LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
LINA ADEIKYTĖ
PAPRASTŲJŲ GARŢDENIŲ (Lotus corniculatus L.) AUGALŲ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas doc. dr. Raimondas Benetis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis, parašas Data
PAPRASTŲJŲ GARŢDENIŲ (Lotus corniculatus L.) AUGALŲ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas doc. dr. Raimondas Benetis, parašas Data
Darbą atliko Magistrantė
Lina Adeikytė, parašas Data
Recenzentas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Oksidacinis stresas, jį sukeliantys veiksniai. ... 11
1.2. Oksidacinio streso poveikis organizmui ... 13
1.3. Antioksidantai, jų veikimo mechanizmas ir klasifikacija ... 14
1.3.1. Fermentiniai antioksidantai ir jų funkcijos ... 15
1.3.2. Nefermentiniai antioksidantai ... 16
1.4. Fenoliniai junginiai, jų paplitimas ... 17
1.4.1 Fenolinių junginių klasifikacija ir struktūra ... 17
1.4.2 Fenolinių junginių antioksidacinės savybės ... 20
1.4.3 Fenolinių junginių ekstrakcija, bendro kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose ... 20
1.5. Paprastųjų garţdenių (Lotus corniculatus L.) bendroji charakteristika ... 23
1.5.1. L. corniculatus taksonomija ir paplitimas ... 23
1.5.2. L. corniculatus morfologija ir fitocheminė sudėtis ... 25
1.5.3. L. corniculatus panaudojimo sritys ... 26
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 27
2.1.Tyrimų objektas ... 27
2.3. Naudota aparatūra ... 28
2.4. Tyrimų metodai ... 28
2.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas... 28
2.4.2. Reagentų paruošimas ... 29
2.4.3. L. corniculatus ţaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 29
2.5. Duomenų analizė ... 34
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 35
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas L. corniculatus ţaliavose ... 38
3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas L. corniculatus ţaliavose ... 41
3.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų sujungimo metodu L. corniculatus ţaliavose 44 3.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas L. corniculatus ţaliavose DPPH surišimo metodu ... 48
3.6. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas L. corniculatus ţaliavose ABTS metodu ... 52
3.7. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo L. corniculatus ţaliavose ... 56
4. IŠVADOS ... 57
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 59
SANTRAUKA
L. Adeikytės magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra – Kaunas.
Paprastųjų garţdenių (Lotus corniculatus L.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.
Tikslas: Ištirti iš įvairių Lietuvos ir Latvijos augaviečių surinktų paprastųjų garţdenių augalinių ţaliavų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, jų morfologinį kintamumą bei antioksidacinį aktyvumą.
Uţdaviniai: 1) Parinkti tyrimui optimalias ekstrakcijos sąlygas iš L. corniculatus augalinių ţaliavų. 2) Įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties rodiklių bei antioksidacinio aktyvumo pokyčius skirtingų fenologinių tarpsnių L. corniculatus ţaliavose. 3) Nustatyti bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose L. corniculatus ţaliavose bei įvertinti jų kintamumą skirtingose augalo morfologinėse dalyse. 4) Nustatyti L. corniculatus ekstraktų antioksidacines savybes ir jų kitimo dėsningumus trijose modelinėse FIC, ABTS ir DPPH sistemose. 5) Įvertinti koreliacinius ryšius tarp L. corniculatus augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti buvo naudojamos paprastųjų garţdenių augalinės ţaliavos, kurios buvo surinktos Lietuvos ir Latvijos teritorijoje . Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu, ekstrahentas – 70 % (V/V) etanolis, ekstrakcijos laikas – 10 min, ekstrakcijos temperatūra – 40 ˚C. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui taikytas Folin-Ciocalteu metodas, o rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (mg/g). Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti taikyta reakcija su AlCl3, o
rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (mg/g). Antioksidacinis ekstraktų aktyvumas vertinamas spektrofotometriniais FIC , DPPH ir ABTS metodais. Rezultatai gauti DPPH ir FIC metodais išreikšti procentais, ABTS metodu - trolokso ekvivalentais (TE, μmol/g).
Rezultatai ir išvados: L. corniculatus ţaliavų bendro fenolinių junginių bei flavonoidų kiekis varijuoja priklausomai nuo morfologinės augalo dalies: ţieduose nustatyti didţiausi vidutiniai fenolinių junginių (26,66 ± 4,35 mg/g) ir flavonoidų (18,21 ± 4,33 mg/g) kiekiai, o maţiausi - stiebuose. Ţiedų ekstraktams taip pat nustatytas ir didţiausias antioksidacinis aktyvumas visose trijose in vitro modelinėse sistemose (FIC – 60,22 ± 10,41 %, DPPH – 50,01 ± 18,10 %, ABTS 43,63 ± 18,73 µmol/g). Didţiausias antioksidacinis poveikis nustatytas Telšių, Anykščių, N. Akmenės, Jelgavos ekstraktuose, o maţiausias- Vilniaus, Gruzdţių, Teizų ir Talsi. Geriausi fitocheminio ir antiokisdacinio tyrimo rezultatai nustatyti – ţydėjimo fazėje.
SUMMARY
Lina Adeikytė. Master‟s Thesis. Scientific adviser: doc. dr. Raimondas Benetis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry – Kaunas.
The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of bird‟s-foot trefoil (Lotus corniculatus L.) plants.
The aim: to examine the quantitative composition of the phenolic compounds in the raw materials of bird‟s-foot trefoil, growing in Lithuania and Latvia, as well as to evaluate the morphological variability and the antioxidant activity of the plants.
Objectives: 1) to select the optimal extraction conditions from L. corniculatus raw materials; 2) to evaluate the changes of the quantitative composition indicators and the antioxidant activity of the phenolic compounds and flavonoids in different phenological stages of L. corniculatus raw materials; 3) to determine the total amount of phenolic compounds and flavonoids in L. corniculatus cenopopulations and to evaluate their variability in different morphological parts of the plant; 4) to evaluate the antioxidant properties of extracts from L. corniculatus and their variation patterns by employing three modelling systems (FIC, ABTS and DPPH); 6) to evaluate the correlation between the amount of phenolic compounds and flavonoids in L. corniculatus raw materials and the antioxidant activity of their extractions.
Research methodology: raw plant materials of L. corniculatus, growing in Lithuania and Latvia, were used in the research. Extraction method – ultrasound agitation, extractant – 70 % (V/V) ethanol, extraction time – 10 min, extraction temperature – 40 ˚C. The Folin-Ciocalteu method was used to determine the total amount of phenolic compounds and the results were expressed as gallic acid equivalents (mg/g). The total amount of flavonoids was estimated by applying a reaction with AlCl3; Results were expressed as rutin equivalents (mg/g). The antioxidant activity of the extracts was
evaluated by employing spectrophotometric methods (FIC, DPPH and ABTS). The results gained from DPPH and FIC methods were presented as a percentage; the ABTS data was expressed as trolox equivalents (mg/g).
Results and conclusions: the total amount of phenolic compounds and flavonoids in raw materials of L. corniculatus varies subject to the morphological part of the plant: the largest amounts of phenolic compounds and flavonoids were identified in flowers, whereas the smallest in stems. Moreover, the highest antioxidant activity was estimated in flower extracts by all three in vitro model systems (FIC – 60,22 ± 10,41%, DPPH – 50,01 ± 18,10%, ABTS 43,63 ± 18,73 µmol/g). The highest antioxidant effect was identified in extracts from Telšiai, Anykščiai, Naujoji Akmenė and Jelgava, while the lowest in extracts from Vilnius, Gruzdţiai, Teizai and Talsi. The best results of the phytochemical and antioxidant analysis were identified in the flowering stage.
SANTRUMPOS
ABTS - 2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. CAT - katalazė
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
FIC - geleţies (II) jonų sujungimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay) F-C - Folin – Ciocalteu metodas
GRE - galo rūgšties ekvivalentai GSH – Px - glutationo peroksidazė
NADPH - nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas RE - rutino ekvivalentai
ROS - reaktyviosios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species) RNS - reaktyviosios azoto formos (angl. Reactive nitrogen species) SOD - superoksido dismutazė
TE - trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalent) V/V - tūrio procentai (jais išreikšta etanolio koncentracija)
ĮVADAS
Oksidacinis stresas - tai biocheminės pusiausvyros sutrikimas, kurio metu sukeliama įvairių ląstelių struktūrų paţaida. Šį procesą sukelia antioksidacinės organizmo sistemos sutrikimai ir aplinkos sąlygos, kurios lemia laisvųjų radikalų perprodukciją ląstelėje. Pagrindinės laisvųjų radikalų formos, kurios sukelia ţalingą poveikį ląstelei, skirstomos į reaktyviąsias deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formas. Jau XVIII a. buvo ţinomas galimas toksinis deguonies poveikis, tačiau neţinomas tikslus jo veikimo mechanizmas. Daugelis mokslininkų metų metus stengėsi tikslai nustatyti kenksmingą deguonies, jo skilimo produktų veikimo mechanizmą, šį poveikį skatinančius veiksnius ir galimas apsaugos priemones.[9,25,47,63]
Laisvuosius radikalus nukenksmina antioksidantai, kurie įvairiais veikimo mechanizmais gali apsaugoti organizmą nuo ţalingų oksidacijos procesų. [9,63] Antioksidantai pagal prigimtį skirstomi į fermentinius ir nefermentinius, o pagal šaltinius - į endogeninius ir egzogeninius. [47,58] Šiuo metu mokslininkų bendruomenėje fiksuojamas ypač didelis susidomėjimas natūraliais egzogeniniais antioksidantais - polifenoliniais junginiais. Šie junginiai yra augalų antriniai metabolitai. Literatūroje galima rasti daug atliktų tyrimų, patvirtinančių polifenolinių junginių teigiamą poveikį sveikatai (širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinėms ligoms, vėţio profilaktikai). [22, 27,57,58]
Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) atlikti tyrimai rodo, kad 80% Ţemės gyventojų ligų profilaktikai ir gydymui renkasi tradicinę mediciną. Šios terapijos metu gydymui daţniausiai vartojami augalų ekstraktai ir juose esantys biologiškai aktyvūs komponentai. [32] Tai įrodo, kad fitoterapija kaip gydymo metodas pasaulyje uţima svarbią vietą. Mokslinėje literatūroje galima rasti daug in vitro ir in vivo sąlygomis atliktų tyrimų rezultatų su augalais. Jų metu analizuojami ne tik tradiciniai vaistiniai augalai, bet intensyviai plėtojami ir kitų augalų rūšių tyrimai, kurių pagrindu būtų galima įvertinti jų pritaikymo galimybes medicinos ir farmacijos srityse.
Paprastieji garţdeniai (Lotus corniculatus L.) priklauso pupinių (Fabaceae) šeimai. [38] L. corniculatus ţaliavose kaupiami kondensuoti taninai, kumarinai, fenolio rūgštys, terpenoidai, saponinai ir flavonoidai. Pastarųjų junginių tyrimams skiriamas didţiausias dėmesys. [21,50,59,60] L. corniculatus augalai pasiţymi plačiomis pritaikymo galimybėmis: jie naudojami ţemės ūkyje kaip pašarinis augalas [13,26], kalvų ir šlaitų apţeldinimui [5,41], kaip bioremediatoriai. [13]. Duomenų apie šio augalo ţaliavų pritaikymo galimybes gydymo tikslams yra maţai. Šiuo metu nustatytas tik priešuţdegiminis [30] bei priešgrybelinis jo ekstraktų poveikis. [21]
Darbo naujumas. Pirmą kartą Lietuvoje nustatytas populiacinis bei morfologinis fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties kintamumas paprastųjų garţdenių ţaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvairavimas. Taip pat įvertintas šių rodiklių įvairavimas L. corniculatus
fenologinių tarpsnių kaitoje. Gauti rezultatai leidţia įvertinti paprastųjų garţdenių augalinės ţaliavos svarbą natūralių antioksidantų gavyboje.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti iš įvairių Lietuvos ir Latvijos augaviečių surinktų ir kultūroje auginamų paprastųjų garţdenių (Lotus corniculatus L.) augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai:
1. Parinkti tyrimui optimalias ekstrakcijos sąlygas iš L. corniculatus augalinių ţaliavų.
2. Įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties rodiklių bei antioksidacinio aktyvumo pokyčius skirtingų fenologinių tarpsnių L. corniculatus ţaliavose.
3. Nustatyti bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose L. corniculatus ţaliavose bei įvertinti jų kintamumą skirtingose augalo morfologinėse dalyse.
4. Nustatyti L. corniculatus ekstraktų antioksidacines savybes ir jų kitimo dėsningumus trijose modelinėse FIC, ABTS ir DPPH sistemose.
5. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp L. corniculatus augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Oksidacinis stresas, jį sukeliantys veiksniai.
Oksidacinį stresas - tai biocheminės pusiausvyros sutrikimas, kurio metu galimi dideli ląstelių membranų ir kitų struktūrų, tokių kaip baltymai, lipidai ir DNR, paţeidimai. Jį sukelia antioksidacinės organizmo sistemos sutrikimai ir aplinkos sąlygos, kurios lemia laisvųjų radikalų perprodukciją ląstelėje. Ląstelėms negalint tinkamai nukenksminti susidariusių laisvųjų radikalų, sutrinka pusiausvyra tarp oksidatorių ir antioksidantų. [9,63,47,58]
Susidomėjimas laisvaisiais radikalais ir jų daroma ţala kilo jau 1950 metais, kada Denham Harman pasiūlė ,,laisvųjų radikalų teoriją“ paaiškinančią organizmo senėjimą. Kaip pagrindinis organizmo senėjimo veiksnys nurodoma laisvųjų radikalų gamyba ir jų kaupimasis aerobiniuose organizmuose, taip ţalojant ląstelių makromolekules. [31]
Maţos molekulės, atomai ar jų grupės, turinčios vieną ir daugiau nesuporuotų elektronų, taigi nepilną elektronų komplektą valentiniame sluoksnyje yra labai reaktyvios ir vadinamos laisvaisiais radikalais. Šie dariniai nestabilūs ir linkę prisijungti arba atiduoti elektronus, dalyvauti oksidacijos - redukcijos reakcijose ir taip įgauti stabilesnę būseną. [9,25,63] Laisvieji radikalai gali egzistuoti trumpą laiką (10–9 s). [3] Paprastai jiems būdingi maţi matmenys, o tai leidţia prasiskverbti pro daugelį membranų. Pagrindinės laisvųjų radikalų formos, kurios sukelia ţalingą poveikį ląstelei, skirstomos į 2 grupes: reaktyviosios deguonies (ROS) ir reaktyviosios azoto (RNS) formos (1 lentelė). Kada du laisvieji radikalai pasidalina savo nesuporuotus elektronus, susidaro neradikalinės formos. Citotoksinės medţiagos RNS ir ROS gali būti tiek radikalinės, tiek neradikalinės formos. (1 lentelė). [9,25,47,62]
1 lentelė. Radikalinės ir neradikalinės RNS ir ROS formos. [9,25,47]
Radikalai Neradikalai
Reaktyviosios deguonies formos (ROS)
Hidroksilo radikalas (OH∙) Vandenilio peroksidas (H2O2)
Superoksido anijonas (O2∙) Ozonas (O3)
Peroksilo radikalas (ROO∙) Singletinis deguonis (1O2)
Lipidų peroksilo radikalas (LOO∙
) Lipidų peroksidas(LOOH)
Hipochlorito rūgštis HOCl
Reaktyviosios azoto (RNS) formos
Azoto monoksidas (NO∙) Diazoto trioksidas (N2O3)
Azoto dioksidas (NO2∙) Peroksinitrito anijonas (ONOO
-) Nitrito rūgštis (HNO2)
RNS ir ROS ląstelėje gali susidaryt dviem būdais: fermentinių ir nefermentinių reakcijų metu. Fermentinių reakcijų metu laisvieji radikalai susidaro dalyvaujant kvėpavimo grandinės reakcijose, fagocitozėje, prostaglandinų sintezėje ir citochromo P450 sistemoje, o nefermentinėmis reakcijomis –
deguoniui reaguojant su organiniais junginiais ir reakcijose, kurias inicijuoja jonizuojanti spinduliuotė. [31,47,63]
Reaktyviosios azoto (RNS) formos gaminamos biologiniuose audiniuose, pavyzdţiui, kraujagyslių endotelio ląstelėse iš L-arginino, veikiant azoto oksido sintazei. Šio fermento veiklą skatina acetilcholinas, bradikininas ir kiti farmakologiniai stimulai. Azoto monoksidas maţomis koncentracijomis dalyvauja reguliuojant daugelį svarbių fiziologinių procesų (kraujo tėkmėje, trombozėje, nervų sistemos aktyvume, gynybinėse organizmo reakcijose). [3,25,47]
Reaktyviosios deguonies formos (ROS) gaunamos iš molekulinio deguonies, vykstant normaliam gyvųjų organizmų ląstelių metabolizmui. Jo metu molekulinis deguonis nepilnai redukuojamas [9,42], o daugiausia jo susidaro mitochondrijose. [31] ROS poveikis taip pat priklauso nuo koncentracijos: esant maţai ir vidutinei – dalyvauja fiziologiniuose ląstelių procesuose (apsaugo nuo patogeninių mikroorganizmų neigiamo poveikio, atlieka gynybinę funkciją), o didelei – paţeidţia ląstelių komponentus, tokius kaip lipidai, baltymai ir DNR, taip ląstelėje sukeldami oksidacinius procesus (lipidų peroksidaciją, baltymų oksidacija, fermentų inaktyvinimą, DNR ir RNR mutacijas). Trys pagrindiniai ROS, kurie turi fiziologinę reikšmę ląstelei: superoksido anijonas (O2∙-), hidroksilo
radikalas (OH∙) (laikomas pačiu reaktyviausiu) ir peroksido radikalas (H2O2) (2 lentelė). [9,42,47]
2 lentelė. Svarbiausios reaktyviosios deguonies formos (ROS) ir jų susidarymas. [9,47]
ROS Formulė Susidaro Reakcija vyksta tarpininkaujant
Superoksido anijonas
O2∙- iš deguonies mitochondrijų elektronų transporto sistemai,
NADPH oksidazė, ksantino oksidazė. Vandenilio
peroksidas
H2O2 iš superoksido anijono superoksido dismutazei, NADPH, ksantino, amino
rūgščių oksidazėms, peroksimose vykstančios metabizmo reakcijos, kuriose dalyvauja deguonis. Hidroksilo
radikalas
OH∙ Iš vandenilio peroksido Haber–Weiss'o ir Fenton'o reakcijoms (jei dalyvauja Fe2+ ir Cu2+ )
Iš superoksido anijono ir vandenilio peroksido
Laisvieji radikalai susidaro veikiant išoriniams (egzogeniniams) veiksniams, tokiems kaip:
cigarečių dūmai, kuriuose gausu superoksido ir azoto oksido, kurie aktyvuoja endogeninius mechanizmus, pavyzdţiui, neutrofilų, makrofagų kaupimąsi;
ozono poveikis, kuris gali sukelti lipidų peroksidaciją ir padidina neutrofilų srautą į kvėpavimo takų epitelį, uţdegimo mediatorių kiekį, kuris sveikiems individams sukelia kvėpavimo funkcijų susilpnėjimą.
jonizuojanti radiacija, kurios metu hidroperoksido formos oksidacijos-redukcijos reakcijose reaguoja su pereinamųjų metalų jonais, pavyzdţiui geleţies ir vario, Haber–Weiss'o ir Fenton'o reakcijomis. [9]
Maistas: rūkyti mėsos gaminiai, aliejuje keptas maistas, didelis riebalų vartojimas.
Ksenobiotikai: vaistai, tokie kaip ciklosporinas, gentamicinas, bleomicinas, pramonininiai tirpikliai. [47]
Alkoholis, kuris ne tik skatina laisvųjų radikalų formavimąsi, ypač kepenyse, bet ir maţina antioksidantų, kurie maţina ROS/RNS kiekį, koncentraciją kraujyje. [63]
Endogeniai veiksniai, kurie lemia laisvųjų radikalų formavimąsi, yra uţdegiminės reakcijos, imuninių ląstelių aktyvacija, psichologinis stresas, per didelis fizinis krūvis ir kiti. [47]
1.2. Oksidacinio streso poveikis organizmui
Per pastaruosius du dešimtmečius mokslininkų atlikti in vivo tyrimai parodė teigiamą ryšį tarp oksidacinio streso ir biologinio organizmo senėjimo, tam tikrų ligų atsiradimo. [31] Oksidacinis stresas susijęs su daugelio vėţinių, širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių bei kitų ligų patogeneze (1 pav.). [9,47,63]
1 pav. Oksidacinio streso poveikis žmogaus organizmui. [9,47,63]
Nustatyta, kad oksidacijos sukelta ţala DNR atsakinga uţ vėţio vystymąsi, nes laisvieji radikalai sukelia chromosomų defektus ir aktyvina onkogeną. [47] Hidroksilo laisvasis radikalas yra
pagrindinis faktorius, kuris paţeidţia DNR bazes ir kurio dėka pradeda formuotis kancerogenezė. Oksidacijos metu taip pat paţeidţiami DNR cukrai (dezoksiribozė) ir gijos, kurie gali sukelti DNR transkripcijos ir susivyniojimo procesų sutrikimus. [31,47] Lyginant su branduolio DNR, mitochondrijų DNR yra jautresnė oksidacijai. [31]
Sumaţėjus NO gamybai ir (arba) padidėjus NO inaktyvacijai ryškėja endotelio disfunkcija. [23] Pradinėse disfunkcijos stadijose padidėja superoksido (O2-) gamyba. O2- oksiduoja NO ir susidaro
reaktyvus ir kenksmingas junginys – peroksinitrito anijonas (ONOO-). [3,48] ONOO- - stiprus oksidatorius, kuris lemia merkapto grupių ardymą ir oksidacinius paţeidimus daugelyje biomolekulių. [48] Šios reakcijos skatina endotelio disfunkciją ir lemia aterosklerozės bei kitų širdies ir kraujagyslių ligų atsiradimą bei vystymąsi. [3,23]
Daugelis eksperimentinių ir klinikinių tyrimų įrodė, kad sergant neurologinėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio liga, oksidacijos sukelta ţala lemia neuronų funkcijų praradimą ir demencijos progresavimą. [47] Oksidatoriai vaidina svarbų vaidmenį stiprinant uţdegiminius procesus, aktyvuodami įvairias kinazes ir redokso transkripcijos veiksnius: branduolio arba neuroninio perdavimo faktorių (NF-κB), aktyvinantį baltymą-1 (AP-1). [31,47] Nėštumo metu sukeltas oksidacinis stresas lemia sutrikusį vaisiaus vystymąsi ir preeklampsiją. Tyrimų duomenys rodo, kad ROS ir RNS dalyvauja lipidų peroksidacijos produktų padidėjime kraujyje ir gimdos augimo sulėtėjime. [47]
Laisvuosius radikalus nukenksmina antioksidantai, taip apsaugodami organizmą nuo jų sukeliamos ţalos. [63]
1.3. Antioksidantai, jų veikimo mechanizmas ir klasifikacija
Antioksidanto terminą 1995 metais apibrėţė mokslininkai Halliwell ir Gutteridge. Jie įvardijo, kad antioksidantai yra medţiagos, kurios maţomis koncentracijomis, lyginant su oksiduojančia medţiaga, reikšmingai sumaţina ar visiškai apsaugo tikslines molekules nuo oksidacijos. [58]
Ţinomi du pagrindiniai antioksidantų veikimo mechanizmai. Pirmojo mechanizmo metu antioksidantas atiduoda elektroną laisvajam radikalui, esančiam toje sistemoje, o antrojo - pašalinami ROS ir RNS iniciatoriai. [36]
Antioksidacinės medţiagos gali būti klasifikuojamos pagal šaltinius į:
Endogeninius arba metabolinius, kurie gaunami metabolizmo reakcijų metu organizme: glutationas, L-argininas, kofermentas Q10, melatoninas, šlapimo rūgštis, transferinas ir kiti.
Egzogeninius, kurie - gaunami kartu su maistu: vitaminai C ir E, karotinoidai, metalai (selenas, magnis, cinkas), flavonoidai, omega-3 ir omega-6 riebalų rūgštys ir kiti. [47,58]
Antioksidantai taip pat yra skirstomi pagal prigimtį į fermentinius ir nefermentinius. [9,47]
1.3.1. Fermentiniai antioksidantai ir jų funkcijos
Pagrindiniai fermentiniai antioksidantai yra superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė (3 lentelė). Šiai kategorijai taip pat priskiriami: hemo oksigenazė, redokso reakcijose dalyvaujantys baltymai (tioredoksinas, peroksiredoksinas) ir pereinamuosius metalų jonus sujungiantys baltymai. [9,19,48,62]
3 lentelė. Pagrindiniai fermentiniai antioksidantai ir jų katalizuojams reakcijos. [9,19,48,62]
Fermetas Fermento simbolis Katalizuojama reakcija
Superoksido dismutazė SOD 2O2∙- + 2H + -> H2O2 + 3 O2 Katalazė CAT 2 H2O2 -> 2H2O+ O2 Glutationo peroksidazė GSH-Px H2O2 + 2 GSH -> GS-SG + 2H20
SOD fermentas yra svarbiausias ir daţniausiai randamas plaučių audiniuose. Jis katalizuoja superoksido virtimą vandenilio peroksidu (3 lentelė). [9] Superoksido dismutazė neleidţia susidaryti peroksinitrito anijonui (ONOO-) ir sutrikdyti endotelio ir mitochondrijų funkcijas. [19] Pagal buvimo vietą ir struktūroje esančius metalo jonus SOD yra skirstoma į izofermentus: Cu,Zn-SOD ir Mn-SOD. Cu,Zn-SOD yra dimeras ir aktyviajame centre turi vario ir cinko jonus. Ši izoforma yra daţniausiai aptinkama citoplazmoje ir tarp dviejų membranų, supančių mitochondriją. Mn-SOD yra tetrameras ir savo aktyviajame centre turi mangano joną. Jis randamas mitochondrijų matrikse. [9,19,63]
Katalazė (CAT) yra tetrameras, susidedantis iš 4 identiškų monomerų, kurie savo aktyviajame centre turi hemo grupę su Fe2+ jonu. Jis katalizuoja H2O2 virtimą vandeniu ir deguonimi (3 lentelė),
taip uţkirsdamas kelią peroksidui patekti į citoplazmą. Šio fermento randama beveik visose organizmo ląstelėse, daţniausiai jų peroksisomose ir citoplazmoje. [9,62,63]
Glutationo peroksidazė (GSH-Px) - tetrameras, kuris savo struktūroje turi seleno joną ir amino rūgštį – selenocisteiną. [9] Atlieka lipidų ir kitų peroksidų redukcijos reakcijas, kurių metu peroksilo radikalą verčia į tam tikrą alkoholį bei H2O2. Esant reduktoriui glutationui (GSH), H2O2
skaidomas iki vandens ir oksiduotos glutationo formos (GS-SG) (3 lentelė). Literatūroje aprašytos 4 fermento izoformos: GSH-Px - 1 (aptinkama beveik visuose audiniuose), GSH-Px -2 (skrandţio ir ţarnyno epitelio ląstelėse), GSH-Px - 3 (ekstraląstelinis, daugiausiai randama plaučiuose ir inkstų audiniuose, kraujo plazmoje). GSH-Px - 4 (citozolyje, mitochondrijose ir branduolyje, skirtingai nuo
kitų - turi didelį giminingumą lipidų peroksidams). [9,15,63] GSH-Px veikimą papildo glutationo reduktazė, kuri, naudojant reduktorių NADPH, iš glutationo oksiduotos formos (GS-SG) redukuoja glutationą. [15]
Pereinamuosius metalų jonus surišantys baltymai - transferinas, feritinas, laktoferitinas, ceruloplazminas ir albuminas. Feritinas sujungia geleţies, o ceruplazminas - vario jonus plazmoje. Taip išvengiama per didelės metalų jonų koncentracijos sukeliamo kenksmingo poveikio ląstelėms. [11,34,48]
1.3.2. Nefermentiniai antioksidantai
Maţos molekulinės masės junginiai, dar vadinami radikalų surišėjais (angl. ,,free radical scavengers“). [8,48] Nefermentiniai antioksidantai, atiduodami elektroną daţniausiai veikia kaip neutralizatoriai oksidacijos grandinės reakcijose [9,47].
Maţos molekulinės masės antioksidantai, remiantis jų tirpumu, skirstomi į tirpius riebaluose (lipofilinius) ir vandenyje (hidrofilinius). [9,48] Hidrofiliniai antioksidantai reaguoja su oksidatoriais ląstelės citozolyje ir kraujo plazmoje, o hidrofobiniai – apsaugo ląstelių membranas nuo lipidų peroksidacijos. [8]
Svarbiausias riebaluose tirpus antioksidantas - vitaminas E, kuris atiduodamas elektroną lipidų peroksidacijos reakcijai, apsaugo ląstelių membranas nuo oksidacijos. [9,48] Vitamino E aktyvumui svarbus yra vitaminas C, nes regeneruoja vitamino E redukuotą formą bei sinergistiškai veikia prieš laisvuosius radikalus. [9,47] Prie riebaluose tirpių junginių yra priskiriamas β- karotinas. Tai pigmentas, randamas augaluose, kuris reaguoja su superoksido anijonu, peroksilo ir hidroksilo radikalais. [9]
Vitaminas C arba L-askorbo rūgštis yra vandenyje tirpus vitaminas, kuris svarbus karnitino, kolageno, neuromediatorių biosintezei bei geleţies pasisavinimui. Askorbo rūgštis apsaugo membranos fosfolipidus nuo peroksidacijos. [47,48] Vitaminas C nukenksmina ROS (hidroksilo, alkoksilo, superoksido radikalus) ir RNS, suformuodamas monodehidroaskorbo rūgštį. [48] Vandenyje tirpių vitaminų grupei priklauso šlapimo rūgštis, kuri apsaugo eritrocitų membraną nuo lipidų peroksidacijos, nukenksmina singletinį deguonį, ROO∙ ir OH∙ radikalus. [48] Hidrofolinis antioksidantas glutationas detoksikuoja vandenilio ir lipidų peroksidus, veikiant GSH-Px. [9]
Mokslinėje literatūroje stebimas nuolat augantis susidomėjimas augalais, kurie kaupia polifenolinius junginius, gebančius įvairiais mechanizmais funkcionuoti kaip antioksidantai. Atliekama daug tyrimų in vitro ir in vivo sąlygomis, įrodančių polifenolinių junginių teigiamą poveikį sveikatai
(širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinėms ligoms, vėţio profilaktikai). Taigi, augalinių polifenolinių junginių tyrimų plėtojimas atveria perspektyvas šių junginių vartojimui įvairiose srityse. [22,27,48,57,58]
1.4. Fenoliniai junginiai, jų paplitimas
Literatūroje aprašyta daugiau nei 8000 skirtingų polifenolinių junginių. Fenoliniai junginiai arba polifenoliniai yra biologiškai aktyvios medţiagos, antriniai augalų metabolitai, kurių struktūroje yra bent vienas aromatinis ţiedas ir viena ar daugiau hidroksigrupių. Polifenoliai apsaugo augalus nuo kenksmingų aplinkos sąlygų, neigiamo mikroorganizmų poveikio ir suteikia augalui spalvą. [58] Jie kaupiami visose augalo dalyse: ţieduose, stiebuose, lapuose, vaisiuose, sėklose, šaknyse ir ţievėje. [34] Fenoliniai junginiai augalo audiniuose, ląstelėse ir jų organoiduose pasiskirsto nevienodai. Netirpūs junginiai randami ląstelės sienelėse, o tirpūs – ląstelės viduje. [27] Ţmogaus organizmas nesintetina daugelio polifenolinių junginių, todėl pastarieji turi būti gaunami su maistu. [24]
Fenolinių junginių sintezę skatina UV spindulių poveikis, sunkiųjų metalų toksiškumas, ţemos temperatūros ir ţemo maistingumo sąlygos. Nustatyta, kad augaluose, kurie auga tropinėse ir kalnuotose vietovėse, randami didesni flavonoidų kiekiai, lyginant su tais, kurie auga vidutinio klimato sąlygomis (dėl didesnės šviesos ir radiacijos poveikio). [27]
1.4.1 Fenolinių junginių klasifikacija ir struktūra
Pagal cheminę struktūrą šie junginiai skirstomi į penkias klases: (2 pav.) stilbenoidus, flavonoidus, fenolio rūgštis, kumarinus ir taninus. Jie tarpusavyje skiriasi anglies atomų skaičiumi ir konfigūracija. [24,47,48,55]
Fenolinių junginių antioksidacinis poveikis paprastai stiprėja daugėjant laisvų hidroksigrupių skaičiui arba susidarant glikozidams su mono ar polisacharidais. Jį taip pat lemia konkretaus junginio klasė ir metoksi grupių buvimas. [24,27]
Kumarinų struktūra sudaryta iš 9 anglies atomų (C) ir yra C6 – C3 konfigūracijos. Taninai –
sudaryti iš 15 anglies atomų ir turi C6 – C3 - C6 konfigūraciją, o stilbenoidai sudaryti iš 18 C atomų su
C6-C2-C6 fragmentu. [24,45]
3 pav. Benzoinės rūgšties( a) ir hidroksicinamono rūgšties (b) darinių bendroji struktūra [10].
Fenolio rūgštys skirstomos į du pogrupius: benzoinės rūgšties (galo, elago) ir cinamono rūgšties (p-kumaro, kavos, ferulo, sinapo) dariniai (3 pav.). Jų struktūra yra sudaryta iš skirtingų anglies atomų skaičiaus: benzoinės rūgšties dariniai iš 7 anglies atomų (C6-C1), o hidroksicinamono - 9
(C6 - C3).[24,44,55] Junginiai, kurie priklauso šioms grupėms, tarpusavyje skiriasi metoksi- (-OCH3) ir
hidroksi- (-OH) pakaitų skaičiumi ir išsidėstymu aromatiniame ţiede.[24] Hidroksicinamono rūgšties dariniai daţniausiai egzistuoja esterių pavidalu, konjuguoti su gliukoze ar karboksirūgštimi. [20] Šios grupės junginių antioksidacinis poveikis siejamas su efektyviu metalo jonų chelatavimu dėl dviejų hidroksigrupių buvimo orto padėtyje (3 pav.).[24]
Flavonoidai (lot. „flavus“ - geltonas) – didţiausia fenolinių junginių grupė. Šiuo metu išskiriama daugiau kaip 4000 flavonoidų. Šių junginių struktūros pagrindas benzo - γ - pirono fragmentas. Jų struktūra sudaryta iš 15 anglies atomų, dviejų benzeno ţiedų (A, B) sujungtų trijų anglies atomų tilteliu (propaniniu fragmentu), kuris su deguonies atomu sudaro heterociklą (C6-C3-C6)
(4 pav.). [45,49,57,58]
4 pav. Flavonoidų bendra struktūra. [49]
Struktūriniai pokyčiai C heterocikle suskirsto flavonoidus į pogrupius: flavonolius, flavanonus, flavonus, izoflavonus, antocianinus, flavanolius (katechinus, proanticianidinus) (2 pav.).
Skirtumai tarp pogrupių atsiranda dėl hidroksigrupių skaičiaus ir išsidėstymo bei alkilinimo ir (arba) glikozilinimo. (4 lentelė) [44,58]
4 lentelė. Flavonoidų pogrupiai, bendros struktūrinės jų formulės ir pavyzdžiai [44,49,58]
Pogrupis Bendra struktūrinė formulė
Struktūros pokyčiai (lyginant su bendra struktūra)
Pavyzdţiai
Flavonoliai C ţiede 3 padėtyje turi hidroksigrupę Kvercetinas, kemferolis Flavanonai C ţiede tarp C2 ir C3 nėra dvigubojo
ryšio, dėl to junginiai yra ne itin patvarūs
Naringeninas, taksifolinas, hesperetinas Flavonai C ţiede 3 padėtyje nėra hidroksigrupės Luteolinas
Izoflavonai B ţiedas prie C ţiedo prisijungęs 3 padėtyje, o ne 2 (kaip kitose pogrupiuose)
Genisteinas Antocianinai C ţiede yra oksonio jonas, kuris lemia
junginio spalvą
Cianidinas
Flavanoliai C ţiedo 3 padėtyje yra hidroksigrupė, tačiau 4 padėtyje nėra okso grupės
Katechinas
Flavonoidai daţniausiai sutinkami glikozidų pavidalu, o tai lemia didesnį tirpumą vandenyje. Glikozidai susidaro prie anglikono prisijungus cukrams. Gliukozė, galaktozė, ramnozė ir ksilozė - pagrindiniai šioje reakcijoje dalyvaujantys sacharidai. Pagal glikozilinimo tipą flavonoidai skirstomi į O – glikozidus, kurie gamtoje sutinkami daţniau, ir C – glikozidus.[49,57] Antioksidaciniam poveikiui flavonoidų struktūroje (4 pav.) yra būtini keli struktūriniai elementai: reikalinga katecholio grupė B ţiede (3‟ ir 4‟ padėtyse), kuri apsprendţia didesnį susidariusio fenoksilo radikalo stabilumą po laisvųjų radikalų sujungimo reakcijos; C ţiede tarp C2 ir C3 reikalingas dvigubas ryšys konjuguotas su C4
padėtyje esančia okso- grupe (=O). Taip pat šiam poveikiui svarbus hidroksi (-OH) grupių buvimas flavonoidų C3 ir C5 padėtyse. [24,49]
1.4.2 Fenolinių junginių antioksidacinės savybės
Polifenoliniai junginiai pasiţymi plačiu biologiniu poveikiu: antikancerogeniniu, antimutageniniu, antimikrobiniu, antitrombotiniu ir kt. Fenolinių junginių antioksidacinis poveikis gali pasireikšti ankstesniame skyriuje aptartais veikimo būdais: fenoliniai junginiai atiduoda elektroną laisviesiems radikalams, sujungia laisvuosius radikalus, pereinamųjų metalų jonus, slopina oksidazes (ciklooksigenazė, lipooksigenazė) ir apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso. [24,27,36,57]
Stilbenams priskiriamas resveratrolis, kuris pasiţymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, yra ciklooksigenazės inhibitorius, aktyvuoja endotelio azoto oksido sintezę, skatina vazodilataciją. [16,48] Resveratrolio antioksidacinės savybės pasireiškia gebėjimu sujungti metalo jonus ir moduliuoti fermentų, pavyzdţiui didinant katalazės, aktyvumą. Šio stilbeno darinio antioksidacinis aktyvumas buvo įrodytas tyrimų su diabetu sergančiomis ţiurkėmis metu. Joms vartojant resveratrolį, sumaţėjo lipidų peroksidacija hipokampe. [48]
Augaluose hidroksibenzoinės rūgšties darinių (galo, elago, vanilino rūgštys) nustatoma maţiau, lyginant su hidroksicinamono rūgšties dariniais. [24,44] Lyginamųjų tyrimu metu įrodyta, kad galo rūgštis ir jos esteriai nukenksmina hipochlorito rūgštį ir sumaţina smegenų fosfolipidų peroksidaciją. Hidroksicinamono rūgšties dariniai taip pat pasiţymi hepatoprotekciniu poveikiu. [45,48]
Naudingu poveikiu ţmogaus sveikatai flavonoidai pasiţymi dėl stiprių antioksidacinių savybių, kurios gali padėti uţkirsti kelią arba sulėtinti daugelio lėtinių ir degeneracinių ligų progresavimą.[47,48]. Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad flavonoidai pasiţymi priešuţdegiminiu, antivirusiniu, antibakteriniu ir antitrombotiniu poveikiu. [20,27,49,57] Flavonoidai gali skatinti II fazės detoksifikuojančius fermentus (NADPH-kvinono oksidoreduktazė, glutationo S-transferazė ir UDP-gliukuronozil transferazė), kurie yra pagrindiniai gynybos fermentai prieš elektrofilinius toksinus ir oksidacinį stresą. [49] Kiekvienas augalas kaupia unikalios kokybinės ir kiekybinės sudėties flavonoidų kompleksą, todėl jo ţaliavos ir iš jų paruošti preparatai gali sukelti įvairų terapinį poveikį. [47,48]
1.4.3 Fenolinių junginių ekstrakcija, bendro kiekio ir antioksidacinio aktyvumo
nustatymas augaliniuose ekstraktuose
Prieš atliekant polifenolinių junginių ekstrakciją iš augalinių ţaliavų, jų mėginiai turi būti tinkamai paruošti. Išgauti polifenolinius junginius galima iš švieţių, dţiovintų ar liofilizuotų augalinių ţaliavų. [12,55] Dţiovinant ţaliavą reikia vengti tiesioginės šviesos ir aukštos temperatūros, nes jų
poveikis gali turėti įtakos polifenolinių junginių sudėčiai. [55] Daţniausiai prieš ekstrakciją, ore ar šalčiu dţiovinti mėginiai yra apdorojami juos malant, trinant ar homogenizuojant.[12,29]
Ekstrakcija daţniausiai vykdoma tirpikliais dėl paprastumo, efektyvumo ir plataus pritaikymo galimybių. Ekstrakcijos išeiga priklauso nuo daugelio veiksnių: tirpiklio poliškumo, ekstrahavimo laiko ir temperatūros, augalinės ţaliavos ir tirpiklio kiekio, mėginių matricos ir jame esančių junginių fizikinių ir cheminių savybių. [12,29] Daţniausiai kaip tirpikliai naudojami metanolis, etanolis, acetonas ir jų mišiniai su vandeniu. Metanoliu efektyviai išekstrahuojami maţos molekulinės masės junginiai, o vandens ir acetono mišiniu – didesnės molekulinės masės flavanoliai. Vis dėlto farmacijos pramonėje etanolis yra tinkamiausias polinis ekstrahentas, nes gauti ekstraktai yra saugūs vartoti ţmonėms. Taip pat jis pasiţymi didele ekstrahavimo galia. [12,17,55]
Efektyviai fenolinių junginių ekstrakcijai uţtikrinti svarbu parinkti tinkamą temperatūrą ir laiką, nes ilgas ekstrakcijos laikas ir aukšta temperatūra gali padidinti šių junginių oksidaciją ir sumaţinti ekstrakcijos išeigą. Daţniausiai ekstrakcija atliekama esant temperatūrai nuo 20 iki 50 °C. Įrodyta, kad didesnė negu 70 °C temperatūra sukelia greitą tam tikrų polifenolių grupių, pavyzdţiui, antocianinų, degradaciją. [12,33]
Norint gauti kuo didesnę veikliųjų medţiagų išeigą, svarbu pasirinkti ir tinkamą ekstrakcijos metodą: maceraciją, Soksleto ekstrakciją, superkritinių skysčių ekstrakciją, pagreitinta ekstrakciją tirpikliais, ekstrakciją ultragarsu ar kitą. Pavyzdţiui, rinktis tradicinius ekstrakcijos metodus, tokius kaip maceraciją ir Soksleto ekstrakciją nėra tikslinga dėl ilgo ekstrahavimo laiko, didelio naudojamų organinių tirpiklių kiekio ir kitų veiksnių, kurie patvirtina maţą ekstrakcijos efektyvumą. Ekstrakcija ultragarsu yra efektyvesnė, be to ji nereikalauja sudėtingų instrumentų, yra saugi ir gana nebrangi. Šis ekstrakcijos būdas gali būti naudojamas tiek didelės, tiek maţesnės apimties bandinių ekstrakcijai. Akustinių bangų sklidimas sukelia kavitacijos procesą. Ultragarso banga sklinda tirpikliu ir sukelia tirpiklyje esančių kavitacinių burbulų sprogimą, taip sustiprina tirpiklio skverbimąsi į ląsteles bei padidina paviršiaus plotą tarp kietos ir skystos fazės. Daugelio tyrimų metu buvo įrodyta, kad ekstrakcija ultragarsu gali sukelti tik neţymią fenolinių junginių degradaciją ir yra tinkama naudoti įvairių augalinių ţaliavų ekstraktų gamybai. [12]
UV spektrofotometriniai metodai yra plačiai taikomi siekiant nustatyti bendrą fenolinių junginių, flavonoidų ir antocianų kiekį, įvertinti antioksidacinį aktyvumą . Šių metodų esmė yra tirpalo absorbcijos spektro kitimas regimosios šviesos srityje. Metodai yra paprasti, patikimi ir gerai atkartojami, tačiau nėra pakankamai atrankūs identifikuoti individualius komponentus ir jų sąlygojamą antioksidacinį atsaką . [4,12,55]
Dėl fenolinių junginių gausos, botaninės matricos sudėtingumo ir kitų junginių buvimo, nei vienas nustatymo metodas nėra tobulas. [12,55] Polifenolinių junginių bendrą kiekį galima nustatyti
šiais metodais: Folin-Denis, Folin-Ciocalteu, permanganatometrija, kolorimetrija su geleţies druskomis ir UV spektrofotometrija. Lyginant su kitais metodais, daţniausiai naudojamas Folin-Ciocalteu (F-C) metodas dėl savo paprastumo, pigumo ir gero atkartojamumo. F-C tyrimas remiasi elektronų perdavimo reakcijomis šarminėje terpėje ir, esant fenoliniams junginiams, susidaro mėlynos spalvos kompleksai. Reakcija stebima esant 760 -765 nm bangos ilgiui. Šio metodo metu kaip etalonas naudojama galo rūgštis, o rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentais (miligramais galo rūgšties/kilogramui ar litrui bandinio). Apibendrinant publikuotus mokslinius tyrimus, galima konstatuoti, kad Folin-Ciocalteu metodas yra labai plačiai naudojamas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti augalinėse ţaliavose. [12,14,16,22,39]
Bendras flavonoidų kiekis taip pat nustatomas spektrofotometriniu metodu. Daţniausiai naudojamas aliuminio chlorido (AlCl3) kolorimetrinis metodas, kurio esmė yra chelatinių flavonoidų
kompleksų susidarymas su Al jonais (flavonų ir flavonolių atveju sudaro stabilius kompleksus dėl C4
esančios ketogrupės bei C3 ir C5 hidroksigrupių). [37] Reakcija stebima esant 410-423 nm bangos
ilgiui. Kaip etalonas naudojamas rutinas arba kvercetinas, o bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ar kvercetino ekvivalentu (mg rutino ar kvercetino /g ekstrakto). [29,52]
Augalinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą preliminariai galima įvertinti spektrofotometriniais in vitro metodais: DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo), ABTS (2,2′-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties), FIC (geleţies jonų sujungimo). Šie metodai pagrįsti fenolinių junginių vandenilio atomo ar elektrono perdavimu (DPPH ir ABTS) arba pereinamųjų metalo jonų sujungimu (FIC). [4,14]
Violetinė spalva Geltona spalva
5 pav. DPPH radikalo ir antioksidanto (AH) reakcija.[53]
DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) – tai stabilus organinis azotinis radikalas. Vykstančios oksidacijos-redukcijos reakcijos metu violetinės spalvos DPPH radikalas redukuojamas į šviesiai geltonos spalvos hidraziną (5 pav.). [4,17,53] DPPH radikalų surišimo geba organinėje terpėje vertinama matuojant absorbcijos sumaţėjimą, esant 515–528 nm bangos ilgiui, kol nusistovi pusiausvyra. Šio antiradikalinio metodo esmė, kad fenolinis junginys pirmiausia greit perduoda elektroną, o po to lėčiau yra atiduodamas protonas. [4,22,35]
FIC (angl. ,,Ferrous Ion Chelating“) – fotometrinis Fe2+ jonų sujungimo metodas. Antioksidacinis aktyvumas taip pat vertinamas spektrofotometru, esant 562 nm bangos ilgiui. Metodo esmė, kad reakcijoje dalyvaujantis ferozinas veikia kaip kompleksonas ir sujungia pereinamųjų metalų jonus. Taip susidaro raudonos spalvos ferozino ir Fe2+ kompleksas. Tokiu būdu įvertinamas chelatuojančių medţiagų aktyvumas, kurioms funkcionuojant biologinėse sistemose sumaţėja reaktyvių Fe2+
jonų, skatinančių Fenton'o ir Haber-Weiss'o tipo reakcijas bei laisvųjų radikalų gamybą. [35,43]
ABTS radikalų - katijonų surišimo metodas. Oksidacijos reakcijų metu sugeneruotas ABTS•+
radikalas-katijonas yra spalvotas radikalas, kuriam regimosios šviesos spektre būdingi absorbcijos maksimumai esant 415, 650, 734 ir 815 nm bangos ilgiams. Metodo esmė, kad antioksidantai (polifenoliniai junginiai) suriša susidariusius ABTS radikalus-katijonus. Šio metodo metu kaip etalonas yra naudojamas troloksas, o rezultatai išreiškiami trolokso ekvivalentais 1 gramui sausos ţaliavos. [4,46]
Didelė dalis augalinių antioksidantų yra polifenoliniai junginiai. Todėl siekiant detaliai įvertinti augalinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą yra tikslinga pirmiausia nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, taip pat vienos svarbiausių šių junginių grupės – flavonoidų kiekį. Išsamesniam augalinių ekstraktų antioksidacinio potencialo įvertinimui tikslinga taikyti keletą in vitro analizės metodų, kurie leistų nustatyti antioksidacinį jų poveikį skirtingais mechanizmais.
1.5. Paprastųjų garţdenių (Lotus corniculatus L.) bendroji charakteristika
1.5.1. L. corniculatus taksonomija ir paplitimas
Paprastieji garţdeniai (Lotus corniculatus L.) yra daugiamečiai ţoliniai augalai, kurie priklauso pupinių (Fabaceae) šeimai, garţdenių genčiai (Lotus). (6 pav.) [21,26]
Pupinių (Fabaceae) arba ankštinių (Leguminosae) šeima yra laikoma trečia pagal skaitlingumą pasaulyje, kuriai priklauso daug svarbių ţydinčių augalų. Pupinių šeimai priklauso apie 730 genčių ir daugiau nei 19 400 rūšių. Daugelis šios šeimos augalų pritaikomi tradicinėje ir šiuolaikinėje medicinoje. Šiuo metu atliekami tyrimai norint įvertinti galimybes ir kitų šios šeimos genčių augalų teikiamas ţaliavas pritaikyti medicinos praktikoje. [38]
6 pav. Paprastieji garždeniai (Lotus corniculatus L.) [47,53]
Garţdenių genčiai (Lotus) priklauso apie 180 rūšių (svarbesnės L. corniculatus, L. japonicus, L. pedunculatus, L. subbiflorus, L. glaber ir kitos). Šios genties augalai gamtoje daţniausiai auga natūraliai (pievose, pakelėse, šlaituose, pagrioviuose), tačiau gali būti ir kultivuojami. Sodinimas į lysves vykdomas pavasarį, tačiau galima sodinti ir rudenį, nes uţtenka laiko augalui vystytis iki šaltojo periodo. [5,13,21]
Garţdeniai yra labai plačiai paplitę ir natūraliai auga beveik visame pasaulyje: įvairiose vietovėse nuo šiaurės Skandinavijos subborealinio ir borealinio (šiaurinio) klimato zonų iki beveik ekvatorinės (pusiaujo) platumos, iškiliose lygumose ir aukštumose. Augalas taip pat paplitęs Pietų ir Šiaurės Amerikos, Australijos ir Naujosios Zelandijos vidutinio klimato regionuose. Platus paprastųjų garţdenių paplitimas nulėmė genetinę jo įvairovę. Manoma, kad ji didţiausia yra Vidurţemio jūros baseine, todėl šis regionas yra itin svarbus genetinių išteklių tyrimams. Lotus genties augalai geriausiai prisitaikę augti vidutinės temperatūros ir vidutinės drėgmės vietovėse. Pasaulyje plačiausiai paplitusi L. corniculatus rūšis. [13,60] Šis augalas priklausomai nuo šalies, kurioje auga, turi daug spalvingų ir skirtingų liaudiškų pavadinimų: paukščių pėdų dobilai (angl. birdsfoot clover), kūdikio šlepetės (angl. baby’s slippers), elnių vikiai (angl. birdfoot deer vetch).[37]
Lietuvoje natūraliai auga trys Lotus rūšys: paprastieji garţdeniai (L. corniculatus), pelkiniai garţdeniai (L. uliginosus) ir siauralapiai garţdeniai (L. tenuis). Savaiminės L. uliginosus ir L. tenuis yra retesnės. Pelkiniai garţdeniai labiau paplitę Baltijos pajūryje, auga šlapiose ir uţpelkėjusiose pievose, krantuose ir šlaituose, durpynuose. Skirtingai nei pelkiniai, siauralapiai garţdeniai auga sausose vietose, ant pylimų ir pakelėse. Lietuvoje, kaip ir visame pasaulyje, labiausiai paplitę – paprastieji garţdeniai, kurie auga pakelėse, šlaituose, ganyklose, pagrioviuose ir pievose. [5,13,21] Latvijos teritorijoje L.corniculatus taip pat labiausiai paplitusi garţdenių rūšis, ypač sausose vietovėse. [64]
Lietuvoje Vokės filialo ţemdirbystės instituto mokslininkas J. Pivoriūnas išvedė naują garţdenių veislę - Gelsvis. Ši veislė yra labai derlinga (vidutinis šieno derlius 6,9 t/ha, sėklų – 200-500
kg/ha) tiek normalioje, tiek rūgščioje dirvoje. Be to, ji yra ilgaamţė, gerai atţelia ir pasiţymi atsparumu šalčiams, sausroms ir ligoms. Gelsvis pradeda ţydėti anksti pavasarį (praţysta daug ankščiau uţ kitas ankštines ţoles), o rudenį vėliau nustoja augti,.[5]
1.5.2. L. corniculatus morfologija ir fitocheminė sudėtis
Paprastieji garţdeniai turi tiesų ar šliauţiantį ţeme, paprastai 10 – 50 cm ilgio, stiebą, kuris yra vientisas, plonas, apvalaus skerspjūvio, apačioje turintis plaukelių. Lapai sudaryti iš penkių lapelių, kurių 2 lapeliai šliejasi prie lapkočio pagrindo ir yra panašūs į stipules, o kiti trys – susigrupavę toliau. Lapai 6-20 mm ilgio ir 2-9 mm pločio, ţalios ar pilkai ţalios spalvos, lygūs, neţymiai dantyti. Ţiedynuose yra po 2-6 ar net 8 ţiedus. Augalai ţydi nuo birţelio iki rugpjūčio mėnesio. Ţiedai sutelkti skėtiškose kekėse, turi ilgus ţiedkočius. Ţiedlapiai nuo geltonos iki vario ar net plytų raudonumo spalvos. Geltoną spalvą lemia augalo kaupiami flavonoidai (dideli kiekiai gosipetino ir kornikulatusino). Taurelę sudaro 5 taurėlapiai, dantyti, lygūs arba šiek tiek plaukuoti. L. corniculatus turi po 5-6 cilindro formos ankštis, kurios yra 15- 30 mm ilgio ir 3 mm skersmens, talpinančios apie 20 sėklų. Ankštys keičia spalvą nuo ţalios iki tamsiai rudos spalvos. Sėklos yra netaisyklingo ovalo formos, taškuotos, blizgios, nuo ţalsvos iki tamsiai rudos spalvos. Šaknis yra šakota, turi pridėtines šaknis ir gumbelius. Dėl gerai išvystytos šaknų sistemos, augalai geba įsisavinti gilesniuose dirvoţemio sluoksniuose esančias maisto medţiagas ir prisitaikyti prie įvairios dirvoţemio sudėties. [5,13,41,50,56] Paprastieji garţdeniai kaip ir kiti Lotus genties augalai patys yra bevaisiai ir turi būti apdulkinami vabzdţių. [50]
L. corniculatus ţaliavose kaupiami kondensuoti taninai, kumarinai, flavonoidai (rutinas, viteksinas kvercetinas, kemferolis, gosipetinas, kornikulatusinas), fenolio rūgštys (benzoinė, p- kumaro), terpenoidai, saponinai (farbitozidas A, sojasaponinas, dehidrosojasaponinas) ir mineralinės medţiagos. [6,21,50,59,60] Sudėtyje esantys kondensuoti taninai suteikia raudoną pigmentaciją šaknų gumbeliams. Lapuose nustatomas didesnis junginių kiekis po ţydėjimo, daţniausiai vidurvasary, palyginus su ūgliais. [13,37] L. corniculatus kaupiamų mineralų sudėtį lemia dirvoţemis ir agronominės savybės, tokios kaip ţolynų ataugimas ir kokybė, ţydėjimo pobūdis. [59,60]
Šeštajam ir septintajam dešimtmetyje (1956 m. Nakaoki ir kiti, 1964 m. Harney ir Grant, 1965 m. Bate-Smith) buvo pradėti L. corniculatus ţaliavose esančių flavonoidų tyrimai. 2003 metais mokslininko Sarelli grupė iš Suomijos nustatė, kad šios rūšies antţeminių dalių ţaliavose butonizacijos ir ţydėjimo fazėse yra nedideli kiekiai izoflavonų (biochanino A ir formononetino). Didţiausi
kvercetino ir kemferolio glikozidų kiekiai buvo nustatyti paprastųjų garţdenių ţieduose, šiek tiek maţesni – lapuose. [50]
1.5.3. L. corniculatus panaudojimo sritys
Paprastieji garţdeniai daţniausiai naudojami ţemės ūkyje kaip pašariniai augalai, turintys didelę maistinę vertę. Jie gyvulių vartojami daţniausiai vegetacijos fazėje ganymosi metu arba laikomi (dţiovinami) šienui ar silosui. Daugiausia vertingų medţiagų sukaupiama prieš vėlyvąją vegetacijos stadiją. [13,26] Lotus genties augalai kaip pašariniai vertinami dėl to, kad gyvuliams nesukelia mitybos sutrikimų, meteorizmo. Šios savybės L. corniculatus ţaliavoms būdingos dėl jose kaupiamų kondensuotųjų taninų, kurie nusodina baltymus, tokiu būdu sumaţindami burbulų formavimąsi didţiajame skrandyje. [21] Karvių, kurios buvo šeriamos L. corniculatus šienu, duodame piene yra nustatoma didesnė koncentracija karotino ir tokoferolio. [56]
Be pritaikymo ţemės ūkyje, paprastieji garţdeniai naudingi ir kitose srityse. Augalai yra atsparūs karščiui, sausrai, šalčiui, drėgmei ir nederlingam dirvoţemiui, pakantūs aliuminio, mangano ir druskos poveikiui. Dėl šių savybių jie tinka kalvoms, šlaitams apţeldinti. [5,13,41] L. corniculatus gerai pakenčia nuganymą ir ilgai išsilaiko ganyklose [5] Šie augalai naudojami kaip bioremediatoriai, nestipriai boru ir selenu uţterštiems dirvoţemiams valyti. Dėl ant šaknų esančių gumbelinių bakterijų dalyvauja azoto fiksacijoje. [13] Lyginant su kitais pupinių šeimos augalais (mėlynţiedė liucerna, dobilų gentimi), paprastieji garţdeniai pasiţymi didesne tolerancija rūgštiniam dirvoţemiui (kurio pH 5 - 7). [5,21]
L. corniculatus ţaliavų fitocheminė sudėtis ir biologinis poveikis nėra plačiai ištirtas. Pastaraisiais metais, remiantis literatūros duomenis, susidomėjimas šiuo augalu didėja ir atliekami vis nauji tyrimai siekiant įvertinti ekstraktų priešgrybelinį, antimikrobinį ir priešuţdegiminį poveikį.
Šiuo metu nustatyta, kad paprastųjų garţdenių metanoliniai ekstraktai pasiţymi priešgrybeliniu poveikiu prieš Alternaria ir Fusarium grybelių rūšis. Nustatyta, kad L. corniculatus ţaliavose kaupiami flavonoidai ir taninai yra atsakingi uţ priešgrybelinį poveikį. [21] 2009 m. Šveicarijoje buvo atliktas tyrimas su pelėmis, siekiant nustatyti priešuţdegiminį šio augalo poveikį. Tyrimo metu naudoti L. corniculatus ekstraktai, ekstrahentu naudojant heksaną, etilo acetatą, n-butanolio ir vandens mišinį. Rezultatai parodė, kad L. corniculatus ekstraktai pasiţymi priešuţdegiminiu aktyvumu slopindami ne tik leukocitus ar jų išsiskyrimą bet ir interleukiną 1β, adenozino deaminazę ir mieloperoksidazę. Manoma, kad uţ šį poveikį yra atsakingi ekstraktų sudėtyje esantys kemferolis, oleonolinė rūgštis ir β-sitosterolis. [30]
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1.Tyrimų objektas
Tyrimo objektas – natūraliai augančių paprastųjų garţdenių (Lotus corniculatus L.) augalinės ţaliavos. Jos buvo surinktos iš 20 skirtingų augaviečių Lietuvos ir Latvijos teritorijose. Mėginiai surinkti masinio ţydėjimo metu 2015 - 2016 m. vasarą (liepos – rugpjūčio mėnesį) (5 lentelė). Iš gamtinių cenopopuliacijų surinkti augalinės ţaliavos mėginiai buvo suskirstyti į lapus, ţiedus ir stiebus, taip buvo gauti trijų augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdţiai.
5 lentelė. Paprastųjų garždenių žaliavų rinkimo data ir vieta Eil. Nr. Ţaliavos rinkimo data Rinkimo vieta Šalis 1 2015-07-21 Kirnaičiai, Joniškio r. Lietuva 2 2015-07-30 Šeduva Lietuva 3 2015-08-02 Telšiai Lietuva 4 2015-07-28 Vilnius (Lazdynėliai) Lietuva 5 2015-08-15 Tauragnai Lietuva 6 2015-08-28 Palanga Lietuva 7 2015-08-10 Panevėţys Lietuva 8 2015-07-31 Rokiškis Lietuva 9 2015-07-29 Anykščiai Lietuva 10 2015-08-10 Naujoji Akmenė Lietuva 11 2015-08-10 Gruzdţiai, Šiaulių r. Lietuva 12 2016-08-20 Teizai, Lazdijų r. Lietuva 13 2016-08-22 Karmėlava, Kauno r. Lietuva 14 2016-07-30 Tauragė Lietuva 15 2015-08-13 Kudirkos Naumiestis, Šakių r. Lietuva 16 2015-07-21 Ryga Latvija 17 2015-07-22 Dobele Latvija 18 2015-07-25 Jelgava Latvija 19 2016-08-01 Talsi Latvija 20 2016-08-02 Engure Latvija
Norint įvertinti fenologinių vystymosi tarpsnių įtaką fenolinių junginių kaupimosi dinamikai ir antioksidacinio poveikio įvairavimui Vytauto Didţiojo universiteto Kauno botanikos sode buvo surinktos L. corniculatus augalinės ţaliavos. Ţaliavą sudarė antţeminės augalo dalys, trijose fenologinėse fazėse: butonizacijos (2016-05-10), masinio ţydėjimo (2016-06-30) ir vaisių susidarymas (2016-08-16).
Surinktos augalinės ţaliavos dţiovintos jas plonai paskleidus ir periodiškai vartant. Patalpa, kurioje dţiovinamos ţaliavos buvo gerai vėdinama, apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdţiovinta paprastųjų garţdenių ţaliava laikoma popierinėse dėţėse, tamsioje ir sausoje vietoje.
2.2.Medţiagos ir reagentai
Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo tirpikliai ir reagentai: išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2009:0008), maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96% (UAB “Stumbras”, Kaunas, Lietuva), 2M Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (,,Sigma –Aldrich“, Šveicarija), 99,5-100,5% natrio karbonatas (,,Sigma – Aldrich“, Prancūzija), ≥ 98% galo rūgšties monohidratas (,,Sigma –Aldrich“, Kinija), ≥ 94% rutino hidratas (,,Sigma – Aldrich“, Vokietija), 100% acto rūgštis (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 95% aliuminio chlorido heksahidratas (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 99,5 proc. metenaminas (,,Sigma – Aldrich“, Rusija), ≥ 97% ferozinas (,,Sigma – Aldrich“, JAV), 99,5% bevandenis geleţies (II) chloridas (,,Alfa Aesar“, Vokietija), 95% DPPH (2,2-deifenil-1-pikrilhidrazilas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), ABTS (2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6- sulfono)) rūgštis (,,Sigma-Aldrich“, Kanada), kalio persulfatas (,,SIAL“, Kanada), troloksas (,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Danija).
2.3. Naudota aparatūra
Ultragarso vonelė– „ElmaSonic S40H“ (U=230V) (gamintojas Elma Schmidbauer (Vokietija)), orbitalinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic (gamintojas IKA-WERKE, Vokietija) ir du spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) bei „Agilent Technologies“ (Cary 60, JAV).
2.4. Tyrimų metodai
2.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas
Tikslus svėrinys 0,100 g L. corniculatus ţaliavos (ţiedų, lapų ar stiebų) uţpilamas 10 ml 70 % (V/V) etanoliu. Ekstraktai ruošiami tamsaus stiklo buteliukuose, po du mėginius iš kiekvienos morfologinės dalies ţaliavos, ją 10 min. veikiant ultragarsu esant 40 °C temperatūrai. Gauti etanoliniai ekstraktai, filtruojami per popierinius filtrus į matavimo cilindrą. Ant filtro esantis ţaliavos likutis praplaunamas 70 % (V/V) etanoliu iki 10 ml. Buvo paruošti 120 L. corniculatus etanolinių ekstraktų (1:100). Analogiškai ruošiami paprastųjų garţdenių skirtingų fenofazių ekstraktai. Smulkinama visa antţeminė dalis ir kiekvienai fazei ruošiami du mėginiai. Taip pagaminti 6 etanoliniai (1:100) ekstraktai.
2.4.2. Reagentų paruošimas
70 proc. (V/V) etanolio - vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 665 ml 96% (V/V) etanolio ir 335 ml išgryninto vandens.
0,2 N Ciocalteu reagentas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 10 ml 2M Folin-Ciocalteu fenolinio reagento praskiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
7,5 proc. (W/V) natrio karbonato (Na2CO3) tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 7,5g bevandenio natrio karbonato tirpinama 100 ml išgryninto vandens.
5 proc. metenamino tirpalas gaminamas 2,5 g metenamino tirpinant 50 ml išgryninto vandens.
33 proc. acto rūgšties tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties skiedţiama vandeniu iki 100 ml ţymos.
10 proc. aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas ruošiamas stiklinėje kolboje 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.
Rutino etanolinis tirpalas gaminamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99% grynumo rutino tirpinant 25 ml 70 % (V/V) etanolio.
2 mM geležies (II) chlorido (FeCl2) tirpalas ruošiamas 0,0063g (tikslus svėrinys) bevandenio FeCl2 tirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas.
5 mM ferozino tirpalas gaminamas 0,0616 g ferozino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml išgryninto vandens.
6×10-5
M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas gaminamas ir laikomas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugančiame nuo šviesos. 0,00118g (tikslus svėrinys) DPPH reagento ištirpinama 50 ml 96% (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas kiekvieną dieną ruošiamas naujas.
ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių tirpinama 50 ml išgryninto vandens, pridedama 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys 15 -16 val. laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Motininis ABTS tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS•+ tirpalą.
2.4.3. L. corniculatus ţaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė
2.4.3.1 Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendrąjį fenolinių junginių kiekį paprastųjų garţdenių augalinėse ţaliavose nustatyti pasirinktas spektrofotometrinis metodas, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Analizei imama 1 ml L.
corniculatus ekstrakto (1:100), kuris sumaišomas su 5 ml 0,2N Folin-Ciocalteu reagento ir (po 3 min.) 4 ml 7,5% (W/V) natrio karbonato tirpalu. Laikoma 60 min tamsoje. Esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru matuojamas optinis tankis. Kaip palyginamasis tirpalas, naudojamas išgrynintas vanduo. Kiekvienas etanolinis ekstraktas - matuojamas maţiausiai po tris kartus.
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) (mg galo rūgšties/g mėginio), remiantis galo rūgšties kalibracine kreive (7 pav.) ir naudojant formulę:
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml); V - pagaminto ekstrakto kiekis (ml); m - atsvertas ţaliavos kiekis (g).
7 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)
2.4.3.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas
Suminis flavonoidų kiekis L. corniculatus etanoliniuose ekstraktuose nustatomas acto rūgštimi (CH3COOH) parūgštintoje aplinkoje, veikiant su aliuminio chlorido (AlCl3) ir metenamino
tirpalais. Analizės metu į 25 ml matavimo kolbutės ruošiami tiriamasis ir lyginamasis tirpalai.
Tiriamajam tirpalui imamas 1 ml paprastųjų garţdenių ekstrakto, įpilama 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33 % CH3COOH, 1,5 ml 10 % AlCl3 ir 2 ml 5 % metenamino tirpalo. Pagamintas
Palyginamajam tirpalui taip pat imamas 1 ml L. corniculatus etanolinio ekstrakto (1:100), pridedama 10 ml 96 % etanolio ir 0,5 ml 33 % CH3COOH tirpalo, o tada mišinys skiedţiamas
distiliuotu vandeniu iki 25 ml ţymės, sumaišoma. Esant 475 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru matuojamas tiriamojo tirpalo optinis tankis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu. Kiekvienas etanolinis ekstraktas - matuojamas maţiausiai po tris kartus.
Bendras flavonoidų kiekis įvertinamas gautą absorbcijos dydį lyginant su etaloninio tirpalo absorbcijos dydţiu. Etaloninis ir palyginamasis rutino tirpalas gaminamas vietoj 1 ml ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) (mg rutino/ml ekstrakto), naudojant formulę:
mR – rutino masė (g), sunaudota etaloniniam rutino tirpalui gaminti;
A – tiriamojo tirpalo (ekstrakto) absorbcijos dydis; V – ekstrakto tūris (ml);
m – atsvertas ţaliavos kiekis (g);
AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
VR – etaloninio rutino tirpalo tūris, ml.
2.4.3.3 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe
2+jonų
sujungimo metodu
Ekstraktuose esančių junginių gebėjimas sudaryti chelatinius kompleksus su pereinamaisiais metalais vertinamas spektrofotometru matuojant Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumaţėjimą, esant 562 nm šviesos bangos ilgiui. Analizei imamas 1 ml L. corniculatus tiriamojo ekstrakto (1:200) ir sumaišomas su 50 μl 2mM FeCl2 tirpalo, o po 5 min reakcija inicijuojama 0,2 ml 5mM ferozino
tirpalu. Sumaišoma ir paliekama 10 min pastovėti. Esant 562 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru matuojama reakcijos mišinio absorbcija. Kartu ruošiamas tuščias bandinys: 1 ml 70% (V/V) etanolio sumaišoma su 50 μl 2mM FeCl2 ir 0,2 ml 5mM ferozino tirpalu. Kaip
palyginamasis tirpalas naudojamas 70 % (V/V) etanolis. Kiekvienas ekstraktas tiriamas maţiausiai po tris kartus. Tiriamo ekstrakto chelatinis aktyvumas išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamos pagal formulę:
Aa – su tiriamuoju ekstraktu bandinio adsorbcijos dydis;
Ab - tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).
2.4.3.4 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų
surišimo metodu
Antioksidaciniam aktyvumo įvertinti pasirinktas DPPH radikalų surišimo metodas, kuris pagrįstas elektronų perdavimo reakcijomis. Imama 50 μl L. corniculatus etanolinio ekstrakto (1:100) ir sumaišoma su 2 ml 6×10-5
M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilo) tirpalo. Kartu ruošiamas tuščias bandinys: 50 μl 70 % (V/V) vandens-etanolio mišinio sumaišoma su 2 ml 6×10-5 M DPPH tirpalu. Esant 515 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydţio maţėjimas, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 30 min.). Antiradikalinis tiriamų ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę:
Aa – su tiriamuoju ekstraktu bandinio adsorbcijos dydis (t = 30 min);
Ab - tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).
2.4.3.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS
•+metodu
Antiradikalinio aktyvumo nustatymui pasirinktas ABTS radikalo sujungimo metodas. Tamsaus stiklo buteliuke gaminamas 2mM motininis ABTS (2,2„-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgšties tirpalas: sveriama 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS reagento, kuris ištirpinamas 50 ml išgryninto vandens. Šis motininis tirpalas aktyvuojamas 70 mM kalio persulfato tirpalu, sumaišomas ir 15-16 val. paliekamas stovėti tamsioje vietoje, kol pasiekiama reakcijos pusiausvyra.
Motininis ABTS tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS•+ tirpalą, kurio absorbcija, esant 734 nm bangos ilgiui, yra 0,800 ± 0,030. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.
Į kiuvetę įpilama 3,0 ml darbinio ABTS•+ tirpalo ir 30 μl tiriamojo (1:100) paprastųjų garţdenių ekstrakto. Pagamintas mišinys 60 min laikomas kambario temperatūroje. Esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru nustatomas tiriamojo mėginio absorbcijos kitimas.
Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui ţaliavos, remiantis trolokso kalibracine kreive (8 pav.) ir naudojant formulę:
c – trolokso koncentracija, remiantis kalibracijos kreive (µmol/l); V - pagaminto ekstrakto kiekis (ml);
m - atsvertas ţaliavos kiekis (g).
8 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų-katijonų sujungimo metodu (n=3)
Trolokso kalibracinė kreivė sudaroma ruošiant septynių skirtingų koncentracijų trolokso tirpalus. Motininis trolokso tirpalas ruošiamas sveriant tikslų (g) trolokso svėrinį ir jį tirpinant 70 % etanolyje. Iš pagaminto motininio tirpalo ruošiami 250-6000 μmol/l koncentracijų tirpalai ir atliekamas ABTS tyrimas. Išmatavus skirtingų koncentracijų tirpalų absorbcijos reikšmės, sudaroma trolokso kalibracinė kreivė (8 pav.).
2.5. Duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta su „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir SPSS 20 (SPSS Inc., JAV) kompiuterinėmis programomis, o jų grafinis vaizdavimas - su „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa. Visi atlikti tyrimai buvo kartoti po tris kartus ir išvestas gautų rezultatų matematinis vidurkis. Duomenų statistiniam įvertinimui taip pat apskaičiuotas vidurkis, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida ir variacijos koeficientas. Tiesinės regresijos modelio tinkamumui apskaičiuotas determinacijos koeficientas R2
. Parinktas reikšmingumo lygmuo 0,05, vadinasi, rezultatai bus laikomi statistiškai reikšmingais, jei p<0,05. Koreliacinių ryšių įvertinimas atliktas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą.
