LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
INGRIDA MELKŪNIENĖ
PIENO BAKTERINIO UŽTERŠTUMO NUSTATYMAS Determination of milk bacterial contamination
Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Jūratė Šiugždaitė
DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Pieno bakterinio užterštumo nustatymas”.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas,
pavardė)
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)
Turinys
Santrumpos ... 5 Santrauka ... 6 Summary ... 7 Įvadas ... 8 I.LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Pieno gamyba ir plėtra ... 10
1.2 Mikroorganizmų charakteristika ... 11
1.3 Žalio pieno užkrėtimas bakterijomis ... 11
1.4 Bakterijų paplitimas piene ir jo produktuose ... 12
1.5 Pieno mikrobiologinė kokybė ... 14
1.6 Žalio pieno mikrofloros apibūdinimas ... 14
1.7 Teisės aktai reglamentuojantys maisto produktų saugą ... 15
II. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI ... 19
2.1 Bendro bakterinio užterštumo nustatymas ... 19
2.2 Enterobakterijų skaičiaus nustatymas ... 21
2.3 Escherichia coli išskyrimas ... 21
2.4 Staphylococcus aureus išskyrimas ... 21
2.4 Staphylococcus aureus nustatymas PGR metodu ... 22
2.5 Duomenų statistinė analizė ... 22
III. REZULTATAI ... 23
3.1 Pieno bendras bakterinis užterštumas ... 23
3.2 Pasterizuoto pieno bakterinis užterštumas ... 28
3.3 Enterobakterijų skaičius piene ... 28
3.4 Enterobakterijų skaičius pasterizuotame piene ... 30
3.5 Sezoniškumo įtaka pieno bakteriniam užterštumui ... 30
3.6 Staphylococcus aureus piene ... 32
IV. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
Santrumpos
BMS bendras mikroorganizmų skaičius
bp bazinės poros
BPA Baird-Parker agar
E.coli Escherichia coli
EaggEC enteroagregacinės Escherichia coli
EHEC enterohemoraginės Escherichia coli
EIEC enteroinvazinės Escherichia coli
EPEC enteropatogeninės Escherichia coli
ETEC enterotoksinės Escherichia coli
KSV/ml kolonijas sudarantys vienetai/ mililitre
L.monocytogenes Listeria monocytogenes
Mac agaras MacConkey
min minutė
MP agaras Milk plate count agar
PGR polimerazės grandininė reakcija
s sekundė
S.aureus Staphylococcus aureus
spp. po šeimos ar genties pavadinimo vartojamas pažymėti visas toje šeimoje ar gentyje esančias migruojančias rūšis
TBX terpė Tryptone Bil X - glucuronide
Santrauka
Maisto produktų bakterinis užterštumas yra labai svarbi ir aktuali tema, ypač šiuo metu, kai žmonės grįžta prie natūralaus maisto. Nors maisto produktų saugą reglamentuoja ne vienas teisės aktas, tačiau dėl bakterinės maisto produktų taršos, vis dar kyla dideli epidemijų protrūkiai, kurie sukelia sveikatos sutrikimus tūkstančiams žmonių visame pasaulyje.
Darbo tikslas: nustatyti karvių žalio ir pasterizuoto pieno bakterinį užterštumą.
Rezultatai: Surinkus žalio ir pasterizuoto pieno mėginius iš skirtingų prekybos vietų ir atlikus tyrimus, nustatyta, kad 44 proc. žalio pieno mėginių viršijo didžiausią leistiną bakterinio užterštumo lygį (EB Nr. 853/2004). Tuo tarpu, nei vienas pasterizuoto pieno mėginys neviršijo leistinos EB Nr. 853/2004 ribos. Palyginus žalio pieno bakterinį užterštumą tarp skirtingų prekybos vietų nustatėme, kad didžiausias užterštumas buvo mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja savo reikmėms. Vidutiniškai užteršti – iš ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda, o mažiausiai užteršti mėginiai, imti iš prekybos centruose, esančių automatinių pieno aparatų. Gauti rezultatai parodė, kad 50 proc. žalio pieno mėginių buvo užteršti S. aureus bakterijomis. Nei vienas mėginys neviršijo nustatytos leistinos normos pagal HN 26:2006 „Maisto produktų mikrobiologiniai kriterijai”. Tuo tarpu nei viename pasterizuoto pieno mėginyje S. aureus bakterijos nebuvo išskirtos. Escherichia coli bakterijos nei viename žalio pieno bei pasterizuoto pieno mėginyje nebuvo identifikuotos. Atlikus gautų rezultatų analizę ir įvertinus bakterinio užterštumo sezoniškumą, nustatyta, kad didžiausias bendras bakterijų skaičius buvo pavasario metu, mažiausias – rudenio metu (P=0.11). Daugiausiai enterobakterijų pieno mėginiuose nustatyta vasaros metu, mažiausiai – rudenį (P=0.01).
Magistro baigiamasis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos Akademijoje, Užkrečiamųjų ligų katedroje, mikrobiologijos laboratorijoje. Darbe pateikta 7 lentelės ir 11 paveikslų.
Summary
Bacterial contamination of food products is a very important and relevant topic, especially nowadays, when people are beginning to use natural food again. Although food safety is regulated by more than one legal act, however, due to bacterial contamination of food, there is a large epidemic outbreak, causing health problems for thousands of people around the world.
Objective: to determine bacterial contamination of raw and pasteurized cow milk.
Results: After collecting samples and carrying out researches of raw and pasteurized milk from different markets, it is determined that 44 % of raw milk samples has exceeded the maximum allowable level of bacterial contamination (EB Nr. 853/2004). Meanwhile none of the samples of pasteurized milk exceeded allowable limits (EB Nr. 853/2004). Comparing bacterial contamination of raw milk between different markets we determined that the highest contamination was found in samples from farmers, who consume production for their own needs. On average contaminated samples was taken from farmers who sells their production. The lowest contamination was found in samples from automatic milk machines from supermarkets. The results showed that 50 % of the raw milk samples were contaminated with S. aureus bacteria. None of samples exceeded the limit laid down in accordance with the HN 26: 2006 "Microbiological criteria for foods". Meanwhile in pasteurized milk samples S. aureus bacteria were not found. Escherichia coli bacteria were not identified in any milk sample (raw or pasteurized). After analysis of the results and evaluating seasonality of bacterial contamination, it is determined that the highest total amount of bacteria were in spring, and the lowest in autumn (P=0.11). The highest amount of Enterobacteriaceae in milk samples were determined in summer time, and the lowest in autumn (P=0.01).
Master thesis carried out in the Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Department of infectious diseases, microbiologic laboratory. The paper contains 7 tables and 11 figures.
Įvadas
Maisto produktų bakterinis užterštumas yra labai svarbi ir aktuali tema, ypač šiuo metu, kai žmonės grįžta prie natūralaus maisto. Nors maisto produktų saugą reglamentuoja ne vienas teisės aktas, tačiau dėl bakterinės maisto produktų taršos vis dar kyla dideli epidemijų protrūkiai, kurie sukelia sveikatos sutrikimus tūkstančiams žmonių visame pasaulyje.
Pasak Park MS., ir kitų (2014) bakterinis užterštumas turi būti reguliariai stebimas ir turi būti atliekami maisto produktų mikrobiologiniai tyrimai. Taip pat nuolat gerinamas sanitarijos lygis, darbuotojai turi būti šviečiami apie asmens, aplinkos higieną, prevenciją kryžminei taršai, ingridientų kontrolę, tam, kad žingsnis po žingsnio būtų galima iki minimumo sumažinti apsinuodijimo maistu riziką.
Nors vis daugiau žmonių grįžta prie natūralaus maisto (žaliavalgystė, pačių užaugintos daržovės bei gyvuliai, natūralus karvės pienas), tikėdami, kad taip pagerins savo savijautą ir sveikatos būklę (išvengs įvairių ligų), tačiau visada išlieka didelė rizika, kad trūkstant informacijos ir žinių, kaip tinkamai apdoroti maisto produktus ir apsaugoti savo sveikatą, kils dideli epideminiai protrūkiai. Daugybei žmonių kils pavojus susirgti įvairiomis gastroinfekcijomis. Pasak Akya A., ir kitų (2013) žalia mėsa ir mėsos produktai kelia didžiausią riziką, nes yra labiausiai užteršti, tačiau pienas ir pieno produktai paprastai užima antrąją vietą pagal bakterinį užterštumą.
Ir nors šiuo metu stengiamasi grįžti prie žalių maisto produktų, kuo mažiau maisto produktus apdoroti, kad kiek įmanoma daugiau organizmas gautų naudingų vitaminų, mineralinių medžiagų, kad visos reikalingos medžiagos būtų kiek įmanoma labiau pasisavinamos organizmo, tačiau atlikti tyrimai rodo, kad nenaudojant jokių terminių apdorojimų, rizikuojame savo ir kitų sveikata, nes vis dar nėra pasiektas aukštas higienos ir sanitarijos lygis. Žmonės per mažai žino apie jiems gręsiančias sveikatos problemas. Kamana O., ir kiti (2014), atlikę pieno mikrobiologinius tyrimus nustatė, kad žalias pienas ir pieno produktai (pagaminti iš žalio pieno) net ir tie, kurie parduodami prekybos centruose, yra labai užteršti ir jų kokybė nuolat kinta. Tuo tarpu pasterizuotas pienas yra daug saugesnis bakterinio užterštumo atžvilgiu. Po pasterizacijos bakterijų kiekiai žaliavoje labai sumažėja. Kartu žmonės yra apsaugomi nuo didelės rizikos susirgti įvairiomis ligomis.
Maisto produktų bakterinis užterštumas yra didelis, o tai sukelia itin didelį pavojų žmonių sveikatai. Šiuo metu ypač padaugėjo perkančiųjų žalią pieną, ir dažnai toks pienas nėra virinamas,
todėl mūsų baigiamojo darbo tema ir yra susijusi su žalio ir pasterizuoto pieno bakteriniu užterštumu.
Mūsų darbo tikslas – nustatyti karvių žalio ir pasterizuoto pieno bakterinį užterštumą. Darbo tikslui pasiekti buvo suformuluoti šie uždaviniai:
1. Ištirti žalią ir pasterizuotą pieną iš skirtingų prekybos vietų ir nustatyti bendrą bakterinį užterštumą.
2. Ištirti žalią ir pasterizuotą pieną iš skirtingų prekybos vietų ir nustatyti enterobakterijų skaičių.
3. Įvertinti žalio ir pasterizuoto pieno užsiteršimą Staphylococcus aureus ir Escherichia coli. 4. Įvertinti bakterinio užterštumo sezoniškumą žaliame piene.
I.LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pieno gamyba ir plėtra
Karvių pienas yra labai maistingas, jame yra lipidų, baltymų (kazeino, išrūgų baltymų), angliavandenių (laktozės), amino rūgščių, vitaminų bei mineralinių medžiagų (kalcio). Jis yra svarbus subalansuotai mitybai. Tačiau dėl savo maistinių savybių, pienas yra itin gera terpė vystytis ir augti įvairiems mikroorganizmams (tarp jų ir patogenams) (Hill et al., 2012).
Pieno bei pieno produktų mikrobiologinis užterštumas dažniausiai atsiranda dėl perdirbimo, tvarkymo procesų, taip pat dėl nehigieniškų sąlygų. E. coli bakterijų buvimas piene rodo enteropatogeninių mikroorganizmų buvimą juose, kuris kelia grėsmę visuomenės sveikaitai. Tai gali sukelti stiprų viduriavimą, vėmimą. Tuo tarpu S. aureus buvimas piene ir jo produktuose kelia pavojų susirgti įvairiomis odos infekcijomis, taip pat gali sukelti toksinio šoko sindromą, abscesus, mirtinas ligas, tokias kaip pneumonija, meningitas, endokarditas ir sepsis (Singh et al., 2008).
Lietuvoje pieno gamybos sektorius yra vienas didžiausių žemės ūkyje. 2008 metais pienas sudarė 24,4 proc. žemės ūkio produkcijos. Perdirbusi daug žaliavos, pieno pramonė pagamina daug pieno produktų, iš kurių net apie 50 proc. realizuoja užsienio rinkose (1 lentelė)(Mikelionytė irk t., 2009).
1 lentelė. Pagrindinių pieno produktų gamyba 2008m. ir 2009m., tūkst.t (Mikelionytė ir kt., 2009).
Pieno produktai 2008 2009 Pokytis
proc. Geriamasis pienas 70,2 75,8 8 Rūgpienis, kefyras 29,2 28,6 -2 Jogurtas 11,6 11,2 -3 Grietinė 21,6 22 2 Varškė 17,3 17,4 1 Sviestas 6,5 9,9 52 Sūris 66,7 58,2 -13
1.2 Mikroorganizmų charakteristika
Escherichia coli. Tai gramneigiamos enterobakterinių šeimai priklausanšios, sporų
nesudarančios lazdelės. Yra žinoma patogeninės E. coli: ETEC, EPEC, EIEC, EHEC, EAggEC ir DAEC (Marks et al., 2011). Enteropatogeninės E. coli dažnai mažiems vaikams sukelia viduriavimą (Ochoa et al., 2011). Ši bakterija yra žmonių ir gyvūnų normali žarnyno mikroflora, tačiau kartu gali būti mirtinu patogenu. Daugelis E. coli kamienų sukelia įvairius žarnyno sutrikimus (Kaper et al., 2004). Vokietija 2011 metais patyrė visoje istorijoje didžiausią protrūkį, susijusį su Šiga toksinus gaminančiomis E. coli padermėmis. Tinkamas atsekamumas, padėjo greitai išsiaiškinti tikrąją protrūkio priežastį. E. coli plinta fekaliniu – oraliniu, bei tiesioginio kontakto metu (Muniesa et al., 2012). Šiga toksiną gaminančios E. coli sukelia gastroenteritus ir kraujingą viduriavimą, taip pat gali sukelti sunkias ligas, tokias kaip hemolizinis ureminis sindromas (Lienemann et al., 2012).
Staphylococcus aureus. Tai gramteigiami sferiniai kokai, kurių ląstelės, mikroskopuojant
primena „vynuogių kekes“. Šių bakterijų yra žmonių nosies gleivinėje bei ant odos. Staphylococcus
aureus sukelia įvairias infekcijas. Jos pasitaiko nuo 20 iki 50 atvejų/ 100000 gyventojų per metus.
Apie 10 – 30 proc. pacientų nuo šios infekcijos miršta. Dėl Staphylococcus aureus sukeliamos infekcijos žmonės miršta dažniau nei nuo AIDS ar hepatito viruso. Labiausiai šiai infekcijai jautrūs vyresnio amžiaus žmonės bei kūdikiai. Kaip sanitarinės būsenos indikatoriai jie aktualūs tuose technologinio proceso etapuose, kur betarpiškai produkcija liečiasi su darbuotojais ar oru (van Hal et al., 2012). Šis mikroorganizmas sukelia klinikinį ir slaptą mastitą (Azizoglu et al., 2012).
Staphylococcus aureus yra atsparus daugeliui antibiotikų. Meticilinui atsparūs S. aureus kelia
didelių sunkumų sveikatos priežiūros įstaigose jau daugiau nei 40 metų. Japonijoje 2000 metais S.
aureus per pieną sukėlė >13,000 didelių maisto intoksikacijų protrūkių (Doyle et al., 2012). S. aureus yra vienas iš pagrindinių mastito sukėlėjų. Šis patogenas žmonėms tampa pavojingas ir gali
sukelti įvairius sveikatos sutrikimus, kai jo koncentracija piene viršija 105 KSV/ml (Hill et al., 2012).
1.3 Žalio pieno užkrėtimas bakterijomis
Pienas, sintetinamas pieno liaukose ir yra beveik sterilus, kol yra išsiskiriamas į tešmenį alveolėmis. Vėlesniame pieno gamybos etape, bakterinis užterštumas gali atsirasti dėl: nešvaraus tešmens, naudojant pieno tvarkymo bei saugojimo įrangą, nepakankamai ją plaunant ir
dezinfekuojant. Karvės sveikata, aplinka, melžimo būdas, įrangos higieniškumas gali įtakoti bakterinės taršos lygį piene. Taip pat yra svarbu pieno laikymo temperatūra bei sandėliavimo trukmė iki tol, kol pienas yra realizuojamas. Visi šie veiksniai veikia bendrą bakterijų skaičių ir bakterijų rūšių atsiradimą (Wallace, 2008).
1.4 Bakterijų paplitimas piene ir jo produktuose
Tyrimas atliktas Irane 2014 metais. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti S. aureus paplitimą piene ir bakterijų atsparumą antibiotikams. S. aureus nustatytas 43 iš 207 (20,1 proc.) pieno mėginiuose. 5 iš 43 pieno mėginių S. aureus buvo atsparus meticilinui (Jamali et al., 2014).
Tyrimai atlikti Kinijoje, 2014 metais, parodė, kad S. aureus yra pagrindinė priežastis, dėl ko pasireiškia galvijų mastitas bei sutrikdoma žmonių sveikata. Šiuo metu vis labiau plinta S. aureus, kurie yra atsparūs meticilinui. 103 mėginiuose išskirta S. aureus, iš jų 49 (47,6 proc.) mėginiuose nustatyti meticilinui atsparūs S. aureus (Pu et al., 2014).
Dėl vis didėjančios maisto paklausos tarp Afrikos gyventojų, pienas tampas vienas iš svarbiausių maisto produktų, kuris yra itin vertingas ir maistingas. Dėl šios priežasties buvo atlikti mikrobiologiniai pieno tyrimai. Daugumos žalio pieno mėginių kokybė buvo patenkinama. Buvo išskirta E. coli, S. aureus, Salmonella spp., ir Listeria monocytogenes. Iš visų tirtų mėginių, 5,2 proc. mėginių išskirta būtent Salmonella spp. Žalias pienas buvo kur kas prastesnės kokybės, lyginant su prekybos centruose parduodamu pasterizuotu pienu (Kamana et al., 2014).
Brazilijoje 2014 metais, siekiant įvertinti S. aureus paplitimą ir atsiradimo priežastis piene buvo surinkti 849 mėginiai: 220 pieno mėginių, 120 mėginių iš pieno talpyklų, 389 mėginiai nuo melžimo aparatų ir indų, bei 120 mėginių nuo melžėjų bei pieno tvarkytojų rankų. 45 proc. mėginių buvo išskirta S. aureus. Tyrimai parodė, kad daugiausiai šios bakterijos aptinkamos dėl prastos higienos melžimo bei laikymo metu (Lee et al., 2014).
Irane buvo atliekami tyrimai, siekiant ištirti žalio ir pasterizuoto pieno užterštumą bakterijomis. Iš viso paimta 100 pasterizuoto ir 100 žalio pieno mėginiai iš 4 pieno ūkių, prekybos centrų ir vertinama E. coli, S. aureus, L. monocytogenes. Žalio pieno 42 mėginiuose išskirta E. coli, 36 mėginiuose – koliformai, 22 mėginiuose – S. aureus. Pasterizuoto pieno 9 mėginiuose išskirta E.
Pieno mėginiuose išaugus E. coli, daroma prielaida, kad pienas yra užterštas nuotekomis ar/ir išmatomis (Vahedi et al., 2013).
Jungtinėse Amerikos Valstijose buvo tiriami žalio pieno mėginiai, norit nustatyti jų kokybinius, kiekybinius požymius, bei bakterinį užterštumą. Buvo nustatoma bendras mikroorganizmų skaičius, E. coli, S. aureus. Iš viso buvo ištirta 214 mėginių. E. coli O157: H7 buvo aptikta 3,79 - 9,05 proc. mėginių (Jackson et al., 2012).
Siekiant išsiaiškinti Staphylococcus aureus paplitimą piene bei jo produktuose, buvo ištirta 122 mėginiai, iš jų 60 žalio pieno, 32 balto sūrio, 10 kashar sūrio, 10 sviesto ir 10 šaldytų ledų mėginių. Tyrimas buvo atliekamas Turkijoje, Samsun provincijoje. Atlikus tyrimus paaiškėjo, kad
S. aureus buvo aptikta 64 mėginiuose, iš jų - žalio pieno 45 mėginiuose (75 proc.), balto sūrio 12
mėginių (37,5 proc.), kashar sūrio 3 mėginiuose (30 proc.), sviesto 3 mėginiuose (30 proc.), ir 1 ledų mėginyje (10 proc.). Staphylococcus aureus buvo nustatomas PGR metodu (Gücükoğlu et al., 2012).
Brazilijoje neperdirbtas pienas yra reguliariai vartojamas vietos gyventojų, todėl buvo atliekami tyrimai, siekiant nustatyti Staphylococcus aureus paplitimą žaliame piene. Buvo paimta 220 pieno mėginių, iš kurių 120 buvo paimta iš pieno cisternų supirkimo vietose, taip pat iš pieno indų, ir nuo melžėjų rankų. Atlikus tyrimus buvo nustatyta, kad S. aureus išskirtas iš 14 mėginių (3,6 proc.) paimtų iš pieno cisternų, 4 mėginiuose nuo melžėjų rankų (3,3 proc.). Šio tyrimo rezultatai rodo, kad retai, tačiau S. aureus žaliame piene atsiranda ir dėl nepakankamo higienos laikymosi melžimo metu, ir dėl netinkamos asmens higienos (Lee et al., 2012).
Naujojoje Zelandijoje buvo tiriamas žaliavinis pienas iš surinkimo cisternų, siekiant išsiaiškinti pieno mikrobiologinį užterštumą. Buvo nustatomas bendras mikroorganizmų skaičius, taip pat E. coli, S. aureus, Salmonella spp., Campylobacter spp. Mėginiai buvo imami kiekvieną mėnesį vienerius metus. Pasibaigus tyrimams, nei viename mėginyje nebuvo aptikta Salmonella spp. ir Campylobacter spp. bakterijų, tuo tarpu S. aureus buvo aptikta 263 mėginiuose, E. coli nustatyta 292 mėginiuose. Gavus tokius pavojų keliančius rezultatus, pienas buvo pasterizuojamas ir dar kartą tiriamas. Paaiškėjo, kad ir po pasterizacijos 2,4 proc. mėginių, buvo aptinkamos E. coli bakterijos (E. coli O157: H7) (Hill et al., 2012).
Norvegijoje buvo tiriamas karvių ir ožkų pienas, siekiant nustatyti jų mikrobiologinį užterštumą. S. aureus bakterijos buvo aptiktos 47,3 proc. karvių pieno mėginiuose, ir 98,8 proc. ožkų pieno mėginiuose. Iš pieno mėginių buvo gaminamas varškės sūris ir tiriama užterštumo padidėjimas. Atlikti tyrimai parodė, kad didžiausias užterštumas S. aureus buvo pasiektas
mėginiuose (tiek iš ožkų, tiek iš karvių pieno, pagamintuose varškės sūriuose) po 5-6 valandų (po pirmojo spaudimo). Kartu buvo tiriama ir L. monocytogenes, tačiau šios bakterijos buvo rastos tik viename karvių pieno mėginyje, tuo tarpu ožkų pienas šių bakterijų atžvilgiu buvo švarus. Šie atlikti tyrimai, parodė žalio pieno higieninę būklę (Jakobsen et al., 2011).
1.5 Pieno mikrobiologinė kokybė
Pieno pramonėje pagal dabartines pasterizavimo sąlygas (15 s esant 72°C) ir laikantis sanitarinių standartų reikalavimų, gaunamas saugus produktas. Tačiau esant didelei rinkos konkurencijai vis dar reikia gerinti produktų kokybę ir pratęsti pieno produktų galiojimo laiką.
Atliekami įvairūs tyrimai, siekiant įvertinti naujas galimybes, apdorojimo būdus, tam, kad būtų sumažinamas pieno bakterinis užterštumas bei prailginamas galiojimo terminas. Šiuo tikslu, žalias pienas apdorojamas UV nuolatinio srauto sistema, esant 254 nm bangos ilgiui. Po tokio apdorojimo, pienas laikomas skirtingose temperatūrose (4 ir 7°C) ir kas savaitę (5 savaites) nustatomas bendras bakterijų skaičius. Gauti tyrimai rodo, kad pieno mėginiuose, kurie buvo apdoroti UV spinduliais, lyginant su kontroliniais mėginiais, bakterijų skaičius buvo žymiai mažesnis (Rossitto et al., 2012).
1.6 Žalio pieno mikrofloros apibūdinimas
Šiuo metu tampa ypač populiaru grįžti prie natūralių, saugių sveikatai produktų. Todėl kartu populiarėja ir žalio pieno vartojimas. Tačiau vartojant žalią pieną yra pavojus užsikrėsti įvairiomis infekcijomis, kurias sukelia Campylobacter, Salmonella spp., taip pat E. coli bakterijos. Pramoninėse šalyse dėl žalio pieno vartojimo pasireiškė per maistą plintančių ligų protrūkiai (jie sudarė 2 – 6 proc., iš jų 39,1 proc. sukėlė pieno vartojimas, 53,1 proc. sūrio vartojimas, 7,8 proc. - kitų pieno produktų vartojimas). Tuo tarpu iki 1938 m. maždaug 25 proc. visų per maistą plintančių ligų protrūkius JAV sukeldavo žalio pieno vartojimas (Claeys et al., 2013).
Žalio pieno vartojimas apima du aspektus: pirmiausiai tai yra patogenų plitimo šaltinis, tačiau tuo pačiu žalio pieno vartojimas svarbus maistingumi ir sveikatingumo aspektu. Tačiau siekiant užtikrinti savo saugumą ir pratęsti pieno galiojimo laiką, jis turi būti termiškai apdorojamas
Šiuo metu europoje žalio karvės pieno mikrobiologiniai kriterijai yra ≤ 100 000 KSV/ml bakterijų kaip numatyta Reglamente (EB) 853/2004, kuris nustato specialias higienos taisykles, dėl maisto produktų higienos. Šiame reglamente numatyta taip pat ir reikalavimai produkcijai, higienos reikalavimai pieno gamybos ūkiuose (pvz., patalpoms, įrangai, melžimo ir pieno surinkimo įrangai, transportui, personalui). Žalias pienas, skirtas vartoti žmonėms, turi atitikti Bendrojo maisto įstatymo (Reglamentas (EB) 178/2002) reikalavimus (2 lentelė)(Claeys et al., 2013).
2 lentelė. Patogenų patekimas į žalią pieną (Claeys et al., 2013).
Patogeniniai mikroorganizmai Tiesioginis perėjimas iš kraujo į pieną Mastito atvejis Fekalinis užterštumas (užterštumas po melžimo, nuo odos ir kt.) Aplinkos šaltiniai Salmonella spp. (x) (S. Dublin) (x) x x Brucella abortus x (x) x Listeria monocytogenes x x x x E. coli x x Staphylococcus aureus x x Bacillus cereus x
Lentelėje (2 lentelė) pateiktas patogeninių bakterijų sąrašas, kurios gali būti žaliame karvės piene, bei būti taršos šaltiniu. Tiesiogiai iš kraujo į pieną gali patekti Brucella abortus ir Listeria
monocytogenes, retai Salmonella spp., (dažniausiai S. Dublin),. Kai karvė serga mastitu, į pieną
gali patekti Listeria monocytogenes ar Staphylococcus aureus, retai Salmonella spp., ir Brucella
abortus. Esant fekaliniam užterštumui, piene aptinkamos Salmonella spp., Listeria monocytogenes
bei Escherichia coli.
1.7 Teisės aktai reglamentuojantys maisto produktų saugą
Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 854/2004, nustatantis specialiąsias gyvūninės kilmės produktų, skirtų vartoti žmonėms, oficialios kontrolės taisykles. IV priede numatyti reikalavimai pieno gamybos įmonių kontrolei. Numatyta, kad pieno gamybos ūkiuose
esantiems gyvūnams turi būti taikoma oficiali kontrolė, siekiant patikrinti, ar laikomasi žalio maisto gamybai ir ypač gyvūnų sveikatos būklei bei veterinarinių priemonių vartojimui taikomų reikalavimų. Ši kontrolė gali būti vykdoma įgaliotojo veterinarijos gydytojo veterinarinių patikrinimų metu, vadovaujantis Bendrijos nuostatomis, reglamentuojančiomis gyvūnų ar visuomenės sveikatą arba gyvūnų gerovę. Taip pat jeigu yra priežasčių įtarti, kad nesilaikoma gyvūnų sveikatai taikomų reikalavimų, turi būti patikrinta bendra gyvūnų sveikatos būklė.
Reglamento (EB) Nr. 853/2004 I priedo 4.1 punkte „žalias pienas“ apibrėžiamas kaip „pienas, gautas iš ūkiuose auginamų gyvūnų pieno liaukų sekrecijos būdu”. Todėl ši apibrėžtis apima ir kitus gyvūnus nei įprastos pieninių gyvūnų rūšys (karvės, avys ir ožkos).
Reglamente (EB) Nr. 178/2002, 4 skirsnyje, 14 straipsnyje nustatyta maisto saugos reikalavimai, kurie nurodo, kad nesaugus maistas į rinką nepateikiamas. Maistas laikomas nesaugus, jei manoma, kad jis:
a) kenkia sveikatai;
b) netinka žmonėms vartoti.
Taip pat nurodoma, kad turi būti galimybė visuose gamybos, perdirbimo ir paskirstymo etapuose atsekti maisto produktą, pašarą, maistui skirtą gyvūną ir kitas medžiagas, skirtas arba reikalaujamas dėti į maistą ar pašarą.
Lietuvos higienos normoje HN 26:2006 “Maisto produktų mikrobiologiniai kriterijai”, nurodyta pieno ir pieno produktų mikrobiologiniai kriterijai (3 lentelė).
3 lentelė. Pieno ir pieno produktų mikrobiologiniai kriterijai
Maisto produkto pavadinimas Mikroorganizmai Mėginio vienetų skaičius Užterštumo riba n c m M 1 2 3 4 5 6
1. Žalias karvių, ožkų ir avių pienas, skirtas tiesiogiai vartoti ir gaminti pieno produktams be šiluminio apdorojimo Koagulazę gaminantys stafilokokai (S. aureus) 5 2 500 ksv/ml 2000 ksv/ml
Salmonella 5 0 25 ml neturi būti
2. Varškė ir varškės gaminiai, pagaminti iš žalio pieno Koagulazę gaminantys stafilokokai (S. aureus) 5 2 10 ksv/g 100 ksv/g Koliforminės bakterijos 5 2 1000 ksv/g 10000 ksv/g
3. Varškė ir varškės gaminiai, pagaminti iš pieno, kuris buvo apdorotas termiškai žemesnėje temperatūroje nei pasterizuojant Koagulazę gaminantys stafilokokai (S. aureus) 5 2 10 ksv/g 100 ksv/g Koliforminės bakterijos 5 2 10 ksv/g 100 ksv/g 4. Varškė ir varškės gaminiai, pagaminti iš pasterizuoto pieno arba
pieno, apdoroto aukštesnėje temperatūroje nei pasterizuojant Koagulazę gaminantys stafilokokai (S. aureus) 5 2 10 ksv/g 100 ksv/g
Dažniausiai pasitaikantys patogeniniai mikroorganizmai – L. monocytogenes
Kur: n – mėginį sudarančių vienetų skaičius;
c – mėginio vienetų, kurių vertės yra tarp m ir M, skaičius;
m – didžiausias leidžiamas mikrobiologinis kriterijus visuose tyrimui paimtuose mėginio vienetuose, išreiškiamas indikuojamų mikroorganizmų skaičiumi konkrečiame tiriamo maisto produkto kiekyje (1 g arba 1 ml). Rezultatas patenkinamas, kai mikroorganizmų skaičius neviršija m;
M – didžiausias leidžiamas mikrobiologinis kriterijus visuose tyrimui paimtuose mėginio vienetuose, išreiškiamas indikuojamų mikroorganizmų skaičiumi konkrečiame tiriamo maisto produkto kiekyje (1 g arba 1 ml). Rezultatas nepatenkinamas, kai viename ar keliuose mėginio vienetuose mikroorganizmų skaičius yra lygus M arba didesnis;
ksv – kolonijas sudarančių vienetų skaičius.
Pagal Europos komisijos reglamentą Nr. 2073/2005, dėl maisto produktų mikrobiologinių kriterijų, žmonių sveikatai pavojų kelia šių produktų vartojimas: žalia arba ne visai išvirta jautiena ir galbūt kitų atrajotojų mėsa, smulkinta mėsa ir fermentuota jautiena ir jos produktai, žalias pienas ir žalio pieno produktai, švieži produktai, visų pirma daigintos sėklos ir nepasterizuotos vaisių ir daržovių sultys. Taip pat šiame reglamente nurodyti maisto produktų mikrobiologiniai kriterijai (4 lentelė).
4 lentelė. Pieno ir pieno produktų mikrobiologiniai kriterijai (EB Nr. 1441/2007)
Maisto kategorija Mikroorganizmas
Mėginių ėmimo
planas Ribos Kriterijaus
taikymo etapas n c m M Pasterizuotas pienas ir kiti pasterizuoti skysti pieno produktai Enterobakterijos 5 2 < 1 ksv/ml 5 ksv/ml Gamybos proceso pabaiga
Iš žalio pieno pagaminti sūriai Koagulazę gaminantys stafilokokai 5 2 104 ksv/g 105 ksv/g Gamybos proceso pabaiga Sviestas ir grietinėlė,
pagaminti iš žalio pieno E.coli 5 2 10 ksv/g 100 ksv/g Gamybos proceso pabaiga
Kur: n- mėginį sudarančių vienetų skaičius; c-mėginio vienetų, kurių vertės yra tarp m ir M skaičius.
E. coli, enterobakterijos ir koagulazę gaminantys stafilokokai:
• Patenkinama, jeigu visos nustatytos vertės yra ≤ m,
• Priimtina, jeigu c/n verčių maksimumas yra tarp m ir M, o likusios nustatytos vertės ≤ m, • Nepatenkinama, jeigu viena arba daugiau nustatytų verčių yra > M arba daugiau nei c/n
verčių yra tarp m ir M.
II. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI
Magistro baigiamojo darbo „Pieno bakterinio užterštumo nustatymas“ tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos, Užkrečiamųjų ligų katedroje, mikrobiologijos laboratorijoje.
Norint įvertinti pieno bakterinį užterštumą, mėginiai buvo imami iš 3-jų skirtingų pieno aparatų, esančių prekybos centruose, 3-jų skirtingų ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda, bei 3-jų skirtingų ūkininkų, kurie gautą produkciją naudoja savo reikmėms (viso 9 vietos). Siekiant įvertinti sezoniškumo įtaką, pieno mėginiai buvo imami pavasarį, vasarą, rudenį bei žiemą. Pieno aparatai, esantys prekybos centruose pavadinti A1; A2; A3, ūkininkai, kurie gautą produkciją parduoda – B1; B2; B3, o ūkininkai, kurie gautą produkciją suvartoja savo reikmėms – C1; C2; C3, pasterizuotas pienas – Ps1; Ps2; Ps3; Ps4; Ps5; Ps6.
2.1 Bendro bakterinio užterštumo nustatymas
Pieno mėginiai kruopščiai išmaišomi, greitai vartant indą su pieno mėginiu 25 kartus, kad mikroorganizmai tolygiai pasiskirstytų. Toliau atliekami dešimtkarčiai skiedimai (1 ml pieno ir 9 ml fiziologinio tirpalo), ir išpilstoma į lėkšteles. 1 ml pieno mėginio iš praskiedimo yra pilamas į Petri lėkšteles su Milk plate count agaru (Oxoid, Anglija) ir laikoma 48 valandas, 30 ºC temperatūroje. Praėjus kultivavimo laikui, suskaičiuojamos mikroorganizmų kolonijos, bakterijų skaičius, esantis 1 ml žalio ar pasterizuoto pieno mėginyje.
Bendras mikroorganizmų skaičius buvo nustatytas, vadovaujantis LST EN ISO 4833:2003 „Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis metodas. Kolonijų skaičiavimo 30 ºC temperatūroje, metodas“.
Skaičiuojamos kolonijos tose lėkštelėse, kuriose išaugo ne mažiau 15 ir ne daugiau nei 300 kolonijų. BMS apskaičiuojamas pagal formulę (1.1):
d n n V C N * ) * 1 . 0 ( * 1+ 2 =
∑
, KSV/g (1.1)čia: Σc – visų lėkštelių kolonijų suma, V – užsėtos medžiagos tūris (ml), n1 – pirmo skiedimo
lėkštelių skaičius, n2 – antro skiedimo lėkštelių skaičius, d – pirmojo praskiedimo koeficientas.
Palyginimui pieno mėginiai sėjami ir ant Petrifilm Aerobic Count plates („3M“, JAV) (1 pav.). Naudojami dešimtkarčiai praskiedimai (1 ml pieno ir 9 ml fiziologinio tirpalo). Ant lygaus paviršiaus padedama Petrifilm plokštelė, pakeliama apsauginė plėvelė ir pipete statmenai plokštelės, centre supilamas 1 ml pieno mėginio iš praskiedimų. Plėvelė yra nuleidžiama. Švelniai paspaudžiama plokštelės centre, kad mėginys tolygiai pasiskirstytų ir sudarytų apskritą augimo plotą (augimo plotas sudaro apie 20 cm2). Plokštelės kultyvuojamos horizontalioje padėtyje, 30 ºC temperatūroje, 48 valandas. Praėjus kultivavimo laikui, dėl raudono dažų indikatoriaus, visos kolonijos būna raudonos (ružavos) spalvos. Tokios kolonijos lengvai atskiriamos nuo neskaidrių maisto dalelių ir yra lengvai suskaičiuojamos. Galima įvertinti ir daugiau nei 250 kolonijų. Jei visas augimo plotas tampa raudonos ar ružavos spalvos, kolonijos nevertinamos ir į rezultatus užrašoma „per daug, kad būtų galima suskaičiuoti“ („too numerous to count (TNTC)). Įvertinamas bakterijų skaičius, esantis 1 ml žalio ar pasterizuoto pieno mėginyje. Norint išaugusias kolonijas identifikuoti, galima pakėlus viršutinę plėvelę, kilpele paimti koloniją iš gelio (Mansion-de Vries et al., 2014).
2.2 Enterobakterijų skaičiaus nustatymas
Atlikus dešimtkarčius skiedimus (1 ml pieno ir 9 ml fiziologinio tirpalo), po 1 ml pieno mėginio iš praskiedimo yra pilama į Petri lėkšteles su Mac Concey agaru (Oxoid, Anglija). Šioje terpėje esantis tulžies druskos mišinys slopina Gram+ bakterijų augimą ir skatina augti Gram- mikroorganizmus. Mėginiai lėkštelėje tolygiai paskirstomi su Drigalskio špateliu. Tada lėkštelės apverčiamos ir dedamos kultivuoti 37 ºC temperatūroje, 48 valandas. Praėjus kultivavimo laikui, lėkštelės išimamos iš termostato ir įvertinamos bei suskaičiuojamos kolonijos. Kolonijos dažomos pagal Gramą („Diagnostica Merck“, Vokietija) ir mikroskopuojamos.
2.3 Escherichia coli išskyrimas
Iš gryno pieno kilpele mėginys yra sėjamas į Petri lėkšteles su TBX selektyviąja terpe (Oxoid, Anglija). Apie 15 min. Petri lėkštelės paliekamos kambario temperatūroje. Tada lėkštelės apverčiamos ir dedamos kultivuoti 37 ºC temperatūroje, 48 valandas. Praėjus kultivavimo laikui, lėkštelės išimamos iš termostato ir įvertinamos išaugusios kolonijos. E. coli bakterijos šioje terpėje išauga sudarydamos žalias kolonijas. Charakteringos kolonijos dažomos pagal Gramą („Diagnostica Merck“, Vokietija) ir mikroskopuojamos. Enterobakterijų biocheminėms savybėms tirti taikytas „Entero pluri Test“ testas (Liofilchem, Italija).
2.4 Staphylococcus aureus išskyrimas
Iš gryno pieno kilpele mėginys yra sėjamos ant Manito druskos agaro ir Baird Parker agaro. Petri lėkštelės su užsėta kultūra kultivuotos termostate 37 °C temperatūroje. Rezultatai vertinti po 24 – 48 val. Koaguliazės (Liofilchem, Italija) ir „Staphytest Plus“ testais (Oxoid, Anglija) nustatyti patogeniniai stafilokokai.
2.4 Staphylococcus aureus nustatymas PGR metodu
Ant BPA agaro (Oxoid, Anglija) išaugusių Staphylococcus aureus bakterijų DNR išskyrimui buvo naudotas 5 proc. „ Chelex-100“ tirpalas (Sigma, USA). Stafilokokų kolonijos (3-5 kolonijos) perkeliamos į mėgintuvėlį su 500 µl „Chelex-100“ tirpalu. Tada mėgintuvėliai inkubuojami 56 °C temperatūroje, 30 min. ir 95 °C temperatūroje, 10 min. Tirpalas centrifuguojamas 2,5 min. 10 000 aps./min. greičiu. Pasibaigus centrifugavimo laikui 300 µl viršutinio tirpalo sluoksnio perkeliama į naujus mėgintuvėlius ir dar kartą centrifuguojama 2,5 min. 10 000 aps./min. greičiu. Gautas supernatantas naudojamas PGR reakcijoje.
Polimerazės grandininei reakcijai (PGR) pasirinkti au-F3 (pirmyn 5‘ – TCGCTTGCTATGATTGTGG – 3‘) ir au-nucR (atgal 5‘- GCCAATGTTCTACCATAGC – 3‘) oligonukleotidų pradmenys, specifiški S. aureus padermėms. Šių pradmenų bazių porų skaičius genome yra 359 bp. PGR mišiniui buvo naudojama bidistiliuotas vanduo, MgCl2 (MBI, Fermentas),
10 x PGR buferis (MBI, Fermentas), dNTP (MBI, Fermentas), Taq DNR polimerazė (MBI, Fermentas) ir oligonukleotidų pradmenys.
Atlikta 30 PGR ciklų: denatūracija – 2 min., 95 ºC temperatūroje ir 95 ºC temperatūroje, 30 s., anilinimas – 35 sek. 56 ºC temperatūroje, prailginimas ir amplifikavimo užbaigimas - 1 min.,72 ºC temperatūroje ir 2 min.,72 ºC temperatūroje.
PGR produktai analizuojami elektroforezės gelyje (3g agarozės gelio+100ml TAE buferio (40 mM Tris, 20 mM acto rūgštis 1mM EDTA)). Po 11 µl PGR produkto pakraunama į 1,2 proc. „Top Vision LE GQ“ agarozės gelį (MBI, Fermentas) su 1,3 proc. etidžio bromido tirpalu. PGR rezultatai vertinami, atlikus elektroforezę (leidžiant 100 V elektros srovę, 60 min.) UV lempos spinduliuose. Buvo naudojamas „GeneRuler TM 1000 bp DNA Ladder“ (MBI, Fermentas) markeris.
2.5 Duomenų statistinė analizė
Duomenų analizė atlikta su „Microsoft Excel 2003“ statistiniu paketu. Buvo nustatoma pieno mikrobiologinių rodiklių vidurkiai, metiniai vidurkiai, mažiausios ir didžiausios reikšmės, taip pat nustatoma koreliaciniai ryšiai, Maknemaro kriterijus, bei vidurkių skirtumų patikimumas, pritaikius Stjudento t kriterijų. Skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi ir patikimi, kai p<0,05.
III. REZULTATAI
3.1 Pieno bendras bakterinis užterštumas
Paveiksluose (2, 3, 4 pav.) pateikta kiekvieno mėginio (skirtingu sezono laiku) bendras bakterijų skaičius. Taip pat nurodyta leistina riba, iki kurios produktas yra tinkamas teikti vartotojui ir kurios negali viršyti nei vienas mėginys.
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 A 1 -P A 1 -V A 1 -R A 1 -Ž A 2 -P A 2 -V A 2 -R A 2 -Ž A 3 -P A 3 -V A 3 -R A 3 -Ž K S V /m l
Pieno mėginiai norma pagal EB Nr.853/2004
291000 68100 93600 10400 132000 118000 79400 72700 180000 29000 0 0
2 pav. Bendras bakterijų skaičius A mėginiuose
Remiantis Europos Parlamento ir Tarybos reglamentu (EB) Nr. 853/2004, kuris nusako konkrečius gyvūninės kilmės maisto produktų higienos reikalavimus, žaliame karvės piene, bendras bakterijų skaičius turi būti ≤100 000 KSV/ml. Didžiausias mūsų nustatytas bendras bakterijų skaičius buvo mėginyje, imtame iš prekybos centre, esančio pieno aparato A1, pavasario metu – 2,91×105 KSV/ml (2 pav.).
Toks didelis bendras bakterijų skaičius gali būti susijęs su netinkamomis atvėsinimo, laikymo, transportavimo sąlygomis, kol pienas pasiekė prekybos centro automatinį pieno aparatą.
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 B 1 -P B 1 -V B 1 -R B 1 -Ž B 2 -P B 2 -V B 2 -R B 2 -Ž B 3 -P B 3 -V B 3 -R B 3 -Ž K S V /m l
Pieno mėginiai norma pagal EB Nr. 853/2004
27000 59000 77200 160000 180000 150000 0 69500 125000 36300 103000 104000
3 pav. Bendras bakterijų skaičius B mėginiuose
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 C 1 -P C 1 -V C 1 -R C 1 -Ž C 2 -P C 2 -V C 2 -R C 2 -Ž C 3 -P C 3 -V C 3 -R C 3 -Ž K S V /m l
Pieno mėginiai norma pagal EB Nr. 853/2004
24000 260000 215000 34500 170000 0 68100 147000 230000 17000 38100 280000
4 pav. Bendras bakterijų skaičius C mėginiuose
Iš visų tirtų pieno mėginių, skirtingu sezono laikotarpiu, numatytą normą viršijo 16 mėginių. Iš jų 4 mėginiai, imti iš prekybos centruose, esančių pieno aparatų (2 mėginiai imti pavasario metu, 2 – vasaros metu) (2 pav.). 6 mėginiai imti iš ūkininkų, kurie prekiauja savo produkcija, iš jų 2 mėginiai imti pavasario metu, 2 – žiemos metu ir po vieną mėginį vasaros ir rudens metu (3 pav.). Bei 6 mėginiai, kurie imti iš ūkininkų, gautą produkciją naudojančių savo reikmėms (2 mėginiai imti pavasario metu, po 1 mėginį vasaros ir rudens, bei 2 mėginiai – žiemos metu) (4 pav.).
Keturiuose mėginiuose bendras bakterijų skaičius nebuvo nustatytas. Iš jų 2 mėginiai - iš prekybos centrų (automatinių pieno aparatų) (2 pav.), vienas mėginys iš ūkininkų, kurie parduoda savo produkciją (3 pav.) ir vienas mėginys iš ūkininkų, kurie gautą produkciją vartoja savo reikmėms (4 pav.).
Lyginant mėginius, imtus iš skirtingų prekybos centrų (aparatų), didžiausias bendras bakterijų skaičius nustatytas A1 prekybos centre, pavasario metu imtame pieno mėginyje – 2,91×105 KSV/ml (tai didžiausias nustatytas BMS tarp visų imtų ir tirtų mėginių). Tuo tarpu
lyginant bendro bakterijų skaičiaus vidurkius, nustatyta, kad daugiausiai užteršti mėginiai buvo imti iš A1 prekybos centro, mažiausiai - iš A3 prekybos centro pieno aparato (2 pav.).
Palyginus mėginius, imtus iš skirtingų ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda, didžiausias bendras bakterijų skaičius nustatytas B2 ūkininko, pavasario metu, imtame pieno mėginyje – 1,8×105 KSV/ml. Tuo tarpu lyginant bendro bakterijų skaičiaus vidurkius, nustatyta, kad daugiausiai užteršti mėginiai buvo imti iš B2 ūkininko, mažiausiai – iš B1 ūkininko (3 pav.).
Lyginant mėginius, imtus iš skirtingų ūkininkų, kurie gautą produkciją naudoja savo reikmėms, didžiausias bendras bakterijų skaičius nustatytas C3 ūkininko, žiemos metu, imtame pieno mėginyje – 2,8×105 KSV/ml. Tuo tarpu lyginant bendro bakterijų skaičiaus vidurkius, nustatyta, kad daugiausiai užteršti mėginiai buvo imti iš C3 ūkininko, mažiausiai – C2 ūkininko (4 pav.).
Palyginus tarpusavyje bendrą bakterijų skaičių pieno mėginiuose, imtuose iš prekybos centruose, esančių aparatų (A), ir pieno mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją parduoda (B) nustatyta, kad bakterijų vidurkiai skiriasi nežymiai (A = 9×104 KSV/ml; B = 9.09×104 KSV/ml). Rezultatai tarpusavyje statistiškai nesiskiria (p=0.54).
Lyginant tarpusavyje bendrą bakterijų skaičių pieno mėginiuose, imtuose iš prekybos centruose, esančių aparatų (A) ir pieno mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja (C), nustatyta, kad nors ir bakterijų vidurkiai yra skirtingi (A = 9×104 KSV/ml; C =
1.24×105 KSV/ml), rezultatai tarpusavyje statistiškai nesiskiria (p=0.54).
Palyginus tarpusavyje bendrą bakterijų skaičių pieno mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją parduoda (B), ir pieno mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją suvartoja (C), nustatyta, kad nors ir bakterijų vidurkiai skiriasi (B = 9.09×104 KSV/ml; C = 1.24×105 KSV/ml),
Bendras bakterijų skaičius buvo nustatomas pieno mėginį, sėjant į Petri lėkšteles su Milk plate agaru ir taip pat buvo naudojamas greitasis BMS nustatymo metodas, sėjant pieno mėginį ant Petrifilm plokštelių. Lyginant tarpusavyje šiuos du BMS nustatymo metodus, Petrifilm plokšteles yra daug patogiau ir paprasčiau naudoti. Jų naudojimas sutaupo laiką, kuris paprastai yra skirtas terpės ruošimui. Petrifilm plokštelės kultivuojamos kaip ir Petri lėkštelės. Tačiau Petrifilm plokštelės yra popierinės ir plonos, jų galima kultivuoti didesnį kiekį, nei Petri lėkštelių. Dėl Petrifilm esančių dažų indikatoriaus kolonijas lengva suskaičiuoti. Skaičiuojamos visos kolonijos, neatsižvelgiant į jų dydį ar spalvos intensyvumą (gali būti ryškiai raudonos arba šviesiai rožinės spalvos) (5 pav.).
5 pav. Bendras bakterijų skaičius ant Petrifilm plokštelės
Palyginus šiuos du metodus, nustatyta, kad didžiausias nustatytas bakterijų skaičius skyrėsi 1,5 karto (MP lėkštelėse - 2,91×105 KSV/ml, Petrifilm plokštelėse - 4,31×105 KSV/ml). MP lėkštelėse BMS vidurkis - 1,01×105 KSV/ml, – Petrifilm plokštelėse – 1,25×105 KSV/ml. Šiais metodais gauti rezultatai statistiškai tarpusavyje nesiskiria (p = 0,2) (5 lentelė).
Bendras bakterijų skaičius nebuvo nustatytas 4 mėginiuose, mėginį sėjant ant MP agaro Petri lėkštelėse, ir net 10 mėginių, mėginį sėjant ant Petrifilm plokštelių (χ2=3,27; χ2(0,05)=3.841. Kadangi 3.27<3.841, vadinasi metodai tarpusavyje nesiskiria ir yra vienodai tinkami nustatyti bendrą bakterijų skaičių)(5 lentelė).
Nustatytas koreliacinis ryšys parodė, kad tarp bakterijų augimo ant MP agaro ir Petrifilm plokštelių yra teigiamas tiesioginis, vidutiniškai stiprus ryšys (R=0.62). Tai rodo, kad bendram bakterijų skaičiui didėjant ant Milk plate agaro, BMS didėja ir ant Petrifilm plokštelių.
5 lentelė. Bendras mikroorganizmų skaičius, sėjant į Petri lėkšteles ir ant Petrifilm
Mėginiai MP, KSV/ml Petrifilm, KSV/ml A1-P 2,91×105 2×105 A1-V 6,81×104 0 A1-R 9,36×104 0 A1-Ž 1,04×104 4,95×104 A2-P 1,32×105 1,7×105 A2-V 1,18×105 4,5×104 A2-R 7,94×104 0 A2-Ž 0 9,09×104 A3-P 7,27×104 1,25×105 A3-V 1,8×105 2,87×105 A3-R 2,9×104 0 A3-Ž 0 0 B1-P 2,7×104 0 B1-V 5,9×104 3,54×105 B1-R 7,72×104 0 B1-Ž 1,6×105 1,58×105 B2-P 1,8×105 4,31×105 B2-V 1,5×105 5,45×104 B2-R 0 0 B2-Ž 6,95×104 9,1×104 B3-P 1,25×105 2,77×105 B3-V 3,63×104 5,45×104 B3-R 1,03×105 0 B3-Ž 1,04×105 1,67×105 C1-P 2,4×104 3,56×104 C1-V 2,6×105 3,46×105 C1-R 2,15×105 1,97×105 C1-Ž 3,45×104 6,14×104 C2-P 1,7×105 3,72×105 C2-V 0 1,77×104 C2-R 6,81×104 5,95×104 C2-Ž 1,47×105 3,3×105 C3-P 2,3×105 0 C3-V 1,7×104 0 C3-R 3,81×104 1,45×105 C3-Ž 2,8×105 3,67×105 Vidurkis 1,01×105 1,25×105 Min 0 0 Max 2,91×105 4,31×105
3.2 Pasterizuoto pieno bakterinis užterštumas
Bendras bakterijų skaičius buvo nustatomas ir pasterizuoto pieno mėginiuose. Remiantis Europos Parlamento ir Tarybos reglamentu (EB) Nr. 853/2004, kuris nusako, kad apdorotame karvės piene, kuris gali būti naudojamas ir pieno produktams gaminti, bendras bakterijų skaičius turi būti ≤100 000 KSV/ml. Tuo tarpu mūsų didžiausias nustatytas bakterijų skaičius buvo 168 KSV/ml. Dviejuose mėginiuose bendras bakterijų skaičius nebuvo nustatytas, o dviejuose buvo – 140 KSV/ml (6 pav.).
Neženklus bakterijų kiekis pasterizuoto pieno mėginiuose rodo, kad pasterizacija sumažina bakterinį užterštumą piene.
2 0 140 140 0 168 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Ps1 Ps2 Ps3 Ps4 Ps5 Ps6 K S V /m l
6 pav. Bendras bakterijų skaičius pasterizuoto pieno mėginiuose
3.3 Enterobakterijų skaičius piene
Enterobakterijos buvo nustatomos pieno mėginius, sėjant ant Mac agaro. Didžiausias enterobakterijų skaičius buvo nustatytas 5,54×105 KSV/ml. Mėginys buvo imtas iš ūkininko, kuris gautą produkciją naudoja savo reikmėms, pavasario metu (C3-P) (6 lentelė).
Ant Mac agaro enterobakterijų neišaugo iš 13 mėginių. Enterobakterijos neaugo rudens metu (7 iš 9 mėginių) ir žiemos metu (3 iš 9 mėginių). Šios bakterijos nebuvo išskirtos iš 6 mėginių,
imtų iš prekybos centruose, esančių pieno aparatų. Taip pat 5 mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda ir 2 mėginių - iš ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja patys.
Lyginant enterobakterijų skaičiaus vidutines reikšmes, nustatyta, kad daugiausiai enterobakterijos augo vasaros metu, imtuose mėginiuose (2,38×105 KSV/ml), mažiausiai – rudenį (1,9×104 KSV/ml). Gauti rezultatai skiriasi statistiškai reikšmingai (P=0,02).
Enterobakterijos daugiausiai buvo nustatomos pieno mėginiuose, kurie imti iš prekybos centruose, esančių pieno aparatų (vidutinė reikšmė – 1,45×105 KSV/ml). Mažiausiai – iš ūkininkų,
kurie gautą produkciją vartoja savo reikmėms – 8,86×104 KSV/ml (6 lentelė).
Lyginant tarpusavyje enterobakterijų skaičių mėginiuose, imtuose iš prekybos centrų pieno aparatų (A) ir mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją parduoda (B), nustatyta, kad bakterijų vidurkiai skiriasi nežymiai. Rezultatai tarpusavyje statistiškai nesiskiria (P=0,4) (6 lentelė).
Palyginus enterobakterijų skaičių mėginiuose, imtuose iš prekybos centrų pieno aparatų (A) ir mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją suvartoja patys (C), nustatyta, kad bakterijų vidurkiai skiriasi. Tačiau rezultatai tarpusavyje statistiškai nesiskiria (P=0,27) (6 lentelė).
Lyginant tarpusavyje enterobakterijų skaičių mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją parduoda (B) ir mėginiuose iš ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja patys (C), nustatyta, kad bakterijų vidurkiai skiriasi. Tačiau rezultatai tarpusavyje statistiškai nesiskiria (p=0.67) (6 lentelė).
6 lentelė. Enterobakterijų augimas žaliavinio pieno mėginiuose
Mėginys Enterobaktijų skaičius, KSV/ml Mėginys Enterobaktijų skaičius, KSV/ml Mėginys Enterobaktijų skaičius, KSV/ml A1-P 1,55×105 B1-P 3,55×105 C1-P 1,36×103 A1-V 2,59×105 B1-V 1,44×105 C1-V 5,45×104 A1-R 0 B1-R 0 C1-R 2×103 A1-Ž 0 B1-Ž 7,27×102 C1-Ž 1,09×103 A2-P 6,36×102 B2-P 0 C2-P 8,19×104 A2-V 5,26×105 B2-V 4,09×105 C2-V 0 A2-R 0 B2-R 0 C2-R 1,65×105 A2-Ž 0 B2-Ž 1,18×105 C2-Ž 1,53×105 A3-P 3,09×105 B3-P 0 C3-P 5,54×105 A3-V 4,93×105 B3-V 2,52×105 C3-V 1,55×103 A3-R 0 B3-R 0 C3-R 0 A3-Ž 0 B3-Ž 1,62×105 C3-Ž 4,82×104
3.4 Enterobakterijų skaičius pasterizuotame piene
Remiantis Komisijos Reglamentu (EB) Nr. 1441/2007, pasterizuotame karvės piene enterobakterijų negali būti daugiau kaip 5 KSV/ml. Tuo tarpu didžiausias mūsų nustatytas enterobakterijų skaičius – 3 KSV/ml. Nei vienas pasterizuoto pieno mėginys neviršijo reglamente nurodytos enterobakterijų leistinos normos. Tai rodo, kad terminis pieno apdorojimas sumažina bakterijų skaičių. Taip pat, kad nebuvo pakartotinio užteršimo.
Enterobakterijos išaugo tik dviejuose pasterizuoto pieno mėginiuose (7 pav).
0 1 2 3 4 5 6 P s 1 P s 2 P s 3 P s 4 P s 5 P s 6 K S V /m l
pieno mėginiai norma pagal EB Nr. 1441/2007
1
0
3
0 0 0
7 pav. Enterobakterijų augimas pasterizuoto pieno mėginiuose
3.5 Sezoniškumo įtaka pieno bakteriniam užterštumui
Gauti rezultatai parodė, kad bendras bakterijų skaičius viršijo leistiną normą 16 iš 36 (44 proc.) tirtų pieno mėginių (2, 3, 4 pav.). Bendro bakterijų skaičiaus visų metų vidurkis – 1,01×105
KSV/ml, enterobakterijų – 1,18×105 KSV/ml. Gauti rezultatai tarpusavyje statistiškai nesiskiria (P=0,56) (7 lentelė).
Atlikus analizę gavome, kad didžiausias bendras bakterijų skaičius buvo nustatytas pavasario metu (1,39×105 KSV/ml), mažiausias – rudens metu (7,82×104 KSV/ml) (P=0.11).
Atlikus analizę paaiškėjo, kad daugiausiai enterobakterijų pieno mėginiuose nustatyta vasaros metu (2,38×105 KSV/ml), mažiausiai – rudens metu (1,86×104 KSV/ml). Gauti rezultatai tarpusavyje skiriasi statistiškai reikšmingai (P=0.01). Žiemą enterobakterijų nustatyta daugiau nei pavasario metu (P=0.16) (7 lentelė).
Nustatytas koreliacinis ryšys parodė, kad tarp bendro bakterijų ir enterobakterijų augimo yra tiesioginis, silpnas ryšys (R=0.25). Tai rodo, kad bendram bakterijų skaičiui didėjant mėginiuose, didėja ir enterobakterijų skaičius.
7 lentelė. Žalio pieno mikrobiologinis užterštumas, skirtingu sezono metu
Sezonas Mėginys BMS, KSV/ml Enterobakterijos, KSV/ml Pavasaris A1-P 2,91×105 1,55×105 A2-P 1,32×105 6,36×102 A3-P 7,27×104 3,09×105 B1-P 2,7×104 3,55×105 B2-P 1,8×105 0 B3-P 1,25×105 0 C1-P 2,4×104 1,36×103 C2-P 1,7×105 8,19×104 C3-P 2,3×105 5,54×105 Vidurkis 1,39×105 b1,62×105 Vasara A1-V 6,81×104 2,59×105 A2-V 1,18×105 5,26×105 A3-V 1,8×105 4,93×105 B1-V 5,9×104 1,44×105 B2-V 1,5×105 4,09×105 B3-V 3,63×104 2,52×105 C1-V 2,6×105 5,45×104 C2-V 0 0 C3-V 1,7×104 1,55×103 Vidurkis 9,89×104 2,38×105 Ruduo A1-R 9,36×104 0 A2-R 7,94×104 0 A3-R 2,9×104 0 B1-R 7,72×104 0 B2-R 0 0 B3-R 1,03×105 0 C1-R 2,15×105 2×103
C-2R 6,81×104 1,65×105 C3-R 3,81×104 0 Vidurkis 7,82×104 1,86×104 Žiema A1-Ž 1,04×104 0 A2-Ž 0 0 A3-Ž 0 0 B1-Ž 1,6×105 7,27×102 B2-Ž 6,95×104 1,18×105 B3-Ž 1,04×105 1,62×105 C1-Ž 3,45×104 1,09×103 C2-Ž 1,47×105 1,53×105 C3-Ž 2,8×105 4,82×104 Vidurkis 8,95×104 a5,37×104 Metų vidurkis 1,01×105 1,18×105 a, b p<0,05
3.6 Staphylococcus aureus piene
Gauti rezultatai parodė, kad Staphylococcus spp., bakterijos nustatytos visais metų laikais ir išskirtos iš visų tirtų žalio pieno mėginių (100 proc.). Tuo tarpu, tiriant pasterizuoto pieno mėginius,
Staphylococcus spp., bakterijos nebuvo nustatytos.
Remiantis higienos norma (HN) 26:2006 „Maisto produktų mikrobiologiniai kriterijai“, žaliame karvės piene S. aureus gali būti iki 500 KSV/ml. Tuo tarpu mūsų didžiausias nustatytas S.
aureus kiekis – 472 KSV/ml (C2-R). Nei viename tirtame mėginyje nenustatytas didesnis nei
leidžiamas šių bakterijų kiekis (10 pav).
Iš visų 36 tirtų mėginių, 18 mėginių (50 proc.) buvo išskirta S. aureus bakterijos.
Dažniausiai S. aureus bakterijos nustatytos mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie produkciją parduoda (8 mėginiai). Lyginant tarpusavyje S. aureus bakterijų augimą mėginiuose iš ūkininkų, kurie produkciją parduoda (76 KSV/ml) ir mėginiuose iš prekybo centrų (11 KSV/ml), nustatyta, kad bakterijų vidurkiai skiriasi 7 kartus. Rezultatai skiriasi statistiškai reikšmingai (P=0,04) (8, 9 pav.).
0 100 200 300 400 500 600 A 1 -P A 2 -P A 3 -P A 1 -V A 2 -V A 3 -V A 1 -R A 2 -R A 3 -R A 1 -Ž A 2 -Ž A 3 -Ž K S V /m l
pieno mėginiai norma pagal HN 26:2006
0 27 18 9
72
0 0 0 9 0 0
0
8 pav. Staphylococcus aureus augimas A pieno mėginiuose
0 100 200 300 400 500 600 B 1 -P B 2 -P B 3 -P B 1 -V B 2 -V B 3 -V B 1 -R B 2 -R B 3 -R B 1 -Ž B 2 -Ž B 3 -Ž K S V /m l
pieno mėginiai norma pagal HN 26:2006
9 154 209 0 118 272 9 136 0 0 9 0
0 100 200 300 400 500 600 C 1 -P C 2 -P C 3 -P C 1 -V C 2 -V C 3 -V C 1 -R C 2 -R C 3 -R C 1 -Ž C 2 -Ž C 3 -Ž K S V /m l
pieno mėginiai norma pagal HN 26:2006
0 31 9 0 0 0 0 472 0 0 36 45
10 pav. Staphylococcus aureus augimas C pieno mėginiuose
S. aureus bakterijos daugiausiai buvo nustatomos pavasario metu (vidutinė reikšmė – 80
KSV/ml), mažiausiai – žiemos metu (11 KSV/ml) (P=0.12). Šių bakterijų daugiau buvo nustatyta rudenį (69 KSV/ml), nei vasarą (54 KSV/ml) (P=0.82).
PGR metodu nustatėme Staphylococcus aureus padermes, išskirtas iš tirtų pieno mėginių. Buvo tiriamos 20 bakterijų kolonijų, išskirtų iš pieno mėginių, kurios buvo teigiamos koaguliazei (su galimai esančiomis S. aureus padermėmis). Identifikuota 18 kolonijų, kuriose buvo
S. aureus padermės, turinčios 359 bazių poras (11 pav.).
S. aureus padermės, išskirtos iš B2 ūkininko, imtuose mėginiuose, visus 4 kartus (pavasarį,
vasarą, rudenį, žiemą). Tuo tarpu iš C1 ūkininko, imtuose mėginiuose, S. aureus padermės nenustatytos nei vienu tyrimų sezonu.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 pav. DNR elektroforezė, naudojant PGR, S. aureus identifikavimui
1, 10 - „GeneRuler TM“ 1000 bp DNR Markeris (MBI, Fermentas). 2,3,4 – neigiami mėginiai. 5,6,7,8 – Staphylococcus aureus. 9 – Teigiama kontrolė: Staphylococcus aureus (ATCC 9144).
IV. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio darbo, o kartu ir atliktų tyrimų, tikslas buvo nustatyti žalio ir pasterizuoto pieno bakterinį užterštumą. Tikėtasi, kad tarp 36 žalio ir 6 pasterizuoto pieno mėginių bus neatitinkančių higienos normų bei reglamentų nustatytų reikalavimų.
Taip pat mūsų tyrimų tikslas buvo palyginti pieno mėginių užterštumą skirtingose prekybos vietose. Bei įsitinkinti, ar ūkininkai, kurie gautą produkciją suvartoja savo reikmėms, užtikrina reikiamą higienos lygį ir sumažina tikimybę sukelti savo bei aplinkinių žmonių sveikatos sutrikimus.
Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausias bakterinis užterštumas buvo nustatytas mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja savo reikmėms (C1, C2, C3). Vidutiniškai užteršti – iš ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda (B1, B2, B3), o mažiausiai užteršti mėginiai, imti iš prekybos centruose, esančių automatinių pieno aparatų (A1, A2, A3). Tai parodo, kad ūkininkai, kurie gautą produkciją vartoja savo reikmėms, nepakankamai laikosi higienos reikalavimų ir ne visada vartoja sveikatai saugią ir kokybišką produkciją.
Gauti duomenys parodė, kad bendras bakterijų skaičius 16-oje mėginių viršijo nustatytą didžiausią leistiną ribą pagal EB Nr.853/2004. Palyginus tarpusavyje pieno mėginius nustatyta, kad dažniausiai leistiną ribą viršijo mėginiai, imti iš ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda. Ir ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja savo reikmėms. Tuo tarpu mažiausiai leistiną ribą viršijo mėginiai, kurie imti iš prekybos centruose, esančių automatinių pieno aparatų.
Ištyrus pasterizuoto pieno mėginius, nustatyta, kad nei vienas mėginys neviršijo leistinos EB Nr. 853/2004 ribos. Tai rodo, kad pasterizacija efektyviai sumažina bakterinį pieno užterštumą.
Daugiausiai enterobakterijos buvo nustatytos vasarą imtuose mėginiuose, mažiausiai – rudenį. Pasterizuotame piene enterobakterijų skaičius neviršijo EB Nr. 1441/2007 leistinos normos. Ir tai rodo, kad terminis apdorojimas yra veiksminga priemonė, apsauganti pieną nuo bakterinio užterštumo. Taip pat kad pasterizuotas pienas nebuvo pakartotinai užterštas, bei buvo naudotas geros kokybės žaliavinis pienas.
Atlikti tyrimai ir gauti duomenys parodė, kad visuose tirtuose žalio pieno mėginiuose (36 mėginiai) buvo identifikuotos Staphylococcus spp., bakterijos. 50 proc. žalio pieno mėginių buvo identifikuotos Staphylococcus aureus bakterijos. Tuo tarpu pasterizuotame piene nei
identifikuojamos pavasario metu, mažiausiai - rudens metu. Didžiausias Staphylococcus aureus skaičius nustatytas mėginiuose, imtuose iš ūkininkų, kurie gautą produkciją parduoda.
Tuo tarpu nei viename žalio pieno bei pasterizuoto pieno mėginyje Escherichia coli bakterijos nebuvo identifikuotos.
Irane buvo atliekami pieno bakterinio užterštumo tyrimai 2013 metais ir 2014 metais. 2013 metais atlikti tyrimai ir gauti duomenys parodė, kad 43 iš 207 (20,1 proc.) žalio pieno mėginių buvo užteršti Staphylococcus aureus bakterijomis. 2014 metais buvo imami po 100 mėginių žalio pieno ir pasterizuoto pieno. Gauti rezultatai parodė, kad iš 100 žalio pieno mėginių, 42 mėginiuose aptikta
E. coli bakterijų, o 22 - S. aureus bakterijų. Iš 100 pasterizuoto pieno mėginių, 9 mėginiuose rasta E. coli bakterijų, o 2 - S. aureus bakterijų (Vahedi et al., 2013). Tuo tarpu mūsų atliktų tyrimų metu
nustatyta, kad Staphylococcus spp. bakterijos augo visuose žalio pieno mėginiuose (36 mėginiai), 18 mėginių iš 36 žalio pieno mėginių (50 proc.) rastos Staphylococcus aureus bakterijos. Pasterizuoto pieno mėginiuose nebuvo nustatyta nei Staphylococcus spp., nei Staphylococcus
aureus bakterijos. Nei žalio nei pasterizuoto pieno mėginiuose nebuvo rastos Escherichia coli
bakterijos.
Remiantis literatūros duomenimis, dėl to, kad pieno ir pieno produktų bakterinis užterštumas yra didelis, kyla rimtas pavojus susirgti įvairiomis infekcinėmis ligomis (Akya et al., 2013). Mūsų rezultatai parodė, kad pienas visais metų laikais yra labai užterštas. Nors žmonių susirgimai dėl bakterinės taršos gali būti susiję ir su pasterizuoto pieno vartojimu, tačiau dažniausiai susirgimai pasireiškia, vartojant žalią pieną (Cerva et al., 2014). Pasterizuotas pienas yra daug saugesnis bakterinio užterštumo atžvilgiu (Kamana et al., 2014). Mūsų gauti rezultatai dar kartą patvirtino šį teiginį, nes nei vienas tirtas pasterizuoto pieno mėginys neviršijo leistino bendro bakterinio užterštumo, bei enterobakterijų skaičiaus, ribų. Taip pat pasterizuotame piene nebuvo ir fekalinį užterštumą rodančių bakterijų.
Kai kurių autorių nuomone (Park et al., 2014), norint pagerinti pieno kokybę reikia nuolat atlikti mikrobiologinius tyrimus. Tam kad pieno kokybė gerėtų, reikia žmones informuoti, kaip jų veiksmai, asmens higiena atsiliepia galutinei produkcijai. Mūsų tyrimų rezultatai parodė, kad labiausiai užteršti yra mėginiai, imti iš ūkininkų, kurie gautą produkciją suvartoja patys. Tai leidžia manyti, kad žmonėms trūksta žinių, kaip tinkamai apsaugoti gaunamą produkciją, o kartu ir savo sveikatą.
Tam, kad pieno gamintojai galėtų greitai nustatyti pieno kokybę, jie turi naudotis greitaisiais metodais (Gargouri et al., 2014). Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad norint greičiau nustatyti bendrą
bakterinį užterštumą, galima tyrimams naudoti Petrifilm plokšteles, vietoj standartinių metodų (P=0,2).
Išvados
1. Ištyrus žalio pieno mėginius iš skirtingų prekybos vietų nustatėme, kad 44 proc. mėginių viršijo didžiausią leistiną bendro bakterinio užterštumo lygį (EB Nr. 853/2004). Tuo tarpu nei vienas pasterizuoto pieno mėginys neviršijo leistinos (EB Nr. 853/2004) ribos. 2. Ištyrus žalio pieno mėginius iš skirtingų prekybos vietų nustatėme, kad didžiausias
eneterobakterijų skaičius buvo mėginyje, imtame iš ūkininko, kuris gautą produkciją suvartoja savo reikmėms, pavasario metu (C3-P). Tuo tarpu nei viename pasterizuoto pieno mėginyje, enterobakterijų skaičius neviršijo EB Nr. 1441/2007 leistinos ribos. 3. Įvertinus žalio pieno užsiteršimą Staphylococcus aureus buvo gauta, kad 50 proc.
mėginių buvo užteršti šiomis bakterijomis, tačiau nei viename mėginyje nebuvo viršyta leidžiama HN 26:2006 riba. Pasterizuoto pieno mėginiuose Staphylococcus aureus nebuvo išskirtos. Gauti rezultatai parodė, kad nei viename žalio pieno bei pasterizuoto pieno mėginyje E. coli bakterijos nebuvo išskirtos.
4. Atlikus gautų rezultatų analizę ir įvertinus bakterinio užterštumo sezoniškumą, nustatyta, kad didžiausias bendras bakterijų skaičius buvo pavasario metu, mažiausias – rudenio metu (P=0.11). Daugiausiai enterobakterijų pieno mėginiuose nustatyta vasaros metu, mažiausiai – rudenį, rezultatai tarpusavyje skyrėsi statistiškai reikšmingai (P=0.01).
