniuose ir kultivuotuose navikų ląstelėse dažnai stebimas žymiai sumažėjęs brandžių miRNR ekspresijos lygis [58]. Šiuose tyrimuose identifikuoti skirtingi miRNR ekspresijos mechanizmai. Trys iš dažniausiai aprašomų:
a. genetiniai pokyčiai ir vieno nukleotido polimorfizmas (angl. single nucleotide polimorphism (SNP)),
b. epigenetinis slopinimas
c. miRNA biogenezės kelio defektai
Genetiniai pakeitimai ir SNP. Išsamus žmogaus miRNR genų žemėlapis parodė, kad didžioji dalis miRNR buvo susietos su trapiomis vietomis, vėžiui būdingais translokacijos taškais, pasikartojančiomis sekomis ir CpG salomis [59]. Tačiau kai kurie tyrimai indikavo tokios associacijos priklausomybę nuo specifinio vėžio tipo. Polimorfizmas atskiruose nukleotiduose (SNP) - plačiai žinomas bei gali lemti
16 dvejopą atsaką.[60]. Funkcijos padidėjimas dėl SNP gali sustiprinti sąveiką su miRNR taikiniu ir taip sustiprinti jo reguliavimo funkciją (pvz., tumoro supresoriaus geno). Priešingai, praradus funkciją dėl SNP gali padidėti miRNR ekspresija, kuri tada veiktų kaip onkogenas [61]. Be to, SNP tikslinėse miRNR vietose taip pat gali sukelti iRNR degradacijos išvengimą [62]. Visi šie stebėjimai parodė, kad SNP gali būti vienas iš veiksnių, lemiančių miRNR biogenezės ir funkcionalumo reguliavimą.
Epigenetinis miRNR ekspresijos reguliavimas. Keletas mokslinių tyrimų grupių ištyrė epigenetikos, t.y. hiper- arba hipo-metilinimo (ankstyvas kancerogenezės įvykis), įtaką miRNR genų aktyvumui [63-65], kadangi jų genų ekspresija, linkusi būti labiau paveikta metilinimo procesais [63,64,66]. Mokslinėje literatūroje randama daug DNR metilinimo procesų, turinčių įtakos miRNR aktyvumui, pavyzdžių. Kai kurie iš jų:
i. Atliekant duomenų apie gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų lyginamąją analizę, nustatyta, kad maždaug 10% tiriamųjų, miRNR ekspresija buvo reguliuojama DNR metilinimo būdu ir kad dalinis metilinimo sumažinimas nepakankamas miRNR funkcijos susigrąžinimui [67].
ii. Įrodyta, reikšminga ir teigiama koreliacija tarp miR-200c / 141 metilinimo ir krūties vėžio ląstelių invazinio pajėgumo [68].
iii. Tiriant miR-200c ne smukių ląstelių plaučių vėžiuose, promotoriaus metilinimas buvo susijęs su ekspresijos praradimu, kas savo ruožtu buvo susiję su prasta diferenciacija, limfmazgių metastazėmis ir silpnesne E-kadherino ekspresija [69].
Be DNR metilinimo, taip pat buvo pranešta, kad histono acetilinimas yra dar vienas epigenetinis reiškinys reguliuojamas vnavikuose. Nustatyta, kad krūties vėžio ląstelėse histono dezacetilazės slopinimas lemia miRNR koncentracijos pokyčius [70].
MiRNA signalizacijos kelio defektai. Daugelis žmogaus miRNR yra koduojami intronuose. Sumažėjęs iRNR koduojančių genų stabilumas, miRNR biogenezėje dalyvaujančių baltymų pakitimai, transkripcijos faktorių mutacijos gali lemti pačios mikroRNR raiškos pokyčius.[71,72,73,74] Tačiau buvo pranešta, kad kai kurie miRNR yra užkoduoti egzoniniuose regionuose. miRNR kontroliuojantys genai dažnai sukoncentruojami ir transkribuojami kaip policistroninis pranešimas arba pašalinami iš iRNR [75]. Buvo pranešta, kad daugelis su Pol-II susijusių transkripcijos faktorių aktyvuoja arba slopina keletą miRNR genų. Taip pat, kad p53 tumoro supresoriaus genas reguliuoja kelių miRNR (pvz., miR34, miR-200) ekspresiją. [76,77]
Kadangi miRNR raiškos profilis vėžinėse ląstelėse pakitęs, tai daro jas patraukliu objektu tyrinėti, siekiant rasti potencialius žymenis vėžio diagnostikai ar terapijai [78]. Kaip diagnostinis žymuo, miRNR yra neinvazyvus taikinys. Šiuo metu atliekami intensyvūs tyrimai, nustatant specifinius navikui ir ligos stadijai žymenis. Tiriant skirtingų miRNR funkcijas taip pat ieškoma taikinių, tinkamų kuriant individualizuotą priešvėžinį gydymą [79]. Yra galimos dvi miRNR terapinio taikymo strategijos: 1 – tiesioginis, į organizmą įterpiant miRNR konstruktus (oligonukleotidų arba virusų pavidalu) vykdomas
17 onko-miRNR slopinimas arba vėžį slopinančių miRNR aktyvinimas; 2 – netiesioginis, specifinių vaistų naudojimas, kurie reguliuotų tam tikrų miRNR raišką atitinkamais transkripcijos ar biogenezės etapais. Tačiau kol kas pagrindinis ribojantis veiksnys – tokių vaistų stabilumo ir efektyvaus pasisavinimo organizme trūkumas [78].
9.2.5 MikroRNR galvos ir kaklo vėžio atveju
Nepaneigimas mikroRNR vaidmuo kancerogenezėje, skatina su šių molekulių ekspresijos tyrimus, siekiant atrasti galimus biožymenius galvos ir kaklo vėžio skryningui, diagnozei ir prognozei. Neseniai pasiekta mikroRNR išraiškos pažanga padėjo geriau suprasti vėžio patogenezę.
MikroRNR reguliacijos sutrikimas - kritinis įvykis galvos ir kaklo navikuose. Sparčiai besivystant genetinių tyrimų technologijoms, daugėja pranešimų apie mikroRNR tinkamumą galvos ir kaklo navikų bandymams. Toliau aptariamos miRNR, buvo naudotos ir šiame tyrime.
MiR-200 šeima atlieka daug funkcijų, reguliuojant vėžio kamienines ląsteles, cheminį jautrumą ir apoptozę [80-82]. Šios šeimos atstovai egzistuoja dviejuose klasteriuose ir pagal tai skirstomi į grupes: 1 chromosomoje (miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200a, miR-200a-5p, and miR-429) bei 12 chromosomoje (miR-141-3p, miR-141-5p, miR-200c-3p, and miR-200c-5p) esantys [83]. Atitinkamai skiriasi ir dažniausi grupių pažeidimai: 1-oje chromosomoje koduojamų molekulių raiška reguliuojama vykstant histonų modifikacijoms, o koduojamų 12-oje – hipermetilinimui.
MiR-200a Įrodyta, kad miR-200a funkcija apima keletą metastazių pakopų. Vienas jų, epitelio - mezenchiminio perėjimo (angl. epithelial-mesenchymal transition (EMT)) slopinimas, kuris savo atžvilgiu inicijuoja epitelinių ląstelių virtimą mezenchiminėmis [84,85]. Be to, taikydamasi į metastazavusią kaskadą, sustiprina tiek pro-, tiek antimetastatinius signalus, ypač ankstyvuose ir vėlyvuose auglio metastazavimo etapuose [86]. Svarbus metastazavimo barjeras, kurio reguliacijoje dalyvauja miR-200a - anoikis (apoptozės forma). Atsparumas šiai programuotai ląstelės žūties formai, stiprina vėžio ląstelių išgyvenamumą sisteminėje kraujotakoje, tokiu būdu taip pat palengvinant antrinio naviko susidarymą tolimuose organuose [85,87]. Taip pat ši molekulė, atlieka svarbų vaidmenį chemoatsparumui. Tyrimuose, įrodyta jog padidėjusi jos ekspresija, antagonistiškai veikdama TP53INP1 ir YAP1 (per juos inhibuojama DNR pakitimų inicijuota apoptozė), buvo glaudžiai susijusi su prasta prognoze bei pooperaciniu atsparumu chemoterapijai. [88]
MiR-141: Taip pat priklauso MiR-200 šeimai. Nesenai įrodyta, jog padidėjusi jos ekspresija, skatina VEGF-A sekrecija, kuri savo atžvilgiu, aktyvuojant fokalinę adhezijos kinazę (angl. focal adhesion
kinaze (FAK)) ir PI3K/AKT/mTOR kelią, sustiprino ląstelių migracijos galimybes [89]. Be to, pastebėta
18 progresijai. To pačio tyrimo metu, įrodyta jog didesnė miRNR-141 raiška skatina ląstelių proliferaciją, atsparumą anoikis, tumoro augimą bei metastazes pilvaplėveje sergant kiaušidžių vėžiu [90,91]. Kituose tyrimuose buvo stebima padidėjusios miR-141 ekspresijos asociacija su atsparumu chemoterapijai bei navikinių ląstelių išgyvenamumu veikiant oksidaciniam stresui [92,93]
MiR-375: sumažėjęs miR-375 lygis buvo koreliuojamas su prasta prognoze ir metastazėmis GKN [94]. Ji gali veikti kaip tumoro supresorius, slopindamas naviko invazines savybes šiuose navikuose [94]. Padidėjusi miR-375 raiška buvo nustatyta tyrimuose su skrandžio vėžiu, kuriuose įrodyta, kad slopina ląstelių proliferaciją ir reguliuoja ląstelių išlikimą [95-97]. Priešingai, tyrimuose su prostatos karcinoma, sergančiųjų kraujo serumuose buvo stebima ryškiai padidėjusi miR-375 ir miR-141 raiška, lyginant su sveikų asmenų kraujo serumais.[98]
Nepaisant kasdien tobulėjančių miRNR profiliavimo būdų bei daugėjančių įrodymų apie epigenetinę galvos ir kaklo navikų etiologiją, vis dar nesutariama, kuri būtų išskirtinai priskiriama šiam vėžiui bei tinkama klinikinei praktikai kaip biožymuo. Tokius tyrimus galimai apsunkina naviko heterogeniškumas, genetinės ir aplinkos variacijos ir pačių tyrimų pobūdžių skirtumai. Visgi, nuo pirmųjų tyrimų su mikroRNR, rasta daug šių molekulių asociacijų su kancerogeneze, kas padėjo labiau suvokti galvos ir kaklo navikų patogenezę. Ši informacija skatina ieškoti specifinių miRNR raiškos pakitimų, kurie ateityje galėtų būti naudojami kaip žymenys diagnozei bei prognozei. Taip pat, geriau suvokiant šių molekulių skirtingas funkcijas, toliau pagilintų tumoro patogenezės žinias.
19
10. TYRIMO METODIKA
Tyrimui buvo pasirinktos trys miRNR – remiantis ankstesnėmis publikuotomis studijomis, kuriose tirtos krūties, stemplės ir kasos vėžio ląstelių kultūros, bei nustatyta, kad YAP1 geno funkcijos gali būti reguliuojamos mikro-RNR-200a [99], mikro-RNR-141 [100], mikro-RNR-375 [101].
Iš jau atrinktų pacientų tyrimui, paimtos biopsinės medžiagos, buvo išskirta miRNR, kuri vėliau tirta tikro laiko PGR reakcija. Atlikus miRNR aiškos analizę buvo įvertina šių miRNR įtaka pacientų ligos pasireiškimui ir prognozei. Apibendrinta tyrimo eiga pateikta 1 paveiksliuke.
1 pav. Tyrimo eiga: Pirmiausia, atrinkus tiriamąsias miRNR, pagal ansčiau publikuotas studijas, parinkti pacientai sergantys galvos ir kaklo navikais. Toliau paimti audiniai visuminės ir miRNR
išskyrimui, kurios tirtos tikro laiko PGR reakcija. Ištyrus pacientų klinikos ir patologijos pasireiškimą bei miRNR raišką - atlikta statistinė analizė.
10.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – miR-141, miR-200 ir miR-375, jų funkcijos ir sąsajos su galvos ir kaklo navikų patogeneze. Tuo tikslu buvo tirtos galvos ir kaklo navikais sergančių pacientų, kuriems taikomas standartinis kompleksinis gydymas - spindulinė terapija kartu su chemoterapija cisplatina arba biologine terapija cetuksimabu, biopsijos ir operacinės medžiagos navikinis ir nenavikinis audinys.
10.2 Metodai
10.2.1 Visuminės RNR ir miRNR išskyrimas
Tiriamosios MiRNR buvo skiriamos iš ląstelių, naudojant „AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal
20 2 pav. Rinkinys skirtas genomo DNR ir visuminės RNR, įskaitant miRNR, vienmomenčiui išskyrimui iš biologinio mėginio. Lizatas pirmiausia praleidžiamas per „AllPrep DNA Mini“ kolonėlę, kad selektyviai sulaikytų DNR, o po to per „RNeasy Mini“ kolonėlę, RNR išskyrimui (įskaitant miRNR).
Tyrimo metu naudoti reagentai (paruošiami ex tempore):
• Buferis FRN – ex tempore pridedamas izopropanolis (42 ml) • Buferis AW1 – ex tempore pridedamas 96-100% etanolis (25 ml) • Buferis AW2 – ex tempore pridedamas 96-100% etanolis (30 ml)
• Buferis RLT Plus – ex tempore pridedamas 10 μl b-mercaptoethanolis 1 ml buferio (esant reikalui pašildomas, kad nesusidarytų precipitatas)
• DNase I – liofilizatas ištirpinamas 550 μl vandens tūryje (dejonizuotas) • Buferis RPE – ex tempore pridedami 44 ml 96-100% etanolio.
2 pav. MiRNR išskyrimas, naudojant „AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit“: Pirmiausia tiriamieji audiniai lizuoti ir hemogenizuoti. Sekančiu etapu altiktas genominės DNR surišimas ir
visuminės RNR išskyrimas. Toliau naudojant atitinkamus reagentus, surišta visuminė RNR ir išskirta miRNR.
Pasverti ir iki 30mg sveriantys RNAlater/Allprotect stabilizuoti naviko audiniai atrinkti lizavimui ir homogenizacijai. Biopsinės medžiagos pirmiausia perkeliamos į audinių homogenizatorių bei užpilamos 600 μl Buferiu RLT Plus, kurio sudėtyje yra guanidino-isotiocianatas. Buferis inaktyvuodamas DNazes ir RNazes, užtikrina nepažeistos DNR ir RNR išskyrimą. Homogenizuota 2-5 min 20-25Hz. Homogenizuotas lizatas perkeltas į „AllPrep DNA Mini“ kolonėlę, kuri įkelta į 2ml mėgintuvėlį. Tada lizatas perkeliamas į „AllPrep DNA Mini“ kolonėlę, įstatytą į 2 ml surinkimo mėgintuvėlį.
Toliau įpilama 150 μl chloroformo ir gerai išmaišoma, supipetuojama. Nucentrifuguojama 4 ºC 3 min maksimaliu apsisukimų greičiu (20 000 x g). Atsargiai perkėlus vandeninę fazę į naują 2 ml mėgintuvėlį, įpilama 80 μl Proteinazės K ir gerai supipetuojama. Proteinazės K skaidymas tinkamai paruoštame buferyje išgrynina didelius DNR kiekius iš visų tipų mėginių. Tada įpylus 350 μl 96-100% etanolio ir gerai supipetavus, inkubuojama kamabario temperatūroje 10 min. Kartojamas plovimas: įpilama 750 μl 96-100% etanolio ir gerai sumaišoma.
21 Iki 700 μl gauto mėginio perkeliama į „RNeasy Mini spin” mėgintuvėlį, įstatytą į 2 ml surinkimo mėgintuvėlį. Uždaromas dangtelis ir centrifuguojama 15 s 20 000 x g. Likęs mėginio kiekis perkeliamas bei vėl nucentrifuguojamas. Išpilamas skystis iš surinkimo mėgintuvėlio.
Sekančiame žingsnyje įpilama 500 μl „Buferio RPE”, uždaromas dangtelis ir 15 s centrifuguojamas maksimaliu apsisukimų greičiu (20 000 x g). Toliau, įpilama 10 μl DNase I ir 70 μl
„Buferio RDD”. Švelniai sumaišoma ir centrifuguojama. Paruoštas DNase I mišinys (80 μl) įpilamas į „RNeasy Mini” mėgintuvėlį ir paliekamas kambario temperatūroje 15 min.
Įpilama 500 μl „Buferio FRN”, uždaromas dangtelis ir centrifuguojama 15 s maksimaliu greičiu (20 000 x g). Perkeliamas „RNeasy Mini” mėgintuvėlis į naują 2 ml surinkimo mėgintuvėlį. Perkeliamas skystis gautas 11 etape ir centrifuguojamas 15 s maksimaliu greičiu (20 000 x g).
Įpilama 500 μl „Buferio RPE”, uždaromas mėgintuvėlis ir centrifuguojamas 15 s maksimaliu greičiu (20 000 x g). Įpilama 500 μl 96-100% etanolio, uždaromas mėgintuvėlis ir centrifuguojamas 2 min maksimaliu greičiu (20 000 x g). Perkeltiamas „RNeasy Mini” mėgintuvėlis ant naujo 1.5 ml surinkimo mėgintuvėlio bei įpilama 50 μl „RNase-free" vandens ant membranos. Uždaromas mėgintuvėlis ir centrifuguojamas1 min >8000 x g.
10.2.2 MiR raiškos pokyčių nustatymas tikro laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodu
Išskirtos miRNR molekulės buvo gausinamos ir vertinamos naudojant tikro laiko miRNR atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją. Šios reakcijos metu galima išskirti kelis etapus.
Pirmiausia išskirtos miRNR molekulės buvo veikiamos poliA polimerazės, kuri prie miRNR molekulių prijungė iš keliolikos ar keliasdešimt adeninio nukleotidų sudarytą uodegą. PoliA reakcijos mišinio sudėtinės dalys nurodytos 1 lentelėje.
1 lentelė. PoliA reakcijai naudojami reagentai ir jų tūris vienai reakcijai
Reagentas 1 reakcija (µl)
10x Poly(A) buferis 0.5
ATP mišinys 0.5
Poly(A) fermento tirpalas 0.3
Vanduo 1.7
Galutinis tūris 3
Gautas reakcijos mišinys sumaišomas, nucentrifuguojamas ir išpilstomas į atskirus PGR mėgintuvėlius. Vienai PGR reakcijai yra naudojami 2 µl miRNR mėginio ir 3 µl Poli(A) reakcijos mišinio. PGR reakcija vykdoma termobloke. Etapai ir sąlygos nurodytos 2 lentelėje.
22
2 lentelė. PoliA reakcijos etapai ir sąlygos.
Žingsnis Temperatūra Laikas
Poly(A) prijungimas 37 °C 45 min.
Reakcijos stabdymas 65 °C 10 min.
Laikymas 4 °C -
Antro etapo metu buvo prijungiami adapteriai, susintetinti sukuriant universalią pradmenų jungimosi vietą 5’ gale. Atskirame mėgintuvėlyje paruošiamas ligazės reakcijai reikalingas mišinys. Reagentai ir jų kiekiai nurodyti 3 lentelėje.
3 lentelė. Ligazės reakcijoje naudojami reagentai ir jų tūris vienai reakcijai.
Reagentas 1 reakcija (µl)
5X DNR Ligazės buferis 3
50% PEG 8000** tirpalas 4.5
25X Ligazės reakcijos adapteris 0.6
RNR ligazė 1.5
Vanduo 0.4
Galutinis tūris 10
PGR reakcijos mišinys sumaišomas su su 10 µl ligazės reakcijos mišiniu. Gautas bandinys sumaišomas ir nucentrifuguojamas bei inkubuojamas 16 °C temperatūroje 60 minučių.
Trečio etapo metu vykdoma atvirkštinės transkripcijos reakcija naudojant universalius poliA uodegai komplementarius pradmenis, sukuriant stabilesnę dvigrandę kDNR molekulę. kDNR molekulės buvo naudojamos vykdant tikro laiko PGR su komerciniu rinkiniu, naudojančiu TaqMan zondus. Šios reakcijos metus susidarančios kDNR molekulės tiriamos naudojant komercinį „TaqMan Advanced miRNA assay“ rinkinį. Atvirkštinės transkripcijos reakcijos mišiniui naudoti reagentai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. kDNR sintezei naudojami reagentai ir jų tūris vienai reakcijai .
Reagentas 1 reakcija (µl) 5X RT buferis 6 dNTP mišinys (25mM) 1.2 20X universalus RT pradmuo 1.5 10X RT fermento mišinys 3 Vanduo 3.3 Galutinis tūris 15
15 µl Atvirkštinės transkripcijos reakcijos mišinio išpilstoma į atskirus mėgintuvėlius ir įpilama 15 mikrolitrų paruošto PGR ir ligazės reakcijos mišinio. Gerai suvorteksuoti ir trumpai nucentrifuguoti reakcijos mišinį. Reakcija vykdoma termobloke. Sąlygos nurodytos 5 lentelėje.
23
5 lentelė. kDNR sintezės sąlygos.
Žingsnis Temperatūra Laikas
Atvirkštinė transkripcija 42 °C 15 min.
Reakcijos stabdymas 85 °C 5 min.
Laikymas 4 °C -
Ketvirto etapo metu yra pagausinamos miRNR molekulės, naudojant universalius pradmenis. 1.5 ml centrifuginiame mėgintuvėlyje paruošiamas miR-Amp reakcijos mišinys (naudoti reagentai 6 lentelėje).
6 lentelė. MiRNR gausinimui naudojami reagentai ir jų tūris vienai reakcijai.
Reagentas 1 reakcija (µl)
2X miR-Amp Master mišinys 25
20X miR-Amp pradmens mišinys 2.5
Vanduo 17.5
Galutinis tūris 45
Sekančiu žingsniu 45 µl miR-Amp Reakcijos mišinio išpilstom į tuščius PGR mėgintuvėlius. Įpilama 5 µl Atvirkštinės Transkripcijos Reakcijos produkto. Galutinis tūris yra 50 µl. Gerai sumaišoma ir trumpai nucentrifuguojama. Reakcija vykdoma automatiniame amplifikatoriuje (termocikleryje) pagal žemiau pateiktą programą:
1. Fermento aktyvacija - 95°C 5 min. 1 ciklas; 2. Denatūracija - 95°C 3 s 14 ciklai;
3. Ilginimas - 60°C 30 s;
4. Reakcijos stabdymas - 99°C 10 min. 1ciklas; 5. Laikymas - 4°C 1 ciklas.
10.2.3 Statistinė analizė
Statistiniam rezultatų apdorojimui naudota kompiuterinė programa „SPSS Statistics V26”. Koreliacijai tarp pacientų charakteristikos ir miRNR raiškos paskaičiuoti taikyta One-way ANOVA bei t-test. Kaplan-Meier formulė naudota siekiant įvertinti miRNR raišką kaip prognostinį faktorių. Jeigu apskaičiuota p reikšmė yra lygi arba mažesnė už kritinį lygmenį (p ≤ 0,05), tai skirtumai tarp dviejų verčių ar jų grupių laikomi statistiškai reikšmingais.
24
11. REZULTATAI
11.1 Mikro-RNR raiška galvos ir kaklo navikuose
Kiekvienam pacientui buvo įvertinta santykinė trijų miRNR raiška navikiame audinyje lyginant su sveiku audiniu. Gautos reikšmės pateiktos santykiais dydžiais. Reikšmės didesnės už 0 (teigiamos) laikomos miRNR raiškos padidėjimu, o mažiau 0 - raiškos sumažėjimu. MiRNR raiškos pasiskirstymas pateiktas 3 paveiksle. Stebėtas 141, 200a santykinis raiškos padidėjimas, miR-375 raiška dažniau buvo sumažėjusi. Įdomu, jog stebėta teigiama koreliacija tarp 141 ir miRNR-200a raiškos (Spearman koreliacijos koeficientas r = 0.721, P < 0.001 X). Paskaičiuotos visų trijų miRNR medianos, kurios naudotos kaip riba navikus suskirstyti į didelės ir mažos raiškos, (MiRNR-141 (0.963 (diapozonas 0.32 iki 7.1)), miRNR-200a (0.985 (diapozonas 0.43 iki 2.66)), miRNR-375 (0.066 (diapozonas 0.02 iki 8.36))). Pacientai, kurių miRNR raiškos viršijo medianas buvo priskirti didelės raiškos, visi kiti - mažos raiškos. Iš 27 tirtų pacientų miRNR-141 didelė raiška stebėta 14 pacientams, didelė miRNR-200a raiška - 14 pacientams, o miRNR-375 – 13 pacientų.
3 pav. MiRNR-141, miRNR-200a bei miRNR-375 raiškos pasiskirstymas tiriamuosiuose audiniuose.
25 MicroRNR-141 raiškos koreliacija su galvos ir kaklo navikų patologijos ir klinikos pasireiškimu pateikta priedų 1 lentelėje. Stebėta amžiaus, limfmazgių įtraukimo bei G stadijos koreliacija, tačiau ji buvo statistiškai nereikšminga. Rezultatai neparodė statistiškai reikšmingo sąryšio su lytimi, pirminio naviko dydžiu, metastazių ir ligos atkryčio tikimybėmis. Visgi stebėta ryški statistiškai reikšminga koreliacija tarp RECIST kriterijų ir miRNRN-141 raiškos (t= 2.196; p=0.04). Kuo labiau sumažėjusi raiška, tuo didesnė tikimybė jog liga buvo stabili arba progresavo.
11.3 miR-200a raiškos koreliacija su patologija bei klinika.
MicroRNR-200a raiškos sąryšis su klinika apibendrinta priedų 2 lentelėje. Rezultatuose stebima koreliacija tarp pacientų amžiaus, ligos atkritimo bei G stadijos, tačiau ji nebuvo statistiškai nereikšminga. Jokio ryšio nestebima tarp lyties, pirminio naviko dydžio, limfmazgių įtraukimo, metastazavimo bei stadijos. Visgi didelė statistiškai reikšminga koreliacija (t= 2.510; p=0.02) stebėta tarp miRNR-200a raiškos sumažėjimo ir RECIST kriterijų (t.y. stabilios ligos arba jos progresavimo).
11.4 miR-375 raiškos koreliacija su patologija bei klinika.
MicroRNR-375 raiškos ryšys su klinika ir patologija apibendrintas priedų 3 lentelėje. Rezultatuose stebima neigiama koreliacija su amžiumi, teigiama su pirminio naviko dydžiu bei stadija, visgi statistinės reikšmės ryšiai neturi. Likę parametrai ( lytis, pirminio naviko dydis, įtraukti limfmazgiai, metastazės, ligos atkrytis bei G stadijos) statististiškai reikšmingo ryšio tarpusavyje su genetinės informacijos raiška neturėjo.
11.5 miR-141 ir miRNR-200a raiškos sumažėjimas ir ligos eiga.
Iki sausio 22d., 2020m. 12 (44.44%) pacientų nustatyta stabili liga arba ligos progresas, o DFS (disease free survival) mediana buvo 21 mėnuo. Tyrimo metu 2 (7,4%) pacientams nustatytas recidyvas (1 – lokalus, 1- limfmazgiuose), taip pat vienam (3.7%) pacientui nustatytos metastazės
26 limfmazgiuose. Kaplan-Meier grafikai sudaryti siekiant įvertinti abiejų miRNR raišką kaip DFS prognostinius faktorius. Stebėta didesnės miRNR-141 ir miRNR-200a raiškos ryšys su DFS lyginant su mažesne raiška, tačiau statistiškai reikšminga buvo tik miRNR-141 raiška(p=0.05), o miRNR-200a raiška statististiškai reikšminga nebuvo (p=.334) (4 pav.)
4 pav. MiRNR-141 ir miRNR-200a raiškos koreliacija su DFS.
Stebint RECIST kriterijų koreliaciją su miRNR-141 ir miRNR-200a raiška buvo tikrinima galimybė pritaikyti šių micro-RNR raiškos pakitimus kaip ligos progreso prognostinius faktorius. Tokiam tikslui - išvestos ROC kreivės (5pav.). Kreivės rodo, jog tiek miRNA-141 (AUC = 0.839, 83.3% jautrumas, 86.7% specifiškumas), tiek miRNA-200b (AUC = 0.756, 75% jautrumas, 53,3% specifiškumas) diskriminavo tarp pacientų, kuriems buvo stebimas ligos progresas arba stabili liga, įrodant galimybę naudoti šias raiškas kaip prognostinius biomarkerius.
27
12. REZULTATŲ APTARIMAS
Paskutiniu dešimtmečiu microRNR profilio tyrimų kiekis išaugo, siekiant įrodyti jų prognostinę vertę, žinant, kad būtent šios genetinės informacijos sutrikusi raiška navikuose dažnai koreliuoja su klinikopatologija arba atsaku į gydymą. Šimtai genų, susijusių su galvos ir kaklo navikų vystymusi ir fenotipu, gali būti taikiniai vienai miRNR. Šio darbo metu pasirinktos trys microRNR: 141, miR-200a ir miR-375 bei tirta jų raiška ir sąsaja su ligos prognoze, sergantiems galvos ir kaklo navikais. Nors miR-141 ir miR-200a priklauso skirtingoms miR-200 šeimos klasėms, o tarpusavyje su miR-375 skiriasi lokalizacija genome bei raiškos valdymo mechanizmais, visų trijų sutrikusi raiška publikacijose siejama su prastesne prognoze, metastazavimu.
Micro-RNR raiškos tirtos RT-PGR metodu tų pačių pacientų sveikuose ir navikiniuose audiniuose (n=27). Gautos reikšmės paverstos santykinėmis (fold change). Stebėtas platus reikšmių diapozonas nuo sumažėjusios raiškos iki padidėjusios. Visų trijų tirtų grupių medianos neviršijo 1, todėl daroma išvada, kad vyravo sumažėjusi miRNR raiška, labiausiai – miRNR-375. Labai skirtingi tiriamųjų anatominės srities ėminiai, galėjo būti dalis priežasties kodėl gauti rezultatai taip plačiai pasiskirstė.
Tiriant micro-RNR ryšį su klinika ir patologija, stebėtas rezultatų išsiskyrimas. MiRNR-141 raiška koreliavo su didesniu amžiumi, regioninių limfmazgių įtraukimu bei G stadija, tačiau gauti rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi. MiRNR-200a koreliavo su amžiumi, ligos atkričiu bei G stadija, vėlgi rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi. Taip pat statistiškai nereikšminga, tačiau didelė koreliacija stebėta tarp miRNR-375 ir pirminio naviko dydžio bei vėžio stadijos. Labiausiai tikėtina priežastis, kodėl tyrimo metu gautos didelės koreliacijos, tačiau nepakankamai statistiškai reikšmingos - tiriamųjų per mažas skaičius, neleidžiantis atspindėti tikrosios situacijos. Tolimesniuose tyrimuose imtį reiktų plėsti bent iki 50 tiriamųjų.
Vienintelė stebėta koreliacija, kuri buvo ir didelė ir statistiškai reikšminga - RECIST kriterijais įvertintas ligos progresas ir miRNR-141 bei miRNR-200a raiškos sumažėjimai. Tokie rezultatai sudaro prielaidą teigti, jog abi miRNR galvos ir kaklo navikų kancerogenezėje dalyvauja kaip tumoro supresoriai.
Kadangi tyrimo metu pacientų mirčių atvejų nestebėta, o atkričių ir metastazių nustatymo atvėjai bendrai nustatyti tik 3, nuspręsta vertinti ligos progresą pagal RECIST kriterijus, suskirsčius juos į dvi grupes: 1 grupė - pilnas arba dalinis atsakas į gydymą, o 2 grupė - stabili liga arba ligos progresas. Pasitelkus šiuos kriterijus buvo sudarytos Kaplan-Meier kreivės siekiant įvertinti abiejų miRNR ir ligos be progreso koreliacija. Stebėta didesnės miRNR-141 ir miRNR-200a raiškos ryšys su DFS, lyginant su mažesne raiška, tačiau statistiškai reikšminga buvo tik miRNR-141 raiška (p=0.05), o miRNR-200a
28 raiška statististiškai reikšminga nebuvo (p=.334). Vėlgi, norint tiksliau įvertinti tokią koreliaciją - tiriamųjų skaičius turėtų būti didinamas.
Galiausiai, stebint RECIST kriterijų koreliacija su miRNR, tačiau išsiskiriant statistiniam reikšmingumui skirtinguose statistiniuose modeliuose, nuspręsta sudaryti ROC kreivės tikrinant galimybę pritaikyti micro-RNR raiškos pakitimus kaip ligos eigos prognostinį faktorių. Tinkamiausias biomarkeris iš tirtų – miRNR-141 raiška, kurios AUC = 0.839, pasižyminti 83.3% jautrumas, 86.7% specifiškumas. Artimi rezultatai buvo ir miRNA-200a AUC = 0.756, pasižyminiti 75% jautrumu, tačiau 53,3% specifiškumu.
Apibendrinant, nepaisant dabartinių pasiekimų galvos ir kaklo navikų diagnostikoje bei gydyme, vis dar išliekant dideliems kiekiams vėlyvų stadijų diagnozių lyginant su ankstyvų, ko pasekoje atitinkamai daugiau prastų išeigų, išlieka didelis poreikis neinvazyviam diagnostiniam bei prognostiniam biomarkeriui. Tyrimo metu įrodžius, kad miRNR-141 ir miRNR-200a statistiškai reikšmingai koreliuoja su ligos atsaku į gydymą, išlieka poreikis tyrimą kartoti išplėtus tiriamųjų skaičių. Tik turint didesnę imtį būtų įmanomą patvirtinti arba paneigti esamas koreliacijas bei įvertinti raiškos pokyčių ryšį su gydymo efektyvumu. Dabartiniai rezultatai, leidžia daryti prielaidą, kad šios micro-RNR atlieka svarbų vaidmenį galvos ir kaklo navikų kancerogenezėje, bet iki galo neatsako į klausimą kokią.
29
13. IŠVADOS
1. Ištyrus 27 pacientus, stebima dominuojantis mikro-RNR-141 raiškos galvos ir kaklo navikuose sumažėjimas. Mikro-RNR-141 raiškos sumažėjimas koreliuoja su ligos atsaku į gydymą (kuo didesnė raiška - tuo labiau tikėtinas atsakas į gydymą) ir galėtų būti naudojama kaip papildoma priemonė vertinti ligos eigai.
2. Mikro-RNR-200a raiška taip pat buvo sumažėjusi didžiąjai daliai pacientų. Raiškos sumažėjimas taip pat koreliuoja su atsaku į gydymą bei galėtų būti naudojama kaip biožymuo ligos prognozei vertinti.
3. Mikro-RNR-375 raiška sumažėjusi daugumai, dviems pacientams jos raiškos nebuvo stebima. Statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp klinikos pasireiškimo, eigos ir raiškos profilio - nestebėta.
30
14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Vis daugėja įrodymų, kad miR reguliuoja daugelį onkogenezės aspektų, įskaitant proliferaciją, invaziją bei metastazavimą. Kadangi vienas pagrindinių uždavinių, susijusių su galvos ir kaklo navikais, išlieka sumažinti vėlyvą diagnostiką bei recidyvavimo dažnį, turėtų toliau būti
skiriamas didelis dėmesys skirtingų mikro-RNR raiškų profiliams šiuose navikuose. Specifinės mikro-RNR būdingos galvos ir kaklo navikams bei jos raiškos pokyčių dėsningumo nustatymas būtinas individualizuotos medicinos progresui klinikinėje praktikoje.
2. Pagrindinė problema su kuria susidurta tyrimo metu – pasirinkta tiriamųjų imtis, kuri buvo per maža įrodyti raiškos profilio koreliacijai su ligos pasireiškimu. Visgi tyrimo metu įrodžius, kad miRNR-141 ir miRNR-200a statistiškai reikšmingai koreliuoja su ligos atsaku į gydymą, išlieka poreikis tyrimą kartoti išplėtus tiriamųjų skaičių. Tik turint didesnę imtį būtų įmanomą patvirtinti arba paneigti esamas koreliacijas bei įvertinti raiškos pokyčių ryšį su klinika.
31
15. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel R, Torre L, Jemal A. Global cancer statistics 2016: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries 2018 [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2019 m. rugsėjo 2 d.]. Prieiga per internetą: http://gco.iarc.fr/today/online-analysis-multi-bars?v=2018&mode=cancer&mode_population=countries&population=900&populations=&ke y=asr&sex=0&cancer=39&type=0&statistic=5&prevalence=0&population_group=0&ages_gro up%5B%5D=0&ages_group%5B%5D=17&nb_items=40&group_cancer=1&include_nmsc=0 &include_nmsc_other=1&type_multiple=%257B%2522inc%2522%253Atrue%252C%2522m ort%2522%253Afalse%252C%2522prev%2522%253Afalse%257D&orientation=vertical&typ e_sort=0&type_nb_items=%257B%2522top%2522%253Atrue%252C%2522bottom%2522%2 53Afalse%257D&population_group_globocan_id=
2. Vigneswaran N, Williams M. Epidemiologic Trends in Head and Neck Cancer and Aids in Diagnosis. Oral and Maxillofacial Surgery Clinics of North America. 2014;26(2):123-141. 3. Ganci F, Sacconi A, Manciocco V, et al. Radioresistance in head and neck squamous cell
carcinoma: possible molecular markers for local recurrence and new putative therapeutic strategies. In: Marcu LG (ed.). Contemporary Issues in Head and Neck Cancer Management, 2015, psl. 3–34.
4. Farah CS, John K, Wu J. Contemporary assessment and management of head and neck cancer surgical margins. In: Marcu LG (ed.). Contemporary Issues in Head and Neck Cancer Management, 2015, psl. 75–130.
5. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. Geneva, World Health Organization; 2016.
6. Wyss A, Hashibe M, Chuang SC, Lee YC, Zhang ZF, et.al. Cigarette, cigar, and pipe smoking and the risk of head and neck cancers: pooled analysis in the International Head and Neck Cancer Epidemiology Consortium. Am J Epidemiol. 2013;178(5):679. Epub 2013 Jun 30.
7. Leemans CR, Braakhuis BJ, Brakenhoff RH: The molecular biology of head and neck cancer. Nat Rev Cancer 2011;11:9–22.
8. Ang KK, Harris J, Wheeler R, et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N Engl J Med. Jul 1; 2010 363(1):24–35. [PubMed: 20530316]
9. Raghupathy R, Hui EP, Chan AT Epstein-Barr virus as a paradigm in nasopharyngeal cancer: from lab to clinic. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2014
32 10. .Lacko M, Braakhuis BJ, Sturgis EM, Boedeker CC, Suárez C, Rinaldo A, Ferlito A, Takes RP Genetic susceptibility to head and neck squamous cell carcinoma Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2014;89(1):38.
11. Stransky N, Egloff AM, Tward AD, et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. Aug 26; 2011 333(6046):1157–1160. [PubMed: 21798893]
12. Hayes N, et al. The Cancer Genome Network. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 2014 in press.
13. Lechner M, Frampton GM, Fenton T, et al. Targeted next-generation sequencing of head and neck squamous cell carcinoma identifies novel genetic alterations in HPV+ and HPV-tumors. Genome medicine. 2013; 5(5):49. [PubMed: 23718828]
14. Cancer Genome Atlas N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 2015;517:576–82.
15. Chung CH, Guthrie VB, Masica DL, et al. Genomic alterations in head and neck squamous cell carcinoma determined by cancer gene-targeted sequencing. Ann Oncol. 2015;26:1216–23. 16. Guerrero-Preston R, Michailidi C, Marchionni L, et al. Key tumor suppressor genes inactivated
by “greater promoter” methylation and somatic mutations in head and neck cancer. Epigenetics. 2014;9:1031–46.
17. Lim AM, Do H, Young RJ, et al. Differential mechanisms of CDKN2A (p16) alteration in oral tongue squamous cell carcinomas and correlation with patient outcome. Int J Cancer. 2014;135:887–95.
18. Olivier M, Hollstein M, Hainaut P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. Jan 2010;2(1):a001008.
19. Loyo M, Li RJ, Bettegowda C, et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. Mar 2013;35(3):454e463.
20. Lindenbergh-van der Plas M, Brakenhoff RH, Kuik DJ, et al. Prognostic significance of truncating TP53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. Jun 1 2011;17(11):3733e3741.
21. Kandoth C, McLellan MD, Vandin F, et al. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types. Nature. Oct 17 2013;502(7471):333e339.
22. Engelman JA. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nat Rev Cancer. Aug 2009; 9(8):550e562.
23. Lui VW, Hedberg ML, Li H, et al. Frequent mutation of the PI3K pathway in head and neck cancer defines predictive biomarkers. Cancer Discov. 2013;3: 761–9.
24. Keren S, Shoude Z, Lu Z, Beibei Y. Role of EGFR as a prognostic factor for survival in head and neck cancer: a meta-analysis. Tumour Biol. 2014;35:2285–95.
33 25. Seiwert TY, Zuo Z, Keck MK, et al. Integrative and comparative genomic analysis of
HPV-positive and HPV-negative head and neck squamous cell carcinomas. Clin Cancer Res. 2015;21:632–41.
26. Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discov. May 2012;2(5):401e404. 27. Pedrero JM, Carracedo DG, Pinto CM, et al. Frequent genetic and biochemical alterations of the
PI 3-K/AKT/PTEN pathway in head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 2005;114:242–8.
28. Kalyankrishna S, Grandis JR. Epidermal growth factor receptor biology in head and neck cancer. J Clin Oncol. Jun 10 2006; 24(17):2666e2672.
29. Yewale C, Baradia D, Vhora I, Patil S, Misra A. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer: A review of trends and strategies. Biomaterials [Internet]. 2013;34(34):8690–707. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.07.100
30. Ha M, Kim VN. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol [Internet]. 2014;15(8):509–24. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrm3838
31. Almeida MI, Reis RM, Calin GA. MicroRNA history: Discovery, recent applications, and next frontiers. Mutat Res - Fundam Mol Mech Mutagen [Internet]. 2011;717(1–2):1–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2011.03.009
32. Homo Sapiens miRNA (1872 Sequences). Available online: http://www.mirbase.org/cgibin/ mirna_summary.pl?org=hsa (accessed on 2019-03).
33. Ameres SL, Zamore PD. Diversifying microRNA sequence and function. Nat Rev Mol Cell Biol [Internet]. 2013;14(8):475–88. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrm3611
34. Jamali Z, Asl Aminabadi N, Attaran R, et al. Micro- RNAs as prognostic molecular signatures in human head and neck squamous cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Oral Oncol 2015;51: 321–331.
35. Ardekani AM, Naeini MM. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2010;2(4):161–79.
36. Singh P, Singh A, Chauhan D. Current understanding on micro RNAs and its regulation in response to Mycobacterial infections [Internet]. 2019 [cited 4 April 2019]. Available from: http://www.jbiomedsci.com/content/20/1/14
37. Denli AM, Tops BB, Plasterk RH, Ketting RF, Hannon GJ. Processing ofprimary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 2004;432(7014):231–5.
38. Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, et al. The nuclear RNase III Droshainitiates microRNA processing. Nature. 2003;425(6956):415–9.
