LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
Joana Celiešiūtė
ŽMOGAUS PAPILOMOS VIRUSO REIKŠMĖ
GIMDOS KAKLELIO KARCINOMAI
IŠSIVYSTYTI IR ULTRAGARSINIO TYRIMO
NAUDA VERTINANT ŠIOS LOKALIZACIJOS
VĖŽIO GYDYMO VEIKSMINGUMĄ
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, medicina (06B)
Disertacija rengta 2009−2016 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Akušerijos ir ginekologijos klinikoje.
Mokslinė vadovė
Prof. dr. Daiva Vaitkienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Me-dicinos akademija, biomeMe-dicinos mokslai, medicina – 06B)
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje.
Pirmininkas
Prof. habil. dr. Virgilijus Ulozas (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina − 06B). Nariai:
Prof. dr. Laima Maleckienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B).
Prof. dr. Gražina Stanislava Drąsutienė (Vilniaus universitetas, biome-dicinos mokslai, medicina – 06B)
Prof. dr. Skirmantė Sauliūnė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, visuomenės mokslai – 09B)
Dr. Marius Domeika (Upsalos universitetas, biomedicinos mokslai, me-dicina – 06B).
Disertacija ginama viešame Medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2017 m. rugpjūčio 30 d., 13 val., Lietuvos sveikatos mokslų universiteto li-goninės Kauno klinikų Akušerijos ginekologijos klinikos didžiojoje audito-rijoje
LIETHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES
Joana Celiešiūtė
THE ROLE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS
TO THE DEVELOPMENT OF CERVICAL
CARCINOMA AND THE UTILITY
OF TRANSVAGINAL ULTRASOUND
IN THE EVALUATION OF CERVICAL
CANCER TREATMENT EFFICACY
Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,
Medicine (06B)
The Dissertation has been prepared at the Department of Obstetrics and Gynecology Medicine of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2009–2016.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Daiva Vaitkiene (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)
The Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences.
Chairperson
Prof. Dr. Habil. Virgilijus Ulozas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06 B) Members:
Prof. Dr. Laima Maleckiene (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)
Prof. Dr. Grazina Stanislava Drasutiene (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine – 06 B)
Prof. Dr. Skirmante Sauliūne (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Public Health – 09B)
Dr. Marius Domeika (Uppsala University, Sweden, Biomedical Sciences, Medicine – 06 B)
Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on the 30th August of 2017, at 13 p.m. at the auditorium of the Department of Obstetric and Gynaecology of Lithuanian University of Health Sciences Hospital Kaunas Clinics.
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 9
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI, MOKSLINIS NAUJUMAS IR AKTUALUMAS ... 12
1.1. Darbo tikslas ... 12
1.2. Darbo uždaviniai ... 12
1.3. Darbo mokslinis naujumas ir aktualumas ... 12
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 15
2.1. Gimdos kaklelio vėžio problematika ... 15
2.2. Gimdos kaklelio vėžio išsivystymas ... 15
2.2.1. Užkrėstumas žmogaus papilomos virusu ir klinikinė reikšmė ... 16
2.2.2. Žmogaus papilomos viruso persistavimas ir rizikos veiksniai ... 20
2.2.3. Infekuotų ląstelių pažeidimas ... 21
2.2.4. Suvėžėjimas ... 22
2.3. Gimdos kaklelio intraepitelinių pokyčių ir karcinomos in situ diagnostika ... 24
2.3.1. Gimdos kaklelio ir makšties nuobrūžų citologinis tyrimas... 24
2.3.2. Gimdos kaklelio tepinėlio plokščiojo epitelio ląstelių pokyčių terminija ... 25
2.4. Žmogaus papilomos viruso diagnostika ... 26
2.5. Gimdos kaklelio vėžio gydymo vertinimo taktikos problematika ... 26
3.TYRIMO METODIKA ... 29
3.1. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga ... 29
3.1.1. Tiriamųjų kontingentas ... 29
3.1.1.1. Pacientės, sergančios gimdos kaklelio karcinoma in situ ... 29
3.1.1.2. Pacientės, sergančios išplitusia gimdos kaklelio karcinoma .... 29
3.1.2. Tyrimo eiga ... 30
3.2. Tyrimo metodai ... 33
3.2.1. Ultragarsinio tyrimo metodika ... 33
3.2.2. Kraujotakos nustatymas doplerio tyrimo metodu ... 34
3.2.2.1. Spalvinio indekso nustatymas doplerio tyrimo metodu ... 35
3.2.2.2. Rezistentiškumo indekso nustatymas doplerio tyrimo metodu ... 35
3.2.2.3. Maksimalaus kraujotakos greičio nustatymas doplerio tyrimo metodu ... 35
3.2.3. Kolposkopinis tyrimo metodas ... 36
3.2.4. Citologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystosios terpės SurePath TM metodu ... 37
3.2.5. Žmogaus papilomos viruso dezoksiribonukleirūgšties (DNR) iš audinio išskyrimas ... 38
3.2.6. DNR kiekio ir grynumo nustatymas ... 39
3.2.8. Žmogaus papilomos viruso genotipo nustatymas taikant
hibridizaciją ir vizualizaciją Luminex technologija ... 40
3.2.9. Statistinė duomenų analizė ... 42
4. REZULTATAI ... 43
4.1. Žmogaus papilomos virusų tipų reikšmė gimdos kaklelio karcinomos in situ išsivystymui bei jų sąsajos su rizikos veiksniais ... 43
4.1.1. Demografiniai duomenys ... 43
4.1.2. Karcinomą in situ sukėlusių žmogaus papilomos viruso tipų pasiskirstymas ir dažnumas ... 43
4.1.3. Karcinomą in situ sukėlusių žmogaus papilomos viruso tipų galimos sąsajas su pacienčių rizikos veiksniais ... 46
4.2. Moterų užkrėstumas žmogaus papilomos virusu ir sąsajos su rizikos veiksniais praėjus penkeriems metams po gimdos kaklelio karcinomos in situ chirurginio gydymo ... 51
4.2.1. Žmogaus papilomos viruso tipų pasiskirstymas ir dažnumas praėjus penkeriems metams ... 51
4.2.2. Pacienčių rizikos veiksnių ir žmogaus papilomos viruso tipų sąsajos praėjus penkeriems metams po operacijos ... 54
4.3. Gimdos kaklelio būklės ir žmogaus papilomos viruso tipų, susijusių su gimdos kaklelio displazijos persistavimu ir atkryčiu, vertinimas praėjus penkeriems metams po gydymo ... 58
4.4. Ultragarsinio tyrimo panaudojimo galimybės vertinant išplitusio gimdos kaklelio vėžio chemospindulinio gydymo veiksmingumą ... 63
5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 67
5.1. Žmogaus papilomos virusų ir rizikos veiksnių svarba karcinomai in situ išsivystyti ... 67
5.2. Žmogaus papilomos viruso tipai ir rizikos veiksniai praėjus penkeriems metams po gimdos kaklelio karcinomos in situ chirurginio gydymo ... 69
5.3. Gimdos kaklelio būklės pokyčiai ir žmogaus papilomos viruso tipų, susijusių su gimdos kaklelio displazijos persistavimu ir atkryčiu, svarba ... 70
5.4. Ultragarsinio tyrimo panaudojimo galimybės vertinant išplitusio gimdos kaklelio vėžio chemospindulinio gydymo veiksmingumą ... 72
6. IŠVADOS ... 75
7. TYRIMO PRANAŠUMAI IR TRŪKUMAI ... 76
8. DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 77
SANTRUMPOS
AGCUS AIS ASCH ASCUS CIN CIS CT CP DA DNR – – – – – – – – – –Nenustatytos kilmės liaukinių epitelio ląstelių atipija (angl.
Atypical glandular cells of undetermined significance)
Endocervikinė adenokarcinoma in situ (angl.
Adenocarcinoma in situ )
Nenustatytos reikšmės atipinės plokščiojo epitelio ląstelės, įtariant HSIL (angl. Atypical squamous cells cannot
exclude HSIL)
Nenustatytos reikšmės atipinės plokščiojo epitelio ląstelės (angl.Atypical squamous cells of undetermined
significance)
Intraepitelinė gimdos kaklelio neoplazija (angl. Cervical
intraepithelial neoplasm) Karcinoma in situ Citologinis tyrimas Citologiniai pokyčiai Dalinis atsakas Dezoksiribonukleorūgštis DR ŽPV EK(ECC) ES F FIGO GDR ŽPV GS HSIL IARC KK KT LSIL LSMUL KK – – – – – – – – – – – –
Didelės rizikos žmogaus papilomos virusas
Endocervikalinis kiuretažas (gimdos kaklelio kanalo abrazija)
Europos Sąjunga Fišerio kriterijus
Tarptautinė akušerių ir ginekologų draugija (angl.
International Federation of Gynecology and Obstetrics)
Galimai didelės rizikos žmogaus papilomos virusas Galimybių santykis
Didelio laipsnio plokščiųjų ląstelių intraepiteliniai pokyčiai (angl.High-grade squamous intraepithelial lesions)
Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra (angl. International
Agency for Reasearch on Cancer)
Kauno klinikos
Kompiuterinė tomografija
MGS (Vmax) MFI MR ŽPV MR – – – –
Maksimalus kraujotakos greitis sistolėjė (angl. Peak
systolic velocity (PSV))
Mėginio fluorescencijos intensyvumas Mažos rizikos žmogaus papilomos virusas Magnetinio rezonanso tyrimas
n NILM p PAP tepinėlis PGR PI PSO – – – – – – – Tiriamųjų skaičius
Nėra intraepitelinių pokyčių ar piktybinio naviko (angl.
Negative for intraepithelial lesions or malignancy)
Statistinis reikšmingump lygmuo Papanicolaou citologinis tyrimas Polimerazės grandininė reakcija Pasikliautinasis intervalas
Pasaulio sveikatos organizacija (angl. World Health
Organisation (WHO)) PRF PU RI RNR rpm SI SN SR VA Vmax UG ŽPV X χ2 – – – – – – – – – – – – – –
Impulsų kartojimosi dažnis (angl. Pulse repetition
frequency)
Priekinis–užpakalinis matmuo Rezistentiškumo indeksas Ribonukleorūgštis
Apsisukimai per minutę Spalvinis indeksas Standartinis nuokrypis Santykinė rizika Visiškas atsakas
Maksimalus kraujotakos greitis sistolėje Ultragarsinis tyrimas
Žmogaus papilomos virusas Vidurkis
ĮVADAS
Gimdos kaklelio kancerogenezės mechanizmas vis dar nėra visiškai aiš-kus. Žinoma, kad pagrindinė gimdos kaklelio vėžio išsivystymo priežastis –
ilgai išliekanti žmogaus papilomos viruso (ŽPV) infekcija. Dažniausiai ŽPV infekcija būna laikina ir iki 90 proc. atvejų išnyksta savaime per 12–
24 mėnesius nuo užsikrėtimo [97, 125]
Gimdos kaklelio vėžio vystymasis – daugiapakopis procesas, kol gimdos kaklelio ląstelių pokyčiai tampa negrįžtami [58, 125]. Nors plačiai pripa-žinta, kad užsikrėtimas didelės rizikos onkogeniniais ŽPV susijęs su gim-dos kaklelio displazijos ir vėžio išsivystymu [58, 93], pastaruoju metu ma-noma, kad ŽPV nėra vienintelis rizikos veiksnys, lemiantis gimdos kaklelio gleivinės pažeidimus ir ikivėžines ligas. Nustatyti ŽPV infekcijos ryšį su gimdos kaklelio intraepitelinės neoplazijos (CIN) ar gimdos kaklelio vėžio išsivystymu pavyksta ne visada [11, 55, 78].
Šiandien žinoma daugiau nei 170 ŽPV tipų, kurie infekuoja lyties or-ganų, viršutinių kvėpavimo takų gleivines ar odą [42]. Įvairių šalių moks-lininkai vieningai sutaria, kad pasaulyje paplitę ir gimdos kaklelio iki-vėžines ligas bei vėžį dažniausiai sukelia du ŽPV tipai – 16 ir 18 [29, 54, 140]. Jie aptinkami iki 71 proc. invazinio gimdos kaklelio vėžio atvejų, o ŽPV16, ŽPV18 ir ŽPV45 tipai – iki 94 proc. gimdos kaklelio adenokar-cinomos atvejų [120]. Lietuvoje atlikto tyrimo duomenimis, 16 tipo ŽPV vyravo gimdos kaklelio vėžio mėginiuose, jis nustatytas 55,8 proc. ser-gančių plokščiųjų ląstelių vėžiu, 35,3 proc. serser-gančių gimdos kaklelio adenokarcinoma [50, 64, 65]. Kitame Lietuvoje atliktame tyrime, tiriant ŽPV skystųjų terpių mėginiuose, 16 tipo ŽPV irgi buvo dažniausias [129]: jis aptiktas 42,3 proc. mėginių, kuriuose rastas ŽPV. Antras pagal dažnumą buvo 31 tipo ŽPV (10,1 proc.), toliau – ŽPV33 (8,2 proc.) ir ŽPV56 (5,7 proc.). 18 tipo ŽPV aptiktas rečiau, lyginant su kitomis šalimis [129].
Dar viename Lietuvoje atliktame tyrime panašūs duomenys gauti esant HSIL pokyčių citologiniame tyrime – nustatyti ne tik ŽPV16 ir ŽPV18 (36,4 proc.), bet ir kitų tipų DR ŽPV, t. y. 31, 33, 58, atskirai ar kartu su ŽPV16 ir ŽPV18 (42,4 proc.) [149]. 16 tipo ŽPV paplitimas įvairiose pasaulio šalyse yra panašus, o kitų didelės rizikos ŽPV tipų – skiriasi [86, 113]. Iš literatūros matyti, kad įvairiuose pasaulio regionuose vyraujančių kitų DR ŽPV paplitimas yra skirtingas [70, 86, 103, 134]. Rytų Azijoje labiau paplitęs 58 tipo ŽPV, didesnė jo įtaka didelio laipsnio intraepite-liniams pokyčiams išsivystyti [134], tuo tarpu Švedijoje po ŽPV 16 eina 31 ir 33 tipų ŽPV [103]. Taigi, Lietuvoje sudarant profilaktikos programas, į kurias įtraukiamas ŽPV tyrimas bei skiepai nuo ŽPV, labai svarbu žinoti, kokie kiti DR ŽPV tipai yra svarbūs didelio laipsnio gimdos kaklelio intraepiteliniams pokyčiams išsivystyti.
Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra (IARC) ŽPV klasifikuoja į tam tikras grupes: patvirtintus karcinogeninius (dar vadinamus onkogeniniais ar di-delės rizikos), tikriausiai karcinogeninius (angl. probably carcinogenic), galimai karcinogeninius (angl. possibly carcinogenic), neklasifikuojamus (angl. not classifiable) ir tikriausiai nekarcinogeninius (angl. probably not
carcinogenic, dar vadinamus mažos rizikos) [125]. Didelės rizikos grupei
nepriskirtų ŽPV tipų galimas onkogeniškumas ir reikšmė gimdos kaklelio vėžio patogenezėje – aktuali tyrinėjimų sritis. Neaišku, kaip įvairūs ŽPV tipai yra susiję su kitais gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniais, todėl tyrimai tęsiami [120, 140].
sėkmingai gydomas chirurginiu būdu. Išplitusios ligos (nuo IIB stadijos) ar net ir ankstyvesnių stadijų, esant nepalankiems prognozės veiksniams, chi-rurgiškai gydyti negalima, todėl skiriamas suderintas chemospindulinis gy-dymas: nuotolinė spindulinė terapija (50 Gy dozė per penkias savaites) kartu su chemoterapija cisplatina (40 mg/m³, kartą per savaitę) ir po to –
uterovagininė brachiterapija [106]. Kadangi, net ir praėjus daugiau nei 5 metams nuo gimdos kaklelio patikros programos pradžios, daugiau nei dviem trečdaliais visų atvejų gimdos kaklelio vėžys diagnozuojamas jau išplitęs (≥ II stadijos), labai svarbu įvertinti išplitusios ligos gydymo efek-tyvumą, kuo tiksliau nustatyti dalinio atsako į gydymą atvejus ir, aptikus ligos persistavimą ar atkryčius po suderinto chemospindulinio gydymo, laiku skirti chemoterapiją ir biologinę terapiją [88]. Atsako į gydymą verti-nimas tebėra sunkus uždavinys specialistams. „Auksinio standarto“ tyrimu chemospindulinio gydymo veiksmingumui vertinti bei pacientėms po gydy-mo stebėti laikoma magnetinio rezonanso togydy-mografija, bet šis tyrigydy-mo meto-das yra gan brangus, jam reikia daug finansinių ir laiko sąnaudų, sunkiai prieinamas ne tik mažiau išsivysčiusiose ES šalyse, bet ir Lietuvoje.
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
1.1. Darbo tikslasĮvertinti žmogaus papilomos viruso tipų reikšmę gimdos kaklelio kar-cinomos in situ išsivystymui bei gimdos kaklelio intraepitelinių pokyčių atsinaujinimui praėjus penkeriems metams po chirurginio gydymo ir ultra-garsinio tyrimo tinkamumą išplitusio gimdos kaklelio vėžio chemospindu-linio gydymo veiksmingumui vertinti.
1.2. Darbo uždaviniai
1. Nustatyti mažos, vidutinės ir didelės rizikos žmogaus papilomos vi-rusų tipus, sukėlusius gimdos kaklelio karcinomą in situ, ir įvertinti jų sąsajas su kitais rizikos veiksniais.
2. Įvertinti moterų užkrėstumą žmogaus papilomos virusu praėjus pen-keriems metams po gimdos kaklelio karcinomos in situ chirurginio gydymo ir ŽPV persistavimo galimas sąsajas su kitais rizikos veiks-niais.
3. Nustatyti gimdos kaklelio būklę bei žmogaus papilomos virusų tipus, susijusius su gimdos kaklelio displazijos atsinaujinimu praėjus pen-keriems metams po karcinomos in situ chirurginio gydymo.
4. Nustatyti ultragarsinio tyrimo panaudojimo galimybes vertinant išpli-tusio gimdos kaklelio vėžio (IB2–IV stadija pagal FIGO) chemospin-dulinio gydymo veiksmingumą.
1.3. Darbo mokslinis naujumas ir aktualumas
Norint nustatyti ryšį tarp ŽPV tipo ir ligos, išskyrimas ŽPV DNR iš gimdos kaklelio histologinės CIN3/Cis medžiagos yra tikslesnis būdas nei tirti citologinėje skystosios terpės medžiagoje.
daug daugiau skirtingų ŽPV tipų (24 tipai) nei ankstesniame (13 tipų) tiek citologinėje, tiek histologinėje medžiagoje. Ligos pažeistame gimdos kak-lelio audinyje nustatyti ŽPV tipai daug tiksliau atskleidžia ryšį tarp ŽPV tipo ir ligos nei aptikti citologinėje skystojoje terpėje. Pavienėse, net ir smarkiai pakitusiose ląstelėse rastas virusas gali būti tik tranzitorinės, pra-einančios, savaime išnykstančios infekcijos išraiška, nes histologiškai kaip CIN3/Cis patvirtinama tik dalis net didelio laipsnio (HSIL) citologinių po-kyčių [66]. Tuo tarpu, jei virusas aptinkamas morfologiniame displazijos ar vėžio audinyje, nustatytų ŽPV tipų ryšys su konkrečia liga yra neabejo-tinas.
Persistuojančios ŽPV infekcijos ryšio su ligos atkryčiais nustatymas sudaro sąlygas optimizuoti pacienčių stebėjimo po gydymo algoritmą.
Žinoma, kad ŽPV yra būtinas veiksnys gimdos kaklelio intraepitelinei neoplazijai išsivystyti, tačiau ši infekcija gali skatinti ir ligos atsinaujinimą po gydymo [73, 76, 80, 118]. Daugeliu atvejų ŽPV infekcija praeina sa-vaime, o gimdos kaklelio intraepitelinę neoplaziją ar vėžį sukelia tik persis-tuojanti infekcija [81, 132]. Taigi, persistuojantys DR ŽPV sukuria sąlygas ne tik pirminei gimdos kaklelio displazijai ar vėžiui išsivystyti [67, 73, 95, 117, 118], bet ir ligai atsinaujinti [16, 37, 61, 73, 76, 146]. Atskirti tran-zitorinę, savaime praeinančią ir vėl pasikartojančią ŽPV infekciją nuo per-sistuojančios nėra lengva. Tam būtina ilgą laiką stebėti tas pačias pacientes ir kartoti joms ŽPV tyrimus su išsamiu tipavimu dinamikoje. Būtent tai ir buvo atliekama mūsų tyrime: toms pačioms pacientėms vertinti ŽPV tipai, sukėlę karcinomą in situ, tirta ŽPV kolonizacija ir analizuota, kokią įtaką skirtingi ŽPV tipai turėjo gimdos kaklelio būklei praėjus 5 metams po gy-dymo. Visiems bendrų stebėjimo po displazijos gydymo algoritmų nėra. Įvairiose šalyse stebint pacientes atliekami tyrimai, jų dažnumas, stebėjimo trukmė priklauso nuo šalies ekonominių ir sveikatos priežiūros sistemos galimybių [58, 77, 104]. Mūsų tyrimo duomenys apie persistuojančios ŽPV infekcijos svarbą po gimdos kaklelio neoplazijos gydymo gali padėti op-timizuoti pacienčių stebėjimo po gydymo algoritmą: vietoj kas 3 mėnesius kartojamų citologinių tepinėlių įdiegti ŽPV tyrimus, leidžiančius saugiai retinti tyrimų intervalus, taupyti sąnaudas.
Žinoti dažniausius ŽPV tipus yra svarbu pasirenkant tiek tinka-miausią ŽPV tyrimą patikrai, tiek tinkatinka-miausią skiepą pirminei profi-laktikai.
nuo konkrečių viruso tipų paplitimo. Mūsų nustatyti dažniausiai CIN3/Cis sukeliantys ŽPV tipai sudaro sąlygas laboratorinės diagnostikos specialis-tams parinkti tinkamiausius mūsų regionui ŽPV diagnostikos rinkinius. Žinoti gimdos kaklelio karcinomos in situ išsivystymui reikšmingiausius DR ŽPV tipus labai svarbu ir diegiant skiepijimo nuo ŽPV programą, pa-renkant skiepą, kurio tikėtina klinikinė ir ekonominė nauda būtų didžiausia. Ultragarsinis tyrimas – neinvazinis, pigus, lengvai prieinamas, nesu-dėtingas, kontraindikacijų ir šalutinio poveikio neturintis tyrimo meto-das, galintis būti alternatyva MR tyrimui po gimdos kaklelio vėžio gy-dymo atrinkti pacientes, kurioms reikalingas detalesnis ištyrimas dėl li-kutinio navikinio audinio ar ligos atkryčio.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Gimdos kaklelio vėžio problematikaProcesas, kol gimdos kaklelio ląstelės tampa patologiškai pakitusios, trunka ilgai ir yra daugiapakopis [125]. Ikivėžiniai gimdos kaklelio pokyčiai vadinami intraepiteline neoplazija. Jei jie negydomi, didėja gimdos kaklelio vėžio rizika [111]. Nepaisant medicinos mokslo pažangos, gimdos kaklelio vėžys yra viena aktualiausių reprodukcinio amžiaus moterų sveikatos prob-lemų. Europos Sąjungoje kasmet gimdos kaklelio vėžiu suserga apie 34 tūkst. moterų, o miršta nuo šios ligos apie 13 tūkst. [58, 60]. Nors litera-tūroje nurodoma, kad bendras gimdos kaklelio vėžio atvejų skaičius Euro-poje mažėja, mirtingumas nuo šios ligos ES šalyse, priimtose po 2003 metų, išlieka didelis. Lietuvoje mirtingumas vienas didžiausių – 9,8 iš 100 000, t. y. 5–7 kartus didesnis nei ES šalyse (2012 m.), kuriose šis rodiklis mažiausias: Suomijoje – 1,4, Maltoje – 1,2 iš 100 000 moterų [60]. Profilak-tinė gimdos kaklelio vėžio patikros programa Lietuvoje vykdoma nuo 2004 metų, tačiau moterų sergamumas gimdos kaklelio vėžiu yra ne tik didžiau-sias Baltijos šalyse, bet ir vienas didžiausių visoje Europoje. Per pasta-ruosius penkerius metus šios ligos dažnumas svyruoja tarp 25,6 ir 29,2 iš 100 000 gyventojų. 2012 metais Lietuvoje buvo užregistruota 431 naujas gimdos kaklelio vėžio atvejis (26,7 iš 100 000), iš jų 35,5 proc. atvejų liga diagnozuota III–IV stadijos [18, 88, 144, 145]. Nors šios ligos galima išvengti atliekant tiek pirminę, tiek antrinę profilaktiką, deja, ir sergamumas ja, ir mirštamumas nuo jos Lietuvoje tebėra didelis [17, 44, 88, 147].
2.2. Gimdos kaklelio vėžio išsivystymas
2.2.1. Užkrėstumas žmogaus papilomos virusu ir klinikinė reikšmė Su įvairiomis infekcijomis siejami apie 2 mln. vėžio atvejų, 1,9 mln. onkologinių ligų sukelia Helicobacter pylori, hepatito B ir C virusai, ŽPV. Apie 30 proc. atvejų įvairių infekcijų sąlygotomis onkologinėmis ligomis serga jaunesni nei 50 metų pacientai [92].
ŽPV infekcija yra viena dažniausių lytiškai plintančių virusinių infekcijų pasaulyje. Didžioji dalis moterų per savo gyvenimą kuriuo nors metu užsikrečia ŽPV [3, 15, 32, 66, 74]. Metaanalizės, kurioje vertinti 194 tyrimų rezultatai, duomenimis, ištyrus daugiau nei 1 mln. moterų, ŽPV rastas 11– 12 proc., net jei citologinių pokyčių nebuvo nustatyta [19]. Įvairiuose geografiniuose regionuose ŽPV dažnumas nesant citologinių pokyčių skiriasi: virusas aptinkamas net iki 24 proc. moterų Afrikos regione žemiau Sacharos, Rytų Europoje – 21,4 proc., Lotynų Amerikoje – 16,1 proc. [19, 40]. Kuo gimdos kaklelio intraepiteliniai pokyčiai ryškesni, tuo ŽPV nustatomas dažniau, o esant gimdos kaklelio vėžiui – net iki 90 proc. atvejų [40]. Dauguma šioje metaanalizėje nagrinėtų studijų rodo, kad labiausiai ŽPV paplitęs jaunesnių nei 25 metų pacienčių grupėje – tai bendra pasaulinė tendencija, nepriklausoma nuo geografinių regionų [19, 137].
ŽPV priklauso Papillomaviridae šeimai, heterogeninių virusų grupei, kurių šerdinę dalį sudaro DNR nukleorūgštis. Jiems būdingas išskirtinis poveikis gleivinėms ar odos plokščiajam epiteliui. Iki šiol identifikuota daugiau nei 170 ŽPV tipų, kurie užkrečia lytinių takų, viršutinių kvėpavimo takų gleivines ir(ar) odą [42]. ŽPV kapsidę sudaro daug baltymų, pagal ku-riuos virusas skiriamas į tipus ir atskiras gentis bei grupes. Alfa (gleivinių) gentį sudaro apie 30 ŽPV tipų, kurie gali užkrėsti ir lytinių takų gleivines, taip pat keletas odos ŽPV tipų, kurie atsakingi už odos karpas. Skiriamos 2 gleivinių ŽPV grupės, kurioms priklauso mažos rizikos (MR) ŽPV (pvz., ŽPV6 ir ŽPV11 tipai), dažniausiai sukeliantys gerybines gleivinių karpas, ir didelės rizikos (DR) ŽPV, kurie yra atsakingi ne tik už gimdos kaklelio vė-žio [43], bet ir makšties, vulvos, išangės, varpos, gerklų išsivystymą [28, 108, 126, 127, 130]. Atskirų tipų ŽPV geba sukelti onkologines ligas per daugelį metų šiek tiek keitėsi. Epidemiologinių tyrimų duomenimis, DR ŽPV neabejotinai priklauso 15 tipų: ŽPV16, ŽPV18, ŽPV31, ŽPV33, ŽPV35, ŽPV39, ŽPV45, ŽPV51, ŽPV52, ŽPV56, ŽPV58, ŽPV59, ŽPV68, ŽPV73 ir ŽPV82 [99]. Kaip galimai didelės (abejotinos) rizikos įvardinti tik 3 tipai: ŽPV26, ŽPV53 ir ŽPV66, nes buvo nustatyta pavienių atvejų esant onkologinėms ligoms, bet nerasta kontrolinėje grupėje. 12 ŽPV tipų –
rizika nenustatyta [87, 99]. Virusų onkogeniškumas įvairiuose tyrimuose įvertintas skirtingai, tačiau Munoz ir bendradarbių tyrime [99] patvirtinta, kad didelės rizikos yra ŽPV68, ŽPV82, galimai didelės (abejotinos) rizikos tipai – ŽPV26, ŽPV53, ŽPV66. ŽPV klasifikavimas pagal vėžinių ligų riziką pateiktas 2.2.1.1 lentelėje [99].
2.2.1.1 lentelė. Žmogaus papilomos viruso klasifikavimas pagal vėžinių ligų riziką
Grupė Žmogaus papilomos viruso tipas
Didelės rizikos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 Galimai didelės rizikos 26, 53, 66
Mažos rizikos 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, CP6108
Įvairių šalių mokslininkai vieningai sutaria, kad labiausiai pasaulyje paplitę ir dažniausiai gimdos kaklelio vėžines ligas sukelia du pagrindiniai ŽPV tipai: ŽPV16 ir ŽPV18 [34, 54, 86, 140, 143]. Jie sukelia apie 71 proc. visų gimdos kaklelio vėžio atvejų [38, 120, 137]. Metaanalizėje, išnagri-nėjus 30 848 invazinio vėžio atvejų, nustatyta, kad bendras ŽPV paplitimas esant invaziniam gimdos kaklelio vėžiui, svyruoja nuo 88,3 proc. iki 94,2 proc. [86]. Kitų tyrimų duomenimis, ŽPV16 paplitimas invazinio vėžio atvejais didžiausias – svyruoja nuo 52 proc. iki 67 proc., antras pagal pa-plitimą yra ŽPV18 (14–20 proc.) [7, 86]. Bendras ŽPV paplitimas reikš-mingai padidėjo: publikuotų tyrimų duomenimis, 1990–1999 metais buvo 85,9 proc., o 2006–2010 metais – 92,9 proc. [86]. Kitų tyrėjų duomenimis, lyginant 1940–1959 metų duomenis su paskelbtais 2000–2007 metais, ŽPV16 ir ŽPV18 nustatomas reikšmingai dažniau: ŽPV16 nustatymo daž-numas padidėjo atitinkamai nuo 61,5 proc. iki 62,1 proc., o ŽPV18 – nuo 6,9 proc. iki 7,2 proc. [7]. Paplitimo didėjimas siejamas su dažnėjančiais dauginės ŽPV infekcijos atvejais (4–15,7 proc.) [86]. ŽPV16 paplitimas
pasaulyje yra panašus, jis mažai priklauso nuo geografinio regiono, o kitų didelės rizikos ŽPV tipų paplitimas gali svyruoti [19, 25, 39]. Metaanalizės duomenimis, didelės rizikos ŽPV pasaulyje labai paplitę [19]. Ištyrus dau-giau nei 200 tūkst. moterų, kurioms citologiniu tyrimu nebuvo nustatyta jokių ląstelių pažeidimų, paaiškėjo, kad tarp aptiktų ŽPV tipų vyravo ne tik ŽPV16 ir ŽPV18, bet ir ŽPV52, ŽPV31, ŽPV58, ŽPV39, ŽPV51 ir ŽPV56. Kai kurių tyrimų duomenimis, sveikų ŽPV užsikrėtusių moterų grupėje be-veik 90 proc. tiriamųjų nustatytas tik vieno tipo ŽPV, bet daugiau nei pu-sei – didelės rizikos ŽPV, o iš jų ŽPV16 apytikriai sudarė net 62 proc. [97].
rizikos ŽPV dažnumas: nuo 13,7 proc., kai citologinių pokyčių nėra, iki 84,4 proc., kai diagnozuoti ryškūs plokščiųjų ląstelių intraepiteliniai po-kyčiai (HSIL) [57, 66]. HSIL atvejais ŽPV16 ir (ar) ŽPV18 rasti reikšmin-gai dažniau, lyginant su mėginiais, kuriuose citologinių pokyčių nebuvo: atitinkamai 27,2 proc. ir 2,7 proc., (p < 0,001) [57]. Tuo tarpu kitų didelės rizikos ŽPV tipų dažnumas nuo intraepitelinių ląstelių pokyčių nepriklauso: net esant neryškiems plokščiojo epitelio intraepiteliniams pokyčiams (LSIL), kiti DR ŽPV buvo nustatyti dažniau nei HSIL atvejais (atitinkamai 48,7 proc. ir 37,1 proc.) [57]. Kitų tyrimų duomenimis, ŽPV16 dažnumas priklauso nuo intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių: kuo pokyčiai dides-nio laipsdides-nio, tuo dažniau jis aptinkamas, t. y. esant CIN1 – 24,5 proc., o esant didelio laipsnio intraepiteliniams pokyčiams – 50,2 proc. [1], tuo tar-pu ŽPV18, ŽPV31, ŽPV33, ŽPV35 ir ŽPV6 ar ŽPV11 nebuvo reikšmingai susiję su intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių laipsniu [1].
Jaunesnio amžiaus moterims, lyginant su vyresnėmis, dažniau nustato-mas daugiau nei vieno tipo ŽPV. Tyrimo duomenimis, 25–29 metų moterys ne vieno tipo didelės rizikos ŽPV buvo užsikrėtusios reikšmingai dažniau nei 50–64 metų amžiaus: atitinkamai 48,3 proc. ir 34,5 proc. (p < 0,001) [57]. Ištyrus ŽPV užsikrėtusias moteris po 24 mėn., nustatyta, kad net 59,6 proc. jų ŽPV infekcija buvo išlikusi nepriklausomai, ar ŽPV buvo mažos ar didelės rizikos [97]. Vis dėlto daugumai moterų (90 proc.) praėjus dvejiems metams nuo užsikrėtimo virusas neaptinkamas [153], jis gali išnykti nesu-kėlęs gimdos kaklelio pažeidimo [42]. Yra tyrimų, kurie rodo, kad beveik 20 proc. iš tų moterų po metų vėl užsikrečia tuo pačiu ar kitu ŽPV [20].
atkrytis ištinka, kai ŽPV persistuoja [14, 132]. Norint įvertinti galimą ligos atkrytį, vien citologinių duomenų nepakanka – po penkerių metų kartu svarbu nustatyti ir DR ŽPV persistavimą, mat, jeigu DR ŽPV nerandama, ligos atkryčio rizika yra mažesnė [68, 76]. Tai svarbu, kad būtų parinkta ekonomiškai efektyvi pacienčių stebėjimo ir tolesnio tyrimo taktika. Nusta-tyta, kad po 6 mėn. tiriant tik DR ŽPV, o po 24 mėn. DR ŽPV tyrimą atlie-kant kartu su citologiniu, būtų galima sumažinti atliekamų kolposkopijų dažnumą, lyginant su vien citologiniu tyrimu, kai DR ŽPV netiriamas [31]. Jei displazija gydoma efektyviai, pašalinamas ne tik pažeidimas, bet ir jo išsivystymą lemiantys DR ŽPV [76, 105, 109].
Jei po gimdos kaklelio displazijos gydymo atliekamas citologinis gim-dos kaklelio ir DR ŽPV tyrimai, neigiama prognozinė vertė kad išsivystis ikivėžiniai didelio laipsnio gimdos kaklelio pokyčiai yra 99 proc. [8, 76, 114, 156]. Jei po 6 mėn. nuo chirurginio didelio laipsnio gimdos kaklelio displazijos gydymo citologinių pokyčių ir ŽPV nenustatoma, CIN2+ po-kyčių rizika per kitus dvejus metus yra mažesnė nei 0,5 proc. [104]. Praėjus penkeriems metams po gydymo, jei citologinio tyrimo rodmenys normalūs ir DR ŽPV nėra, CIN2 ar ryškesnių pokyčių rizika yra 1,0 proc. (95 proc. PI 0,2–4,6), o po dešimties metų – 3,6 proc. (95 proc. PI 1,1–10,7) [76, 104]. Jei citologinių pokyčių ar DR ŽPV nustatoma, rizika susirgti per penkerius metus siekia 17,8 proc. (95 proc. PI 12,0–25,7), o per dešimt metų – 21,1 proc. (14,0–30,5) [76, 77]. Jei po 6 mėn. nuo gydymo atlikus citologinį tyrimą kartu su DR ŽPV pokyčių nerandama, kita patikra re-komenduojama po 24 mėnesių [31, 76, 156) dėl didelio šių abiejų tyrimų jautrumo [13, 76, 80, 156].
DR ŽPV tyrimas atrinkti moteris, kurioms gimdos kaklelio ikivėžinės ligos atkryčio tikimybė yra didesnė, ir joms pritaikyti tiksliausią stebėjimo taktiką bei ankstyvą gydymą, jei jo reikia. DR ŽPV tyrimo pranašumas –
tikslesnis ir ankstesnis ligos atkryčio diagnozavimas. Jei DR ŽPV neap-tinkama, neigiama prognozinė vertė yra šimtaprocentinė [59, 146]. Tuo at-veju toliau moteriai atliekama įprastinė patikra [59, 104]. Moterims tyrimai ir stebėjimas gali būti atliekami atsižvelgiant į DR ŽPV tyrimo rezultatus. Tos, kurioms DR ŽPV aptinkamas, siunčiamos kolposkopinio tyrimo, o kurioms DR ŽPV neaptinkama, kviečiamos atvykti po 3 metų ir vėliau tikrinamos įprastai [58, 85, 104].
Taigi, nuo didelio laipsnio intraepitelinių pokyčių gydytos moterys, iki grįžta į bendrą populiacijos patikros programą, pagal skirtingus protokolus, atidžiai stebimos nuo 2 iki 20 metų [77]. Kadangi nėra bendrų rekomen-dacijų, šis klausimas aktualus iki šiol.
2.2.2. Žmogaus papilomos viruso persistavimas ir rizikos veiksniai Dažniausiai ŽPV infekuotas ląsteles organizmo imuninė sistema atpa-žįsta ir pašalina. Dauguma ŽPV infekcijų yra laikinos ir praeina savaime per 12–24 mėnesius nuo užsikrėtimo. Tyrimų duomenimis, per 2 metus ŽPV infekcija išnyksta apie 90 proc. moterų [153]. Persistuojanti ŽPV infekcija yra didžiausias gimdos kaklelio rizikos veiksnys, ir būtent šios moterys dažniausiai suserga gimdos kaklelio vėžiu. Kuo ilgiau tam tikro genotipo ŽPV išsilaiko organizme, tuo tikimybė, jog virusas išnyks, mažėja, o diagnozuoti ikivėžinę būklę – didėja [97].
persistavimas geriamųjų kontraceptikų vartotojų grupėje sietinas su moters hormonų pusiausvyra [91].
Kitas nepriklausomas gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksnys yra rūky-mas [1, 15]. Rūkyrūky-mas slopina vietinį imunitetą, o cigarečių sudėtyje esantis aktyvus mutageninis komponentas sudaro sąlygas ŽPV persistuoti, kas ska-tina vėžinę transformaciją. Yra duomenų, kad rūkymas gali būti nepriklau-somas rizikos veiksnys, galintis sukelti didelio laipsnio gimdos kaklelio intraepitelinius pokyčius [1].
ŽPV infekcijos rizika priklauso ir nuo lytinės elgsenos. Per vieną lytinį aktą su užsikrėtusiu partneriu tikimybė įgyti ŽPV yra vidutiniškai 40 proc. [20]. Naujas partneris ŽPV infekcijos įgijimo riziką didina 10 proc. [20]. Kitų tyrimų duomenimis, esant naujam partneriui rizika įgyti ŽPV infekciją yra 21 proc., o per gyvenimą lytinių partnerių daugėjant – dar 21 proc. [47, 48]. Rizika užsikrėsti ŽPV nuo naujo partnerio didėja ir bendrojoje po-puliacijoje, ir vyresnių nei 40 metų moterų grupėje [47, 66, 142].
Daug gimdymų – dar vienas rizikos veiksnys, galintis turėti įtakos dos kaklelio vėžio išsivystymui [21]. ŽPV užsikrėtusioms moterims, gim-džiusios 7 ir daugiau kartų, rizika susirgti gimdos kaklelio vėžiu yra 4 kartus didesnė nei negimdžiusioms užsikrėtusiosioms [15].
Tyrimų duomenų apie kitų gyvensenos veiksnių, pvz.: alkoholio, įvairių dietų, įtaką ŽPV persistavimui rasti nepavyko. Nors ankstesnėse studijose buvo galimų duomenų apie kitų virusų –paprastojo herpeso (Herpes
simp-lex), 6, 7 tipų herpeso ar citomegalo – superinfekcijos įtaką ŽPV
persista-vimui, tačiau vėlesnių tyrimų, patvirtinančių ar atmetančių šią tikimybę, rasti nepavyko [21].
2.2.3. Infekuotų ląstelių pažeidimas
ŽPV genomą sudaro dvigrandė DNR, kurią koduoja 8 genai. Atsižvel-giant į viruso ciklo metu vykstančios baltymų raiškos, identifikuoti 2 funk-cionuojantys genomo regionai: koduojantis regionas, turintis ankstyvuosius genus E1, E2, E4, E5, E6 ir E7, ir regionas, turintis 2 vėlyvuosius genus, didžiuosius ir mažuosius kapsidės baltymus L1 ir L2 (2.2.3.1 lentelė). ŽPV genomas turi papildomą nekoduojantį regioną, kuriame yra daug reguliuo-jančių elementų, dalyvaureguliuo-jančių viruso DNR replikacijoje ir transkripcijoje [27, 36, 107, 125, 152].
turi įtakos ląstelės ciklo reguliavimui. ŽPV 16 E7 baltymas jungiasi su pRb ir sukelia nevaldomą ląstelių dauginimąsi. ŽPV 16E6 slopina naviką slo-pinantį baltymą p53. P53 baltymas reguliuoja genų, reguliuojančių ląstelės ciklo kontrolę ar apoptozę, raišką. E6 reaguoja su 100 kDA ląstelės baltymu (E6AP). E6/E6AP kompleksas prisijungia p53, kuris greitai priverčia proteosomas degraduoti: ŽPV pažeistos ląstelės suvėžėja. Veikdami kartu E6 ir E7 baltymai skatina ląstelių proliferaciją, prailgina ląstelių ciklą ir neleidžia vykti apoptozei. Virusas užkrečia išimtinai epitelį ir gamina naujas virusines daleles tik visiškai subrendusiose epitelio ląstelėse. Taip ŽPV sutrikdo normalią ląstelės ciklo kontrolę: skatina nekontroliuojamą ląstelių dalijimąsi ir sukelia genetines pažaidas. Ląstelės nebetrukdo virusui daugin-tis, o vienoje ląstelėje pasidaugina šimtai ar net tūkstančiai ŽPV genomų [32, 42]. Esant ikivėžinei būklei, nediferencijuotos ląstelės su genetiniais sutrikimais, pakeičia beveik visą gimdos kaklelio storį. Laikas nuo užsikrėtimo ŽPV iki pirmųjų ikivėžinės būklės pokyčių gali būti stebėtinai trumpas [63].
2.2.3.1 lentelė. Biologinės žmogaus papilomos viruso savybės, ankstyvieji
baltymai ir jų ląstelių taikiniai
ŽPV
baltymai Funkcija Ląstelių taikiniai
E7 Didysis onkobaltymas, ląstelės ciklo slopinimas pRb, p107, p130 E6 Didysis onkobaltymas, ląstelės proliferacija,
blokuoja apoptozę hTERT, MAGUK, cIAP P53, E6AP, CBP, p300, E5 Aktyvuoja mitogeninius signalus augimo
faktoriams/ankstyvoje transformacijos stadijoje –
E4 Destabilizuoja citokeratiną –
E2 Virusinės DNR replikacija ir transkripcija –
E1 Virusinės DNR replikacija –
Ghittoni R, 2015.
2.2.4. Suvėžėjimas
duomenimis, ŽPV16 susijęs su didelio laipsnio intraepitelinės neoplazijos išsivystymu jaunesniame amžiuje ir ryškesniais kolposkopiniais vaizdais, lyginant su kitų tipų ŽPV sukelta patologija [150].
De Sanjose dideliame pasauliniame tyrime, kuris apėmė 5 kontinentų 38 šalių 1949–2009 metais gimdos kaklelio vėžiu sirgusių moterų populiaciją, norint įvertinti ŽPV DNR tipų paplitimą buvo ištirti 10 575 parafino blokų histologinės medžiagos mėginiai. Dažniausiai gimdos kaklelio vėžio atve-jais buvo nustatyti aštuoni ŽPV tipai: ŽPV16, ŽPV18, ŽPV31, ŽPV33, ŽPV35, ŽPV45, ŽPV52 ir ŽPV58. Pastebėta tendencija, kad per 60 metų ŽPV16 išskyrimo dažnumas mažėjo, o kitų ŽPV tipų – didėjo, bet statistiš-kai reikšmingo skirtumo nenustatyta. Trys ŽPV tipai – ŽPV16, ŽPV18 ir ŽPV45 – vyravo visuose histologiniuose mėginiuose esant plokščiųjų ląste-lių karcinomai, adenokarcinomai ir plokščiųjų ląsteląste-lių adenokarcinomai. ŽPV18 ir ŽPV45 kartu reikšmingai dažniau buvo nustatyti adenokarcino-mos atvejais, lyginant su plokščiųjų ląstelių karcinoma (atitinkamai 44 proc. ir 14 proc., p < 0,001). Jaunesnio amžiaus pacienčių grupėje dažniau rasti ŽPV18 ir ŽPV45, lyginant su ŽPV16. Įdomu tai, kad, šio tyrimo duome-nimis, ŽPV45 buvo trečias pagal dažnumą invazinės ligos atveju, nors šio tipo virusas, lyginant su ŽPV16, kai nėra citologinių pokyčių, nustatomas itin retai (atitinkamai 0,4 proc. ir 2,5 proc.), o LSIL atvejais – atitinkamai 3,7 proc. ir 20 proc. Tai, matyt, lemia stiprios šio viruso onkogeninės savy-bės. Tyrėjai mano, kad taip galima paaiškinti, kodėl laikotarpis nuo už-sikrėtimo ŽPV45 iki vėžio išsivystymo yra trumpesnis, be ikivėžinio pažei-dimo stadijos. Šio tyrimo duomenimis, gimdos kaklelio vėžys, priklausomai nuo histologinio tipo, esant ŽPV16, ŽPV18 ir ŽPV45 infekcijai, gali išsivystyti 4 metais greičiau, lyginant su kitais tipais [120]. Lietuvoje atlikto tyrimo duomenimis, ŽPV16, ŽPV18 ir ŽPV45 buvo užsikrėtusios 84,2 proc. tiriamosios, kurioms citologiniu tyrimu nustatyti HSIL bei ryškūs kolposko-piniai pokyčiai, ir 78,5 proc. – kurioms nustatyti HSIL bei didelio laipsnio intraepiteliniai gimdos kaklelio pokyčiai (CIN2, CIN2–3, CIS) [65].
2.3. Gimdos kaklelio intraepitelinių pokyčių ir karcinomos
in situ diagnostika
2.3.2. Gimdos kaklelio tepinėlio plokščiojo epitelio ląstelių pokyčių terminija
PAP tepinėlyje nustatomus plokščiojo epitelio intraepitelinius pokyčius, rezultatų vertinimą ir interpretaciją apibrėžia Bethesda klasifikavimo sis-tema, kuri pirmą kartą pristatyta 1988 m., 1999 m. patvirtinta, o nuo 2001 m. pradėta naudoti klinikinėje praktikoje. Ši klasifikavimo sistema pakeitė iki tol naudotą CIN vertinimo sistemą, kuri buvo orientuota daugiau į audi-nio struktūrinius pokyčius. Bethesda sistema sukurta norint pagerinti su-pratimą apie gimdos kaklelio ikivėžines ligas ir nustatyti bendrą aprašo-mosios diagnostinės histologijos terminiją (2.3.2.1 lentelė) [100]. Atsižvel-giant į naujų terminų atsiradimą, molekulinių testų pritaikymą diagnostinės patikros tikslais ir vis gerėjantį gimdos kaklelio vėžinių ligų biologinių me-chanizmų supratimą, ši sistema buvo peržiūrėta ir 2014 m. priimta. Šiuo metu gimdos kaklelio tepinėlių vertinimas ir rezultatų interpretavimas atliekamas naudojant atnaujintą 2014 m. Bethesda klasifikaciją [100]. Plokščiojo epitelio pokyčiai pagal Bethesda sistemą klasifikuojami į ketu-rias kategorijas: ASC – atipinės plokščiojo epitelio ląstelės, LSIL – nedide-lio laipsnio, arba nežymus, intraepitelinis pažeidimas, HSIL – didenedide-lio laips-nio, arba žymus, intraepitelinis pažeidimas (karcinoma in situ) ir plokščiųjų ląstelių karcinoma.
2.3.2.1 lentelė. Gimdos kaklelio plokščiojo epitelio ląstelių pokyčių
vertini-mas pagal įvairias klasifikavimo sistevertini-mas
Papanicolaou PSO CIN Bethesda
I klasė Intraepitelinių pokyčių ar vėžio nėra
II klasė Atipinės plokščiojo epitelio ląstelės Neryški displazija CIN1 Nežymūs plokščiųjų ląstelių
intraepi-teliniai pokyčiai III klasė Vidutinė
displazija CIN2 Žymūs plokščiųjų ląstelių intraepite-liniai pokyčiai Ryški displazija CIN3 Žymūs plokščiųjų ląstelių
intraepite-liniai pokyčiai
IV klasė Karcinoma in situ CIN3 Žymūs plokščiųjų ląstelių intraepite-liniai pokyčiai
2.4. Žmogaus papilomos viruso diagnostika
ŽPV dezoksinukleorūgšties (DNR) nustatymas gimdos kaklelio ir makš-ties nuobrūžų mėginiuose yra labai svarbus ankstyvosios gimdos kaklelio vėžio diagnostikos žymuo, nes gali būti aptinkamas, kol dar nėra mor-fologinių ląstelinių pokyčių [42, 128]. Aptikus didelės rizikos ŽPV tipus, įprastai pacientės stebimos ir tiriamos dažniau – tai leidžia laiku pastebėti ląstelių pokyčius ir diagnozuoti ikivėžines ligas. Patikros programose pir-maeiliu pasirinkus DR ŽPV tyrimą, o ne PAP, jau per pirmąjį etapą gimdos kaklelio neoplazijos atvejų nustatoma iki 50 proc. daugiau [30, 102, 116, 117]. ŽPV tyrimas patikros programose yra pranašesnis ir jautresnis nei PAP tepinėlio citologinis vertinimas [26, 62, 117, 124]. Vis dėlto gali būti, kad per pirminę patikrą tiriant vien tik ŽPV ir nustačius didelės rizikos ŽPV tipus gerokai padaugėtų kolposkopinių tyrimų [119]. ŽPV tyrimo trūkumas tas, kad neįmanoma atskirti laikinos infekcijos nuo persistuojančios, neryškių ląstelių pokyčių nuo suvėžėjimo. ŽPV dažnai nustatomas jaunoms moterims, tačiau daugumai jų infekcija išnyksta nesukėlusi jokių pasekmių [30]. Todėl ŽPV tirti rekomenduoja vyresnėms kaip 30 metų moterims, nes jaunesnėms dėl laikinos ŽPV infekcijos rezultatas dažnai gali būti klaidingai teigiamas [53, 60, 98, 124]. Jeigu patikros programose būtų įdiegta, kad per pirminį patikrinimą ŽPV DNR tyrimas atliekamas kartu su citologiniu, būtų atrinkta iki 100 proc. rizikos grupės moterų [103].
Kadangi ŽPV esant ASCUS aptinkamas nuo 2,9 proc. iki 9 proc. atvejų, ŽPV tyrimo svarba, kai nustatoma šių citologinių pokyčių, neabejojama. ŽPV tyrimas ASCUS atvejais sumažina kolposkopijos dažnumą 40 proc. ir pagerina intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių diagnostiką [119, 133; 139].
2.5. Gimdos kaklelio vėžio gydymo vertinimo problematika Gimdos kaklelio vėžio gydymo taktika pasirankama atlikus klinikinį sta-dijavimą, remiantis FIGO (angl. The International Federation of
Gyneco-logy and Obstetrics) rekomendacijomis (kolposkopija, naviko biopsija,
stromą gylį, invaziją į kraujagysles, limfagysles, priegimdžius, makštį, me-tastazes limfmazgiuose) gali padėti parinkti geriausią gydymo taktiką [6, 10, 33, 138], todėl radiologiniai tyrimai, t. y. kompiuterinė tomografija (KT) ar magnetinio rezonanso (MR) tyrimas, tampa rutininiais tyrimais klinikinėje praktikoje [6, 56]. Įvertinus šiuos duomenis, pasirenkamas gydymo meto-das: esant ankstyvos stadijos vėžiui (pagal FIGO iki IIA stadijos) – chirur-ginis gydymas, o kai liga išplitusi (pagal FIGO nuo IIB stadijos) ar yra ne-palankių prognozinių kriterijų – suderintas chemospindulinis gydymas.
Bendras šia liga sergančių moterų 5 metų išgyvenamumas siekia 73 proc., tačiau prognozė, kai gimdos kaklelio vėžys išplitęs, tebėra nepaten-kinama [138]. Ligos atkrytis ar ligos persistavimas po taikyto gydymo nu-statomas iki 35 proc. pacienčių, sergančių invaziniu gimdos kaklelio vėžiu [154]. Esant ankstyvoms invazinio gimdos kaklelio vėžio stadijoms (pagal FIGO IB–IIA stadija), ligos atkrytis pasitaiko nuo 10 iki 20 proc. atvejų, o esant išplitusiam gimdos kaklelio vėžiui, atkryčio rizika išauga iki 70 proc. Ligos atkryčio tikimybė labai susijusi su prognoziniais rizikos veiksniais [154].
netinkamas pacientėms, kurių organizme yra metalo (klipsai ant krauja-gyslių, širdies stimuliatoriai, sąnarių protezai ir pan.). Pastaruoju metu me-dicinoje naudojami metalai yra atsparūs magneto poveikiui, todėl daugiausia dėmesio kreipiama į praeityje atliktas intervencijas.
3. TYRIMO METODIKA
3.1. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga 3.1.1. Tiriamųjų kontingentas
3.1.1.1. Pacientės, sergančios gimdos kaklelio karcinoma in situ Į tyrimą buvo įtraukta šimtas 2009–2011 m. LSMU KK Akušerijos ir gi-nekologijos klinikoje gydytų pacienčių, kurioms diagnozuota gimdos kak-lelio karcinoma in situ.
Tiriamųjų įtraukimo kriterijai:
1. Pacientės 2009–2011 m. gydytos LSMU KK Akušerijos ir gine-kologijos klinikoje, kurioms atlikus operaciją – gimdos kaklelio diatermokonizaciją – histologiškai patvirtinta gimdos kaklelio kar-cinomos in situ diagnozė.
2. Amžius > 18 metų.
3. Sutikimas dalyvauti tyrime. Tiriamųjų atmetimo kriterijai:
1. Pacientės, kurioms gimdos kaklelio karcinoma in situ gydyta kitais metodais: lazerio vaporizacija ar vagininė histerektomija.
2. Pacientės, operuotos nuo gimdos kaklelio karcinomos in situ (pa-tvirtintos priešoperacine biopsija), kurioms pooperaciniu gimdos kaklelio konuso histologiniu tyrimu nustatyta mažesnio laipsnio intraepitelinė neoplazija.
3. Pacientės, kurios buvo pakartotinai operuotos atliekant visišką gim-dos pašalinimo operaciją dėl kitų ginekologinių ligų.
4. Kvietimo dalyvauti tyrime metu rasta uždegimo pokyčių makštyje ar gimdos kaklelyje.
5. Kvietimo dalyvauti tyrime metu buvo nustatytas nėštumas. 3.1.1.2. Pacientės, sergančios išplitusia gimdos kaklelio karcinoma Į tyrimą buvo įtrauktos 79-ios 2009–2011 m. LSMU KK Akušerijos ir ginekologijos klinikoje gydytos pacientės, sergančios IB2–IV stadijos (pa-gal FIGO) gimdos kaklelio vėžiu, kurioms numatytas chemospindulinis gy-dymas.
Tiriamųjų įtraukimo kriterijai:
1. Histologiškai (iš biopsinės medžiagos) patvirtintas gimdos kaklelio invazinis vėžys.
3. Kaip pirmos eilės gydymo metodas skirtas suderintas chemospin-dulinis gydymas.
4. Karnovskio indeksas ≥70. 5. Sutikimas dalyvauti tyrime. Tiriamųjų atmetimo kriterijai:
1. Histologiškai patvirtinti šviesiųjų ląstelių, neuroendokrininiai ar mišrūs (turintys neuroendokrininių dalių) navikai.
2. Nėštumas.
3. Kitos onkologinės ligos anamnezėje. 4. Sunkios ekstragenitalinės ligos.
5. Psichikos ligos ir (ar) sutrikimai, galintys turėti įtakos tolesniam pacientės stebėjimui ir gydymui.
3.1.2. Tyrimo eiga
Pacienčių, sergančių gimdos kaklelio karcinoma in situ, tyrimo eiga pa-teikiama 3.1.2.1 pav.
Momentinis tyrimas vykdytas 2014–2016 metais LSMU KK Akušerijos ir ginekologijos klinikoje. Į tyrimą įtrauktos 172 moterys, 2009–2011 metais gydytos LSMU KK Akušerijos ir ginekologijos klinikoje nuo gimdos kaklelio karcinomos in situ. Moterys atrinktos iš Akušerijos ir ginekologijos klinikos registro. Iš telefonu kviestų 172 moterų dalyvauti sutiko 117 mo-terų (68,02 proc.), tyrime dalyvavo 100 (58,13 proc.) momo-terų. 2,9 proc. (n = 5) informavo, kad šiuo metu gyvena ne Lietuvoje, todėl tyrime dalyvauti negali. 11,62 proc. (n = 20) atsisakė dalyvauti tyrime, nenurodydamos prie-žasties. 9,88 proc. (n = 17) moterų tyrime sutiko dalyvauti, tačiau neatvyko. Su 17,44 proc. (n = 30) moterų nepavyko susisiekti.
Reikalingam tiriamųjų skaičiui nustatyti taikyta Panioto formulė (Jadov, 1987): N n 1 1 2 + ∆ = ,
kur ∆ – atrankos paklaida (0,05); N (117) – tiriamos visumos dydis; n – imties dydis. Imčiai pagrįsti su 5 proc. paklaida užtektų 90 tiriamųjų.
3.1.2.1 pav. Pacienčių, sergančių gimdos kaklelio karcinoma in situ,
tyrimo eiga
gydytojas. Visoms dalyvauti tyrime sutikusioms moterims paimtas ir atliktas gimdos kaklelio nuobrūžų skystųjų terpių citologinis tyrimas bei ŽPV tyri-mas, atliktas kolposkopinis tyrimas nustačius pokyčių (CT ir DR ŽPV) bei histologinis medžiagos tyrimas po gimdos kaklelio kanalo arbazijos ar tikslinės biopsijos, kontroliuojamos kolposkopu.
Pacienčių, sergančių išplitusia gimdos kaklelio karcinoma, tyrimo eiga pateikiama 3.1.2.2 pav.
2009–2011 m. LSMU KK Akušerijos ir ginekologijos klinikoje nuo gimdos kaklelio karcinomos gydytos pacientės, kurioms taikytas chemospindulinis gydymas
n = 79
Pacientės, sutikusios dalyvauti ir atitikusios įtraukimo kriterijus
n = 79 I etapas
Atliktas ultragarsinis tyrimas prieš gydymą n = 79
Atkrito n = 16 II etapas
Atliktas ultragarsinis tyrimas prieš 4-ą chemoterapijos kursą
n = 63
Atkrito n = 11 III etapas
Atliktas ultragarsinis tyrimas 3 mėn. po baigto chemospindulinio gydymo
n = 52
3.1.2.2 pav. Pacienčių, sergančių išplitusia gimdos kaklelio karcinoma,
Momentinis tyrimas vykdytas 2009–2011 metais LSMU KK Akušerijos ir ginekologijos klinikoje. Į tyrimą pakviestos 79 pacientės, 2009–2011 me-tais gydytos LSMU KK Akušerijos ir ginekologijos klinikoje nuo gimdos kaklelio IB2–IV stadijos vėžio (pagal FIGO), kurioms buvo numatytas su-derintas chemospindulinis gydymas. Visoms pacientėms atliktas vagininis pilkosios skalės ultragarsinis tyrimas, doplerometrinis kraujotakos tyrimas gimdos kaklelio morfometriniams ir kraujotakos pokyčiams įvertinti. Vagi-ninis ultragarsinis tyrimas atliktas prieš gydymą, gydymo viduryje, (prieš 4 chemoterapijos kursą) ir praėjus 3 mėnesiams po gydymo. Dalis pacienčių jau po pirmo etapo atsisakė dalyvauti tyrime, nes išvyko gydytis kitur, dalis pacienčių į kitą tyrimą neatvyko. Į tyrimą įtrauktos ir rezultatai analizuoti tik visus tyrimo etapus perėjusių 52 pacienčių.
3.2. Tyrimo metodai 3.2.1. Ultragarsinio tyrimo metodika
Ultragarsinio tyrimo metodika buvo standartizuota, visus tyrimus atliko vienas tyrėjas „Toshiba Aplio“ („Toshiba Medical Systems“, Tokijas, Japo-nija) ultragarso aparatu naudodamas vagininį daugiadažnį daviklį („Toshiba PVT-674BT“, 3,6–8,8 MHz). Matavimai buvo atlikti sagitalinėje ir skersi-nėje plokštumose, sustabdžius vaizdą, standartiniais sistemoje instaliuotais kaliperiais.
Sagitalinėje plokštumoje vertintos šie morfometriniai gimdos kaklelio naviko (vertintas solidus, hipoechogeniškas ar heterogeniškas darinys) pa-rametrai:
• didžiausias naviko ilgis (I) sagitalinėje plokštumoje; • priekinis–užpakalinis naviko matmuo (PU diametras).
Skersinėje plokštumoje (vaizdas išgautas pasukant daviklį 90 laipsnių kampu) matuota:
• didžiausias naviko plotis (P).
Kiekvienas morfometrinis parametras matuotas mažiausiai tris kartus. Vaizdai ir vaizdo klipai išsaugoti DICOM formatu, kad vėliau būtų galima atlikti analizę OsiriX 2.7.5 DICOM analizės kompiuterine programa.
3.2.1.1 pav. Gimdos kaklelio naviko matmenys sagitalinėje (I, PU) ir
skersinėje (P) plokštumosenaviko tūriui apskaičiuoti.
Vertinant atsaką į gydymą, laikyta, kad atsakas visiškas, kai naviko li-kučių nematoma, dalinis –kai naviko dydis sumažėjęs daugiau nei 50 proc.
3.2.2. Kraujotakos nustatymas doplerio tyrimo metodu
3.2.2.1. Spalvinio indekso nustatymas doplerio tyrimo metodu
Pilkojoje skalėje sagitalinėje plokštumoje, kurioje matomas didžiausias naviko plotas, įjungus spalvinio doplerio režimą ir esant minimaliam impul-sų kartojimosi dažniui (angl. Pulse repetition frequency, PRF) nustatytas na-viko kraujotakos SI, vertinant nuo 1 iki 4 balų:
• 1 balas, kai naviko struktūroje kraujotakos židinių nematyti arba jie minimalūs.
• 2 balai, kai naviko struktūroje matyti nuo 1 iki 3 kraujotakos židinių. • 3 balai, kai naviko struktūroje matyti nuo 4 iki 6 kraujotakos židinių. • 4 balai, kai naviko struktūroje matyti daugiau nei 6 kraujotakos
ži-diniai.
3.2.2.2. Rezistentiškumo indekso nustatymas doplerio tyrimo metodu Pilkojoje skalėje sagitalinėje plokštumoje, kurioje matomas didžiausias naviko plotas, įjungus spalvinio doplerio režimą ir esant minimaliam PRF, įjungtas pulsinio doplerio režimas (tripleto režimas) ir užrašyta doplero-grama, kurioje matyti mažiausiai trys doplerometrinių bangų kompleksai. Automatiniu režimu apibrėžus doplerometrinių bangų kompleksą, išmatuo-tas rezistentiškumo indeksas.
3.2.2.3. Maksimalaus kraujotakos greičio nustatymas doplerio tyrimo metodu
Pilkojoje skalėje sagitalinėje plokštumoje, kurioje matomas didžiausias naviko plotas, įjungus spalvinio doplerio režimą ir esant maksimaliam PRF, įjungtas pulsinio doplerio režimas (tripleto režimas) ir užrašyta doplerogra-ma, kurioje matyti mažiausiai trys doplerometrinių bangų kompleksai. Automatiniu režimu apibrėžus doplerometrinių bangų kompleksą, išma-tuotas maksimalus kraujotakos greitis sistolėje.
3.2.2.3.1 pav. Rezistentiškumo indekso ir maksimalaus kraujotakos greičio
nustatymas doplerio tyrimo metodu
3.2.3. Kolposkopinis tyrimas
federa-cijos nomenklatūros rekomendacijomis. Galimi kolposkopijos radiniai: normalūs kolposkopiniai vaizdai ir nenormalūs: įtariama mažo ir didelio laipsnio invazija, nespecifiniai ir įvairūs kolposkopiniai vaizdai. Kolposko-pijos tikslas – aptikti labiausiai pakitusią gimdos kaklelio vietą, kad būtų galima atlikti tikslinę biopsiją ir histologinį medžiagos tyrimą.
3.2.4. Citologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystosios terpės SurePath TM metodu
Tiriamoji medžiaga iš gimdos kaklelio buvo imama šepetėliu
Cervex-Brush(Rovers® Medical Devices, Olandija). Gimdos kaklelio žiotyse
šepe-tėlis švelniai suktas gimdos kaklelio paviršiumi 5 kartus pagal laikrodžio rodyklę, todėl citologinės medžiagos vienu metu paimta iš egzo- ir endocer-vikinio kanalo sričių. Šepetėlį laikant rankoje, jo galvutė su paimta cito-logine medžiaga, nykščiu ir smiliumi nuimta nuo kotelio ir įmesta į trans-portinį konteinerį su skysta fiksuojančia terpe SurePath, turinčia 24 proc. etanolio (Becton Dickinson, JAV). Paimtas mėginys laboratorijoje homoge-nizuojamas 15 sek. kratant Tri Path Imagingmaišytuvu (Becton Dickinson, JAV) 3000 apsisukimų per min. greičiu. Tada ėminys Prep Mate sistema (Becton Dickinson, JAV) automatiškai perkeltas į centrifugos vamzdelį su tankio gradientu (polisacharido tirpalas, kuriame yra natrio azido). Ląstelių suspencija su tankio gradientu centrifuguota (centrifuga Rotina 46, Vokie-tija) 2 kartus: iš pradžių 2 min. 200 apsisukimų per min. greičiu, vėliau 10 min. 800 aps./min. greičiu, kad pasišalintų kraujas, gleivės ir kitos prie-maišos. Iš gautų nuosėdų paruoštas ir nudažytas citologinis tepinėlis BD
PrepStain automatine tepinėlių ruošimo ir dažymo sistema. Taip citologinė
gimdos kaklelio medžiaga tolygiai (vienu sluoksniu) paskleista 13 mm ob-jektinio stiklelio plote ir automatiniu būdu nudažyta Papanicolau dažymo metodu. Tepinėliai vertinti šviesiniu mikroskopu Olympus-CX-41. Iš pra-džių tepinėliai apžiūrėti padidinus 50 ir 100 kartų – įvertinta nusidažymo kokybė, ląstelių pasiskirstymas ir kiekis. Tada nuosekliai peržiūrėtas ir įvertintas visas tepinėlis, neaiškios ar pakitusios ląstelės apžiūrėtos padidus 400 kartų ir įvertintos. Tepinėlių rezultatai pateikti tik tada, kai plokščiojo epitelio ląstelių rasta ne mažiau kaip 5000 r/l ir nustatyta transformacijų bei endocervikinės gimdos kaklelio srities ląstelių. Rezultatų interpretavimas pateiktas remiantis 2001 metų Bethesdos sistema:
• nėra intraepitelinių pokyčių ar piktybinio naviko (NILM);
• nenustatytos reikšmės atipinės plokščiojo epitelio ląstelės (ASCUS); • nežymūs plokščiojo epitelio intraepiteliniai pokyčiai (LSIL);
• žymūs plokščiųjų ląstelių intraepiteliniai pokyčiai (HSIL); • CIS (karcinoma in situ);
• AIS (endocervikinė adenocarcinoma in situ);
• nenustatytos reikšmės atipinės liaukinio epitelio ląstelės (AGC-NOS). 3.2.5. Žmogaus papilomos viruso dezoksiribonukleorūgšties (DNR) išskyrimas iš audinio
ŽPV tipai nustatyti gimdos kaklelio pooperacinio konuso histologinėje medžiagoje. Atsakingas gydytojas patologas paruošia formalinu fiksuotą ir į parafiną įlietą audinio mėginį genetiniam molekuliniam tyrimui: iš vieno pa-rafino bloko atpjaunami ne mažiau kaip penki 5 mikronų storio histologiniai pjūviai, kuriuose gausu ląstelių, ir įdedami į vieną sterilų 1,5 ml mėgin-tuvėlį.
Dezoksiribonukleorūgštis (DNR) iš parafinu dengto audinio išskirta nau-dojant komercinį QIAamp DNA FFPE Tissue (Qiagen, JAV) rinkinį, kurio sudėtyje yra visi reikiami reagentai ir priemonės: proteinazė K, buferiai,
QIAamp MinElute kolonėlės. Tyrimo pradžioje iš kiekvieno parafino su
biopsine medžiaga bloko vienam tyrimui atpjauti ir sudėti į mikrocentrifu-ginius mėgintuvėlius ne mažiau kaip 8 pjūviai, kurių storis 5–10 µm.
Tiriamoji medžiaga pirmuoju DNR išskyrimo etapu, kad ištirptų ir pasišalintų parafino likučiai, užpilta 1 ml ksileno ir 10 s kratyta kratytuvu
Vortex V-1 (BioSan, Latvija). Tada mėgintuvėlis su tiriamąja medžiaga 2
min. kambario temperatūroje centrifuguotas visu greičiu centrifugoje
Het-tich Rotina 35 (Vokietija). Susidaręs supernatantas iš mėgintuvėlio
pašalin-tas su pipete paliekant nuosėdas. Tęsiant tyrimą, ant mėgintuvėlyje esančių nuosėdų, kad pasišalintų į audinį įsigėręs ksilenas, užpilta 1 ml 96–100 proc. etanolio ir viskas gerai išmaišyta kratytuvu. Toliau mėgintuvėlio turinys 2 min. kambario temperatūroje centrifuguotas visu greičiu. Susidaręs super-natantas iš mėgintuvėlio pašalintas su pipete paliekant nuosėdas.
neįvyktų kontaminacija tarp mėginių. Tęsiant tyrimą, į mėgintuvėlius įpilta 200 µl buferio AL (lizės buferis), gerai išmaišyta kratytuvu. Tada į mišinį įpilta 200 µl 96–100 proc. etanolio ir kartotinai viskas gerai išmaišyta kra-tytuvu. Po sumaišymo, prieš atidarant mėgintuvėlius, jie iš karto centri-fuguoti keletą minučių, kad pasišalintų susidaręs kondensatas nuo dangtelių viršaus ir atidarant neįvyktų kontaminacija tarp mėginių. Susidaręs lizatas iš mėgintuvėlių atsargiai perkeltas ant QIAamp MinElute kolonėlių, uždėtų ant 2 ml mėgintuvėlių. Viskas uždengta dangteliais ir centrifuguota 6000 × g (8000 apsisukimų per minutę (rpm)) 1 min. Kai lizatas visiškai pratekėjo pro membraną, QIAamp MinElute kolonėlės perkeltos ant naujų 2 ml mė-gintuvėlių, o panaudoti su lizatu išmesti. QIAamp MinElute kolonėlės at-sargiai atidarytos ir ant jų užpilta 500 µl buferio AW1 (plovimo buferis). Kolonėlės uždengtos dangteliais ir centrifuguotos 6000 × g (8000 rpm) 1 min., po centrifugavimo kolonėlės perkeltos ant naujų 2 ml mėgintuvėlių, o panaudoti išmesti. Kolonėlės kartotinai atsargiai atidarytos ir ant jų užpilta 500 µl buferio AW2 (plovimo buferis), tada uždengtos dangteliais ir cent-rifuguotos 6000 × g (8000 rpm) 1 min. Po centrifugavimo kolonėlės dar kar-tą perkeltos ant naujų 2 ml mėgintuvėlių ir dar karkar-tą centrifuguotos 3 min. 20 000 × g (14 000 rpm) greičiu, kad kolonėlėse esančios membranos visiškai išdžiūtų. Tolesniu etapu kolonėlės dar kartą perkeltos ant naujų 1,5 ml mikrocentrifuginių mėgintuvėlių, atsargiai atidarytos ir užpilta 50 µl buferio ATE. Uždarius dangtelius, kolonėlės inkubuotos kambario tempera-tūroje 1 min. ir centrifuguotos 20 000 × g (14 000 rpm) greičiu 1 min., kad išskirtos koncentruotos DNR eliucija būtų atskirta nuo membranos.
3.2.6. DNR kiekio ir grynumo nustatymas
3.2.7. DNR pagausinimas polimerazės grandininės reakcijos metodu Tyrimo pradžioje buvo paruoštas reakcijos mišinys, esantis Optiplex
HPV Genotyping (DiaMex, JAV) rinkinyje, kurio sudėtyje yra visi reikiami
reagentai: pradmenys, 26 skirtingos karoliukų grupės, sujungtos su 24 ŽPV, vienu β-globino ir vienu hibridizacijos kontrolės specifiniu oligonukleotido zondu. β-globinas buvo naudojamas kaip kokybės kontrolė genominei DNR nustatyti polimerazės grandininės reakcijos metodu. Tyrimo pradžioje į sterilius mėgintuvėlius, įstatytus į šaldomąjį stovelį, priklausomai nuo tiria-mų mėginių skaičiaus, buvo įpilta po 2 μl pradmens Primer Set 1, 0,5 μl pradmens Primer Set 2, 25 μl mišinio 2 × PGR MM , 12,5 μl vandens be RNazių ir 10 μl mėginio nukleorūgščių. Į papildomą mėgintuvėlį vietoj mėginio nukleorūgščių buvo įpilta 10 μl vandens be RNazių neigiamai kont-rolei. Mišiniai buvo gerai išmaišyti pipete ir įdėti į PGR ciklerį (Labcycler, Vokietija). PGR pagausinimui naudota speciali programa, atliktų ciklų skaičius pateiktas 3.2.7.1 lentelėje.
3.2.7.1 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos protokolas
PGR etapas Temperatūra Reakcijos trukmė min. : sek. Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 94 °C 15 : 0 1
Denatūracija 94 °C 0 :20 40
Pradmenų prilipimas 38 °C 0 : 30 40
Sintezė 71 °C 0 : 80 40
Galutinė sintezė 71 °C 4 : 0 1
Kol vyko PGR ciklai, buvo pagamintas dažymo tirpalas: į sterilų 2 ml mėgintuvėlį, priklausomai nuo tiriamų mėginių skaičiaus, buvo įpilta po 7,5 μl rinkinyje pateikto konjugato ir po 67,5 μl dažymo buferio. Mišinys gerai išmaišytas pipete ir paliktas stovėti tamsoje kambario temperatūroje.
3.2.8. Žmogaus papilomos viruso genotipo nustatymas taikant hibridizaciją ir vizualizaciją Luminex technologija
mišinio. Į trečiąjį mėgintuvėlį – 10 μl neigiamos kontrolės tirpalo, paga-minto PGR reakcijai. Į likusius mėgintuvėlius įpilta po 10 μl PGR produkto. Visuose mėgintuvėliuose esantys mišiniai buvo gerai išmaišyti pipete. Ga-liausiai hibridizacijos plokštelė buvo užklijuota specialia rinkinyje pateikta plėvele ir laikyta 10 min termocikleryje 95 °C temperatūroje. Tolesniu etapu plokštelė 1 min. buvo šaldoma ant ledo ir iš karto įdėta 30 min. į termo-kratytuvą ThermoShaker PST-60HL plus (BioSan, Latvija) 41 °C tempe-ratūroje, nustačius 500 rpm kratymo greitį. Kol mėginiai buvo inkubuojami termocikleryje, į filtracijos plokštelės šulinėlius, priklausomai nuo tiriamų mėginių skaičiaus, įpilta po 100 μl buferinio tirpalo ir plokštelė inkubuota kambario temperatūroje. Po 25 min. buferinis tirpalas nusiurbtas vakuumine pompa Millipore MultiScreen (Fisher Scientific, Jungtinė Karalystė), nusta-čius 12 inHg slėgį.
Mėginiai iš hibridizacijos plokštelės daugiakanale pipete perkelti į filtra-cijos plokštelę ir gerai išmaišyti. Nusiurbus ir pašalinus tirpalus vakuumine pompa (12 inHg), į filtracijos plokštelės šulinėlius buvo įpilta po 100 μl buferinio tirpalo ir vėl vakuumine pompa (12 inHg) pašalinti, o plokštelės apačia nuvalyta. Tada į filtracijos plokštelės šulinėlius įpilta po 70 μl anks-čiau pasigaminto dažymo tirpalo ir inkubuota 30 min. termokratytuve, esant 25 °C temperatūrai, nustačius 250 rpm kratymo greitį.
Tolesniu tyrimo etapu, praėjus nurodytam 30 min. laikui, tirpalas iš filt-racijos plokštelės šulinėlių nusiurbtas vakuumine pompa (12 inHg) ir paša-lintas. Į kiekvieną šulinėlį pilta po 100 μl buferinio tirpalo ir tirpalas pa-šalintas vakuumine pompa (12 inHg). Plokštelės apačia nuvalyta. Pastarasis etapas kartotas dar kartą, o trečią kartą į šulinėlius įpylus po 100 μl buferinio tirpalo, daugiakanale pipete jie buvo išmaišyti ir perkelti į specialią rin-kinyje pateiktą 96 Lock-Well plokštelę. Plokštelė su mėginiais įdėta į
Lu-minex 100/200 (LuLu-minex Corporation, JAV) tėkmės citometrą ir įjungta
speciali programa, nustatyta tyrimui.
Luminex technologija naudoja polistireno karoliukus, kurie yra nudažyti
įvairaus intensyvumo dviem spektriškai skirtingais raudonais fluoroforais. Kiekvienas karoliukų kompleksas prijungtas prie specifinio oligonukleotido zondo. Tikslinės sekos yra netiesiogiai sujungtos su trečiuoju fluoroforu.
Luminex tėkmės citometras išanalizavo bei įvertino fluorescencijos
signa-lus ir juos išsaugojo specialioje kompiuterio programoje. Kiekvieno mėginio fluorescencijos intensyvumas buvo skaičiuotas kaip MFI (fluorescencijos intensyvumo medianą) ir išdėliotas į lentelę. Kiekvienam mėginiui ir ŽPV tipui rezultatas apskaičiuotas remiantis neigiamos kontrolės signalu. Rezul-tatai apskaičiuoti pagal šias formules:
Išskyrus:
ŽPV 18, 59, 82 ribinė vertė = pamatinė vertė + 50 MFI ŽPV 16 ribinė vertė = pamatinė vertė + 100 MFI
Rezultatai vertinti, jei hibridizacijos kontrolė (HC) buvo > 200 MFI.
Optiplex HPV Genotyping rinkinys skirtas nustatyti didelės rizikos ŽPV
tipams: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68,73, 82, galimai di-delės rizikos: 26, 53, 66, ir mažos rizikos: 6, 11, 42, 43, 44, 70 ŽPV tipams.
3.2.9. Statistinė duomenų analizė
4. REZULTATAI
4.1. Žmogaus papilomos virusų tipų reikšmė gimdos kaklelio karcinomos in situ išsivystymui bei jų sąsajos su rizikos veiksniais
4.1.1. Demografiniai duomenys
Operuotų moterų amžius vidurkis buvo 35,85 metai (SN – 7,73; 95 proc. PI 40,12–43,18, p < 0,05). Jauniausia moteris – 22 metų, vyriausia – 58 metų. Tiriamosios buvo suskirstytos į 4 amžiaus grupes: mažiau nei 30 metų, 30–39 metų, 40–49 metų ir daugiau nei 50 metų (4.1.1.1 lentelė). Didžioji dalis (78 proc.) tiriamųjų gyveno mieste (95 proc. PI 70–86 proc., p < 0,05), o kaimuose ir miesteliuose – atitinkamai 16 proc. ir 6 proc. Dauguma tirtų moterų buvo ištekėjusios (67 proc.), išsiskyrusių – 21 proc., gyvenančių neregistruotoje santuokoje – 9 proc., netekėjusių ir našlių – atitinkamai 2 proc. ir 1 proc.. Didžioji dalis tiriamųjų turėjo aukštąjį išsi-mokslinimą (54 proc.), specialųjį vidurinį, vidurinį, nebaigtą aukštąjį ir pra-dinį atitinkamai 29 proc., 13 proc., 3 proc. ir 1 proc. moterų.
4.1.1.1 lentelė. Tiriamųjų skaičius pagal amžiaus grupes
Amžius grupės,
metai Tiriamųjų skaičius, n (proc.)
< 30 15 (15)
30–39 62 (62)
40–49 17 (17)
> 50 6 (6)
4.1.2. Karcinomą in situ sukėlusių žmogaus papilomos viruso tipų pasiskirstymas ir dažnumas
4.1.2.1 pav. Žmogaus papilomos viruso tipai ir jų pasiskirstymas
histologinėje medžiagoje
85,7 proc. (n = 66) atvejų nustatytas tik vieno tipo ŽPV, o 14,3 proc. (n = 11) – dviejų skirtingų tipų ŽPV. Daugiau nei vieno tipo ŽPV aptiktas vyresnėms nei 30 metų moterims. Visais atvejais, kai nustatytas ne vieno tipo ŽPV, kartu su kurio nors kito tipo ŽPV rastas ŽPV16: su ŽPV45 (n = 3), ŽPV53 (n = 2), ŽPV58 (n = 2), ŽPV18 (n = 1), ŽPV33 (n = 1), ŽPV52 (n = 1). Dėl mažo atvejų skaičiaus jokio statistinio skirtumo tarp atskirų tipų derinių nenustatyta. Išskirtų ŽPV tipų skaičius pagal amžiaus grupes pateikiamas 4.1.2.1 lentelėje.
4.1.2.1 lentelė. Žmogaus papilomos viruso tipų skaičius tiriamojoje
medžia-goje pagal amžiaus grupes
Amžius
grupės, metai Tiriamųjų skaičius, n (proc.) Rastas ŽPV, n (proc.) Rastas daugiau nei vieno tipo ŽPV, n (proc.)
< 30 15 (15) 13 (86,7) 1 (6,7)
30–39 62 (62) 48 (77,4) 8 (12,9)
40–49 17 (17) 12 (70,6) 2 (11,8)
≥ 50 6 (6) 4 (66,7) 0
