LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROSIOS PAKOPOS STUDIJOS
Ievos Golubickaitės
GLIOBLASTOMŲ SKIRSTYMAS Į POTIPIUS,
VERTINANT GENŲ TAIKINIŲ RAIŠKOS PROFILIO POKYČIUS Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas dokt. Giedrius Steponaitis Konsultantė dr. Daina Skiriutė
TURINYS
SANTRAUKA ... 3 SUMMARY ... 4 PADĖKA ... 5 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Nervinis audinys ... 91.2 Galvos smegenų navikai ... 10
1.3 Gliomos ... 10
1.4 Glioblastoma ... 11
1.4.1 Etiologija ... 12
1.4.2 Simptomai ir diagnozė ... 12
1.4.3 Gydymas ir prognozė ... 13
1.4.4 CNS navikų epidemiologija Lietuvoje ... 13
1.5 Molekuliniai žymenys ... 14
1.5.1 MGMT promotoriaus metilinimo statusas ... 14
1.5.2 IDH mutacijos ... 15
1.5.3 1p/19q kodelecija ... 15
1.6 Glioblastomų tipavimas ... 16
1.7 Referentiniai genai ... 17
1.8 Genai taikiniai ... 18
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 21
2.1 Tyrimo planas ... 21
2.2 Tiriamoji medžiaga ... 22
2.3 Audinio paruošimas ... 22
2.4 RNR išskyrimas iš audinio ... 22
2.4.1 RNR koncentracijos ir švarumo matavimas ... 24
2.5 kDNR sintezė ... 25
2.6 Genų raiškos įvertinimas pritaikant TL-AT-PGR ... 26
2.6.1 Pradmenų generavimas genų raiškos tyrimams ... 27
2.6.2 Genų raiškos nustatymas tikro laiko PGR metodu naudojant SYBR® Green metodą ... 28
2.7 Statistinė duomenų analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1 Genų taikinių atranka, duomenų bazės analizė ir sutipavimo tikslumo įvertinimas ... 30
3.2 GBM raiškos ištyrimas ir suskirstymas į potipius ... 31
3.3 Statistinė analizė klinikiniams pacientų duomenims įvertinti ir jų sąsajos su GBM potipiu ... 34
3.3.1 Ryšys tarp GBM potipio ir pacientų lyties ... 34
3.3.2 Ryšys tarp GBM potipio ir pacientų amžiaus ... 34
3.3.3 Ryšys tarp GBM potipio ir pacientų išgyvenamumo ... 35
IŠVADOS ... 37
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRAUKA
Darbo autorius: Ieva Golubickaitė
Pavadinimas: Glioblastomų skirstymas į potipius, vertinant genų taikinių raiškos profilio pokyčius
Darbo vadovas: dokt. Giedrius Steponaitis
Glioblastomos - tai dažniausi pirminiai aukšto piktybiškumo laipsnio galvos smegenų navikai, kilę iš supiktybėjusių astrocitų ir pasižymintys bloga prognoze, trumpa pacientų išgyvenimo trukme, nepaisant taikomo agresyvaus gydymo. Glioblastomos pasižymi dideliu histologiniu ir genų raiškos heterogeniškumu bei genetinių pokyčių įvairove. Dėl šių priežasčių neretai sudėtinga tiksliai diagnozuoti ligą bei prognozuoti tolimesnę jos eigą. Norint gauti kuo tikslesnius duomenis apie auglį, jau taikomi ne tik histopatologiniai, bet ir molekulinių žymenų tyrimai, kurie padeda patikslinti diagnozę, nustatyti auglio kilmę bei pritaikyti efektyvesnę terapiją. Nepaisant pastarosios pažangos ir toliau yra siekiama atrasti genų taikinių rinkinius, kurių genų raiškos profilio ištyrimas leistų dar tiksliau nustatyti diagnozę, parinkti tinkamiausią gydymą, prognozuoti ligos eigą, naviko ataugimo tikimybę ar pacientų išgyvenamumą.
Šio tyrimo tikslas buvo identifikuoti potencialius genus-taikinius, kurie būtų susiję su glioblastomų patogeneze, įvertinti jų tinkamumą glioblastomų sutipavimui remiantis literatūros bei TCGA duomenų bazėje esančiais duomenimis, ištirti atrinktų genų iRNR raišką glioblastomose ir jas suskirstyti į potipius bei nustatyti potipių ryšį su pacientų klinikiniais duomenimis. Tyrimo metu naudota RNR išskirta iš 61 pooperacinio pacientų smegenų navikinio audinio. 16 genų taikinių ir 5 referentinių genų raiška ištirta taikant atvirkštinės transkripcijos tikro laiko PGR metodą su SYBR-Green I dažu. Duomenys išanalizuoti ir vizualizuoti, naudojant IBM SPSS Statistics (versija 20) ir GraphPad Prism 7.0, atitinkamai statistines ir grafines duomenų apdorojimo programas. Pagal atrinktų genų taikinių raišką, naudojantis sukurtu algoritmu, glioblastomų mėginiai buvo suskirstyti į tris potipius 78 proc. tikslumu.
SUMMARY
Author of Master’s thesis: Ieva Golubickaitė
Full title of Master’s thesis: Glioblastoma subtyping based on target-genes expression profile Supervisor: PhD student Giedrius Steponaitis
Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive form of primary malignant brain cancer in adults, derived from astrocytes. Glioblastoma has a high mortality rate and uniformly poor prognosis despite intensive treatment. It exhibits both histological and gene expression heterogeneity together with genetic diversity. For these reasons, it is often difficult to accurately diagnose the disease and to predict its further course. Histopathological and molecular markers are already used in order to obtain the accurate data on the tumor diagnosis, origin or selection of the most effective therapy. Nevertheless, the latest advancement there is still a need to move toward clarifying the sets of target genes whose expression could be used as biomarkers and would give more accurate information on diagnosis, best choice of treatment, prediction of course, recurrence chance and patient survival.
The aim of this study was to identify potential target genes associated with pathogenesis of glioblastoma, evaluate their suitability for GBM subtyping, based on publication and TCGA data base analysis, investigate mRNA gene expression in glioblastoma samples, assign them into subtypes and determine the relation between subtypes and clinical data of the patients. The mRNA used for this study was extracted from 61 GBM samples. The expression of 16 target genes and 5 housekeeping genes was performed using reverse transcriptase real-time PCR method with SYBR-Green I dye. Data analyzed and visualized using IBM SPSS Statistics (version 20) and GraphPad Prism 7.0 respectively. Using generated algorithm glioblastoma samples were divided into one of three subtypes with 78% of accuracy based on gene expression profile.
5
PADĖKA
Dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Neuromokslų instituto direktoriui Prof. habl. dr. Arimantui Tamašauskui, Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos vadovui doc. dr. Kęstučiui Skauminui už suteiktą galimybę prisidėti prie laboratorijos atliekamų tyrimų.
Didelę padėką išreiškiu savo baigiamojo darbo vadovui dokt. Giedriui Steponaičiui ir konsultantei dr. Dainai Skiriutei už vertingus patarimus moksliniais klausimais, visada geranorišką požiūrį bei skatinimą tobulėti.
Taip pat dėkoju Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos kolektyvui už visokeriopą pagalbą atliekant baigiamąjį darbą.
Dėkoju Vilniaus Universiteto bioinformatikos krypties studentui Dovydui Kičiatovui, kuris sukūrė ir pritaikė atitinkamus bioinformatikos modelius, kurie buvo panaudoti atliekant šiuos tyrimus.
6
Darbas ginamas viešame magistro darbų gynimo komisijos posėdyje 2018 m. birželio 18d., LSMU Laboratorinės medicinos klinikoje, 217 salėje 09:00 – 16:00 val. Adresas: Eivenių g. 2, Kaunas, Lietuva, LT-50009.
Tiriamasis darbas atliktas: 2016-2018m. Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Neuromokslų institute, Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje.
Tyrimams su biomedžiaga laboratorijoje buvo gautas etikos komiteto leidimas:
Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas (protokolo Nr. P2-9/2003).
Tyrimas iš dalies finansuotas LSMU Medicinos fakulteto studijų lėšomis.
Visi Neuromokslų instituto Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje atliktų tyrimų duomenys priklauso Molekulinės neuroonkologijos laboratorijai, nepriklausomai nuo to, kas atliko tyrimus. Gauti duomenys gali būti naudojami Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos mokslininkų ir laboratorijos doktorantų reikmėms, bei I-II studijų pakopos studentų, atlikusių tyrimus laboratorijoje, baigiamųjų darbų rengimui.
7
SANTRUMPOS
ACTB beta aktinas (angl. actin beta)
BCAS1 krūties karcinomos pagausinta seka 1 (angl. Breast Carcinoma Amplified Sequence 1)
CBTRUS Jungtinių valstijų centrinės nervų sistemos auglių registras (angl. Central Brain Tumor Registry of the United States)
CD4 T ląstelių paviršiaus glikoproteinas CD4 (angl. T-Cell Surface Glycoprotein CD4)
CDH4 kadherinas 4 (angl. Cadherin 4)
CHI3L1 į chitinazę 3 panašus baltymas 1 (angl. Chitinase 3 Like 1) CNS centrinė nervų sistema
CSPG5 chondroitino sulfato proteoglikanas 5 (angl. Chondroitin Sulfate Proteoglycan 5)
DAB2 klatriną sujungiantis baltymas (angl. Clathrin Adaptor Protein) DNR deoksiribonukleorūgštis
EASR Europos standartizuotas rodiklis
ERBB3 tirozino kinazės tipo ląstelių paviršiaus receptorius HER3 (angl. Tyrosine Kinase-Type Cell Surface Receptor HER3)
FCGR2B IgG fragmento Fc receptorius IIb (angl. Fc Fragment Of IgG Receptor IIb)
GAPDH gliceralaldehido-3-fosfato dehidrogenazė (angl. Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase) GBM glioblastoma
HPRT1 hipoksantino fosforilbosiltransferazė 1 (angl. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1) iRNR informacinė RNR
kDNR kopijinė DNR
KLRC3 ląstelių žudikių į lecitiną panašus receptorius C3 (angl. Killer Cell Lectin Like Receptor C3) LOH heterozigotiškumo praradimas
MHC audinių suderinamumo kompleksas (angl. The major histocompatibility complex)
NES nestinas (angl. Nestin)
NR2E1 branduolio receptorių 2 pogrupio E grupės 1 narys (angl. Nuclear Receptor Subfamily 2 Group E Member 1)
NVI nacionalinis vėžio institutas
PDGFRA trombocitų kilmės augimo faktoriaus receptorius alfa (angl. Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha)
PFN2 profilinas 2 (angl. Profilin 2) PSO pasaulinė sveikatos organizacija RNR ribonukleino rūgštis
SNAP91 su sinaptosomomis susijęs baltymas 91 (angl. Synaptosome Associated Protein 91)
SPRY2 pumpuro homologas 2 (angl. Sprouty RTK Signaling Antagonist 2) TCGA vėžio genomo atlasas (angl. The cancer genome atlas)
TL-PGR tikro laiko polimerazės grandininė reakcija
VAV3 guanino nukleotido pakeitimo faktorius 3 (angl. Guanine Nucleotide Exchange Factor 3)
VEGF kraujagyslių endotelio augimo faktorius (angl. Vascular endothelial growth factor) WASR pasaulio standartizuotas rodiklis
YWHAZ tirozino 3-monooksigenazės/triptofano 5-monooksigenazę aktyvuojantis baltymas zeta (angl. Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxygenase Activation Protein Zeta)
ĮVADAS
Astrocitomos – dažniausiai pasitaikantys pirminiai galvos smegenų augliai suaugusiųjų tarpe, sudarantys net iki 81 proc. visų piktybinių galvos smegenų auglių. Glioblastoma (GBM) - agresyviausias astrocitomų variantas, pagal PSO priskiriamas IV piktybiškumo laipsniui. Glioblastomos sudaro apie 56,1 proc. visų gliomų ir pasižymi trumpu vidutiniu pacientų išgyvenamumu, kuris tesiekia 12-15 mėnesių po operacijos. Šių auglių gydymui taikomi agresyvūs metodai - chirurginis auglio pašalinimas, chemo bei radioterapija. Dėl diagnostinių žymenų trūkumo tikslesnė smegenų auglių diagnozė yra galima tik po chirurginio auglio šalinimo ar biopsijos ir histologinio-molekulinio navikinio pavyzdžio ištyrimo. Dėl glioblastomų heterogeniškumo net ir atlikus histologinę-molekulinę audinio analizę, pagal dabartinius PSO standartus, numatyti gydymo efektyvumą bei prognozuoti ligą yra labai sunku, kadangi tai pačiai patologijai priskiriamų auglių elgesys neretai kardinaliai skiriasi. Dėl klinikinės eigos bei išgyvenamumo skirtumų glioblastomoms detaliau suklasifikuoti jau naudojami molekuliniai žymenys – IDH geno mutacijos ir 1p/19q chromosomų kodelecijos įvertinimas pagal PSO rekomendacijas. IDH geno mutacija leidžia įvertinti ar glioblastoma yra pirminė, smegenyse atsiradusi de novo, ar antrinė, progresavusi iš žemesnio į aukštesnio piktybiškumo laipsnio auglį, ir pagal tai įvertinti išgyvenamumo galimybes, o 1p/19q kodelecija – astrocitomoms ir oligodendrogliomoms atskirti. Nepaisant naudojamų molekulinių žymenų ir pasiekto progreso genetikos ir epigenetikos srityse ir toliau yra siekiama vėžinį procesą nustatyti kuo ankstyvesnėje stadijoje, naudojant kuo mažiau invazyvius tyrimo metodus bei gauti daugiau ir tikslesnės informacijos apie auglio molekulinius pokyčius, ligos eigos prognozę, atsaką į taikomą gydymą, ir pacientų išgyvenamumą. Intensyvių mokslinių tyrimų metu buvo nustatyta, kad glioblastomos gali būti skirstomos į potipius, kurie susiję su naviko molekuliniais pokyčiais ir pacientų atsaku į taikomą gydymą. Tiriant molekulinius pokyčius, pavyzdžiui, genų taikinių iRNR raišką, siekiama identifikuoti naujus biožymenis, sutipuoti glioblastomas bei nustatyti GBM potipių ryšį su pacientų klinikiniais duomenimis.
Tyrimo tikslas: suskirstyti pooperacinius glioblastomų mėginius į potipius pagal atrinktų genų-taikinių iRNR raiškos duomenis ir įvertinti potipių ryšį su pacientų klinikinėmis charakteristikomis. Tyrimo uždaviniai:
1. Išanalizuoti literatūros duomenis ir atrinkti GBM sutipavimui tinkamus genus-taikinius. 2. Panaudojant TCGA duomenų bazėje esančių GBM raiškos duomenis įvertinti atrinktų genų
rinkinio tikslumą GBM tipavimui ir pasirinkti optimalų taikinių kiekį tyrimui.
3. Ištirti genų taikinių iRNR raišką GBM mėginiuose ir naudojantis apmokytu sprendimų medžio modeliu suskirstyti į GBM potipius.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Nervinis audinysGalvos smegenų audinys yra sudarytas iš nervinių ląstelių – neuronų ir juos supančių neuroglijos ląstelių (žr. 1 pav.). Neuronai yra svarbiausios smegenų audinio ląstelės, kuriomis yra perduodamas ir sklinda nervinis impulsas. Žmogaus smegenyse yra apie 1012 neuronų. Nervinės ląstelės sudarytos iš kūno, kuriame yra branduolys, ir dviejų tipų ataugų – aksonų (ilgosios ataugos) ir dendritų (trumposios ataugos). Iš aksonų į dendritus cheminėmis medžiagomis, neurotransmiteriais, perduodamas signalas. Procesas vyksta tarp ilgųjų ir trumpųjų ataugų esančioje erdvėje – sinapsėje (1). Glijos ląstelės atlieka atraminę funkciją neuronams, palaiko smegenų sandarą, tuo jos yra panašios į jungiamąjį audinį. Smegenyse glijos yra 10-50 kartų daugiau nei neuronų. Glijos ląstelės skirstomos į centrinius ir periferinius gliocitus. Centriniai gliocitai yra smegenų audinyje ir skiriami į mikrogliją ir makrogliją. Mikroglija yra mažiausios neuroglijos ląstelės, tai fagocitai, imunokompetentinės nervų sistemos ląstelės. Pažeidimo vietoje mikroglijos ląstelės dauginasi, fagocituoja pažeistą audinį. Makroglijai priskiriami astrocitai, ependimocitai, oligodendrocitai bei polidendrocitai. Astrocitai dalyvauja vandens ir jonų homeostazės palaikyme, kartu su kapiliarų siena sudaro hematoencefalinį barjerą, o esant smegenų sužalojimui užpildo pažeidimo vietą randiniu audiniu. Ependimocitai išsidėstę vienu sluoksniu sudaro dangalą – ependimą, kuri iškloja smegenų ertmių paviršius, kuriuose cirkuliuoja smegenų skystis. Ependimocitai atlieka dengiamąją, atraminę, hematolikvorinio barjero funkciją bei sekretuoja cerebrospinalinį skystį. Pagrindinė oligodendrocitų funkcija - mielinizuoti neuronų ataugas, aksonus, siekiant paspartinti nervinio impulso perdavimą. Polidendrocitai yra oligodendorcitų pirmtakai. Šių ląstelių funkcija nėra pilnai nustatyta, tačiau manoma, kad jos išlieka visą gyvenimą ir gamina subrendusius
oligodendrocitus, užtikrindamos reikiamą jų kiekį. (2–4). Periferiniams gliocitams priklauso neurolemocitai ir mazgų gliocitai. Neurolemocitai dar vadinami Švano ląstelėmis ir formuoja apvalkalus mieliną ir neurolemą, dalyvauja medžiagų apykaitoje tarp nervinių skaidulų ir kraujo. Mazgų gliocitai apsupa neuronų kūną ir apriboja, atskirdami nuo aplinkinių audinių (4).
1 pav. Nervinio audinio ląstelės Adaptuota pagal (5)
10
1.2 Galvos smegenų navikai
Galvos smegenų augliai gali būti įvairių tipų ir formuotis visose smegenų dalyse, taip pat jie gali būti pirminiai ir antriniai. Pirminiai navikai smegenyse atsiranda de novo (6). Antriniai galvos smegenų navikai yra progresavę iš žemesnio į aukštesnio piktybiškumo laipsnio navikus. Jie identifikuojami remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) rekomendacijomis pagal histologinius ir molekulinius žymenis (7). Navikas priskiriamas tam tikram tipui pagal PSO, nurodoma kurioje vietoje lokalizuotas ir iš kokių ląstelių jis kilęs (nustatoma histopatologiniais tyrimais) bei molekulines savybes, pavyzdžiui, difuzinė astrocitoma, IDH geno mutacija.
1.3 Gliomos
Gliomoms priskiriami navikai, kilę iš pakitusių glijos ląstelių (8). Tai dažniausiai pasitaikantys pirminiai galvos smegenų navikai suaugusiųjų tarpe, kurie sudaro net 81 proc. visų piktybinių auglių smegenyse. Šie augliai gali būti įvardinami kaip lokalūs, nes retai išplinta į kitus organus. Nepaisant šios savybės, aukšto piktybiškumo gliomos difuziškai plinta smegenyse ir dėl to sunkiai pašalinamos chirurginiu būdu (9). Pagal PSO gliomoms priskiriamos įvairių piktybiškumo laipsnių astrocitomos, oligodendrogliomos ir ependimomos (10). Ilgą laiką gliomos buvo klasifikuojamos pagal PSO nustatytus histopatologinius kriterijus, tokius kaip branduolio atipiškumas, ląstelinis polimorfizmas, mitozinis aktyvumas, kraujagyslių proliferacija, nekrozė (11). 2016 metais PSO atnaujino galvos smegenų navikų klasifikavimą, įtraukiant ir molekulinių navikų parametrų vertinimą. Buvo išskirti šie difuzinės astrocitomos piktybiškumo laipsniai: difuzinė astrocitoma, IDH mutacija – II piktybiškumo laipsnis; anaplastinė astrocitoma, IDH mutacija – III; glioblastoma (GBM), IDH laukinis tipas – IV; glioblastoma IDH mutacija – IV; difuzinė vidurio linijos struktūrų glioma H3K27M mutacija – IV; oligodendroglioma, IDH mutacija, 1p/19q kodelecija – II; anaplastinė oligodendroglioma, IDH mutacija, 1p/19q kodelecija - III (žr. 2 pav.). Pilocitinė astrocitoma – I piktybiškumo laipsnio yra priskiriama prie kitų astrocitinių auglių kategorijos (12). Piktybiškiausios visų pirminių piktybinių galvos smegenų navikų yra glioblastomos, kurios sudaro apie 46,1 proc., o penkių metų išgyvenamumas pacientams tesiekia tik apie 5,1 proc. visų diagnozuotų atvejų (13).
11
2 pav. Gliomų klasifikacija pagal PSO Adaptuota pagal Louis su bendraautoriais (12)
1.4 Glioblastoma
Glioblastomos tai aukšto piktybiškumo laipsnio centrinės nervų sistemos navikas, kilęs iš supiktybėjusių astrocitų. Tai agresyviausios ir dažniausiai pasireiškiančios gliomos - 56,1proc. (žr. 3 pav.), kurios siejamos su trumpu pacientų išgyvenamumu bei bloga prognoze, nepaisant taikomo agresyvaus gydymo (14,15). Vidutinis astrocitomų pasireiškimo dažnis Europoje 4,8 iš 100 000. Pagal amžiaus grupes: 0-14m. pasireiškimo dažnis 0,87 iš 100 000; 15-24m. – 0,99 iš 100 000; 25-64m. – 5,10 iš 100 000; vyresniems nei 65m. – 11,40 iš 100 000. Europoje 2003 metų pradžioje gyventojų, kuriems nustatyta astrocitoma buvo 20,42 iš 100 000, išgyvenusių 2 metus po diagnozės – 4,09 iš 100 000 (16). Pacientų, kuriems diagnozuota glioblastoma, išgyvenamumo mediana tesiekia 15-18 mėnesių po diagnozės (17,18). CBTRUS (angl. Central Brain Tumor Registry of the United States) duomenimis 2010-2014 metais glioblastoma buvo dažniausiai pasitaikantis navikas iš visų piktybinių CNS navikų ir sudarė net apie 47,1 proc. atvejų (žr. 3 pav.). Glioblastomos dažniausiai pasireiškia de novo ir tik maža dalis (5-10 proc.) progresuoja iš žemesnio piktybiškumo laipsnio navikų (7). Anglijoje glioblastomų pasireiškimo dažnis 2007-2011 metais buvo 4,64 iš 100 000. Išgyvenamumo mediana 6,1 mėnesio (19). Bendrais Europos ir Šiaurės Amerikos duomenimis glioblastomų pasireiškimas yra 2-3 žmonėms 100 000 gyventojų kasmet (20). Glioblastomos yra heterogeniškos tiek fenotipiškai, tiek molekuliniu požiūriu, todėl, remiantis IDH mutacijomis, išskiriami keli tipai. Pagal 2016 metų PSO klasifikaciją išskiriami pagrindiniai glioblastomų tipai:
a) Glioblastoma, IDH laukinio tipo. Pasireiškia apie 90 proc. atvejų, daugiausiai vyresniems nei 55m. pacientams de novo;
12
b) Glioblastoma, IDH mutacija. Pasireiškia apie 10 proc. atvejų, jaunesniems pacientams ir siejamas su antriniu smegenų augliu;
c) Glioblastoma, NOS (angl. not otherwise specified). Tai visi kiti atvejai, kai GBM nėra apibrėžta kitaip, dėl neaiškių ar neatliktų molekulinių tyrimų (12,21).
3 pav. Glioblastomų pasireiškimo dažnis Adaptuota pagal Ostrom su bendraautoriais (15) A – Gliomų pasireiškimo dažnis pagal histologiją; B - Piktybinių pirminių CNS auglių pasireiškimo dažnis.
1.4.1 Etiologija
Glioblastomų etiologija nėra visiškai išaiškinta, tačiau manoma, kad jos atsiranda spontaniškai, šeiminio paveldėjimo nenustatyta. Glioblastomos rizikos veiksniai yra kitos genetinės ligos, pavyzdžiui, Fraumeni, Turcot sindromas, tuberkulinė sklerozė, I tipo neurofibromatozė. Li-Fraumeni sindromas ir neurofibromatozė siejami su didesne rizika išsivystyti žemo piktybiškumo laipsnio gliomoms. Galvos traumos gali būti predisponuojantis veiksnys (20,22,23). Sąsajų su GBM pasireiškimu ir asmeniniais įpročiais, tokiais kaip mobiliojo telefono naudojimas, dieta, alkoholio, kofeino ar nikotino vartojimas, nenustatyta (23,24).
1.4.2 Simptomai ir diagnozė
Simptomų būdingų tik glioblastomai nėra, jie priklauso nuo naviko lokalizacijos. Kol navikas nedidelis simptomų dažniausiai nejaučiama. Dauguma simptomų susiję su spaudimu į galvos smegenis (intrakranijinis spaudimas), todėl jaučiami tik tuomet, kai auglys jau ganėtinai didelis. Dažniausi simptomai - galvos skausmas, pykinimas, vėmimas, epilepsijos priepuoliai, elgsenos pokyčiai, jutimo, regos sutrikimas (2,22). Įtariant galvos smegenų naviką yra atliekami radiologiniai tyrimai – galvos smegenų kompiuterinė tomografija, magnetinio rezonanso tyrimai. Naviko piktybiškumo laipsnis
13
tiksliai nustatomas histopatologiniais ir molekuliniais tyrimais tik atlikus audinio biopsiją ar po chirurginio auglio pašalinimo (20,25).
1.4.3 Gydymas ir prognozė
Pagrindinis ir svarbiausias gydymo eigos elementas yra chirurginis auglio pašalinimas, kuris yra komplikuotas dėl infiltratyvaus augimo. Po operacijos pacientui skiriama chemoterapija ir/arba radioterapija (26,27). Chemoterapinis vaistas temozolomidas buvo patvirtintas naudojimui tik 2005 metais ir taikant kartu su radioterapija padidino išgyvenamumą nuo 12,1 iki 14,6 mėnesių, nei taikant tik radioterapiją (28). Temozolomidas pasižymi alkilinančiu poveikiu, pajėgus pereiti kraujo-smegenų barjerą. Tai yra triazenas, kuris fiziologinėje pH aplinkoje virsta veikliuoju junginiu monometiltriazenoimidazolo karboksamidu. Šio preparato veikimas pasižymi guanino metilinimu O6 ir N7 padėtyje. Tokie neatitikimai lemia deoksiribonukleorūgšties (DNR) grandinės trūkius, pažeidžiama normali replikacija, sutrikdomas ląstelės dalijimasis ir inicijuojama apoptozė (29,30). Tyrimai atliekami ir su kitu preparatu bevacizumabu, siekiant įsitinkinti, kad kartu su chemoterapiniais vaistais skiriant šį preparatą, kuris jungiasi su kraujagyslių endotelio augimo faktoriumi VEGF (angl. vascular endothelial growth factor) ir slopina jo veikimą, būtų užkirstas kelias kraujagyslių tinklo formavimuisi auglyje (20,31). Šiuo metu turimais duomenimis bevacizumabo įtraukimas į standartinio gydymo schemas yra reikšmingas bendram išgyvenamumui tik tiems pacientams, kuriems nustatyta pronervinio tipo, IDH1 mutacijos neturinti glioblastoma (32). Nepaisant agresyvaus gydymo vidutinis pacientų išgyvenamumas siekia vos 12-15 mėnesių, o 5 metus išgyvena mažiau nei 5 proc. (17,33). Tyrimo, atlikto JAV duomenimis, pacientų išgyvenamumas 2000-2010 metais siekė 8 mėnesius (34). Netaikant gydymo vidutinė pacientų išgyvenamumo trukmė tesiekia 3 mėnesius (17).
1.4.4 CNS navikų epidemiologija Lietuvoje
Centrinės nervų sistemos (CNS) navikų dažnį Lietuvoje galima vertinti remiantis Lietuvos vėžio registro duomenimis, kurie pateikiami Nacionalinio vėžio instituto (NVI) tinklalapyje, 2006-2012 metams (35). Piktybiniai onkologiniai susirgimai Lietuvoje 2009-2006-2012 metais pasireiškė vidutiniškai 17 802 žmonių, iš kurių tik 1,55-1,67 proc. sudarė smegenų augliai (žr. 1 lentelė) (36–39). Nors smegenų navikai sudaro nedidelį susirgimų procentą, tačiau mirtingumas nuo šių navikų yra labai didelis. Pasireiškimo ir mirtingumo rodikliai yra standartizuojami, siekiant tendencijas Lietuvoje palyginti su Europinėmis bei pasaulinėmis sergamumo tendencijomis. „Standartizuotas sergamumo rodiklis apskaičiuotas taikant tiesioginės standartizacijos metodą pasaulio ir Europos standartinėms populiacijoms“ (36). Šis rodiklis parodo, koks būtų Lietuvos gyventojų sergamumas, jei amžiaus struktūra būtų tokia, kaip standartinės populiacijos ir skaičiuojamas pagal nustatytą formulę (1
14
priedas). Pagal minėtas tendencijas matyti (žr. 1 lentelė), kad sergamumas bei mirtingumas Lietuvoje visu laikotarpiu išliko didelis ir viršijo Europos bei pasaulines tendencijas (36–39).
1 lentelė. Smegenų navikų pasireiškimas Lietuvoje NVI duomenimis Adaptuota pagal Smailytę su bendraautoriais (36–39)
Metai
Visi piktybiniai navikai (C00-C96)
Smegenų navikai (C70-C72) Mirčių atvejai
n n proc. Rodiklis EASR WASR n Rodiklis EASR WASR
2012 17734 275 1,55 9,2 7,7 6,3 245 8,2 6,4 4,9
2011 17862 280 1,57 9,2 7,7 6,1 265 8,8 6,9 5,3
2010 17810 298 1,67 9,1 7,8 6,2 118 7,3 6,1 4,5
2009 17802 288 1,62 8,6 7,4 5,8 238 7,1 5,9 4,3
Rodiklis - sergamumo (mirtingumo) rodiklis, naujai diagnozuotų vėžio (mirčių nuo vėžio) atvejų skaičius, tam tikroje populiacijoje tam tikru laikotarpiu; EASR – Europos standartas; WASR – pasaulio standartas.
1.5 Molekuliniai žymenys
Molekuliniai žymenys yra saviti pagal gliomų piktybiškumo laipsnį. Glioblastomoms priskiriami navikai pasižymi dideliu genetiniu heterogeniškumu, todėl šiuo metu išskiriami keli žymenys, pavyzdžiui, MGMT geno promotoriaus metilinimo statusas, IDH1/2 mutacija, EGFR geno iRNR raiškos (toliau raiškos) padidėjimas, gliomų CpG salų (G-CIMP) metilinimo fenotipas, TP53 geno mutacija ir chromosomų pokyčiai (17). Pirminėms glioblastomoms būdinga padidėjusi EGFR geno raiška, PTEN geno mutacijos, heterozigotiškumo praradimas (LOH) 10q, p16 delecijos, MDM2 amplifikacija, hTERT promotoriaus mutacijos ir IDH1 mutacijų nebuvimas. Antrinių glioblastomų žymenys – TP53, ATRX ir IDH1 mutacijos, heterozigotiškumo praradimas 10q (21,40). Nors genetinių ir epigenetinių žymenų glioblastomoms nustatyta gana nemažai, bet praktikoje dėl savo diagnostinės ir prognostinės vertės pritaikomos tik IDH1/2 mutacijos ir 1p/19q kodelecijos (41).
1.5.1 MGMT promotoriaus metilinimo statusas
Temozolomidas yra alkilinantis preparatas, kurio veikimas pagrįstas metilo grupių pernešimu ant guanino bazių, susidarant O6- ir N7-metilguaninui. Dėl tokio virsmo, vykstant DNR replikacijai, metilguaninas nuskaitomas kaip adeninas. Esant DNR grandinės neatitikimams fermentai, skirti atitaisyti DNR, pašalina O6- metilguaniną, sukurdami trūkius DNR grandinėje ir dėl šios priežasties yra aktyvuojama apoptozė (42). MGMT yra baltymas, kuris veikia DNR atitaisyme, pašalindamas visas metilo grupes nuo guanino O6 pozicijų, taip ląsteles paversdamas atsparias temozolomidui
15
(43,44). MGMT promotoriaus metilinimas sukelia šio geno nutildymą ir taip padidėja jautrumas temozolomidui. Nemetilintas MGMT genas lemia aktyvią geno raišką ir didelius kiekius fermentų, atitaisančių pažaidas, ir tokiu būdu sąlygojamas atsparumas chemoterapijai. MGMT promotoriaus metilinimas kaip prognostinis ar predikcinis veiksnys yra svarbus pacientams, nes leidžia parinkti tinkamą gydymo strategiją, numatyti išgyvenamumą ir vaisto poveikį (45–48).
1.5.2 IDH mutacijos
Izocitrato dehidrogenazių (IDH1-3) šeimai priklauso trys fermentai, kurie katalizuoja izocitrato oksidacinį dekarboksilinimą iki α-ketoglutarato (14). IDH1 ir IDH2 atitinkamai citoplazmoje ir mitochondrijose generuoja NADPH, taip pat manoma, kad IDH svarbus ląstelėms kaip gynybinis mechanizmas nuo oksidacinio streso (49). Neretai pacientams sergantiems vėžiu, pavyzdžiui, prostatos, glioma, sarkoma, ūmia mieloidine leukemija, krūties karcinoma nustatomos IDH genų mutacijos (49,50). Astrocitomų atveju IDH1/2 mutacijos yra būdingos žemesnio piktybiškumo (II-III) laipsnio navikams, o daugiau nei 90 proc. mutacijų sudaro IDH1 geno mutacija. Antrinėms glioblastomoms, kurios išsivysto iš žemesnio laipsnio astrocitomų, būdingas didelis IDH genų mutacijų dažnis, tuo tarpu pirminėse glioblastomose IDH mutacijų dažnis yra labai mažas (51,52). Šis molekulinis navikų požymis buvo identifikuotas kaip puikus žymuo, kuris padeda atskirti pirmines ir antrines glioblastomas ir yra vienas iš anksčiausiai atsirandančių molekulinių pokyčių gliomagenezėje (27,47). IDH mutacijos dažnesnės jaunesniems suaugusiems pacientams ir siejamos su geresne prognoze aukšto piktybiškumo laipsnio navikuose (53). Nustatyta, kad aukšto piktybiškumo laipsnio gliomos su IDH1 mutacija – antrinės gliomos - kilusios iš žemesnio piktybiškumo laipsnio navikų ir pasižymi mažiau agresyvia klinikine eiga (54). Tokių pacientų vidutinė išgyvenamumo trukmė siekia apie 31 mėnesį, tuo tarpu navikų su laukinio tipo IDH – pirminių glioblastomų - 15 mėnesių (55–57).
1.5.3 1p/19q kodelecija
1p/19q kodelecija tai 1 chromosomos trumpojo peties ir 19 chromosomos ilgojo peties praradimas, kuris yra nesubalansuotos translokacijos t(1;19)(q10;p10) padarinys, dėl kurio prarandama viena hibridinė chromosoma ir tuo pačiu prarandamas heterozigotiškumas (žr. 4 pav.) (41). 1p chromosomos dalinė delecija būdinga astrocitinės kilmės navikams, o 1p/19q kodelecija yra susijusi su oligodendrogliomomis ir yra retai aptinkama kitų auglių tarpe bei pasižymi didesniu jautrumu chemo ir radioterapijai (9,17). Glioblastomose su oligodendrogliomų elementais ši kodelecija pasitaiko retai, bet pasižymi geresne prognoze nei glioblastomos (58). 1p/19q kodelecija kaip žymuo naudojamas atskirti oligodendrogliomas nuo astrocitinės kilmės navikų (59).
16
4 pav. 1p/19q chromosomų kodelecija Adaptuota pagal Brandner su bendraautoriais (60)
A – nepakitusios 1 ir 19 chromosomos; B – 1p/19q chromosomų kodelecija 1.6 Glioblastomų tipavimas
CNS navikų klasifikavimas, patvirtintas PSO, iki 2016 metų buvo pagrįstas tik histopatologiniu auglio įvertinimu. Šiuo metu CNS navikai klasifikuojami vertinant tiek histologinius, tiek ir molekulinius žymenis. Histologiškai vertinamas branduolio atipiškumas, nekrozė, kraujagyslių vešėjimas ir kiti požymiai, pagal kuriuos galima nustatyti auglio piktybiškumo laipsnį (61). Po tokio įvertinimo astrocitomos gali būti išskiriamos į piktybiškumo laipsnius, tačiau net ir priskirtos tam pačiam laipsniui, neretai skiriasi savo eiga ir prognoze. Dėl šių skirtumų skirstymas buvo papildytas, siekiant išskirti auglius į pirminius ir antrinius. Toks skirstymas buvo naudingas, tačiau vis dar pernelyg platus. Dėl esamo poreikio tikslesniam tokio didelio heterogeniškumo auglių klasifikavimui buvo pradėti taikyti molekuliniai tyrimai, iš pradžių tik kaip papildomi, rekomendacinio pobūdžio, o 2016 metais patvirtinti pagal PSO ir naudojami kartu su histologiniu ištyrimu. Dabartiniai molekuliniai tyrimai leidžia nustatyti auglio kilmę, prognozuoti pacientų išgyvenamumą (62,63). Vis dėlto, yra manoma, kad esant tokiam dideliam histologiniam heterogeniškumui tarp to paties piktybiškumo laipsnio glioblastomų, šiuos navikus būtų galima suskirstyti į smulkesnes, homogeniškesnes grupes, potipius, remiantis molekulinėmis navikų savybes. Siekiant nustatyti genetinius ir epigenetinius pokyčius, kaip potencialius GBM žymenis 2008 metais buvo atlikta 600 genų taikinių sekoskaita daugiau nei dviejuose šimtuose žmogaus GBM mėginių. Tyrimo metu buvo nustatyti taikinių, dalyvaujančių signaliniuose keliuose, pokyčiai apimantys nekontroliuojamą ląstelių dalijimąsi, padidėjusį ląstelių gyvybingumą ir infiltratyvumą tokiu būdu auglio ląstelėms išvengiant ląstelės ciklo
17
patikros taškų ir apoptozės (64). Siekiant suklasifikuoti glioblastomas buvo atrinkti trys pavieniai molekuliniai žymenys - IDH, TERT mutacijos, 1p/19q kodelecija, tačiau šių duomenų neužteko reikšmingam grupių atsiskyrimui (65). 2010 metais Verhaak su bendraautoriais (66) išanalizavus TCGA (angl. The cancer genome atlas) pateikiamus duomenis glioblastomose identifikavo keturis molekulinius potipius, kurie pasižymi specifiniais molekuliniais pokyčiais: pronervinį, klasikinį, mezenchiminį ir nervinį. Pronerviniam potipiui būdingi PDGFRA, CDK6, CDK4, MET genų pokyčiai ir dažnos IDH1 mutacijos. Klasikinis potipis pasižymi EGFR geno amplifikacija, PTEN ir CDNK2A delecija, 10 chromosomos praradimu ir 7 amplifikacija. Mezenchiminiam potipiui būdingos NF1, TP53, CDKN2A genų mutacijos ir/arba praradimas tuo tarpu nervinis potipis pasižymi padidėjusia NEFL, GABRA1, SYT1, SLC12A5, EGFR genų raiška (67). Verhaak su bendraautoriais (66) tyrimo metu nustatė ryšį tarp GBM potipio ir ląstelių tipų, pavyzdžiui, pronerviniame potipyje rasta oligodendrocitinių žymenų, klasikiniame – astrocitinių, nerviniame – oligodendrocitinių ir astrocitinių bei neuronų, mezenchiminiame – astroglijos žymenų. Klasikinis, mezenchiminis ir nervinis potipiai nesiskiria savo prognoze, tačiau pronerviniam potipiui būdingas jaunesnis pacientų amžius ir ilgesnis išgyvenamumas (68). Teigiama, jog molekulinis glioblastomų suskirstymas į potipius ne tik papildytų histopatologinę analizę, leistų tiksliau nustatyti diagnozę bei prognozuoti ligos gydymą, bet ir padėtų parinkti tinkamiausią gydymo metodą. Aiškūs molekuliniai skirtumai tarp skirtingų GBM potipių leidžia spėti, kad histologiškai panašių navikų atsiradimas gali būti sąlygotas visiškai skirtingų pradinių molekulinių pokyčių ląstelėje. Nepaisant GBM tipavimo privalumo, neretai susiduriama su trūkumais dėl auglio heterogeniškumo, dėl kurio to paties auglio mėginiai gali būti priskiriami bent dviem potipiams (69). Tokie tyrimų rezultatai leidžia suprasti sunkumus norint patvirtinti biožymenis klinikinei praktikai (70). Būtent todėl būtini tolimesni tyrimai leisiantys GBM suskirstyti bent į kelias smulkesnes grupes.
1.7 Referentiniai genai
Šio tyrimo metu buvo atrinkti 5 referentiniai genai. Tokie genai svarbūs rezultatų normalizavimui, siekiant pašalinti raiškos skirtumus tarp mėginių, atsiradusius medžiagos paruošimo metu (paimamas nevienodas pradinės medžiagos kiekis, nukleorūgščių gryninimo efektyvumo variacijos tarp skirtingų mėginių, priemaišos išgrynintoje medžiagoje, skirtingas kDNR sintezės ir PGR reakcijos efektyvumas ir kt.), todėl jų raiška turi būti kuo stabilesnė nepriklausomai nuo aplinkos sąlygų. Tiriamų genų raiškos normalizavimas nepašalina biologinės variacijos tarp mėginių. Manoma, kad kaip referentiniai genai geriausiai galėtų būti panaudojami tokie genai, kurie yra svarbūs ląstelės biologiniuose procesuose nepriklausomai nuo jų rūšies, atliekamos funkcijos ir taip pat gyvybiškai svarbūs ląstelėms, o jų raiška tik nežymiai kistų tarp analizuojamų mėginių. Nepaisant ankščiau
18
išvardintų kriterijų, skirtingų audinių tipų genų raiškos vertinimui naudojami referentiniai genai šiek tiek skiriasi. Paskelbtos kelios studijos, kuriose pateikta informacija apie glioblastomoms labiausiai tinkamus referentinius genus (71–73). Remiantis pastarųjų studijų duomenimis mes atsirinkome 6 genus, kurie pasižymėjo mažiausia raiškos variacija tarp mėginių: ACTB, GAPDH, HPRT1, YWHAZ, 18S rRNA. ACTB – struktūrinis citoskeleto baltymas; GAPDH –dalyvauja glikolizėje ir gliukogenezėje; HPRT1 – dalyvauja purinų sintezėje; YWHAZ – priklauso baltymų šeimai, kuri dalyvauja signalų perdavimo keliuose; 18S rRNA – ribosomų subvienetas (74).
1.8 Genai taikiniai
Tyrimui buvo atrinkti genai-taikiniai, kurie ankstesnių tyrimų buvo parodyti kaip svarbūs taikiniai GBM tipavimui. Visi tyrimui atrinkti genai yra transliuojami į baltymines sekas yra susiję su tiek su ląstelės vėžėjimo procesais, tiek normalia ląstelės funkcija. Net 8 atrinkti taikiniai (CD4, CDH4, SPRY2, ERBB3, KLRC3, PDGFRA, PFN2, CSPG5) dalyvauja ląstelės judrumo ir adhezijos reguliacijos procesuose, 5 taikiniai (CHI3L1, VAV3, NR2E1, SPRY2, ERBB3) susiję su apoptozės procesų reguliacija, 5 taikiniai (NES, VAV3, ERBB3, KLRC3, PDGFRA) susiję su ląstelių proliferacijos reguliacija, DAB2, VAV3, NR2E1 ir SPRY2 svarbūs angiogenezės procesuose, DAB2, NES ir NR2E1 taikiniai susiję su ląstelės ciklo reguliacija, SPRY2, PDGFRA ir CSPG5 taikiniai susiję su ląstelių diferenciacija, CD4, FCG2B ir CHI3L1 genai dalyvauja imuninio ir uždegiminio atsako procesuose, SNAP91 reguliuoja baltymų transportą ląstelėje. Tyrimui pasirinktų taikinių ir patologijos ryšys pateiktas antroje lentelėje.
19
2 lentelė. Analizuojami genai ir jų ypatybės
Pavadinimas, vieta genome Koduojamas baltymas Funkcija iRNR raiškos pokytis Patologija CD4 12p13.31 T limfocitų membranos glikoproteinas
Sąveikauja su MHC II klasės antigenais; žmogaus imunodeficito viruso receptorius, inicijuoja ankstyvą T ląstelių aktyvaciją, taip pat
tai mediatorius netiesioginiams neuronų pažeidimams Sumažėjimas Glioblastoma (75)
CHI3L1 1q32.1 Uždegiminiuose procesuose dalyvaujantis glikoproteinas
Dalyvauja audinių pertvarkyme, svarbus uždegiminiuose procesuose, geba aktyvuoti ląstelių proliferaciją, migraciją, angiogenezę, saugo nuo apoptozės
Padidėjimas
Ne mažų ląstelių plaučių vėžys; epitelinė kiaušidžių, prostatos karcinoma; glioblastoma; krūties, kolorektalinis vėžys (76–81) DAB2 5p13.1 Mitogenams jautrus fosfoproteinas
Dalyvauja endocitozės, mitozės ir augimo faktorių perdavimo
keliuose Sumažėjimas
Kiaušidžių karcinomos ląstelių linijose; plaučių, krūties, kolorektalinis vėžys (82,83)
FCGR2B
1q23.3
Gama globulinų Fc regiono receptorius
Dalyvauja imuninių kompleksų fagocitozėje, reguliuoja B limfocitų
antikūnų gamybą Padidėjimas Folikulinė limfoma (84)
CDH4 20q13.33 Nuo kalcio priklausomas ląstelių adhezijos glikoproteinas
Svarbus ląstelių migracijai, signaliniams keliams, adhezijai,
apoptozės inhibicijai, audinių morfogenezei; smegenų segmentacijai ir neuronų formavimuisi; inkstų, raumenų, kepenų vystymuisi. Gali veikti kaip onkogenas ir onkosupresorius
Sumažėjimas
Didelio piktybiškumo krūties karcinoma; plaučių vėžys (85,86) NES 1q23.1 Tarpinių pluoštų baltymas, ekspresuojamas nervinėse ląstelėse
Dalyvauja mitozėje, proliferacijoje, angiogenezėje Padidėjimas
Smegenų, prostatos, gaubtinės žarnos, kasos, krūties vėžys; melanoma (87–90) NR2E1 6q21 Receptorius, svarbus tinklainės vystymuisi
Svarbus tinklainės vystymuisi, nervinio audinio kamieninių ląstelių
proliferacijai Padidėjimas Smegenų vėžys (astrocitomos, ependimomos, gliomos) (91,92) SPRY2 13q31.1 Tirozino kinazių signalinio kelio receptoriaus inhibitorius
Viduląstelinis baltymas reguliuoja tirozino kinazių signalinio kelio receptorius, kurie svarbūs ląstelių augimui, diferenciacijai ir auglio vystymuisi.
Epidermio augimo faktoriaus ir mitogenų aktyvuotuose kinazių signaliniuose keliuose baltymas gali veikti dvipusiškai – gali būti slopintojas arba aktyvatorius
Sumažėjimas Padidėjimas
Krūties, kepenų, plaučių, prostatos vėžys;
Melanoma, gaubtinės žarnos karcinoma (93–96)
20 Pavadinimas, vieta genome Koduojamas baltymas Funkcija iRNR raiškos pokytis Patologija VAV3 1p13.3 Guanino nukleotido keitimo faktorius
Dalyvauja ląstelės morfologiniame remodeliavime, genų
transkripcijoje, proliferacijoje, apoptozėje Padidėjimas
Šlapimo pūslės, prostatos, skrandžio, krūties vėžys; limfoma; glioblastoma (97– 100) BCAS1 20q13.2 Krūties karcinomos pagausinta seka 1
Funkcija nėra tiksliai nustatyta, tačiau žinoma, kad jis būtinas smegenų funkcionavimui, nes trūkumas sukelia nerimą ir į šizofreniją panašų elgesį pelėse
Padidėjimas
Krūties ir gaubtinės žarnos vėžys (siejamas su
agresyvesniu auglio fenotipu)
(101–103) ERBB3 12q13.2 Epidermio augimo faktoriaus receptorius tirozino kinazėms
Svarbus ląstelių proliferacijai ir išgyvenamumui Padidėjimas
Prostatos, šlapimo pūslės, krūtų, kiaušidžių, kasos, skrandžio, plaučių vėžys (104) KLRC3 12p13.2 Natūraliųjų žudikių ląstelių transmembraninis baltymas
Dalyvauja ląstelių proliferacijoje, svarbus ląstelių atsparumui
radioterapijai, inazyvumui ir ląstelių atsinaujinimui Padidėjimas Glioblastoma (105)
PDGFRA 4q12 Ląstelių paviršiaus receptorius iš trombocitų augimo faktoriams
Svarbus organų vystymuisi, žaizdų gyjimui, auglių progresavimui Šio geno mutacijos siejamos su idiopatiniu hipereozinofiliniu sindromu, somatiniais virškinamojo trakto stromos augliais ir vėžiniais susirgimais Padidėjimas Gliomos (106–109) PFN2 3q25.1 Su aktino monomerais besirišantis baltymas profilinas
Reguliuoja aktino polimerizaciją atsake į ekstraląstelinius signalus
bei ląstelių mirtį Padidėjimas
Stemplės plokščiųjų ląstelių karcinoma (110,111) SNAP91 6q14.2 Klatrino apvalkalą sudarantis baltymas
Dalyvauja sinapsių sudaryme, sinapsinių pūslelių (dengtų klatrinu)
reguliacijoje Sumažėjimas Kolorektalinis vėžys, glioblastoma (112–114) CSPG5 3p21.31 Proteoglikanas, nervinės sistemos augimo ir diferenciacijos faktorius
Dalyvauja nervinių ląstelių adhezijoje, sinapsių formavime, aktyvuoja ErbB receptorius ir skatina vėžinių krūties vėžio ląstelių proliferaciją
Padidėjimas Glioma, skrandžio ir gaubtinės žarnos vėžys (115– 117)
Raudona spalva pažymėti genai, priskiriami mezenchiminiam, violetine – pronerviniam, mėlyna – klasikiniam glioblastomos potipiui. CSPG5 genas priskiriamas klasikiniam ir pronerviniam potipiams.
21
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
2.1 Tyrimo planas
Dėl esamo gairių trūkumo, kaip reikėtų atlikti glioblastomų tipavimą, prieš pradedant tyrimus buvo atliekamas kruopštus darbų planavimas. Pirmiausia numatyta iš publikacijų atrinkti genus taikinius, kurie leistų kuo didesniu tikslumu tipuoti glioblastomas. Lygiagrečiai atliekama atranka ir analizė pagal TCGA duomenų bazėje esančią informaciją, atrenkami informatyviausi genai. Palyginus atrinktus duomenis, buvo atliekama palyginamoji taikinių analizė ir sudaromas genų taikinių sąrašas bei patvirtinami atrinkti genai. Vėliau buvo atliekami atrinktų genų raiškos tyrimai, gauti duomenys apdorojami, analizuojami ir GBM mėginiai suskirstomi į potipius. Atliekama klinikinių duomenų ryšio su GBM potipiu analizė. Tyrimo modelio schema pavaizduota 5 paveiksle.
22
2.2 Tiriamoji medžiaga
Tyrimui buvo panaudoti galvos smegenų navikų, glioblastomų, pooperaciniai mėginiai. Visi mėginiai surinkti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno klinikų neurochirurgijos klinikoje 2015-2017 metais ir iki tyrimo saugoti skystame azote (-196°C temperatūroje). Tyrimams gautas Kauno regioninis bioetikos komiteto leidimas Nr. P2-9/2003. Iš pacientų gauti raštiški sutikimai juos informavus apie dalyvavimą projekte. Siekiant užtikrinti pacientų konfidencialumą, visi mėginiai buvo užkoduoti.
Iš navikinių mėginių, pritaikant atitinkamus metodus buvo išskirta ribonukleino rūgštis (RNR), susintetinta kopijinė DNR (kDNR) ir atlikti genų raiškos tyrimai. Atrinkus 16 genų-taikinių bei 5 referentinius genusjų raiška buvo ištirta ir išanalizuota 61 mėginyje.
2.3 Audinio paruošimas
Siekiant padidinti RNR medžiagos išeigą ir ją apsaugoti nuo degradacijos navikiniai audiniai buvo homogenizuojami krio-homogenizacijos būdu, panaudojant skystą azotą. RNR gryninimui buvo panaudota ~100 mg homogenizuoto audinio miltelių.
Reagentai: 3 proc. vandenilio peroksidas, distiliuotas vanduo, skystas azotas.
Priemonės: 1,5 ml centrifuginiai mėgintuvėliai („Safe Lock Tubes 1,5 ml“, Eppendorf AG, Vokietija), aliuminio folija, apsauginiai akiniai, grūstuvė, medicininis chalatas, piestelė, pincetas.
Eiga:
o Visi įrankiai išvalomi naudojant 3proc. vandenilio peroksidą bei distiliuotą vandenį, siekiant sumažinti nukleazių poveikį.
o Pooperacinis audinys trinamas grūstuvėje panaudojant piestelę, šio etapo metu naudojamas skystas azotas, kuris neleidžia audiniui atšilti.
o Gauti homogenizuoto navikinio audinio milteliai perkeliami į mėgintuvėlį be nukleazių, pasveriami. Likusi medžiaga padalinama į papildomus mėgintuvėlius kitiems tyrimams.
o Paruošti mėginiai saugomi -80°C temperatūroje iki RNR gryninimo.
2.4 RNR išskyrimas iš audinio
RNR išskirta iš audinio panaudojant mirVana™ miRNA Isolation Kit rinkinį. Visos procedūros atliktos pagal gamintojo nurodymus.
23
Reagentai: chloroformas (99 proc., #3313.4 Rotipuran, „Carl Roth“, Vokietija), etanolis (96 proc., „Stumbras“, Lietuva), reagentai iš rinkinio: Elution Solution, Lysis/Binding buferis, miRNA Homogenate Additive, Wash solution I, Wash solution 2/3 (mirVana™ miRNA Isolation Kit #1560, Invitrogen, Lietuva).
Priemonės: 1,5 ml centrifuginiai mėgintuvėliai („Safe Lock Tubes 1,5 ml“, Eppendorf AG, Vokietija), centrifuga („Eppendorf centrifuge 5415R“ Eppendorf AG, Hamburgas, Vokietija), keičiamo tūrio pipetės („Eppendorf ResearchPlus“, Eppendorf AG, Vokietija), ledo vonelė, pipetės antgaliai („Sure One Fisherbrand“, Thermo Fisher Scientific, JAV), mėgintuvėliai su filtrais (iš rinkinio mirVana™ miRNA Isolation Kit #1560, Invitrogen, Lietuva), purtyklė („MS2 Minishaker“ IKA, Wilmington, JAV), ultragarsinis homogenizatorius („500-Watt Ultrasonic Homogenizer“, Cole-Parmer, JAV).
Eiga:
o Į homogenizuotus ir -80°C temperatūroje laikytus mėginius įpilama 10 kartų daugiau nei mėginio masė Lysis/Binding buferio ir maišoma, kol mėginys tampa vienalytis. Šis etapas vykdomas mėginį laikant ant ledo, kad mėginys neatšiltų, nes ledo kristalai šylant gali suardyti ląstelės struktūras, išlaisvinti RNAzes.
o Įpilama miRNA Homogenate Additive reagento tiek, kad šis sudarytų 1/10 naudoto Lysis/Binding buferio tūrio, mėginys gerai sumaišomas purtykle ir inkubuojamas 10min. ant ledo.
o Po inkubacijos į mėginį įpilamas chloroformo tūris lygus pradiniam Lysis/Binding reagento tūriui, mėginys 60 s sumaišomas naudojant purtyklę, centrifuguojamas 5 min, 10 000 x g greičiu kambario temperatūroje.
o Po centrifugavimo viršutinioji fazė perkeliama į naują mėgintuvėlį. Chloroformas naudojamas išsodinti organines medžiagas bei atskirti RNR, todėl po centrifugavimo yra matomos trys fazės: mėgintuvėlio apačioje – organinė, kurioje gausu DNR ir baltymų, vidurinė – interfazinė ir viršuje – RNR ištirpusi vandeningoje fazėje.
o Įpilama 1,25 mėginio tūrio etanolio, mėgintuvėlis pavartomas ir visas jo tūris perkeliamas į specialią kolonėlę su filtru patalpintą į 2 ml mėgintuvėlį, centrifuguojama 15 s, 10 000 x g greičiu kambario temperatūroje.
o Po centrifugavimo kolonėlės perkeliamos į kitą, švarų mėgintuvėlį, įpilama 700 µl Wash solution I, centrifuguojama 10 s, 10 000 x g greičiu kambario temperatūroje, filtratas išpilamas. o Į kolonėlę įpilama 500 µl Wash solution 2/3, centrifuguojama 10 s, 10 000 x g greičiu
24
o Mėgintuvėliai su kolonėlėmis centrifuguojami 1 min, 10 000 x g greičiu kambario temperatūroje. Šiame etape vykdoma kolonėlėje esančio filtro su imobilizuota RNR medžiaga džiovinimas nuo užsilikusio praplovimo buferio „Wash solution“. Kolonėlės perkeliamos į naujus 1,5 ml centrifuginius mėgintuvėlius.
o Ant kolonėlėje esančio filtro vidurio užpilama 30 µl iš anksto pašildyto (iki 95°C) „Elution Solution“, centrifuguojama 30 s, didžiausiu greičiu, kambario temperatūroje.
o Po centrifugavimo filtratas surenkamas ir dar kartą užlašinamas ant filtro vidurio ir pakartojamas centrifugavimas.
o Flitrate esanti išgryninta RNR medžiaga kiekybiškai ir kokybiškai įvertinama spektrofotometru ir paliekama saugoti –80°C temperatūroje iki kopijinės DNR (kDNR) sintezės etapo.
2.4.1 RNR koncentracijos ir švarumo matavimas
RNR koncentracijos ir švarumo matavimas leidžia įvertinti turimos RNR kiekį ir kokybę mėginyje, kuris bus naudojamas tolimesniems tyrimams. RNR laikoma švaria, kai esant 260nm/280nm bangos ilgiams santykis ne mažesnis kaip 2,0. Užteršimą fenoliais gali indikuoti mažesnis nei 2,0-2,2 santykis esant 260nm/230nm bangos ilgiams, kadangi fenolinės medžiagos gerai sugeria UV šviesą esant 230nm bangos ilgiui. Jei minėti santykiai mažesni, RNR eksperimentuose gali būti naudojama, bet tai gali turėti įtakos rezultatams. DNR koncentracija ir švarumas buvo išmatuoti naudojantis NanoDrop2000 bekiuvečiu spektrofotometru, kurio matavimo principas pagrįstas šviesos absobcija, kurią sugeria nukleorūgštys.
Reagentai: Elution Solution (mirVana™ miRNA Isolation Kit #1560, Invitrogen, Lietuva).
Priemonės: bekiuvetis spektrofotometras („NanoDrop2000“, # ND-2000, Thermo Fisher Scientific, JAV), keičiamo tūrio pipetės („Eppendorf ResearchPlus“, Eppendorf AG, Vokietija), pipetės antgaliai
(„Sure One Fisherbrand“, Thermo Fisher Scientific, JAV).
Eiga:
o Prieš pradedant matavimus spektrofotometras įjungiamas, paleidžiama „NanoDrop 2000” programa.
o Aparatas sukalibruojamas su buferiu (Elution solution), kuriame buvo ištirpinta RNR. o Atlikus kalibraciją įrenginio pjedestalas švariai nuvalomas.
o Tiriamasis RNR mėginys atšildomas, sumaišomas ir 1,5 µl užnešama ant pjedestalo. o Atliekamas matavimas, įvertinama RNR koncentracija ir švarumas.
25
2.5 kDNR sintezė
Genų raiškos tyrimų esmė kiekybiškai įvertinti informacinės RNR (iRNR) kiekį mėginyje ar ląstelėje, tačiau RNR yra labai nestabili ir jautri aplinkos pokyčiams dėl to reikalingos papildomos manipuliacijos. Siekiant užtikrinti RNR stabilumą ir vienodas sąlygas kiekvieno eksperimento metu yra vykdoma kopijinės DNR (kDNR) sintezė, kuomet veikiant fermentui atvirkštinei transkriptazei prie viengrandės RNR grandinės susintetinama komplementari DNR grandinė. Susintetinta kDNR yra stabilesnė nei RNR ir ją galima laikyti -20°C temperatūroje, kurioje ji išlieka nepakitusi iki 6 mėn. Siekiant, kad visa iRNR būtų susintetinama į kDNR, naudojami atsitiktiniai heksameriniai pradmenys, kuriuose šeši nukleotidai yra išsidėstę visais įmanomais variantais t.y. 5´ – (NNNNNN) –3´, N = A, C, G, G. kDNR sintezė atlikta panaudojant Appied Biosystems™ High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor. Visos procedūros atliktos pagal gamintojo nurodymus.
Reagentai : H2O be nukleazių, DNazė („Dnase I, Rnase-free“, #EN0521, Thermo Fisher Scientific, Lietuva), DNazės buferis („10X Reaction Buffer with MgCl2“, #EN0521 Thermo Fisher Scientific, Lietuva), EDTA buferis („50mM EDTA“, #EN0521, Thermo Fisher Scientific, Lietuva), RNazių inhibitorius (40 U/µl „Ribolock“, #EO0381, Thermo Fisher Scientific, Lietuva), reagentai iš rinkinio: atsitiktiniai heksamerų pradmenys (RT Random Primers), atvirkštinė transkriptazė (MultiScribe® Reverse Transcriptase), nukleotidų mišinys (dNTP Mix), reakcijos buferis (RT buffer) (Appied Biosystems™ High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor, # 4374966, Thermo Fisher Scientific, Lietuva).
Priemonės: 1,5 ml centrifuginiai mėgintuvėliai („Safe Lock Tubes 1,5 ml“, Eppendorf AG, Vokietija), 200 µl PGR mėgintuvėliai, centrifuga („Eppendorf centrifuge 5415R“ Eppendorf AG, Hamburgas, Vokietija), keičiamo tūrio pipetės („Eppendorf ResearchPlus“, Eppendorf AG, Vokietija), laminaras („Airstream Biohazard Safety Cabinet class II“ ESCO, Singapūras), termocikleris („Veriti 96 Well Thermal Cycler“ Applied Biosystems, JAV), pipetės antgaliai („Sure One Fisherbrand“, Thermo Fisher Scientific, JAV), purtyklė („MS2 Minishaker“ IKA, Wilmington, JAV).
Eiga:
o Į 200 µl mėgintuvėlį įpilamas vanduo be nukleazių, kurio kiekis apskaičiuotas pagal RNR koncentraciją (pavyzdžiui, 2 µg RNR turi būti 10 µl tūryje). Mėginiai, kai nevykdoma inkubacija, laikomi šaltame stovelyje.
o Į mėginius įpilama 1/10 bendro tūrio DNazės buferio ir 1U DNazės. Inkubuojama 15 min 37°C. DNazė suardo DNR, kuri galėjo išsiskirti kartu su RNR.
26
o Įpilama po 25 mmol EDTA. Inkubuojama 65°C temperatūroje 10 min. EDTA skirta inaktyvuoti DNazę, kad ši nesuskaidytų pagamintos kDNR.
o Įpilama po 1/10 bendro tūrio atsitiktinių heksamerų pradmenų, 1/10 bendro tūrio reakcijos buferio, 1/25 bendro tūrio dNTP, 20U Ribolock reagento, 50U atvirkštinės transkriptazės, vandens be nukleazių įpilama iki 20 µl bendro tūrio. Trumpai nucentrifuguojama ir mėginiai sudedami į termociklerį, kuriame vyksta inkubacija pagal programą: 10 min 25°C, 120 min 37°C, 5 min 85°C.
o Po reakcijos gaunama kDNR (koncentracija ~100 ng/µl). Paruošiami darbiniai mėginiai, kurių koncentracija yra ~5 ng/µl. Mėginiai iki naudojimo laikomi -20°C (~5 ng/µl koncentacijos) arba -80°C (~100 ng/µl koncentacijos).
2.6 Genų raiškos įvertinimas pritaikant TL-AT-PGR
Genų raiška gali būti nustatoma tikro laiko atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (TL-AT-PGR) metodu. Šis metodas yra kiekybinis ir leidžia nustatyti genų raiškos skirtumus tarp mėginių. Siekiant gauti patikimus rezultatus labai svarbu užtikrinti tikslius reakcijos mišinio bei mėginio kiekius. Vykstant TL-AT-PGR yra matuojama į dvigrandę DNR interkaliuojančio dažo fluorescencija. Didėjant reakcijos ciklų skaičiui bei gausėjant DNR kiekiui, yra matomi signalai, kurie rodo medžiagos kiekį išreikštą Ct reikšme. Siekiant įvertinti genų raiškos skirtumus būtina ištirti „namų ruošos“ (angl. housekeeping) arba kitaip referentinių genų raišką, kuri teoriškai ląstelėse išlieka pastovi, nepriklausomai ar ląstelė yra sveika, ar suvėžėjusi. Ištyrus namų ruošos genų raišką pagal ją galima gana tiksliai įvertinti genų taikinių raiškos pokyčius mėginiuose.
Reakcijoms atlikti buvo naudojamos 96 šulinėlių plokštelės, kuriose vyksta reakcijos. Pirmiausia į šulinėlius išpilstomas reakcijos mišinys, vėliau tiriamieji mėginiai. Kiekvienam mėginiui yra skiriami trys pakartojimai, siekiant užtikrinti rezultatų patikimumą ir norint išvengti klaidingai teigiamų ar neigiamų rezultatų, kurie galėjo atsirasti ne dėl pokyčių tiriamajame mėginyje, bet dėl išorės veiksnių. Kiekvienos reakcijos metu yra naudojama sveikų smegenų kDNR kontrolė, taip pat neigiamos kontrolės – H2O ir kDNR sintezės kontrolė, kurioje nebuvo įdėta atvirkštinės transkriptazės. Sveikų smegenų kontrolės mėginys yra skirtas normalizuoti variacijas tarp reakcijų ir genų raiškos palyginimui tarp sveiko ir navikinio audinio. H2O kontrolė skirta užtikrinti, kad naudojamuose reagentuose nebuvo ar tyrimo atlikimo metu nepateko nukleorūgštys, kurios galėtų turėti įtakos tyrimo rezultatams. Neigiamas kDNR sintezės kontrolinis mėginys yra paruošiamas kiekvienos kDNR sintezės metu tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir kiti mėginiai, išskyrus tai, kad į jo reakciją nėra įdedama atvirkštinės transkriptazės fermento. Neigiama kDNR sintezės kontrolė skirta užtikrinti, kad atliekant kDNR sintezę nebuvo kontaminacijos DNR medžiaga nei mėginiuose, nei naudotuose
27
reagentuose. Minėtos kontrolės svarbios užtikrinti reakcijos specifiškumą, nes tyrimams naudotas SYBR-Green I dažas, kuris nespecifiškai interkaliuoja dvigrandę DNR (žr. 6 pav.). PGR aparatas užfiksuoja sužadintą fluorescenciją ir pateikia ją skaitine išraiška. Siekiant užtikrinti, kad tikro laiko PGR metu būtų pagausinta tik mus dominančio geno seka, svarbu sugeneruoti tinkamus pradmenis, kurie leistų pagausinti tik specifišką kDNR.
6 pav. SYBR® Green I dažo veikimo principas Adaptuota pagal (118)
2.6.1 Pradmenų generavimas genų raiškos tyrimams
Pradmenys, genų raiškos nustatymui, sugeneruoti naudojant PerlPrimer programą (pradmenų sekos pateiktos 2 priede). Genų taikinių genominės DNR ir transkriptų sekos buvo paimtos iš laisvai prieinamos Ensembl transkriptų ir genomų duomenų bazės (http://www.ensembl.org/index.html). Didžiajai daliai taikinių pradmenys, transkripto elementui, sugeneruoti remiantis Sandmann et al., 2015 pateikta amplikono sekos informacija (analizuoti tie patys transkriptai, kaip ir Phillips et al. tyrimo metu) (32). Kiekvienam genui specifiniai pradmenys buvo sukurti taip, kad bent vienas iš
28
pradmenų kirstų egzono-egzono jungtį, amplikono dydis būtų tarp 90-255bp, pradmenų lydymosi temperatūra būtų 58-62°C, o to paties geno-taikinio pradmenų lydymosi temperatūra nesiskirtų daugiau nei 1°C. Iš programoje pateikiamų pradmenų porų buvo pasirinkti tokie, kurių GC santykis tarp 50-60 proc., kuris užtikrina pradmenų specifiškumą ir tuo pačiu tinkamą atkaitinimo temperatūrą, o 3’ pradmens pabaigoje būtų 1-3 nukleotidai sudarantys 3 vandenilines jungtis - G, C, tačiau ne A, T nukleotidai, kurie nulemia mažesnį pradmens specifiškumą. Taip pat buvo siekiama sukurti pradmenis, kurie būtų kuo mažiau komplementarūs tarpusavyje ir nesudarytų antrinių struktūrų reakcijos metu. Atrinkus tinkamiausius pradmenis jie buvo patikrinami naudojant internete laisvai prieinamus įrankius, tokius kaip in silico PGR (http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgPcr) ir NCBI Primer BLAST tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Tyrimo sąlygų optimizavimas atliktas pritaikant įprastą PGR su skirtingomis pradmenų koncentracijomis bei temperatūriniais parametrais (pradmenų hibridizacijos etape), siekiant užtikrinti tikro laiko PGR specifiškumą tik tiriamajam genui.
2.6.2 Genų raiškos nustatymas tikro laiko PGR metodu naudojant SYBR® Green metodą
Reagentai : H2O be nukleazių, kDNR (5 ng/µl), pradmenys, TL-PGR mišinys („Power SYBR® Green PCR Master Mix (2X)“ #4367659, Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific, Jungtinė Karalystė).
Priemonės: 1,5 ml centrifuginiai mėgintuvėliai („Safe Lock Tubes 1,5 ml“, Eppendorf AG, Vokietija), 96-ių šulinėlių plokštelė („MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with barcode“, Applied Biosystems), apsauginė plėvelė („MicroAmp Optical adhesive Film“, Applied Biosystems, JAV), centrifuga („Eppendorf centrifuge 5810R“, Eppendorf AG, Vokietija), keičiamo tūrio pipetės („Eppendorf ResearchPlus“, Eppendorf AG, Vokietija), pipetės antgaliai („Sure One Fisherbrand“, Thermo Fisher Scientific, JAV), tikro laiko PGR termocikleris („Applied Biosystems 7500 Fast“, Applied Biosystems, JAV).
Eiga:
1. Paruošiamas protokolas (kiekvienam mėginiui po 12 µl bendro tūrio) ir į kiekvieną šulinėlį išpilstoma po 9 µl paruošto mišinio; įnešama po 15 ng kDNR (3 priedas).
2. Plokštelė uždengiama apsaugine plėvele, nucentrifuguojama.
29
2.7 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojantis IBM SPSS Statistics (versija 20) ir gauti duomenys vizualizuoti GraphPad Software Inc. „Prism 7.0“ programa. Statistinės hipotezės tikrinimui pasirinktas reikšmingumo lygmuo lygus 0,05. Kokybiniai požymiai, tiriamųjų lytis, amžiaus ir išgyvenamumo grupės aprašyti procentine išraiška. Kokybinių požymių̨ grupių̨ homogeniškumas tikrintas χ2 kriterijumi. Dviejų grupių kiekybinių duomenų palyginimui buvo naudojamas nepriklausomų imčių t kriterijus (angl. t-test), trijų ir daugiau grupių kiekybinių duomenų palyginimui buvo pritaikyta ANOVA analizė su Tiuki (angl. Tukey) vidurkių daugybinių palyginimų (angl. post hoc) kriterijumi. Pacientų išgyvenamumo tikimybės tarp skirtingų potipių vertintos Kaplan-Meier kreivių metodu, o palygintos naudojant Log-rank kriterijų. Pagal tyrimo metu gautų genų raiškos duomenis mėginiai buvo suskirstyti į potipius pritaikant sprendimų medžių algoritmą ir atsitiktinio miško algoritmą, naudojant laisvai prieinamą R paketą (versija 3.4.4).
30
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tyrimo metu atlikta genų taikinių analizė, jų įvertinimas ir parinkimas tyrimui. Glioblastomų sutipavimui pasirinkta naudoti 16 genų taikinių BCAS1, CD4, CDH4, CHI3L1, CSPG5, DAB2, ERBB3, FCGR2B, KLRC3, NES, NR2E1, PDGFRA, PFN2, SNAP91, SPRY2, VAV3. Genų raiška ištirta 61 mėginyje, tyrimui naudoti 5 referentiniai genai: ACTB, GAPDH, HPRT1, YWHAZ, 18S rRNA. Pagal gautus genų raiškos rezultatus mėginiai buvo suskirstyti į potipius pasitelkiant bioinformatikos įrankius, įvertintas ryšys tarp potipių ir klinikinių pacientų duomenų statistiniais metodais.
3.1 Genų taikinių atranka, duomenų bazės analizė ir sutipavimo tikslumo įvertinimas
Genų taikinių atranka buvo vykdoma remiantis publikuotais kitų tyrėjų glioblastomų sutipavimo duomenimis - Phillips su bendraautoriais (62), Verhaak su bendraautoriais (66), Sandmann su bendraautoriais (32). Iš minėtų publikacijų buvo atrenkami genai, kurie atitiktų išsikeltus kriterijus:
a) Genų raiška būtų ištirta ir aprašyta visose atrinktose publikacijose;
b) Geno raiška, kaip biožymuo, būtų priskirta tam pačiam GBM potipiui visose studijose; c) Geno raiška būtų specifiška GBM potipiui.
3 lentelė. Genų kandidatų sąrašai
Genų skaičius Genų pavadinimai
24 BCAS1, CD4, CD45, CDH4, CDK6, CHI3L1, CSPG5, DAB2, DNM3, ERBB3, FCGR2B, GPR17,
KLRC3, MEOX2, NCAM1, NES, NR2E1, PDGFRA, PFN2, SERPINA1, SNAP91, SPRY2, TLR4, VAV3
16 BCAS1, CD4, CDH4, CHI3L1, CSPG5, DAB2, ERBB3, FCGR2B, KLRC3, NES, NR2E1, PDGFRA,
PFN2, SNAP91, SPRY2, VAV3
8 CDH4, CHI3L1, DAB2, ERBB3, FCGR2B, KLRC3, SNAP91, VAV3
Siekiant įvertinti atrinktų taikinių tinkamumą GBM sutipavimui, panaudojome TCGA duomenų bazėje esančius laisvai prieinamus GBM pacientų, kurių potipiai žinomi, raiškos duomenis. GBM sutipavimui atlikti buvo naudojamas atsitiktinio miško (angl. random forest) algoritmas, kurio veikimas pagrįstas spendimų medžio principu. Modelio principas pagrįstas tuo, jog modelis pradžioje apsimoko pagal jam pateikiamus duomenis (šiuo atveju transkriptų raiškos duomenis) suskirstyti pavyzdžius į tam tikras grupes (šiuo atveju GBM potipius), o vėliau jam pateikiama užduotis – suskirstyti tam tikrą imties dalį pagal tai, ką jis išmoko. Kadangi pateiktos užduoties atsakymas iš anksto žinomas, galima pasakyti, kokiu tikslumu modelis gali suskirstyti jam naujai pateiktą informaciją. Modelio apmokymams ir analizei naudojome du duomenų masyvus (iš TCGA duomenų bazės) gautus su skirtingomis mikrogardelių tyrimo platformomis: HU-U133A ir Agilent-4502A, su
31
kuriomis atitinkamai buvo išanalizuota 529 ir 343 GBM pacientų navikiniai mėginiai. Šio modelio funkcionavimui 80 proc. turimų duomenų buvo panaudojama algoritmo apmokymams, o 20 proc. duomenų tyrimui ir verifikacijai abiejų platformų atvejais.
TCGA duomenų bazėje pateikti apie 12000 transkriptų raiškos duomenys ištirti mikrogardelėmis. Pritaikant sprendimų medžio algoritmą iš jų buvo atrinkti 535 genai, kurie buvo svarbūs GBM sutipavimui. Modelio tikslumas panaudojant 535 genus siekė 85-93proc., priklausomai nuo naudotos tyrimo platformos duomenų masyvo. Sekančiame etape modeliui pateikėme 24 mūsų pačių atrinktų genų sąrašą pagal publikuotus duomenis, pagal kurį nurodėme modeliui apsimokyti panaudojant 80 proc. pacientų imtį ir išanalizuoti likusią 20 proc. imtį su abejų platformų duomenimis. Vertėtų paminėti, kad visi mūsų atrinkti genai buvo ir sprendimų medžio algoritmo atrinktame 535 genų sąraše. Pritaikant 24 taikinių raiškos duomenis modelio tikslumas siekė net 79 proc. Buvo nuspręsta dar labiau sumažinti taikinių sąrašą ir sudaryti dar 2 variantai: 16 ir 8 genų sąrašai su kuriais buvo atlikti analogiški vertinimai. Nustatyta, kad panaudojant 16 genų raišką pasiekiamas net 78 proc. glioblastomų sutipavimo tikslumas, tuo tarpu panaudojant 8 genų raišką - 72 proc. (žr. 7 pav.). Įvertinus visus variantus buvo pasirinktas optimaliausias – 16 genų sąrašas, kuriuo vadovaujantis būtų galima nustatyti glioblastomos potipį 78proc. tikslumu. Šis genų sąrašas naudotas tolimesniuose tyrimų etapuose.
7 pav. Atrinktų genų taikinių sutipavimo tikslumas
Tyrimo metu buvo nuspręsta GBM sutipuoti į tris potipius: klasikinį, mezenchiminį ir pronervinį. Į tyrimą nebuvo įtrauktas nervinis potipis dėl to, kad jam nėra priskirti jokie specifiniai genai, kurių raiška leistų identifikuoti šį potipį ir atskirti jį nuo kitų, o naudojamų genų raiška nervinio potipio navikuose labai varijuoja tarp mėginių (67). Taip pat nervinio potipio navikai tesudaro iki 10 proc. visų GBM, kurių genų raiškos profilis panašus į sveikų smegenų audinio genų raiškos profilį (66). Kadangi tiek sprendimų medžių apmokymams, tiek ir analizei buvo naudojami visi keturi potipiai, manoma, kad į tyrimą įtraukus genus, skirtus nervinio potipio klasifikavimui, būtų pasiektas dar didesnis tikslumas.
3.2 GBM raiškos ištyrimas ir suskirstymas į potipius
Genų iRNR raiška tiriamuose mėginiuose nustatyta TL-AT-PGR SYBR Green I metodu. Kaip vidinės kontrolės genai buvo naudojami: ACTB, GAPDH, HPRT1, YWHAZ, 18S rRNA. Tyrimo metu buvo ištirta 16 genų taikinių raiška 61 GBM mėginyje. Genų raiškos skirtumai tarp GBM potipių, kiekvieno taikinio atveju pavaizduoti 8 paveiksle. Panaudojant apmokytą sprendimo medžių
