STOROSIOS ŽARNOS KARCINOMOS KRAS IR NRAS GENŲ MUTACIJŲ DAŽNIO PASISKIRSTYMO DĖSNINGUMAI, TIRIANT FORMALINU FIKSUOTUS Į PARAFINĄ ĮLIETUS AUDINIUS REALAUS LAIKO PGR METODU

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA

ANTROSIOS PAKOPOS STUDIJOS

Dovilė Kalikauskienė Vabalienė

STOROSIOS ŽARNOS KARCINOMOS KRAS IR NRAS GENŲ

MUTACIJŲ DAŽNIO PASISKIRSTYMO DĖSNINGUMAI, TIRIANT

FORMALINU FIKSUOTUS Į PARAFINĄ ĮLIETUS AUDINIUS

REALAUS LAIKO PGR METODU

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovė: prof. habil. dr. Dalia Pangonytė

2

TURINYS

TYRIMO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. KRAS ir NRAS genų vaidmuo, reguliuojant eukariotinių ląstelių augimą ir diferenciaciją ... 10

1.2. KRAS ir NRAS genų neletaliųjų mutacijų reikšmė storosios žarnos karcinomos onkogenezėje .. 12

1.3. Storosios žarnos karcinomos klinikinės morfologinės raiškos charakteristika ... 14

1.4. KRAS ir NRAS genų mutacijų nustatymo diagnostinė vertė, parenkant individualizuotą biologinę terapiją storosios žarnos karcinomos atveju ... 16

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 18

2.1. Storosios žarnos karcinomos audinių paruošimas mikroskopiniam tyrimui ... 18

2.2. DNR išskyrimo iš formalinu fiksuotų į parafiną įlietų storosios žarnos audinių ir gryninimo procedūros ... 20

2.3. KRAS geno mutacijų detekcijos 12/13 ir 61 kodonuose procedūra iš storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių išskirtos DNR ... 22

2.4. KRAS geno mutacijų detekcijos 117 ir 146 bei NRAS geno mutacijų detekcijos 12/13, 59-61, 117, 134 ir 146 kodonuose procedūra iš storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių išskirtos DNR ... 24

2.5. Statistinė analizė ... 25

3. TYRIMO REZULTATAI ... 27

4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 35

IŠVADOS ... 38

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ……….39

3

SANTRAUKA

Dovilė Kalikauskienė Vabalienė

Storosios žarnos karcinomos KRAS ir NRAS genų mutacijų pasiskirsytmo dėsningumai, tiriant formalinu fiksuotus į parafiną įlietus audinius realaus laiko PGR metodu

Vadovė: prof. habil. dr. Dalia Pangonytė

Tyrimo tikslas: nustatyti storosios žarnos karcinomos KRAS ir NRAS genų mutacijų, pasiskirstymo dėsningumus, tiriant formalinu fiksuotus ir į parafiną įlietus audinius realaus laiko PGR metodu.

Tyrimo uždaviniai: 1. Nustatyti pacientų, kuriems patologijos tyrimo metu diagnozuota storosios žarnos karcinoma ir atliktas KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijų detekcijos molekulinis tyrimas, KRAS geno 12/13, 61, 117, 146 kodonų bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117, 146 kodonų mutacijų dažnio pasiskirstymo dėsningumus, atliekant molekulinį tyrimą dviem etapais. 2. Įvertinti pacientų, kuriems molekulinio tyrimo metu nustatyta KRAS arba NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, ir kuriems nustatytas laukinis tipas, storosios žarnos karcinomos anatominę lokalizaciją. 3. Įvertinti sergančių storosios žarnos karcinoma pacientų, kuriems molekulinio tyrimo metu nustatyta KRAS arba NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, ir kuriems nustatytas laukinis tipas, pasiskirstymo pagal PSO TNM klasifikacijos kategorijas. 4. Įvertinti sergančių storosios žarnos karcinoma pacientų, kuriems molekulinio tyrimo metu nustatyta KRAS arba NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, ir kuriems nustatytas laukinis tipas, pirminio piktybinio naviko diferenciacijos laipsnį (G). Tyrimo metodai: Tyrimas atliktas LSMUL KK Patologinės anatomijos klinikoje 2016-09-01 – 2018-06-01 laikotarpiu. Tyrimo objektas – KRAS ir NRAS genų kodonų mutacijos, nustatomos analizuojant DNR, išskirtą iš storosios žarnos karcinomos audinių, prieš tai atlikus mikroskopinį tyrimą šviesiniu mikroskopu. KRAS ir NRAS genų detekcija atlikta dviem etapais: KRAS geno mutacijų detekcija 12/13 ir 61 kodonuose; nenustačius KRAS geno mutacijų 12/13 ir 61 kodonuose, atlikta KRAS geno mutacijų detekcija 117 ir 146 kodonuose bei NRAS geno mutacijų detekcija 12, 13, 59-61, 117 ir 146 kodonuose. Statistinis reikšmingumas p<0,05.

Tyrimo rezultatai: Atlikus 302 pacientų tyrimą KRAS arba NRAS genų kodonų per du tyrimo etapus storosios žarnos karcinomos audinyje KRAS ir NRAS geno mutacijos nustatytos 57,0 proc. tiriamųjų, lyginant su 50,7 proc., kai buvo tiriama tik dažniausios KRAS geno mutacijos vienu etapu (p<0,05). Dažniausia karcinomos lokalizacija – tiesioji (32,8 proc., n = 99) ir riestinė žarna (22,2 proc., n = 67). Abiejose pacientų grupėse vyravo T3 kategorija 51,9 proc., n = 67 – tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų mutacijas; 56,7 proc., n = 59 – tarp turinčiųjų laukinį tipą; p>0,05. Tiek tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų mutacijas, vyravo N0 kategorija: 49,0 proc. (n = 51) tarp turinčiųjų laukinį tipą ir 48,1 proc. (n = 63) tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų mutacijas. Tiek tarp KRAS bei NRAS genų mutacijas turinčių pacientų, tiek tarp pacientų su laukiniu tipu vyravo vidutiniškai diferencijuota (G2) storosios žarnos karcinoma (atitinkamai, 56,9 proc., n = 74 ir 53,6 proc., n = 90; p>0,05). Taip pat pastebėta, jog tarp turinčių laukinį tipą pacientų gerai diferencijuota (G1) storosios žarnos karcinoma buvo statistiškai reikšmingai retesnė, lyginant su pacientais, kuriems nustatytos KRAS ar NRAS genų mutacijos (10 proc., n = 13 ir 16,1 proc., n = 27; p<0,05).

Išvados: 1. Per du tyrimo etapus storosios žarnos karcinomos audinyje KRAS ir NRAS geno mutacijos nustatytos 57,0 proc. tiriamųjų, lyginant su 50,7 proc., kai buvo tiriama tik dažniausios KRAS geno mutacijos vienu etapu (p<0,05). 2. Tiek tarp pacientų su laukiniu tipu, tiek ligonių su nustatytomis KRAS arba NRAS genų kodonų mutacijomis, dažniausiai karcinoma aptinkama tiesiojoje žarnoje bei riestinėje žarnoje. 3. Tiek tarp pacientų su laukiniu tipu, tiek ligonių su nustatytomis KRAS arba NRAS genų mutacijomis dažniausiai nustatyta T3 kategorija pagal TNM klasfikaciją. 4. Statistiškai reikšmingai dažniau KRAS ar NRAS genų kodonų mutacijas turintiems pacientams buvo nustatyta gerai diferencijuota (G1) storosios žarnos karcinoma (p>0,05).

4

SUMMARY

Dovilė Kalikauskienė Vabalienė

Distribution patterns of KRAS and NRAS genes mutations in colorectal carcinoma testing formalin-fixed paraffin embedded tissues by real time PCR

Supervisor: prof. habil. dr. Dalia Pangonytė, MD

Aim of study: to identify distribution patterns of KRAS and NRAS genes mutations in colorectal carcinoma testing paraffin embedded tissues by real time PCR.

Goals: 1.To identify distribution patterns of KRAS and NRAS genes mutations in colorectal carcinoma patients among those with wild type and detected KRAS and NRAS genes codons mutations by two-stage testing. 2. To identify distribution patterns among colorectal carcinoma patients with detected KRAS or NRAS genes codons mutations by tumor‘s anatomical localization, TNM classification categories and grade of differentiation. 3. To identify distribution patterns among colorectal carcinoma patients with KRAS or NRAS genes wild type by tumor‘s anatomical localization, TNM classification categories and grade of differentiation. 4. To compare distribution patterns between colorectal carcinoma patients with detected KRAS or NRAS genes codons mutations and wild type colorectal carcinoma patients by tumor‘s anatomical localization, TNM classification categories and grade of differentiation (G).

Methods: Research was performed at the Department of Pathological Anatomy of LUHSH Kaunas Clinics between 2016-09-01 and 2018-06-01. Object of research – KRAS or NRAS genes codons mutations detected in DNA purified from formalin-fixed paraffin embedded tissues of colorectal carcinoma after thorough pathology examination of colorectal tissues. KRAS and NRAS genes codons were detected by two steps: KRAS gene‘s 12/13 and 61 codons mutation detection; if those mutations are undetected, then KRAS gene‘s 117, 146 codons and NRAS 12/13, 59-61, 117, 146 codons mutations detection. Statistical significance was p<0,05.

Results: KRAS or NRAS genes codons mutations were detected for 57.0% patients by two-stage testing, compared to 50,7% patients by one-testing staging out of 302 tested patients (p<0.05). Most common anatomical localization of colorectal carcinoma were rectum (32.8%, n = 99) and sigmoid intestine (22.2%, n = 67). Most common category of primary colorectal carcinoma was T3 both in patients with detected KRAS or NRAS mutations (51.9%, n = 67) and wild type patients (56.7%, n = 59) (p>0.05). Most common category determining tumor‘s spreading to regional lymphnodes was N0 both in patients with detected KRAS or NRAS mutations (49.04%, n = 51) and wild type patients (48.09%, n = 63) (p>0.05). Most common grade of differentiation in colorectal carcinoma was moderately differentiated (G2) in both groups of patients (56.9%, n = 74 patients with mutation and 53.6%, n = 90 patients with wild type; p>0,05). Morever, well-differentiated (G3) colorectal carcinoma was statistically significantly less common among wild type patients compared to patients with KRAS or NRAS genes mutations (10%, n = 13 and 16.1%, n = 27, adequately; p<0,05).

Conclusions: 1. KRAS or NRAS genes codons mutations in colorectal carcinoma tissue were detected in 57.0% cases by two-stage testing, compared to 50.7% cases by one-stage testing (p<0.05). 2. Most common anatomical localization was rectum and sigmoid intestine for both wild-type group as well as KRAS and NRAS mutation-positive colorectal carcinoma patients. 3. Most common categories of TNM classification were T3 and N0 both for both wild-type as well as KRAS and NRAS mutation-positive colorectal carcinoma patients. 4. Well-differentiated (G1) colorectal carcinoma was statistically significantly less common among wild-type patients compared to patients with KRAS or NRAS genes codons mutations (p<0.05).

5

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei prof. habil. dr. Daliai Pangonytei už metodinę pagalbą atliekant molekulinės patologijos tyrimus ir rengiant baigiamąjį magistro darbą, dėkoju lektorei Mildai Kuprytei už suteiktas teorines ir praktines žinias bei nuolatines konsultacijas.

Dėkoju Patologinės anatomijos klinikos gydytojams patologams, atlikusiems storosios žarnos patologijos tyrimus, kurių išvadomis galėjau remtis.

INTERESŲ KONFLIKTAS

6

SANTRUMPOS

ALK (angl. k. Anaplastic Lymphoma Receptor Tyrosine Kinase) – receptorinė tirozino kinazė; angl. k. – anglų kalba;

Anti-EGFR (angl. k. antibodies against epithelial growth factor receptor) – antikūnai prieš epitelio augimo veiksnio receptorių;

APC (angl. k. adenomatous polyposis colon) – genas, koduojantis naviko augimą slopinantį ir chromosomų skaičiaus stabilumą ląstelei dalijantis užtikrinantį baltymą APC;

BRAF (angl. k. B-Raf proto-oncogene) – genas, koduojantis RAF baltymų šeimai priklausančias serino – treonino kinazę;

ºC – temperatūra pagal Celsijų;

CpG (anglų k. – cytosine-phosphate-guanine) – pasikartojančios „citozino – fosfatinės grupės – guanino“ sekos;

DNR – deoksiribonukleininė rūgštis;

EGFR (angl. k. epithelial growth factor receptor) – epitelio augimo veiksnio receptorius;

ErbB (angl. k. epidermal growth factor family) – receptorinių tirozino kinazių šeima, kuriai priklauso HER1, HER2, HER3 ir HER4;

et al. (lotynų kalba) – ir kiti;

FGF (angl. k. fibroblast growth factor) – fibroblastų augimo veiksnys;

G (G1, G2, G3) – diferenciacijos laipsnis (atitinkamai, gerai diferencijuotas, vidutiniškai diferencijuotas, blogai diferencijuotas);

GAP – guanino trifosfatazę aktyvinanti baltymų sistema; GDP – guanozindifosfatas;

GEF – guanozino difosfato kinazė; GTP – guanozintrifosfatas;

H+E – hematoksilino ir eozino audinių dažymo metodas;

HRAS (angl. k. homologous to the oncogene of the Harvey rat sarcoma virus) – proto-onkogenas; HER (angl. k. human epithelial receptor) – augimo veiksnio receptorius.

JAK/STAT (angl. k. Janus kinase/signal transducer and activator of transcription) sistema – viduląstelinio signalo perdavimą reguliuojanti baltymų sistema;

kt. – kitas, kiti, kitos;

KRAS (angl. k. homologous to the oncogene of the Kirsen rat sarcoma virus) – proto-onkogenas; M (angl. k. metastasis) – tolimosios piktybinio naviko metastazės;

MAPK – mitogeninius signalus aktyvuojančių kinazių sistema; ml – mililitras;

7 MSI – mikrosatelitų nestabilumas;

MYC (angl.k. avian myelocytomatosis virus) – transkripcijos veiksnys; N (angl. k. node) – piktybinio naviko išplitimas į sritinius limfmazgius;

NRAS - (angl. k. – neuroblastoma RAS viral oncogene homolog) – proto-onkogenas; n – atvejų skaičius;

p – statistinis reikšmingumas;

p16 – nuo ciklinų priklausančių kinazių slopiklis (inhibitorius), inaktyvuojantis nuo ciklino D priklausančią kinazę, fosforilinančią retinoblastomos baltymą;

p53 – genas, koduojantis p53 baltymą, reguliuojantį ląstelės ciklą; pav. – paveikslas;

PDGF (angl. k. platelet-derived growth factor) – trombocitų kilmės augimo veiksnys; PGR (angl. k. PCR – polymerase chaina reaction) – polimerazės grandininė reakcija;

PIK3CA (angl. k. Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase gene) – genas, koduojantis fosfatidilinozitol-3-kinazės p110a katalizinį domeną;

proc. – procentai;

PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija;

PTEN (angl. k. Phosphatase And Tensin Homolog gene) – genas, koduojantis naviko augimą slopinantį fosfatazę PTEN, reguliuojančią ląstelės augimą bei dalijimąsi;

RAS (angl. k. rat sarcoma virus) – viduląstelinių signalinių baltymų šeima, reguliuojanti signalo perdavimo kontroliuojant ląstelės proliferaciją, diferenciaciją, adheziją, apoptozę bei migraciją;

RASSF1A (angl. k. Ras association domain family 1 isoform A gene) – genas, koduojantis naviko augimą slopinantį (tumorosupresinį) baltymą, moduliuojantį apoptozinius ir ląstelės ciklo patikros signalinius kelius;

SMAD4 (angl.k. Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4 gene) – genas, koduojantis signalinės sistemtos baltymą, perduodantį signalą iš ląstelės paviršiaus per transformuojantį augimo veiksnio receptorių beta į branduolį;

T (angl. k. tumor) – pirminis piktybinis navikas;

Tm (angl. k. melting temperature) – lydimosi temperatūra

TNM (angl. k. tumor – node – metastasis) – Pasaulinės sveikatos organizacijos standartizuota klasifikacija piktybiniams navikams;

x g (angl. k. units of gravity, or times gravity) – vienetai, kuriais matuojama santykinė centrifugos galia; χ2

8

ĮVADAS

Storosios žarnos karcinoma yra vienas labiausiai paplitusių piktybinių navikų, sąlygojantis didelį pacientų mirštamumą nuo šios navikinės ligos komplikacijų. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, 2012 metais pasaulyje storosios žarnos karcinoma sirgo apie 1,36 milijono žmonių, o mirštamumas siekė 694 000 storosios žarnos karcinoma sergančių pacientų (1). Tuo tarpu, Lietuvoje, Vėžio registro duomenimis, kasmet užregistruojama apie 1600 naujų storosios žarnos atvejų (2).

Moksliniais tyrimais patvirtinta, jog storosios žarnos karcinomos onkogenezėje yra reikšmingos neletalios daugybinės KRAS, NRAS, APC, p53, BRAF, PIK3CA, PTEN, SMAD4 ir kitų genų mutacijos (3-5), sąlygojančios žarnos epitelio ląstelių chromosomų aneuplodiją, delecijas, translokacijas, mikrosatelitinių sekų nestabilumą bei deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) hipermetilinimo reakcijas (6,7). Svarbu atkreipti dėmesį, jog RAS onkogenų šeimos mutacijos nustatomos jau ankstyvoje storosios žarnos onkogenezės stadijoje, o aktyvuojančios KRAS geno apskritai aptinkamos iki 70 proc. karcinomų atvejų (8,9).

Navikų struktūros molekulinių pokyčių analizės metodai vis plačiau taikomi klinikinėje praktikoje ir turi svarią prognostinę bei predikcinę vertę, parenkant individualizuotą paciento sveikatos būklės priežiūros strategiją [10]. Kalbant apie mokslo įrodymais pagrįstą, kryptingą paciento sveikatos būklės priežiūrą diagnozavus storosios žarnos karcinomą, norint pradėti kombinuotą chemoterapijos ir taikinių terapijos su monokloniniais antikūnais prieš epitelio augimo veiksnio receptorių (anti-EGFR) gydymą [11], klinikinėje praktikoje pirmuoju etapu dažniausiai tiriamos KRAS geno 12 ir 13 kodonų mutacijos, o antruoju etapu – KRAS geno 61, 117, 146 kodonų bei NRAS geno 12, 13, 59-61, 117 ir 146 kodonų mutacijos. Nustatytos kliniškai reikšmingos KRAS ar NRAS genų mutacijos gali turėti įtakos formuojantis storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių atsparumui, taikant pasirinktą chemoterapijos ar gydymo monokloniniais antikūnais schemą (11).

Siekiant optimizuoti individualizuotą kombinuotą storosios žarnos karcinomos gydymo strategiją bei optimizuoti paciento sveikatos būklės priežiūros efektyvumą, svarbu detaliai išsiaiškinti storosios žarnos karcinomos KRAS ir NRAS genų mutacijų, lemiančių gydymo taktikos pasirinkimą anti-EGFR monokloniniais antikūnais, dažnumo pasiskirstymo dėsningumus, tiriant formalinu fiksuotus ir į parafiną įlietus storosios žarnos karcinomos audinius realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodu.

9

TYRIMO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo tikslas: nustatyti storosios žarnos karcinomos KRAS ir NRAS genų mutacijų, lemiančių gydymo taktikos pasirinkimą anti-EGFR monokloniniais antikūnais, dažnumo pasiskirstymo dėsningumus, tiriant formalinu fiksuotus ir į parafiną įlietus audinius realaus laiko PGR metodu.

Tyrimo uždaviniai:

1. Nustatyti pacientų, kuriems patologijos tyrimo metu diagnozuota storosios žarnos karcinoma ir atliktas KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijų detekcijos molekulinis tyrimas, KRAS geno 12/13, 61, 117, 146 kodonų bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117, 146 kodonų mutacijų dažnio pasiskirstymo dėsningumus, atliekant molekulinį tyrimą dviem etapais.

2. Įvertinti pacientų, kuriems molekulinio tyrimo metu nustatyta KRAS arba NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, ir kuriems nustatytas laukinis tipas, storosios žarnos karcinomos anatominę lokalizaciją.

3. Įvertinti sergančių storosios žarnos karcinoma pacientų, kuriems molekulinio tyrimo metu nustatyta KRAS arba NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, ir kuriems nustatytas laukinis tipas, pasiskirstymo pagal PSO TNM klasifikacijos kategorijas.

4. Įvertinti sergančių storosios žarnos karcinoma pacientų, kuriems molekulinio tyrimo metu nustatyta KRAS arba NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, ir kuriems nustatytas laukinis tipas, pirminio piktybinio naviko diferenciacijos laipsnį (G).

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. KRAS ir NRAS genų vaidmuo, reguliuojant eukariotinių ląstelių augimą ir diferenciaciją

Ląstelių navikinės transformacijos mechanizmas yra glaudžiai susijęs su eukariotinės ląstelės proliferacijos reguliacijos mechanizmų pažeidimais. Fiziologiškai ląstelės augimo ir proliferacijos kontrolę užtikrina užląsteliniai ir intraląsteliniai signaliniai procesai, kurių svarbiausi komponentai yra: A. Ligandas – augimo veiksnys, pavyzdžiui, trombocitų kilmės augimo veiksniai (PDGF), fibroblastų augimo veiksniai (FGF);

B. Augimo veiksnio receptorius – dažniausiai tirozino kinazių grupės transmembraniniai baltymai, kurių intraląstelinis domenas pasižymi fermentiniu aktyvumu, pavyzdžiui, ErbB receptorių šeima, ALK receptorius;

C. Pirminiai ir antriniai intraląstelinio signalo perdavėjai citoplazmoje, pavyzdžiui, RAS (angl. k. rat sarcoma virus) guanozino trifosfatą (GTP) prijungiančių baltymų (G baltymų) šeima, JAK (angl. k. Janus kinase)/STAT (angl.k. signal transducer and activator of transcription) sistema (4);

D. Transkripcijos veiksniai – turi specifines amino rūgščių sekas, kurių dėka gali jungtis prie DNR ir aktyvuoti ar slopinti genų transkripciją, pavyzdžiui, MYC (angl. k. avian myelocytomatosis virus) transkripcijos veiksnys (12);

E. Ląstelės ciklo baltymai – skatina ląstelę pereiti į kitą aktyvaus ląstelės ciklo etapą – ciklinai, nuo ciklinų priklausančios kinazės bei jų inhibitoriai;

F. Naviko slopinimo veiksniai – slopina ląstelės proliferaciją, pavyzdžiui, retinoblastomos, APC (angl. k. adenomatous polyposis colon) veiksniai (13);

G. Apoptozės procesas – tai pavienių ląstelių „mirties“ forma, kurios metu ląstelė suyra į apoptozinius kūnelius ir yra fagocituojama vietinių makrofagų, nesukeldama uždegimo. Paprastai apoptozės mechanizmas aktyvuojamas ląstelės genomo pažaidų atitaisymo sistemai nesugebėjus ištaisyti esamos DNR pažaidos (14);

H. DNR pažaidų reparacijos mechanizmai – aktyvuojami genai, atsakingi ląstelės ciklo sustabdymą, pažaidų taisymą ir apoptozės aktyvavimą, pavyzdžiui, baltymas p53 (3).

Fiziologiškai ląstelėje dauguma augimo veiksnių prisijungia prie transmembraninių augimo veiksnių receptorių ir, įvykus šių receptorių dimerizacijai, intraląstelinis receptoriaus domenas, paprastai pasižymintis tirozino kinazei būdingu fermentiniu aktyvumu, yra fosforilinamas. Fosforilintas intraląstelinis augimo faktoriaus receptoriaus sužadinį intraląstelinių signalinių baltymų kaskadą, tokiu būdu perduodant mitogeninį signalą į ląstelės branduolį, kur yra aktyvinami transkripcijos veiksniai, atsakingi už eukariotinės ląstelės perėjimą į aktyvaus ciklo fazę. Genai, kurie

11 eukariotinėje ląstelėje yra atsakingi už eukariotinės ląstelės proliferacijos bei diferenciacijos kontrolę, yra vadinami proto-onkogenais, o įvykus neletalioms šių genų mutacijos toks genas tampa onkogenu.

Už viduląstelinei augimo signalą perduodančiai sistemai priklausančių, GTP surišančių, monomerinių RAS šeimos baltymų, esančių ląstelės plazminės membranos vidinio fosfolipidinio sluoksnio paviršiuje, raišką yra atsakingi RAS proto-onkogenai, pirmąkart nustatyti analizuojant ląsteles transformuojančius retrovirusus. Žinduolių ląstelėse nustatyti trys RAS proto-onkogenų grupei priklausantys genai (1 pav.) (4,15):

• HRAS (angl. k. – homologous to the oncogene of the Harvey rat sarcoma virus) – nustatytas 1964 metais 11 chromosomos trumpojo peties p15.5 lokuse, sudarytas iš 7 egzonų, koduoja HRAS baltymą, kurio didžiausia raiška stebima odos ir kiek mažiau – smegenų ir stemplės audiniuose; • KRAS (angl. k. – homologous to the oncogene of the Kirsen rat sarcoma virus) – nustatytas 1970 metais 12 chromosomos trumpojo peties p12.1 lokuse, sudarytas iš 6 egzonų, koduoja KRAS baltymą, kurio didžiausia raiška stebima storosios žarnos, smegenų, stemplės, plonosios žarnos ir kiek mažiau – skrandžio audiniuose. Dėl skirtingo KRAS geno pirminės transkripcinės RNR brendimo pobūdžio, transkripto transliacijos metu gali susidaryti viena iš dviejų, C galo aminorūgščių seka besiskiriančių KRAS baltymo izoformų;

• NRAS (angl. k. – neuroblastoma RAS viral oncogene homolog) – nustatytas 1983 metais neuroblastomos ląstelėse 1 chromosomos trumpojo peties p13.2 lokuse, sudarytas iš 7 egzonų, koduoja NRAS baltymą, kurio didžiausia raiška stebima kaulų čiulpų, storosios žarnos, kirmėlinės ataugos, limfmazgių bei placentos audiniuose.

RAS intraląstelinio signalo perdavimo sistema fiziologiniu požiūriu yra labai svarbi perduodant iš užląstelinės erdvės gautą mitogeninį signalą, generuojamą augimo veiksnių ar užląstelinių signalinių molekulių. Augimo veiksniui prisijungus prie augimo veiksnio receptoriaus ir įvykus viduląstelinio domeno fosforilinimui, aktyvuojama prie specialaus baltymo adaptoriaus prisijungusi guanozino difosfato kinazė (GEF), kuri skatina GDP fosforilinimą. Taip neaktyvus RAS

12 baltymas, savo sudėtyje turintis GDP, yra transformuojamas į aktyvią, savo sudėtyje GTP turinčią formą. Toliau mitogeninis signalas perduodamas RAF-1 kinazei, pradedančiai viduląstelinių signalinių baltymų fosforilinimo kaskadą per mitogeninius signalus aktyvuojančių kinazių (MAPK) kelią. Fosforilinti transkripcijos veiksniai aktyvuoja konkrečių tikslinių genų rinkinių transkripciją – vyksta už eukariotinės ląstelės augimo bei diferenciacijos kontrolę atsakingų genų raiška. Neesant augimo veiksnio signalo, aktyvaus RAS baltymo sudėtyje esantis GTP hidrolizuojamas dalyvaujant fermentui guanozino trifosfatazei, o RAS baltymas, prisijungęs GDP, tampa neaktyviu – RAS signalinė sistema deaktyvuojama (4, 15).

RAS viduląstelinių signalinių baltymų sistemos aktyvumas reguliuojamas cikliškai ir priklauso nuo (4, 15):

1) GTP ir GDP nukleotidų, prisijungusių prie RAS baltymo, kiekio ir jų santykio viduląstelinėje terpėje;

2) GTP hidrolizės reakcijos aktyvumo ir greičio.

Šiuos du procesus reguliuoja už guanino nukleotido perkėlimą atsakinga atskira baltymų sistema, kuri pašalina GDP iš RAS baltymo ir prijungia GTP prie RAS baltymo, bei guanino trifosfatazę aktyvinanti baltymų (GAP) sistema, kuri slopina RAS sistemos aktyvumą (15). Guanozino trifosfatazės ir GEF kompleksas prisijungia prie neaktyvaus RAS – GDP komplekso ir skatina GDP disosociaciją iš šio komplekso. GDP vietą RAS sistemoje pakeičia GTP, sukeldamas GEF disociaciją (15).

Apibendrinant, galima teigti, jog RAS viduląstelinės signalinės sistemos baltymai HRAS, KRAS bei NRAS yra svarbūs ląstelės augimo reguliacijai, reaguojant į užląstelinius augimo signalus ir perduodant šį išorės, ląstelės augimą bei diferenciaciją reguliuojantį signalą į branduolį. Šios viduląstelinės baltymų sistemos aktyvumas reguliuojamas cikliniu principu, priklausomai nuo augimo veiksnių receptorių konformacinių pokyčių bei viduląstelinių sistemos substratų kiekio bei genų raiškos lygmeniu priklausomo nuo kaskadoje dalyvaujančių fermentų aktyvumo bei substratų pokyčių, siekiant išvengti nekontroliuojamo eukariotinės ląstelės augimo.

1.2. KRAS ir NRAS genų neletaliųjų mutacijų reikšmė storosios žarnos karcinomos onkogenezėje

Storosios žarnos karcinoma formuojasi palaipsniui vykstant neletalioms mutacijoms bei sutrikus epigenetiniams mechanizmams, kas skatina storosios žarnos epitelio ląstelių navikinę transformaciją. Sutrikus ląstelių augimo ir proliferacijos reguliacijos mechanizmams, susidaro gėrybiniai navikai – adenomos, o gausėjant ląstelių genomo bei epigenetinių mechanizmų pažeidimų –

13 piktybiniai navikai – karcinomos. Apie 90 proc. atvejų storosios žarnos karcinomos atvejų formuojasi dėl spontaninių neletaliųjų mutacijų (16, 17).

Storosios žarnos epitelio ląstelių genų, atsakingų už ląstelės proliferacijos ir augimo kontrolę, pažaidos gali vykti dėl skirtingo lygmens molekulinių onkogenezės mechanizmų, esant:

A. Mikrosatelitų nestabilumui (MSI) – nustatomas apie 15 proc. storosios žarnos karcinomos atvejų. Mikrosatelitai – tai 1 – 10 nukleotidų ilgio tandeminių pasikartojimų sekos, kartu su dominuojančiomis įterptinėmis sekomis ar transpozoninių sekų liekanomis sudarančios pasikartojančius genomo regionus. Dėl genetinio tandeminių pasikartojimų sekų nestabilumo šiuose genomo regionuose mutacijos vyksta 103 – 106 mutacijų/vienai ląstelių kartai dažniu (18);

B. Suaktyvėjus slopinantiems epigenetinės genų raiškų reguliacijos mechanizmams. Suintensyvėjus CpG (anglų k. – cytosine-phosphate-guanine) turtingų sekų metilinimo reakcijoms, dėl ko susilpnėja naviką slopinančius baltymus koduojančių genų – APC, RASSF1A, p16, E-cadherin transkripcija, kurių slopinimas yra svarbi karcinomos onkogenezės grandis (16, 17, 19, 20).

Be minėtų onkogenezės mechanizmų ne mažiau eukariotinės ląstelės navikinei transformacijai yra reikšmingi už ląstelės augimo kontrolę atsakingų genų, reguliuojančių augimo signalo perdavimą, mutacijos. RAS sistemos genų taškinės mutacijos aptinkamos apie 90 proc. kasos adenokarcinomų bei cholangiokarcinomų, apie 50 proc. storosios žarnos, endometriumo bei skydliaukės karcinomų ir apie 30 proc. – plaučių adenokarcinomų bei mieloleukemijų atvejų (21,22). RAS genų mutacijos rečiausiai pasitaiko gimdos kaklelio ar krūties piktybinių navikų atvejais.

RAS genų neletalios taškinės mutacijos sąlygoja defektyvių savo sandara RAS sistemos baltymų raišką. Šių baltymų esminiai struktūriniai pokyčiai yra nustatomi GTP sujungiančiame ar už GTP hidrolizę atsakingame aminorūgščių sekų regionuose. Įvykus struktūriniams šių regionų pokyčiams, pavyzdžiui 12-oje vietoje aminorūgščių sekoje esančio glicino ar 61-oje vietoje – glutamino (23), sutrinka ciklinė nuo GTP priklausoma RAS sistemos baltymų aktyvacija ir deaktyvacija. GTP nukleotidas lieka prisijungęs prie RAS sistemos baltymo, RAS viduląstelinė signalo perdavimo sistema išlieka aktyvi, ir tokiu būdu eukariotinė ląstelė yra „suklaidinama“ – nesant jokio užląstelinio augimo veiksnio į ląstelės branduolį perduodami signalai, stimuliuojantys už ląstelės dalijimąsi ir augimą genų raišką (15).

Storosios žarnos epitelio ląstelėse vykstant navikinei transformacijai, iki 50 proc. atvejų nustatomos taškinės KRAS geno mutacijos. Dažniausiai apie 90 proc. kliniškai reikšmingos KRAS geno taškinės mutacijos nustatomos 2 egzone: 80 proc. – 12 kodone ir 20 proc. – 13 kodone (24). Apie 10 proc. taškinių KRAS geno mutacijų nustatomos 3 egzono 61 kodone bei 4 egzono 149 kodone. Įvykus taškinėms KRAS geno mutacijoms 2, 3 ar 4 egzonuose, genuose guaninas yra pakeičiamas į adenoziną arba timiną (24). KRAS geno 2 arba 3 egzono taškininės mutacijos lemia ženkliai sumažėjusį RAS

14 sistemai priklausančios guanozino trifosfatazės fermentinį aktyvumą, o 4 egzono taškinės mutacijos sąlygoja GDP transformacijos į GTP stimuliaciją (24).

NRAS geno mutacija aptinkama 3-5 proc., dažniausiai 61 kodone (25). NRAS geno mutacijos 12, 13, 61, 146 kodonuose turi tokį patį poveikį kaip ir KRAS geno mutacijos (RAS GTPazių aktyvumui).

Apibendrinant, galima teigti, jog RAS genų mutacijos sąlygoja reikšmingus struktūrinius jų ekspresuojamų baltymų aminorūgščių sekų pokyčius, kurie gali turėti įtakos susilpnėjusiam ar iškreiptai padidėjusiam fermentiniam RAS sistemos komponentų aktyvumui, kas sutrikdo eukariotinės ląstelės augimo bei diferenciacijos kontrolės mechanizmus bei prisideda prie ląstelių onkogenezinės transformacijos, kurios rezultatas – navikiškai pakitusi ląstelė, gebanti augti ir dalintis bei jokio išorinio ar vidinio augimo signalo. Minėtų molekulinių augimo procesų kontrolės praradimas sudaro palankią aplinką ir sąlygas žmogaus organizme formuotis storosios žarnos navikinei ligai.

1.3. Storosios žarnos karcinomos klinikinės morfologinės raiškos charakteristika

Storosios žarnos karcinoma – tai vienas dažniausiai sutinkamų piktybinių navikų pasaulyje. Didžiausias sergamumas storosios žarnos navikais stebimas Šiaurės, Vakarų Europoje, Australijoje, Naujoje Zelandijoje, Šiaurės Amerikoje (apie 40 – 60 iš 100 000) (26).

Lietuvoje storosios žarnos karcinoma yra vienas iš 5 dažniausiai pasitaikančių piktybinių navikų. Lietuvos vėžio registro duomenimis, 2011 metais užregistruota 905 gaubtinės žarnos vėžio atvejai (28,1 atvejo/100 000 gyventojų) ir 724 tiesiosios žarnos vėžio atvejai (22,5 atvejo/100 000 gyventojų) (2). Pastebėta, jog dažniau serga vyresni nei 55 metų žmonės, ir dažniau storosios žarnos piktybiniai navikai diagnozuojami vyrams (2). Storosios žarnos piktybiniai navikai yra viena dažniausių mirties priežasčių, lyginant su kitais vėžiniais susirgimais: 2010 metais užfiksuota beveik 1000 mirčių, kurias sąlygojo piktybiniai storosios žarnos navikai: gaubtinės žarnos – 15,9 atvejo/100 000 gyventojų, tiesiosios žarnos – 13 atvejų/100 000 gyventojų (2).

Kalbant apie storosios žarnos piktybinių navikų anatominę lokalizaciją, šių piktybinių navikų pasiskirstymas pagal naviko augimo lokalizaciją storojoje žarnos yra panašus. Analizuojant storosios žarnos piktybinių navikų makroskopinio augimo pobūdį, pastebėta, jog proksimaliniame storosios žarnos segmente piktybiniai navikai neretai suformuoja necirkuliarias, polipoidines, egzofitines mases ir kliniškai žarnų obstrukcijos nesukelia (27, 28). Tuo tarpu, distaliau augantiems piktybiniams navikams yra būdingas cirkuliarus, daugiau infiltratyvus augimo pobūdis, kuris progresuojančios

15 storosios žarnos navikinės ligos atvejų neretai kliniškai pasireiškia žarnų nepraeinumu dėl žarnos spindžio stenozės ar visiškos obstrukcijos (27, 28).

Atlikus detalią pašalinto žarnos piktybinio naviko mikroskopinę analizę, įvertinama navikinio audinio histogenezė, architektoninės atipijos bei navikinių ląstelių citologinės atipijos požymiai, gleivių produkcija, diferenciacijos laipsnis, navikinės stromos desmoplastinė reakcija (27). Remiantis morfologiniais navikinių audinių požymiais dažniausiai nustatomi epitelinės kilmės piktybiniai navikai – adenokarcinoma (apie 95 proc. atvejų), rečiau mucininė ar žiedinių ląstelių karcinoma, plokščialąstelinė ar mišri karcinoma (27, 28). Neepitelinės kilmės navikai – virškinamojo trakto stromos karcinoma, lejomiosarkoma – yra diagnozuojami žymiai rečiau (27).

Apibendrinus storosios žarnos piktybinio naviko makroskopinio ir mikroskopinio tyrimo rezultatus, pateikiamos patologijos tyrimo išvados, kuriose pažymima informacija apie naviko histologinį tipą pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos klasifikaciją bei nurodomos TNM klasifikacijos kategorijos (1 lentelė) (27).

1 lentelė. Storosios žarnos pirminio piktybinio naviko Pasaulinės sveikatos organizacijos TNM klasifikacijos kategorijų grupių charakteristika

Kategorija Kategorijos

grupė Kategorijos grupės charakteristika

T Tx Pirminio naviko įvertinti neįmanoma

T0 Pirminio naviko nėra

Tis Carcinoma in situ

T1 Navikas infiltravęs pogleivį

T2 Navikas infiltravęs raumeninį sluoksnį

T3 Navikas per raumeninį sluoksnį infiltravęs subserozinį sluoksnį arba

seroza nepadengtus perikolinius audinius

T4a Navikas peraugęs visceralinę pilvaplėvę

T4b Navikas tiesiogiai infiltravęs gretimus organus ar struktūras

N Nx Sritinių limfmazgių įvetinti neįmanoma

N0 Sritiniuose limfmazgiuose metastazių nėra

N1a Yra metastazių 1 sritiniame limfmazgyje

N1b Yra metastazių 2-3 sritiniuose limfmazgiuose

N1c Navikiniai židiniai subseroziniame, pasaito riebaliniame audiniame,

neperitoniniame riebaliniame audinyje aplink storąją ar tiesiąją žarną, sritiniuose limfmazgiuose metastazių nėra.

N2a Yra metastazių 4 – 6 sritiniuose limfmazgiuose

N2b Yra metastazių 7 ir daugiau sritinių limfmazgių

M M0 Tolimųjų metastazių nėra

M1a Yra metastazių viename organe (pavyzdžiui, kepenyse, plaučiuose,

kiaušidėje, nesritiniuose limfmazgiuose)

16 Apibendrinant galima teigti, kad storosios žarnos piktybiniai navikai, pasižymintys didele biologine įvairove, kurią sąlygoja neletalios, genominį navikinių ląstelių nestabilumą lemiančios mutacijos, yra įvertinami struktūriniu pokyčiu atliekant detalų patologijos tyrimą ir kategorizuojant naviko morfologinius požymius, atsižvelgiant į Pasaulinės sveikatos organizaciją TNM klasifikaciją, kas turi įtakos parenkant tolimesnę paciento sveikatos būklės priežiūros optimizavimo strategiją.

1.4. KRAS ir NRAS genų mutacijų nustatymo diagnostinė vertė, parenkant individualizuotą biologinę terapiją storosios žarnos karcinomos atveju

Vakarų šalyse apie 20 proc. pacientų storosios žarnos karcinomos diagnozė nustatoma esant pažengusiai šios navikinės ligos stadijai (26,27). Vyresniems nei 40 metų pacientams, kuriems diagnozuota išplitusi, su tolimosiomis metastazėmis storosios žarnos karcinoma anksčiau buvo parenkamas standartinis sisteminis taikant chemoterapiją. Tobulėjant chemoterapijoms priemonėms, pacientų išgyvenamumas pailgėjo nuo 12 mėnesių, taikant 5 – fluoruracilo monoterapiją, iki 2 metų, naudojant oksiplatiną, irinotekaną ir taikinių biologinę terapiją (11). Siekiant optimizuoti storosios žarnos karcinomos gydymą, išaiškinamasi atskirų molekulinių sistemų poveikis onkogenezinei eukariotinės ląstelės transformacijai, norint atrasti potencialius medikamentinius preparatus individualizuotai paciento terapijai, nustačius jo navikui specifiškas ir kliniškai reikšmingas mutacijas, ir taip sumažinti, kiek įmanoma, šalutinius gydymo poveikius (11).

Kaip aptarta anksčiau, EGFR yra svarbus molekulinių sistemų, reguliuojančių ląstelės augimą, dalijimąsi, išlikimą bei navikinių ląstelių metastazavimo potencialą, komponentas. Taikininiai preparatai, kurie geba nuslopinti ir užblokuoti šiuos molekulinių sistemų komponentus tampa pirmo pasirinkimo terapine priemone gydant metastazavusią storosios žarnos karcinomą (29, 30). Anti-EGFR terapija su monokloniniais antikūnais cetuksimabu ir panitumumabu ženkliai pagerina chemoterapijos efektyvumą, bet toks efektyvumo didėjimas stebimas tik tarp pacientų, turinčių laukinį KRAS bei NRAS geno alelį (31,32). Štai todėl KRAS ir NRAS genų mutacijų nustatymas šiuo metu yra plačiai taikomas klinikinėje praktikoje, siekiant optimizuoti biologinės terapijos gydymo efektyvumą bei išvengti nepageidaujamų šalutinių poveikių.

Amado ir kitų (31) tyrimo duomenimis, KRAS geno mutacija nustatyta 43 proc. pacientų, sergančių storosios žarnos karcinoma, ir pastebėta, jog terapijos panitumumabu efektyvumas buvo ženkliai didesnis tarp pacientų, turinčių laukinį KRAS geno alelį, nei tų, kuriems nustatyta šio geno mutacija, lyginant išgyvenamumo be ligos progreso trukmę (atitinkamai, 12,3 ir 7,7 savaitės, p<0,001), atsako į terapiją dažnį (atitinkamai, 17 proc. ir 0 proc.) bei bendrą išgyvenamumo trukmę.

17 Karapetis ir kitų (32) tyrimo duomenimis, KRAS geno mutacija nustatyta 42,3 proc. iš 394 pacientų, sirgusių storosios žarnos karcinoma ir gydytų cetuksimabu arba standartine chemoterapija. Pastebėta, jog pacientai, kuriems nustatyta KRAS geno mutacijos, gydymas cetuksimabu nebuvo efektyvus, lyginant bendrą išgyvenamumo trukmę (atitinkamai, 4,8 ir 9,5 mėnesio, p<0,001) bei išgyvenamumo trukmę be ligos progreso (atitinkamai, 1,9 ir 3,78 mėnesio, p<0,001).

Panašūs anti-EGFR terapijos efektyvumo pokyčių dėsningumai pastebėti ir metastazavusia storosios žarnos karcinoma sergantiems pacientams, turintiems NRAS geno mutacijas (NRAS mutacijų dažnis šių pacientų populiacijoje siekia 2 – 5 proc.) (33).

Doudillard ir kitų (33) tyrimo duomenimis, NRAS mutacijos nustatytos tarp 3,4 proc. išplitusia storosios žarnos karcinoma sirgusių pacientų. Lyginant pacientus, turinčius NRAS geno mutaciją ir laukinį alelį, pastarųjų išgyvenamumo trukmė be ligos progreso buvo ilgesnė (atitinkamai, 7,9 ir 10,1 mėnesio, p=0,004) ir bendra išgyvenumo trukmė buvo ilgesnė (atitinkamai, 20,2 ir 26 mėnesiai, p=0,04).

Apibendrinant galima teigti, jog KRAS ir NRAS genų mutacijų detekcija yra reikšminga klinikiniu požiūriu, kadangi nustačius šių genų struktūros pokyčius parenkamas individualizuotas, paciento navikinių ląstelių genetinę transformaciją atitinkantis tikslinis gydymas, sumažinama nepageidaujamo, tiesiogiai su chemoterapija susijusio šalutinio poveikio, tikimybė bei optimizuojamas ligonio, sergančio išplitusia storosios žarnos karcinoma, sveikatos būklės priežiūros planas.

18

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

Tiriamasis objektas – KRAS ir NRAS mutacijos, nustatomos analizuojant DNR, išskirtą iš storosios žarnos karcinomos audinių (biopsinė arba operacinė medžiaga), prieš tai atlikus šių audinių makroskopinį tyrimą, paruošimą mikroskopiniam tyrimui ir mikroskopinį tyrimą šviesiniu mikroskopu.

Iš viso tyrime analizuoti 302 pacientų, kuriems Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Patologinės anatomijos klinikoje gydytojai patologai storosios žarnos karcinomą diagnozavo patologijos tyrimo metu vertinant biopsinę (27,5 proc., n = 83 atvejai) ar operacinę medžiagą (72,5 proc., n = 219 atvejai), DNR mėginiai: 58,3 proc. (n = 176) vyrų ir 41,7 proc. (n = 126) moterų.

Pacientų, kuriems atlikti KRAS ir NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų iš išgrynintos storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių DNR detekcijos tyrimai, amžius buvo vidutiniškai 67,8 ± 10,8 metų (vyrai – 67,9 ± 10,2 metų, moterys – 67,7 ± 11,5 metų; p>0,05).

KRAS ir NRAS genų detekciją darbo autorė atliko dviem etapais: 1 etapas: KRAS geno mutacijų detekcija 12/13 ir 61 kodonuose;

2 etapas: nenustačius KRAS geno mutacijų 12/13 ir 61 kodonuose, atlikta KRAS geno mutacijų detekcija 117 ir 146 kodonuose bei NRAS geno mutacijų detekcija 12, 13, 59-61, 117 ir 146 kodonuose.

2.1.Storosios žarnos karcinomos audinių paruošimas mikroskopiniam tyrimui

Storosios žarnos audinio fragmentai su naviku fiksuojami 10 proc. buferiniu formalino tirpalu. Operacinė medžiaga fiksuojama ne mažiau nei 24 valandas prieš atliekant makroskopinį gautos medžiagos aprašymą bei makroskopinio separavimo procedūrą (2 pav.). Operacinės medžiagos makroskopinio aprašymo metu įvertinama naviko lokalizacija, dydis, santykis su aplinkinėmis pašalintomis anatominėmis struktūromis bei rezekciniais kraštais.

Po makroskopinio vertinimo atliekama operacinės medžiagos separavimo procedūra, mikroskopiniam tyrimui reikalingi audinio fragmentai perkeliami į standartizuotas patologijos tyrimui histologines kasetes (3 pav.).

Patologijos laboratorijoje audinio fragmentai histologinėse kasetėse patalpinami į procesorių “Thermo Shandon Pathcentre Tissue Processor” („Thermo Fisher Scientific“, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos), kuriame standartizuotai atliekamos audinių fiksavimo, dehidratacijos, skaidrinimo bei impregnavimo parafinu procedūros.

19

2 pav. Storosios žarnos karcinoma (operacinė medžiaga, atverta išilgai rezekuoto storosios žarnos fragmento, fiksuota 10 proc. buferiniu formalino tirpalu)

Parafine impregnuoti audiniai pernešami į blokų formavino centrą bei patalpinami į parafino vonelę, iš kurios išimamos histologinės kasetės. Histologinės kasetės atidaromos, audinys įdedamas į įliejimo formelę, orientuojamas centre, švelniai prispaudžiamas prie dugno pinceto pagalba, su parafino dozatoriumi užliejama šilto parafino. Parafino bloko formelė su audiniu padedama ant šaldomosios plokštės. Parafinui sustingus, iš formelės išimamas suformuotas parafininis blokas, kuriame įlietas storosios žarnos su naviku audinio fragmentas (4 pav.).

Parafininiai blokai su storosios žarnos audinio fragmentais pjaunami rotaciniu pusiau automatiniu mikrotomu „Leica RM2245“ („Leica Biosystems“, Wetzlar, Vokietija). 3 μm storio pjūvis ištiesinamas bei panardinus objektyvinį stiklelį į vonelę, švelniai “užtraukiamas” ant objektinio stiklelio. Preparatas nusausinamas, džiovinamas esant kambario temperatūrai, vėliau transportuojamas į termostatą (60ºC).

Histologiniai preparatai dažomi rutininiu H+E (hematoksilino ir eozino) būdu. Hematoksilino dažai ląstelės branduolius nudažo mėlynai, eozinas ląstelės citoplazmą nudažo įvairiais rožinės spalvos

3 pav. Storosios žarnos karcinomos audinio fragmentai standartizuotose patologijos tyrimui histologinėse kasetėse (iš operacinės medžiagos, fiksuota 10 proc. buferiniu formalino tirpalu)

20

4 pav. Storosios žarnos karcinomos fragmentai, įlieti į parafino blokus

atspalviais, priklausomai nuo citoplazmos sudėties. Histologinių preparatų dažymo procedūra atliekamo automatizuotai, naudojant histologinių preparatų dažymo instrumentą “Thermo ScientificTM Gemini AS Automated Slide Stainer” („Thermo Fisher Scientific“, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos). Preparatai sudedami į specialų, dažymo instrumentui pritaikytą stovą, kuris patalpinamas į histologinių preparatų dažymo instrumentą, parenkamas histologinių preparatų dažymo hematoksilinu ir eozinu protokolas pagal numatyto instrumento programą.

Nudažyti histologiniai preparatai padengiami dengiamaisiais stikleliais. Parengus storosios žarnos karcinomos audinius mikroskopiniam tyrimui, šviesiniu mikroskopu įvertinamas histologinis storosios žarnos pirminio naviko tipas pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos klasifikaciją, T ir N kategorijos, piktybinio naviko diferenciacijos laipsnis, parenkamas informatyviausias naviko plotas genetiniam tyrimui ir DNR išskyrimui.

2.2. DNR išskyrimo iš formalinu fiksuotų į parafiną įlietų storosios žarnos audinių ir gryninimo procedūros

DNR išskiriama ir gryninama iš formaline fiksuotų į parafiną įlietų storosios žarnos karcinomos audinių, naudojant „cobas® DNA Sample Preparation Kit“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija) rinkinį taikant IVD reikalavimus. DNR, išgryninta panaudojus šį rinkinį, yra tinkama realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) atlikimui ir galimų KRAS bei NRAS genų mutacijų detekcijai, nes DNR yra išvaloma nuo įvairių biologinių medžiagų ir PGR inhibitorių.

Gydytojas patologas mikroskopinio tyrimo metu įvertinęs ir nustatęs informatyviausią ir tyrimui optimalų storosios žarnos karcinomos plotą, parenka parafino bloką su įlietu atitinkamu

21 audinio fragmentu. Nupjaunamas vienas 5μm audinio pjūvis, dedamas į sterilų, 1,5 ml mėgintuvėlį, neliečiant vidinės audinio pusės. Deparafinizavimo procedūra, panaudojant ksileno bei etanolio tirpalus. Po parafino pašalinimo mėgintuvėliai dedami į 560C laipsnių kaitinimo bloką ir laikomi, kol gauta granulė bus sausa.

Atliekant ląstelių lizavimo procedūrą, ant sausos granulės pilama 180 μl DNR audinių lizės buferinio tirpalo ir 70 μl proteinazės K, mėginiai maišomi 30 sekundžių, tada sudedami į 560C kaitinimo bloką 60 minučių, po to maišomi 10 sekundžių ir grąžinami atgal į kaitinimo bloką, kur esant 900C temperatūrai, laikomi 60 minučių. Po inkubacijos mėginiai vėsinami 10 minučių ir centrifuguojami 6 – 10 sekundžių.

Pilama 200 μl DNR parafiną surišančio buferinio tirpalo, mėginiai laikomi, esant kambario temperatūrai, 10 min. Po to įpilama 100 μl propanolio. Mėginiai maišomi ir visas turinys perkeliamas į surinkimo mėgintuvėlį su filtru. Nucentrifugavus skystis išmetamas kartu su mėgintuvėliu, filtras perkeliamas į kitą surinkimo mėgintuvėlį.

Toliau vykdomas DNR gryninimas. Pilamas DNR plovimo buferinis tirpalas I – 500 μl, centrifuguojama 8000 x g galia 1 minutę. Turinys išpilamas, mėgintuvėlis nusausinamas ir filtras dedamas į tą patį surinkimo mėgintuvėlį. Vykdomas antras DNR valymo etapas: pilamas DNR plovimo buferinis tirpalas II – 500 μl, centrifuguojama 8000 x g galia 1 minutę. Turinys išpilamas, filtras dedamas į naują surinkimo mėgintuvėlį ir centrifuguojama 17000 x g galia 1 minutę.

DNR išskyrimas kolonėlėje pagrįstas adsorbcija ant kieto paviršiaus. Lizuojamos biologinio objekto ląstelės prisitvirtina ant filtrų dėl aukštos joninės jėgos chaotropinių tirpalų, o nuo filtro nuplaunamos specialiu eliucijos buferiu. Pilama 100 μl DNR išplovimo buferinio tirpalo, mėginiai centrifuguojami 8000 x g galia 1 minutę. Išgryninta DNR gali būti panaudota tolimesniems tyrimams arba laikoma užšaldyta, esant -200C iki planuojamo tyrimo.

Siekiant įvertinti išgrynintos iš storosios žarnos karcinomos audinių DNR koncentraciją ir švarumą, naudojamas „NanoDrop 2000 UV-Vis“ („Thermo Fisher Scientific“, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos) spektrofotometras. Šiuo spektrofotometru galima matuoti mažus DNR pavyzdžių kiekius nuo 0,5 iki 2 μl. Norint išmatuoti DNR koncentraciją ir švarumą, matuojama tirpalo absorbcija (optinis tankis), esant 260 nm UV bangų ilgiui. DNR švarumą nusako dydžių, gautų esant 260 nm ir 280 nm bangos ilgiams, santykis (norma 1,8-2,0).

Paėmus 2 μl tirpalo, jis perkeliamas ant spektrofotometro detektoriaus. Programoje, pasirinkus komandą matuoti, po keletos sekundžių kompiuteryje parodoma norimo tirpalo koncentracija. Po kiekvieno skirtingo mėginio koncentracijos matavimo, detektorius nuplaunamas su vandeniu be nukleazių, kad nebūtų iškreipta kitų mėginių koncetracijos vertė. DNR koncentracija turi būti ≥ 5 ng/μl, kad būtų galima atlikti realaus laiko PGR, panaudojant rinkinį „cobas®KRAS Mutation Test“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija).


22 2.3. KRAS geno mutacijų detekcijos 12/13 ir 61 kodonuose procedūra iš storosios žarnos

karcinomos navikinių ląstelių išskirtos DNR

Siekiant padauginti iš storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių išskirtus DNR fragmentus ir įvertinti KRAS geno 12/13 bei 61 kodonų struktūrinę būklę (laukinis alelis ar mutacija), imama 25 μl paruošto 5 ng/μl koncentracijos išskirtos DNR tirpalo.

Ruošiant pagrindinį darbinį mišinį realaus laiko PGR ir KRAS geno 12/13 ir 61 kodonų mutacijų nustatymui, apskaičiuojamas reikalingas reakcijai reagentų kiekis pagal rinkinio „cobas® KRAS Mutation Test“ taikant IVD rekomendacijas. Paruošti „cobas® KRAS Mutation Test“ rinkinio reagentai atšildomi iki kambario temperatūros. Pažymimi du sterilūs mikrocentrifugos mėgintuvėliai, skirti darbiniam pagrindiniam mišiniui. Mišiniui reikalingi reagentai supilstomi į sterilius mėgintuvėlius.

Atsargiai įlašinama po 25 μl paruošto darbinio mišinio (reakcijos mišinys ir atitinkami pradmenys bei fluoroforu žymėti zondai) į kiekvieną mikroplokštelės šulinėlį. Pipete įlašinama 25 μl atskiesto mėginio DNR į atitinkamą šulinėlį, kaskart keičiant mikrodozatoriaus antgalį. Pipete su nauju antgaliu įlašinama 25 μl paruošto kontrolinio mišinio, kuriame yra mėginio DNR su patvirtintomis KRAS geno tiriamų kodonų mutacijomis (teigiama kontrolė) į reakcijų dėklo šulinėlius A01 ir A02 pozicijose. Po to įlašinama 25 μl kontrolinio mišinio, kuriame vietoj mėginio DNR yra specialiai rinkinyje paruoštas vanduo (neigiama kontrolė) į reakcijų mikroplokštelės šulinėlius B01 ir B02 pozicijose. 25 μl tyrimo kalibracijai reikalingo mišinio įlašinama į C01, C02 padėties mikroplokštelės šulinėlius, kaskart keičiant antgalius. Įsitikinama, kad visas skystis yra šulinėlio dugne, o šulinėlio kraštuose “nekabėtų” mėginių tirpalų lašai. Reakcijų mikroplokštelės dėklas yra uždengiamas sandarinimo plėvele (pateikiama kartu su mikroplokštele) (5 pav.).

5 pav. Reakcijos mikroplokštelė su realaus laiko PGR ir mutacijų detekcijai mėginiais (žymėjimai: „+“ – teigiama kontrolė; „-“ – neigiama kontrolė; „K“ – kalibravimo mišinys; vertikaliai sunumeruoti šulinėliai –

23

6 pav. Reakcijos mikroplokštelė su storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių DNR, kontroliniais ir kalibravimo mėginiais patalpinamas į tyrimo instrumentą „cobas® z 480“ („Roche Molecular

Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija)

Padengus reakcijų mikroplokštelės dėklą sandarinimo plėvele, dėklas yra patalpinamas į realaus laiko PGR atlikimo ir mutacijų detekcijos instrumentą „cobas® z 480“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija) (6 pav.), kompiuterinėje programoje „Cobas® 4800 V.2.1“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija) nurodant šulinėlių pozicijas mikroplokštelėje ir nustant reakcijos parametrus pagal rekomenduojamas tyrimo protokolo sąlygas.

7 pav. KRAS geno 12/13 ir 61 kodonų detekcijos tyrimo, kontrolinių bei kalibracijos mėginių išvados (kompiuterinė programa „Cobas® 4800 V.2.1“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija))

24 Tyrimo instrumentui pabaigus atitinkamas reakcijas ir KRAS geno mutacijų 12/13 bei 61 kodonuose detekcijos procedūras, kompiuterinėje programoje pateikiamos išvados apie tirtų kodonų būklę. Šie rezultatai lyginami su kontrolinių ir kalbravimo mėginių rezultatais (7 pav.).

Neaptikus KRAS mutacijų 12/13 ir 61 kodonuose, pereinama prie antrojo storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių molekulinio tyrimo etapo.

2.4. KRAS geno mutacijų detekcijos 117 ir 146 bei NRAS geno mutacijų detekcijos 12/13, 59-61, 117 ir 146 kodonuose procedūra iš storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių išskirtos DNR

Siekiant padauginti iš storosios žarnos karcinomos navikinių ląstelių išskirtus DNR fragmentus ir įvertinti KRAS geno 117, 146 kodonų bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117 bei 146 kodonų struktūrinę būklę (laukinis alelis ar mutacija), imama 5 μl paruošto 5 ng/μl koncentracijos išskirtos DNR tirpalo.

Ruošiant pagrindinį darbinį mišinį realaus laiko PGR ir KRAS geno 117, 146 kodonų bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117, 134 bei 146 kodonų mutacijų nustatymui, apskaičiuojamas reikalingas reakcijai reagentų kiekis pagal rinkinio „LightMix® Kit NRAS 12-13, 59-61, 117, 146 and KRAS 117, 146“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija) rekomendacijas. Paruošti „LightMix® Kit NRAS 12-13, 59-61, 117, 134, 146 and KRAS 117, 146“ rinkinio reagentai atšildomi iki kambario temperatūros. Mišiniui reikalingi reagentai supilstomi į sterilius mėgintuvėlius.

Atsargiai įlašinama po 15 μl paruošto darbinio mišinio (reakcijos mišinys ir atitinkami pradmenys bei fluoroforu žymėti zondai) į kiekvieną mikroplokštelės šulinėlį. Pipete įlašinama 5 μl atskiesto mėginio DNR į atitinkamą šulinėlį, kaskart keičiant mikrodozatoriaus antgalį. Pipete su nauju antgaliu įlašinama 5 μl paruošto kontrolinio mišinio, kuriame yra mėginio DNR su patvirtintomis KRAS ir NRAS genų tiriamų kodonų mutacijomis (teigiama kontrolė). Po to įlašinama 5 μl kontrolinio mišinio, kuriame vietoj DNR mėginio yra specialiai reakcijai paruoštas vanduo (neigiama kontrolė). Įsitikinama, kad visas skystis yra šulinėlio dugne, o šulinėlio kraštuose “nekabėtų” mėginių tirpalų lašai. Reakcijų mikroplokštelės dėklas yra uždengiamas sandarinimo plėvele (pateikiama kartu su mikroplokštele).

Padengus reakcijų mikroplokštelės dėklą sandarinimo plėvele, dėklas yra patalpinamas į realaus laiko PGR atlikimo ir mutacijų detekcijos instrumentą „cobas® z 480“, kompiuterinėje programoje „Cobas® 4800 V.2.1“ nurodant šulinėlių pozicijas mikroplokštelėje ir nustant reakcijos parametrus pagal rekomenduojamas tyrimo protokolo sąlygas.

Tyrimo instrumentui pabaigus atitinkamas reakcijas ir KRAS geno 117, 146 kodonuose bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117 ir 146 kodonuose detekcijos procedūras, kompiuterinėje programoje

25

8 pav. KRAS geno 117 ir 134 kodonų bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117, 146 kodonų detekcijos tyrimo išvados ir Tm kreivės analizė NRAS geno 117 kodono mutacijos detekcijai patvirtinti (kompiuterinė

programa „Cobas® 4800 V.2.1“ („Roche Molecular Diagnostics“, Bazelis, Šveicarija))

„Cobas® 4800 V.2.1“ pateikiamos išvados apie tirtų kodonų būklę. Siekiant įsitikinti pateikiamomis tyrimo instrumento programos išvadomis apie minėtų KRAS ir NRAS genų kodonų būklę, analizuojamos atitinkamų mėginių DNR fluorescencijos intensyvumą, esant tam tikrai lydimosi temperatūrai, ieškant intensyviausios fluorescencijos, atitinkančios nurodytas lydimosi temperatūrų vertes, esant mutacijoms skirtinguose KRAS ir NRAS genų kodonuose. Šie rezultatai lyginami su kontrolinių mėginių rezultatais (8 pav.). Galutinį vertinimą atlieka gydytojas patologas.

2.5. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant statistinės analizės programą „IBM SPSS Statistics 20.0“ (Armonkas, Niujorkas, Jungtinės Amerikos Valstijos). Kiekybinei duomenų analizei hipotezė apie matuojamų požymių reikšmių normalųjį skirtinį tikrinta taikant Kolmogorov-Smirnov kriterijų.

Tiriamiesiems požymiams aprašyti buvo naudojama aprašomosios statistikos charakteristika – vidurkis bei standartinis nuokrypis. Kokybinei duomenų analizei skirtumams tarp grupių nustatyti

26 buvo taikyti χ2 kriterijus bei Fisher vienpusio ir dvipusio kriterijų skaičiavimas. Statistinių hipotezių tikrinimui buvo taikytas statistinio reikšmingumo lygmuo p<0,05.

27

3.TYRIMO REZULTATAI

RAS genų mutacijų nustatymas atliktas realaus laiko PGR termocikleriu dviem etapais, atsižvelgiant į šių mutacijų dažnumą ir galimybę taikyti IVD metodiką bei tyrimo kaštus.

Pirmuoju storosios žarnos karcinomos molekulinio tyrimo etapu atlikta KRAS geno 12/13 ar 61 kodonų mutacijų nustatymas. Šios mutacijos apatiktos 50,7 proc. pacientų: 49,7 proc. (n = 149 atvejai) – KRAS geno 12/13 kodonų mutacija ir 1,0 proc. (n = 3 atvejai) – KRAS geno 61 kodono mutacija (p<0,05). 49,3 proc. tirtų pacientų (n = 150 atvejų) KRAS geno 12/13 arba 61 kodonų mutacijos pirmuoju molekulinio tyrimo etapu nenustatytos (9 pav.).

Storosios žarnos karcinoma sergantiems pacientams, kuriems KRAS geno 12/13 ar 61 kodonų mutacijų nenustatyta pirmuoju molekulinio tyrimo etapu, atliktas KRAS geno 117, 146 kodonų bei NRAS geno 12/13, 59-61, 117 ir 146 kodonų mutacijų detekcijos molekulinis tyrimas. Antruoju molekulinio tyrimo etapu dažniau nustatyta KRAS geno 146 kodono (n = 7 atvejai), 117 kodono mutacija (n = 1 atvejis). NRAS geno 12/13 kodono mutacija nustatyta 5 pacientams, 59-61 kodonų – 4 ir 146 kodono – 3 pacientams. NRAS geno 117 kodono mutacijų nenustatyta (10 pav.).

Taigi, atlikus detalią 302 pacientų, kuriems patologijos tyrimo metu diagnozuota storosios žarnos karcinoma, dviejų etapų analizę, KRAS arba NRAS genų kodonų kliniškai reikšmingos mutacijos nustatytos 57,0 proc. (n = 172 atvejai) pacientų, lyginant su 50,7 proc. pirmuoju etapu (p<0,05), kai buvo nustatomos tik dažniausios mutacijos (11 pav.).

9 pav. KRAS geno 12/13 ir 61 kodonų mutacijų pasiskirstymas tarp storosios žarnos karcinoma sergančių pacientų, kuriems atliktas molekulinis KRAS geno tyrimas pirmuoju etapu

150 49,7% 3 1,0% 149 49,3%

KRAS geno 12/13 kodono mutacija

KRAS geno 61 kodono mutacija

KRAS geno 12/13 arba 61 kodonų mutacijų nenustatyta

28

10 pav. KRAS geno 117, 146 kodonų ir NRAS geno 12/13, 59-61 ir 146 kodonų mutacijų pasiskirstymas tarp storosios žarnos karcinoma sergančių pacientų, kuriems atliktas molekulinis KRAS ir NRAS genų

tyrimas antruoju etapu

Palyginome ligonių sergančių storžarnės karcinoma klinikinę ir morfologinę charakteristiką, kai buvo nustatytas KRAS ir NRAS genų laukinis tipas ir kai buvo jų kodonų mutacijos. Šios dvi grupės lyties požiūriu nesiskyrė. Vyrams storosios žarnos karcinoma buvo diagnozuota dažniau tiek tarp pacientų, turinčių laukinį tipą (60 proc., n = 78), ir tarp tų, kuriems nustatyta KRAS ar NRAS genų kodonų mutacijos (57 proc., n = 98) (p>0,05) (12 pav.).

11 pav. KRAS ir NRAS mutacijų dažnio pasiskirstymo dėsningumai tarp storosios žarnos karcinoma sergančių pacientų, atliekant molekulinį tyrimą pirmuoju etapu ir dviem etapais (p<0,05)

1 1% 7 5% 5 3% 4 2% 3 2% 130 87%

Nustatyta KRAS geno 117 kodono mutacija

Nustatyta KRAS geno 146 kodono mutacija

Nustatyta NRAS geno 12/13 kodonų mutacija

Nustatyta NRAS geno 59-61 kodonų mutacija

Nustatyta NRAS geno 146 kodono mutacija

KRAS ir NRAS genų mutacijų nenustatyta

50,7 57 49,3 43 0 10 20 30 40 50 60 70

Pirmuoju etapu Dviem etapais

da

žn

is

(p

ro

c.) KRAS ir NRAS genų

mutacijų nustatyta

KRAS ir NRAS genų mutacijų nenustatyta

29

12 pav. Pacientų, kuriems diagnozuota storosios žarnos karcinoma ir atliktas molekulinis tyrimas dėl KRAS ar NRAS genų kodonų mutacijų, pasiskirstymas pagal lytį (p>0,05)

Dažniausia storosios žarnos karcinomos anatominė lokalizacija buvo tiesioji (32,8 proc., n = 99 atvejai) riestinė (22,2 proc., n = 67 atvejai) ir kylančioji žarna (12,9 proc., n = 39 atvejai), rečiausiai – kirmėlinė atauga (0,3 proc., n = 1 atvejis), išangės ir analinis kanalas (0,7 proc., n = 2 atvejai) bei nusileidžiančioji žarna (3,6 proc., n = 11 atvejų) (13 pav.).

13 pav. Storosios žarnos karcinomos anatominė lokalizacija

60 ₅₇ 40 ₄₃ 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Laukinis tipas KRAS/NRAS genų kodonų mutacijos

Vyrai Moterys tiesioji 32,8% riestinė 22,2% kylančioji 12,9% akloji 6,3% skersinė 4,6% nusileidžiančioji 3,6% išangė ir analinis kanalas 0,7% kirmėlinė atauga 0,3% metastazė 11,6% nepatikslinta 5,0%

30

14 pav. Storosios žarnos karcinomos anatominė lokalizacija, kai buvo nustatyta KRAS/NRAS genų kodonų mutacijos ir laukinis alelis (p>0,05)

Palyginus sergančiųjų storosios žarnos karcinoma pacientų, kuriems nustatyta KRAS bei NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijos, bei turinčiųjų šių genų kodonų laukinį alelį, nustatyta, jog karcinomos pasiskirstymas pagal lokalizaciją anatominiu požiūriu statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) (14 pav.).

15 pav. Storosios žarnos karcinomos pasiskirstymas pagal T kategoriją, nustatytą tiriant operacinę medžiagą vertinant pagal TNM klasifikaciją

29,2 35,5 26,2 19,2 16,2 10,5 4,6 7,6 3,8 3,5 5,4 4,1 0 1,2 0 0,6 14 4,1 0% 20% 40% 60% 80% 100% Laukinis tipas tiesioji riestinė kylančioji akloji nusileidžiančioji skersinė išangė ir analinis kanalas kirmėlinė atauga metastazė nepatikslinta T4b 2,4% T4a 20,6% T3 54,1% T2 14,6% T1 8,3%

31

16 pav. Storosios žarnos karcinomos pasiskirstymas pagal T kategorijas (TNM klasifikacija pagal PSO) tarp pacientų, turinčių KRAS/NRAS genų kodonų mutacijas ir laukinį alelį (p>0,05)

Kai KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijos detekcijos testai buvo atliekami išskyrus DNR iš navikinių ląstelių, esančių operacinėje medžiagoje, nustatyta, jog dažniausiai patologijos tyrimo metu storosios žarnos karcinoma buvo infiltravusi serozos ar pilvaplėve nedengtą prie storosios žarnos esantį riebalinį audinį – T3 kategorija pagal PSO TNM klasifikaciją (54,1 proc., n = 126 atvejai), kiek rečiau – peraugusi serozą, bet neinfiltruojanti greta esančių audinių – T4a kategorija pagal PSO TNM klasifikaciją (20,6 proc., n = 48 atvejai). Analizuojant operacinę medžiagą, rečiausiai nustatyta storosios žarnos karcinoma, infiltruojanti gretimus organus – T4b kategorija pagal PSO TNM klasifikaciją (2,4 proc., n = 6 atvejai) (15 pav.).

Atlikus operacinės medžiagos analizę ir palyginus pacientų, kuriems nustatyta KRAS ir NRAS genų kodonų mutacijos, ir turinčiųjų laukinį šių genų alelį, nustatyta, jog storosios žarnos karcinomos pasiskirstymas pagal T kategoriją (TNM klasifikacija pagal PSO), buvo panašus. Abiejose pacientų grupėse tarp kategorijų, diagnozuotų atliekant storosios žarnos karcinomos operacinės medžiagos patologijos tyrimą, vyravo T3 kategorija (51,9 proc., n = 67 atvejai – tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijas; 56,7 proc., n = 59 atvejai – tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų laukinį alelį; p>0,05) (16 pav.).

Vertinant storosios žarnos karcinomos išplitimą į sritinius limfmazgius, pastebėta, jog dažniausiai tarp pacientų, kuriems KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijų detekcijos procedūros atliktos iš operacinės medžiagos išgrynintos navikinių ląstelių DNR, dažniausiai karcinomos plitimo į limfmazgius nenustatyta – N0 kategorija pagal PSO TNM klasifikaciją (48,5 proc., n = 114 atvejų), 2,9 2,4 20,2 20,9 56,7 _51,9 14,4 14,7 5,8 _10,1 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Laukinis tipas KRAS/NRAS genų kodonų

mutacijos T4b T4a T3 T2 T1

32

17 pav. Storosios žarnos karcinomos pasiskirstymas pagal N kategoriją, nustatytą iš operacinės medžiagos vertinant pagal TNM klasifikaciją

kiek rečiau – N1b ir N1a kategorijos (atitinkamai 14,5 proc., n = 34 atvejai ir 13,2 proc., n = 31 atvejis) (17 pav.).

Vertinant pacientų, kuriems atliktas storosios žarnos operacinės medžiagos patologijos tyrimas ir KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijos tyrimai iš navikinių ląstelių DNR, pastebėta, jog tiek tarp pacientų, turinčių laukinį KRAS bei NRAS genų tipą, tiek tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų kliniškai reikšmingų kodonų mutacijas, vyravo N0 kategorija pagal PSO TNM klasifikaciją: 49,0 proc. (n = 51 atvejis) tarp turinčiųjų laukinį tipą ir 48,1 proc. (n = 63 atvejai) tarp turinčiųjų KRAS bei NRAS genų kodonų mutacijas (18 pav.).

18 pav. Storosios žarnos karcinomos pasiskirstymas pagal N kategorijas (TNM klasifikacija pagal PSO) tarp pacientų, turinčių KRAS/NRAS genų kodonų mutacijas ir laukinį alelį (p>0,05)

N2b 6,0% N2a 5,1% N1c 8,1% N1b 14,5% N1a 13,2% N0 48,5% Nx 4,7% 4,8 6,9 6,7 3,8 7,7 8,4 13,5 15,3 15,4 11,4 49 _48,1 2,9 6,1 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Laukinis tipas KRAS/NRAS genų kodonų mutacijos

N2b N2a N1c N1b N1a N0 Nx