Ovuliacijos nustatymo būdo ir histopatologinių pokyčių gimdos gleivinėje reikšmė veislinių kalių reprodukcijai

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Milda Maslauskė

Ovuliacijos nustatymo būdo ir histopatologinių

pokyčių gimdos gleivinėje reikšmė veislinių kalių

reprodukcijai

Significance of ovulation detection method and

histopathological changes in uterine mucosa for

reproduction of breeding bitches

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: Prof., dr. Vita Riškevičienė

2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ovuliacijos nustatymo būdo ir histopatologinių pokyčių gimdos gleivinėje reikšmė veislinių kalių reprodukcijai“:

1. yra atliktas mano pačios.

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Milda Maslauskė

(data) (autorės vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.

Dr. Audronė Šeibokaitė

(data) (redaktorės vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui

(data) Prof., dr. Vita Riškevičienė (darbo vadovės vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

Prof., habil. dr. Saulius Petkevičius (aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo

vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas Prof., habil. dr. Henrikas Žilinskas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas,

3

TURINYS

1.1 Kalių lytinio ciklo fiziologiniai ypatumai ... 8

1.2 Kalės lytinio ciklo fazės ... 8

1.3 Optimalus kalių kergimo laikas ... 10

1.4 Kalių ovuliacijos laiko nustatymo būdai ... 11

1.4.1 Progesterono koncentracijos nustatymas kraujo serume ... 11

1.4.2 Tyrimas ultragarsu ... 12

1.4.3 Kalių makšties gleivinės citologija ... 13

1.4.4 Kalių makšties gleivinės makroskopinis vertinimas (vaginoskopija) ... 17

1.5 Kalių gimdos patologijos ir jų reikšmė ovuliacijos pasireiškimui ... 20

1.5.1 Cistinė endometriumo hiperplazija ... 20

1.5.2 Endometritas ... 21

1.5.3 Adenomiozė ... 22

1.5.4 Mukometra ... 22

2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 23

2.1 Tyrimų atlikimo eiga ... 24

3 TYRIMŲ REZULTATAI ... 26

3.1 Kalių reprodukcijos rodiklių vertinimas ... 26

3.2 Kliniškai sveikų įvairaus amžiaus kalių gimdos gleivinės histopatologinės būklės vertinimas anestrus stadijos metu ... 30

4 REZULTATŲ APTARIMAS ... 36 IŠVADOS ... 39 REKOMENDACIJOS ... 40 PADĖKA ... 41 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42 PRIEDAI ... 47

4 OVULIACIJOS NUSTATYMO BŪDO IR HISTOPATOLOGINIŲ POKYČIŲ GIMDOS

GLEIVINĖJE REIKŠMĖ VEISLINIŲ KALIŲ REPRODUKCIJAI Milda Maslauskė

Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Kalių nevaisingumą gali įtakoti patelės amžius, netinkamai nustatytas ovuliacijos laikas bei gimdos ir kiaušidžių ligos.

Šio darbo tikslas buvo nustatyti veislinių kalių reprodukcinius parametrus ir įvertinti jų ovuliacijos laiko nustatymo būdo bei gimdos gleivinės histopatologinių pažeidimų reikšmę reprodukcijai. Buvo vykdoma anketinė apklausa (n = 150), surinkti veislinių kalių reprodukcijos parametrai, histomorfologiškai įvertinti 35 įvairaus amžiaus kliniškai sveikų kalių gimdos gleivinės mėginiai anestrus stadijos metu.

Nustatyta, kad veisimui dažniausiai yra naudojamos vidutinio, 4–6 metų, amžiaus kalės, ruja 80,67 proc. kalių pasireiškia 2 kartus per metus, bet didėjant patelės amžiui rujų skaičius didėja (r = 0,181 (p < 0,027)). Kalės sėklinimas / kergimas dažniausiai yra kartojamas 2 kartus (p < 0,05), o atvedamų šuniukų skaičius nepriklauso nuo ovuliacijos laiko nustatymo būdo ir kergimų skaičiaus (p > 0,05). Progesterono koncentracijos tyrimas ovuliacijos laikui nustatyti yra naudojamas 65 proc., makšties citologija – 26 proc., empiriškai ruja nustatoma 9 proc. atvejų. Ovuliacijai nustatyti naudojant progesterono tyrimą, sėkmingų apvaisinimų procentas buvo 20,46 proc. geresnis lyginant

su subjektyviu ir 47,86 proc. lyginant su empiriniu būdu (r = 0,728, p < 0,02). Įvertinus kliniškai

sveikų anestrus stadijoje esančių kalių gimdos gleivinę, 28,5 proc. ir 17,2 proc. atvejų buvo nustatytas lėtinis arba ūminis endometritas, atitinkamai ir 17,1 proc. atvejų CEH. Nevaisingumą sukeliančių patologijų kiekis kliniškai sveikų, anestrus stadijoje esančių, kalių gimdoje daugėja, didėjant patelės amžiui (r = 0,659, p < 0,05).

5 SIGNIFICANCE OF OVULATION DETECTION METHOD AND HISTOPATHOLOGICAL

CHANGES IN UTERINE MUCOSA FOR REPRODUCTION OF BREEDING BITCHES Milda Maslauskė

Master’s Thesis

SUMMARY

Fertility in bitches can be affected by the age of a female dog, inaccurate detection of ovulation time and uterine and ovarian pathologies.

The aim of this study was to determine the reproductive parameters of breeding bitches and to evaluate their significance, the ovulation time detection method and uterine mucosal histopathological lesions for reproduction. A questionnaire survey (n = 150) was performed, the reproductive parameters of breeding bitches were collected, and 35 uterine mucosal samples of clinically healthy anestrus bitches of different ages were evaluated histomorphologically.

It was found that middle-aged, 4–6-year-old bitches are most often used for breeding, oestrus occurs in 80.67% of bitches twice a year, but the number of oestrus increases with increasing age of the female dog (r = 0.181 (p < 0.027)). Insemination / mating of bitches is usually repeated 2 times (p < 0.05), and the number of puppies born does not depend on the method of determining the m ovulation time and the number of mating (p > 0.05). Objective testing of serum progesterone concentration in order to determine the ovulation time is used in 65% of cases, subjective methods (vaginal cytology, etc.) in 26%, and empirical detection methods of estrus – in 9% of cases. Using a

progesterone testing to detect ovulation time, the percentage of successful fertilization was 20.46%

better compared to the subjective and 47.86% to the empirical methods (r = 0.728, p < 0.02). In the

uterine mucosa of clinically healthy anestrus bitches, chronic or acute endometritis was detected in 28.5% and 17.2% of cases respectively, and CEH in 17.1% of cases. The incidence of infertility pathologies in the uterus of clinically healthy, anestrus bitches increases with the increasing female dog age (r = 0.659, p < 0.05).

6

SANTRUMPOS

CEH – cistinė endometriumo hiperplazija FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas HE – hematoksilinas-eozinas

IGF-1 – insulino augimo faktorius – 1 LH – liuteinizuojantis hormonas OHE – ovariohisterektomija P4 – progesteronas

T. y. – tai yra Val. – valandos

7

ĮVADAS

Nevaisingumas yra dažna patologija ir vidutiniškai pasitaiko 25–50 proc. gyvūnų (15). To priežastys yra įvairios (16, 17), tačiau dažniausiai nevaisingumą sukelia įgimtos ar įgytos gimdos ir / ar kiaušidžių patologijos, patelės amžius, infekcijos, bloga reproduktoriaus spermos kokybė (1). Viena iš dažniausių kalių nevaisingumo priežasčių yra netinkamai ar apskritai nenustatytas optimalus kalių kergimo laikas, nes dėl kalėms būdingos spontaninės ovuliacijos optimalų kergimo laiką nustatyti yra sunku (2, 3). Nežiūrint nuolat tobulėjančių diagnostikos priemonių, nevaisingumo

problema šunų patelių tarpe išlieka aktuali. Yra aprašoma daugybė būdų, klinikinių požymių ir tyrimų, kuriuos rekomenduojama naudoti patvirtinant kalės ovuliacijos laiką. Tai kalės elgsenos pokyčių stebėjimas, kalės makšties gleivinės citologinis tyrimas, progesterono koncentracijos kraujo serume nustatymas, makšties endoskopija, tyrimas ultragarsu, gimdos kaklelio gleivių sekrecijos įvertinimas bei makšties pH matavimas (16, 17).

Didžioji dalis kalių gimdos patologijų, kurios galėjo būti nevaisingumo priežastimi, yra aptinkamos atlikus ovariohisterektomiją ir pašalintų audinių histopatologinius tyrimus. Dažniausiai nustatomos gimdos patologijos yra cistinė endometriumo hiperplazija, piometra, endometritas, adenomiozė, mukometra, hidrometra, bei navikinės ligos (36–39). Gimdos gleivinės pažeidimai, nesvarbu, uždegiminiai, hiperplaziniai ar neoplastiniai, gali būti nevaisingumo priežastimis (40).

Lietuvoje apie veislinių kalių reprodukcinius parametrus, veisėjų pasirenkamus ovuliacijos nustatymo bei apvaisinimo būdus literatūroje aprašytų duomenų nepavyko rasti. Taip pat nėra žinoma situacija veislynuose apie sėkmingų apvaisinimų dažnį bei vados dydį. Nebuvo rasta duomenų ir apie gimdos gleivinės histopatologinius tyrimus ir patologijas galinčias įtakoti nevaisingumą. Todėl tuo vadovaudamiesi mes iškėlėme sau darbo tikslą:

Nustatyti veislinių kalių reprodukcinius parametrus ir įvertinti jų ir ovuliacijos laiko nustatymo būdo bei gimdos gleivinės histopatologinių pokyčių reikšmę reprodukcijai.

Tikslui pasiekti buvo įgyvendinami šie darbo uždaviniai:

1. Apklausos būdu įvertinti registruotuose veislynuose laikomų kalių reprodukcinius parametrus; 2. Įvertinti registruotuose veislynuose naudojamus kalių ovuliacijos laiko nustatymo būdus; 3. Nustatyti ovuliacijos laiko nustatymo būdų koreliacinius ryšius su kalės apsivaisinimu;

4. Atlikti kliniškai sveikų kalių gimdos gleivinės anestrus stadijos metu histomorfologinį įvertinimą. 5. Nustatyti histopatologinių pokyčių gimdos gleivinėje dažnio priklausomybę nuo kalės amžiaus.

8

1 LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Kalių lytinio ciklo fiziologiniai ypatumai

Šunų reprodukcinės sistemos fiziologija skiriasi nuo kitų gyvūnų rūšių. Šunys yra monoestriniai gyvūnai, praradę sezoniškumą prijaukinimo metu. Šunų patelių ovuliacija pasireiškia spontaniškai (4–6). Pirmasis kalės lytinis ciklas pasireiškia nuo 6 iki 10 mėnesių amžiaus laikotarpyje, tačiau pirmosios rujos nebuvimas, iki kalė sulaukia 24 mėnesių, taip pat nėra patologija. Yra nustatyta, kad optimalus kalių rujos pasireiškimo amžiaus intervalas yra nuo 4 iki 13 mėnesių, arba vidutiniškai apie 7 mėnesiai (7). Kalės lytinis ciklas trunka nuo 5 iki 12 mėnesių (vidutiniškai 6–7 mėnesius) (5). Kalių lytinis ciklas yra skirstomas į keturias fazes: priešrujo (proestrus) fazė trunka nuo 5 iki 20 dienų, ruja (estrus) – nuo 5 iki 15 dienų, porujo (metestrus / diestrus) – nuo 50 iki 80 dienų ir ramybės periodas (rujos nebuvimas) (anestrus) įprastai trunka nuo 80 iki 240 dienų (4, 8).

Endokrininė kalių lytinio ciklo reguliacija nuo kitų naminių gyvūnų rūšių patelių taip pat skiriasi daugeliu aspektų. Kalėms būdinga užsitęsusi LH sekrecija, LH ir prolaktino liuteotropinis veikimas, prailgėjusi geltonkūnio fazė dėl nepakankamo gimdos liuteolizinio veikimo, ryški preovuliacinė folikulų liuteinizacija, susijusi su progesterono (P4) kiekio padidėjimu, sąlygoto anksčiau išvardintų veiksnių. Visa tai yra laikoma svarbiu veiksniu, darančiu įtaką reprodukciniams įvykiams vykstantiems preovuliaciniu laikotarpiu. Užsitęsusi geltonkūnio fazė yra stebima nešuningų kalių tarpe, todėl jų progesterono koncentracija kraujo serume ilgiau išlieka aukštesnė, nei šuningų kalių kraujyje. Progesteronas slopina naujų folikulų brendimą ir ovuliaciją (4).

1.2 Kalės lytinio ciklo fazės

Priešrujis (prooestrus) – pirmoji lytinio ciklo fazė, kuri vidutiniškai trunka 9 dienas (nuo 5 iki 20 dienų) (8). Šio tarpsnio metu yra pastebimas ryškus reprodukcinės sistemos aktyvumo padidėjimas, kurį sukelia didėjanti estrogenų koncentracija kraujo plazmoje (8). Priešrujis išoriškai dažniausiai nustatomas iš klinikinių požymių, tokių kaip lytinių lūpų paraudimas ir padidėjimas bei serozinių kraujingų išskyrų pasirodymas iš makšties dėl gimdos gleivinės kapiliarų plyšimo ir eritrocitų diapedezės gimdos kraujagyslėse (4, 7–10).

Kiti priešrujui būdingi požymiai nustatomi vaginoskopinio tyrimo metu. Matomos hiperemiškos paburkusios makšties gleivinės raukšlės tarp kurių matyti kraujingų išskyrų (7, 8).

Priešrujo metu pasireiškia kalių elgsenos pokyčiai: kalė tampa draugiška, žaisminga, vizgina uodegą. Tačiau kartais gali pasireikšti ir priešingas elgesys – kalė tampa agresyvi (8). Patelės domisi patinais, tačiau nesileidžia kergiama. Patinų dėmesį patelė atkreipia pradėdama sekretuoti specifinius feromonus, tokius kaip metill p-hydroxybenzoatas. Norėdama kuo plačiau paskleisti feromonus ir pritraukti patiną, kalė pradeda dažniau šlapintis (7, 8).

9 Tokį gyvūno elgesį ir pokyčius organizme sąlygoja didėjanti estrogenų koncentracija kraujo plazmoje. Estradiolio kiekis ankstyvojo priešrujo metu būna nuo 5 iki 15 pg / mL, o vėlyvojo priešrujo metu vidutiniškai padidėja iki ~ 70 pg / mL ir svyruoja nuo 40 iki 120 pg / mL (7).

Didžiausia estrogenų koncentracija susidaro likus 12 – 72 valandoms iki priešrujo fazės pabaigos, prieš pasireiškiant LH bangai (4, 7, 8). Tačiau estrogenų kiekis nerodo vaisingo laikotarpio laiko ar trukmės, nes ovuliaciją sukelia ne estrogenai, bet pasireiškusi LH banga (7).

Progesteronas priešrujo fazėje išlieka baziniame lygyje ir svyruoja nuo 0,2–0,4 ng / ml. Progesterono kiekis didėti pradeda tik šios fazės pabaigoje ir pasiekia 1,0 ng / ml koncentraciją. Progesterono koncentracijos didėjimas priešrujo metu pasireiškia prasidėjus preovuliacinei folikulų liutenizacijai (4, 7, 8). Nustatyta, kad priešrujo fazė baigiasi tada, kai kalė leidžiasi kergiama (4).

Ruja (oestrus) prasideda kai estrogenų koncentracija sumažėja, o progesterono sekrecija ir koncentracija kraujo plazmoje pradeda didėti (7, 8, 11).

Išoriškai rujos metu kalės makštis pradeda trauktis ir suminkštėja, dažniausiai sumažėja makšties išskyrų, jos pasidaro šviesesnės (12). Kalė prisileidžia patiną ir leidžiasi kergiama (8). Ši fazė trunka nuo 5 iki 15 dienų (vidutiniškai 9 dienas) (8), bet gali tęstis net 21 dieną (6).

Ruja užsitęsia, jei kraujyje estrogenų koncentracija išlieka didelė. Padidėjusią estrogenų sekreciją gali sukelti folikulų cistos, kiaušidžių navikai, kepenų veiklos sutrikimai, medikamentai ir kitos priežastys (13).

Rujos metu estrogenų koncentracija mažėja nuo priešrujo fazėje susidariusios didžiausios vertės iki vidutinės 10–20 pg / ml, kurią sukelia LH banga, prasidėjusi dar prieš rujos pradžią (8). LH padidėjimas, sukeliantis ovuliaciją, kuri įvyksta praėjus 2–3 dienoms po LH bangos pasireiškimo, yra pagrindinis endokrininis įvykis kalės reprodukciniame cikle.

Rujos laikotarpiu per priešovuliacinės LH bangos laiką progesterono kiekis serume greitai padidėja virš 1–3 ng / ml ir iškart, arba po 1–3 dienų pertraukos, sparčiai padidėja dar labiau. Iki 10 dienos pasibaigus rujai ar netrukus po jos LH kiekis pasiekia 10–25 ng / ml (4, 8).

Mokslininkas Blendinger (7) nurodo, kad progesterono koncentracija kalės lytinio ciklo metu kinta nuo 0,8 iki 3,0 ng / ml LH piko metu; nuo 1,0 iki 8,0 ng / ml ovuliacijos metu ir nuo 4,0 iki 20 ng / ml vaisinguoju periodu.

Porujis (dioestrus/metestrus) trunka nuo 45 iki 70 dienų (vidutiniškai 60 dienų). Jei kalė neapvaisinama, porujis tęsiasi nuo 2 iki 3 mėnesių (8).

Šią fazę lengviau identifikuoti atliekant makšties gleivinės citologinį tyrimą, nei vertinant elgsenos pokyčius. Porujo metu kalė nebeišskiria feromonų ir būna reprodukciškai neaktyvi (5, 7, 10). Makšties tepinėlyje matomas ryškus paviršinių epitelinių ląstelių sumažėjimas, vyrauja tarpinės ir parabazinės epitelinės ląstelės (7), kurios sudaro daugiau nei 50 proc. visų bendro makšties tepinėlio ląstelių kiekio (10).

10 Porujo fazė yra charakterizuojama progesterono koncentracijos padidėjimu pirmoje šio periodo pusėje ir estradiolio koncentracijos svyravimais antroje periodo pusėje (14). Porujo metu (20–35 ciklo dieną) progesterono kiekis kraujo serume pasiekia sintezės piką ir padidėja iki 15–80 ng / ml. Didelis P4 kiekis skatina endometriumo proliferaciją ir liaukų veiklą (14).

P4 koncentracija pradeda mažėti ir 55–90 porujo dieną (vidutiniškai 70 dieną) jo koncentracija būna mažesnė nei 1 ng / ml (8). Estrogenų kiekis šiame tarpsnyje siekia bazinį, nuo 2 iki 10 ng / mL lygį (7), tačiau taip pat galimi estrogenų koncentracijos svyravimai.

Apie 30 dieną po ovuliacijos estrogenų koncentracija pradeda didėti. Didžiausia estrogenų koncentracija porujo metu nustatoma po rujos praėjus 40 dienų. Laipsniškas tiek estradiolio, tiek progesterono mažėjimas pasireiškia apie 50 porujo dieną, o mažiausia jų koncentracija būna apie 60 porujo dieną (15).

Mokslinėje literatūroje nepavyko rasti duomenų apie atliktus tyrimus, apibūdinančius kalių endometriumo storį ir gimdos gleivinės ląstelių proliferacijos laipsnį kiekvienu iš šių hormoninių pokyčių periodu, po rujos (15).

Porujo fazė baigiasi tuomet, kai regresuoja geltonkūnis (70–80 dieną). Mokslininkai Saleh ir Shamkhi (5) teigia, kad porujo pabaiga yra siejama su endometriumo atsistatymu pasireiškiančiu 130–140 dieną.

Ramybės periodas (anoestrus) – trunka nuo 80 iki 240 dienų (8, 16). Šios fazės metu išnyksta rujai būdingi elgsenos ir klinikiniai požymiai, patele nesidomi patinai, o patelė patinais. Šis tarpsnis pasižymi kiaušidžių neveiklumu, gimdos involiucija ir endometriumo atsistatymu (7, 8). Tačiau hormoniniu požiūriu tai nėra ramybės laikas. Estradiolio koncentracija anoestrus metu kinta ir būna nuo 5 iki 10 pg / ml.

LH kiekis ramybės periodo metu taip pat būna žema (< 1–2 ng / ml), tačiau atskiros jo padidėjimų bangos pasireiškia ir svyruoja nuo 3 iki 30 ng / ml.

FSH koncentracija anestrus metu yra didelė ir svyruoja nuo 50 iki 400 ng / ml, (vidutiniškai apie 140 ng / ml). Pastebimi FSH pikai, kurie paprastai sutampa su LH bangomis.

Progesterono koncentracija kraujo serume išlieka mažesnė nei 1 ng / ml (7, 8).

1.3 Optimalus kalių kergimo laikas

Kalių nevaisingumas yra dažna patologija ir vidutiniškai pasitaiko 25–50 proc. gyvūnų (1). Nevaisingumo priežastys yra įvairios (2, 3). Nevaisingumą sukelia gimdos ar kiaušidžių patologijos, bloga spermos kokybė, patelės amžius ir kt. (1). Tačiau viena iš dažniausių kalių nevaisingumo priežasčių yra ne laiku atliekamas kergimas (3), kai netiksliai nustatomos vaisingos dienos (ovuliacijos laikas) (2).

11 Yra atliekama ir aprašyta daugybė būdų, klinikinių požymių ir tyrimų, siekiant nustatyti kalių ovulacijos laiką. Tuo tikslu stebimi kalės elgsenos pokyčiai, tiriama makšties citologija, matuojama progesterono koncentracija kalės kraujo serume, atliekama makšties endoskopija, tyrimas ultragarsu, tiriama gimdos kaklelio gleivių sekrecija bei matuojama makšties pH (2, 3). Nustatyta, kad fiziologiniai ovuliacijos laiko ir jo trukmės svyravimai yra galimi priklausomai nuo kalės veislės, amžiaus ir netgi tarp tos pačios kalės atskirų lytinių ciklų (2).

Mažų veislių kalės įprastai rujoja jaunesnės ir jų rujos pasireiškia dažniau nei didelių veislių kalių, t. y. didesnių veislių kalių ramybės periodas trunka trumpiau nei mažų veislių kalių. Didelę įtaką tam turi paveldimumas (17). Pastebima, jog kalėms, kurios gyvena kartu, įvyksta lytinio ciklo savaiminė sinchronizacija (18).

Mokslininkas Borge ir kt. (19) nustatė, kad vidutinis šunų vadų dydis yra 5,4 ± 0,025 šuniukai, tačiau didesnių veislių kalės atveda daugiau palikuonių. Miniatiūrinių veislių (< 5 kg) vidutinis vados dydis yra 3,5 ± 0,04, mažų veislių (5–10 kg) – 4,2 ± 0,03, vidutinių (10–25 kg) – 5,7 ± 0,04, didelių (25–45 kg) – 6,9 ± 0,05 ir gigantinių, sveriančių daugiau nei 45 kg – 7,1 ± 0,13 šuniukų. Tai reiškia, kad didesnė kalė, gali atsivesti didesnį skaičių šuniukų, tačiau santykinis vaisiaus dydis, palyginus su kalės svoriu, yra didesnis mažesnių veislių kalių nei didelių veislių kalių.

Literatūroje aprašoma (19), kad įvertinus kalės amžiaus įtaka vadų lizdo dydžiui nustatyta, kad kalei senstant palikuonių skaičius palaipsniui mažėja, pvz.: vidutinio dydžio veislinių kalių tarpe pirmosios vados dydis buvo 5,7 ± 0,04, o paskutinės vados dydis – 4,2 ± 0,04 šuniukai (19). Mokslininkas Gill (20) nustatė, jog didžiausias kalių atvedamų šuniukų skaičius nustatomas kalei sulaukus dvejų metų, o vėliau vidutinis vados dydis pradeda mažėti. Taip pat nustatyta, kad senų kalių ramybės fazė yra pailgėjusi.

Nustatyta, kad nepriklausomai nuo kalės veislės, dydžio ir amžiaus vidutinis vados dydis būna didesnis ir siekia 5,39 ± 0,02 šuniukus, kai patelės apvaisinamos naudojant natūralų kergimo būdą. Kalę sėklinant šviežia sperma, ji atveda 5,39 ± 0,14 šuniukus, o sėklinant šaldyta sperma – 5,49 ± 0,24. Taigi apvaisinant kalę šaldyta sperma, vados dydis sumažėja vidutiniškai 0,4 šuniuko, o apvaisinant šaldyta sperma vados dydis sumažėja vidutiniškai 1,3 šuniuko, lyginant su natūraliu apvaisinimo metodu (19).

1.4 Kalių ovuliacijos laiko nustatymo būdai

1.4.1 Progesterono koncentracijos nustatymas kraujo serume

Šiuo metu progesterono tyrimas yra vienas tiksliausių tyrimų siekiant nustatyti kalės ovuliacijos laiką.

Preovuliacinis progesterono koncentracijos padidėjimas kraujo serume dėl kalių organizme pasireiškiančios preovuliacinės folikulų liutenizacijos, yra vienas iš unikalių šunų reprodukcijos

12 proceso ypatumų. Ramybės fazės ir ankstyvojo priešrujo metu po LH bangos, progesterono kiekis serume siekia tik maždaug 1 ng / ml, o ovuliacijos metu jo koncentracija pakyla nuo 4 iki 10 ng / ml. Tai įvyksta dėl visiškos folikulų liuteinizacijos (2, 3, 21). Be to, progesterono koncentracija kraujo serume matuojama ir norint nustatyti kalės kiaušidžių funkcijų sutrikimus bei šuningumo anomalijas (21).

Progesterono koncentracija gali būti nustatoma radioimuniniu (RIA), imunogermentiniu (IFA), skysčių chromatografijos ir tandeminės masių spektrometrijos (LC-MS/MS) metodais (22, 23). Neseniai progesterono kiekiui kraujo serume nustatyti pradėti naudoti fermentinis fluorescencinis (ELFA) ir chemiliuminescencinis imuninis tyrimai (CLIA) (21, 24, 25).

1.4.2 Tyrimas ultragarsu

Kalių ovuliacijos diagnostika ultragarsu nėra paprasta klinikinė procedūra. Priešingai nei kitų gyvūnų rūšių patelių, kalių kiaušidžių tyrimą ultragarsu yra sunku atlikti dėl santykinai mažo kiaušidžių dydžio, mažų folikulų ir mažo jų skaičiaus bei netipiško kiaušidžių funkcionavimo priešovuliaciniu laikotarpiu. Įrodyta, kad maždaug 70–80 proc. kalių folikulų ovuliuoja maždaug 24– 72 val. po LH piko pasireiškimo.

Kita problema su kuria susiduria veterinarijos gydytojai, yra anatominė kalių kiaušidžių vieta, apsunkinanti jų matymą ir vertinimą. Dešinioji kalės kiaušidė yra labiau pasislinkusi kranialiai, palyginti su kairiąja kiaušide, ir yra dengiama šonkaulių lanko. Nutukusių kalių tyrimas ultragarsu yra taip pat neinformatyvus (26, 27).

Vidutiniškai 60–70 proc. kalių ovuliacija trunka 48 val. Jų kiaušidžių folikulai nesuyra, bet palaipsniui praranda formą ir vis dar būna užpildyti skysčiu. Atliekant tyrimą ultragarsu, kai kurie kiaušidėse esantys folikulai išlieka hipoechogeninių struktūrų pavidale. Jauni hemoraginiai geltonkūniai tuomet atrodo panašūs į greitai ovuliuosiančius folikulus. Likusių 30–40 proc. kalių ovuliacija yra panaši kaip ir kitų rūšių patelių, kuri baigiasi tipišku ovuliavusių folikulų suirimu iškart po ovuliacijos (26).

Tyrimai ultragarsu atliekami 4–5 proestrus dieną ir tęsiami kiekvieną dieną iki kol nustatoma ovuliacija ir pastebimas susidaręs geltonkūnis. Ovuliacijos pradžia yra laikas, kai daugumos didžiausio skersmens folikulų ertmės išnyko per dieną (greitas suirimas – jaunas geltonkūnis su 1–2 mm storio sienelėmis) arba folikulai ima mažėti iš lėto ir per 2–3 dienas praranda įprastą sferinę formą (užsitęsęs suirimas) (26).

13 1.4.3 Kalių makšties gleivinės citologija

Eksfoliacinė makšties citologija – greitas, neinvazinis ir patikimas metodas, skirtas nustatyti lytinio ciklo fazę bei ovuliacijos laiką (28–31). Tai rodo tiesioginę koreliaciją su gyvūno hormonine būkle ir suteikia esminės informacijos apie kalės reprodukcines funkcijas (31).

Eksfoliacinės (atsiskyrusios gleivinės ląstelės) ląstelės atspindi kalės hormoninę būseną. Didėjanti estrogenų koncentracija skatina makšties gleivinės epitelio hiperplaziją, keratinizaciją ir eksfoliaciją (atsiskyrimą) (29). Anestrus fazės metu makšties epitelį sudaro tik keli ląstelių sluoksniai, vyrauja parabazinės ir mažos tarpinės ląstelės. Didėjant estradiolio koncentracijai, makšties epitelis proliferuoja, diferencijuojasi ir susidaro daugiau nei 20 ląstelių sluoksnių, kad apsaugoti gleivinę kopuliacijos metu (32). Storėjant makšties gleivinės epiteliui, ląstelės nusilupa ir pasišalina su makšties išskyromis, todėl epitelio ląstelių identifikacija tepinėlyje yra taikoma priešrujo ir rujos fazėms nustatyti bei patvirtinti tinkamą kergimo laiką (28, 29).

Makšties epitelio ląstelių morfologija įvertinama naudojant specifinius kriterijus: ląstelės dydį, formos pokyčius, branduolį bei jo dydį ir degeneracijos laipsnį. Tuomet ląstelės suskirstomos į grupes ir nustatoma lytinio ciklo fazė (32).

Bazinės ląstelės yra labai mažos,10–20 μm dydžio, turinčios didelį apvalų branduolį ir nedidelį kiekį citoplazmos aplink jį. Iš jų formuojasi visos kitos epitelinės ląstelės, matomos makšties tepinėlyje. Bazinės ląstelės lokalizuojasi ant bazinės membranos, nesisluoksniuoja ir tepinėlyje retai randamos (28).

Parabazinės ląstelės (1 pav.) yra mažos, 15–25 μm dydžio apvalios ląstelės, turinčios didelį branduolį ir mažai citoplazmos. Citoplazmoje retais atvejais galima pastebėti citoplazminių vakuolių. Parabazinių ląstelių citoplazmoje kartais gali būti neutrofilų, ir tokios ląstelės yra vadinamos „metestrus ląstelėmis“. Jų galima aptikti priešrujo, porujo ir ramybės fazės metu ar vaginito atveju (28).

14 1 pav. Makšties gleivinės parabazinės ląstelės (nuotrauka M. Maslauskės)

Tarpinės ląstelės (2 pav.) yra įvairaus dydžio. Šios ląstelės yra diferencijuojamos į mažąsias (~ 20 μm) ir didžiąsias (~ 30 μm). Abiejų dydžių ląstelės turi suformuotą branduolį. Mažos tarpinės ląstelės yra apvalios ar elipsinės formos, tačiau gali būti ir daugiakampės. Didžiosios tarpinės ląstelės yra netaisyklingos ar kampuotos formos. Didelės tarpinės ląstelės kartais dar vadinamos paviršinėmis arba pereinamosiomis tarpinėmis ląstelėmis (28).

2 pav. Makšties gleivinės tarpinės ląstelės (nuotrauka M. Maslauskės)

Parabazinės ląstelės

15 Paviršinės ląstelės (3 pav.) yra didžiausios makšties epitelio ląstelės, kurių skersmuo svyruoja nuo 30 μm iki 75 μm. Makšties tepinėlyje jų daugiausiai randama esant estrogenų pikui. Ląstelių kraštai yra netaisyklingi, kampuoti. Kadangi ląstelės yra negyvos, jų branduoliai maži, piknotiški ir blankūs arba gali būti suirę (28).

3 pav. Makšties gleivinės paviršinės ląstelės (nuotrauka M. Maslauskės)

Žvynelinės ląstelės yra didelės suragėjusios epitelinės paviršinės ląstelės. Rujos stadijos metu jos nusidažo tamsiai melsvai violetine spalva (28).

1.4.3.1 Makšties gleivinės epitelio citologininiai pokyčiai priešrujo metu

Ankstyvojo priešrujo fazėje (4 pav.) esančios makšties gleivinės epitelio tepinėlio citologinis vaizdas panašus į ramybės fazėje esančio epitelio vaizdą. Priešrujo metu kliniškai pasireiškia kraujavimas iš makšties, todėl makšties išskyros būna kraujingos, o tepinėlyje randama eritrocitų, didžiąją dalį sudaro parabazinės, mažos ir didelės tarpinės epitelinės ląstelės bei nedaug paviršinio epitelio ląstelių (13, 28).

4 pav. Makšties tepinėlis priešrujo metu (nuotrauka M. Maslauskės)

1 – eritrocitai; 2 – mažos tarpinės ląstelės; 3 – didelės tarpinės ląstelės; 4 – paviršinės ląstelės; 5 – suragėjusios ląstelės

1

2

3

5

16 1.4.3.2 Makšties gleivinės epitelio citologiniai pokyčiai rujos metu

Rujos metu (5 pav.) tepinėlyje 80–90 proc. visų matomų ląstelių sudaro paviršinės ląstelės su piknotiškais branduoliais, eritrocitų ir neutrofilų nebūna (13).

Įprastai ovuliacija įvyksta praėjus maždaug 2 dienoms po liutenizuojančio hormono piko, sumažėjus estrogenų kiekiui serume ir padidėjus progesterono koncentracijai kraujo serume. Tačiau, kadangi maksimalus ląstelių suragėjimo laikas nėra pastovus ir gali įvykti net 6 dienas prieš ar 3 dienas po LH piko, makšties citologija yra netikslus tyrimas ovuliacijos laikui nustatyti (28–30, 33).

5 pav. Makšties tepinėlis rujos metu (nuotrauka M. Maslauskės)

1.4.3.3 Makšties gleivinės epitelio citologiniai pokyčiai porujo ir ramybės periodų metu Makšties gleivinės epitelio citologiniai pokyčiai porujo (diestrus) (6 pav.) fazėje ženkliai skiriasi nuo paimto mėginio tikrosios rujos metu. Per 24–48 val. nuo tikrosios rujos pabaigos paviršinių ląstelių skaičius sumažėja iki 20 proc., tuo tarpu parabazinių ir tarpinių ląstelių skaičius padidėja. Iš karto nusilupa daug ląstelių, todėl gali būti stebimos susikaupusių ląstelių sankaupos. Neutrofilų skaičius būna įvairus ir dažnai sutampa su padidėjusiu parabazinių ir tarpinių ląstelių skaičiumi. Gali būti randama eritrocitų ir bakterijų (28–30, 33).

Ramybės fazės metu (anestrus) makšties citologinis vaizdas pastovus. Tepinėlyje vyrauja parabazinės ir tarpinės ląstelės. Retai aptinkami neutrofilai, eritrocitai ir bakterijos (13)

Paviršinės ląstelės Suragėjusios/žvynelinės ląstelės

17 6 pav. Makšties tepinėlis porujo ir ramybės periodų metu (nuotrauka M. Maslauskės)

1.4.4 Kalių makšties gleivinės makroskopinis vertinimas (vaginoskopija)

Endoskopinė vaginoskopija yra greita ir neinvazinė procedūra, kuri gali suteikti papildomos diagnostinės informacijos ne tik apie lytinio ciklo fazę, bet ir apie patologijas gimdos kaklelyje, makšties navikus, jų tipą bei dydį, polipus ir kitas įvairias patologijas (34).

Makroskopinis gimdos gleivinės ištyrimas (vaginoskopija) yra atliekamas kaip papildomas tyrimas norint nustatyti ovuliacijos laiką, nes makšties gleivinės kontūrai, spalva ir sekrecija yra priklausoma nuo hormonų koncentracijos pokyčių. Skirtingomis lytinio ciklo fazėmis skiriasi makšties gleivinės ir gimdos kaklelio išvaizda (34, 35). Estrogenų koncentracija kraujyje pradeda didėti besibaigiant ramybės fazei ir tęsiasi visą priešrujo periodą. Didėjanti estrogenų koncentracija sukelia lytinių organų kraujagyslių vazodiliataciją sukeldama makšties ir lytinių lūpų edemą. Gleivinė tampa išburkusi, lygi, rausvos spalvos. Ansktyvojo priešrujo metu atliekant vaginoskopiją galima pastebėti gleivinės edemą ir besiformuojančias naujas gleivinės klostes. Vėlyvojo priešrujo metu gleivinė paburkusi, rausvos spalvos, išryškėjusios išilginės klostės, tarp kurių matyti kraujingų išskyrų (7 pav.) (34, 36–38).

Parabazinės

18 7 pav. Makšties gleivinės endoskopinis vaizdas priešrujo metu (34).

Likus porai dienų iki priešrujo pabaigos kraujo serume pradeda didėti progesterono ir mažėti estrogenų koncentracija, padaugėja LH. Visa tai sukelia ovuliaciją, kuri įvyksta praėjus 2–3 dienoms po LH bangos. Šiuo laikotarpiu kalei pasireiškia tikroji ruja ir ji turėtų būti kergiama. Tiriant vaginoskopu vaisingo periodo pradžia nustatoma pagal išilginių raukšlių subliuškimą ir stipriai išreikštas susiformavusias skersines makšties raukšles, iš pradžių jos neryškios, vėliau labai išryškėja. Pastebima mažėjanti edema ir transudacija, o gleivinės spalva iš rausvos / raudonos pasikeičia į beveik baltą. (8 pav.) (8, 34, 38).

8 pav. Makšties gleivinės endoskopinis vaizdas rujos metu (34)

Pasibaigus rujos periodui ir prasidėjus porujui makšties gleivinės raukšlės regresuoja, gleivinė išsilygina, suplonėja. Pastebimas gleivinės margumas, hiperemiškos dėmės. Hiperemiškos dėmės yra būdingos tik porujo fazei (9 pav.) (34).

19 9 pav. Makšties gleivinės endoskopinis vaizdas baigiantis rujai ir prasidedant porujui (34)

Porujo metu makšties gleivinės raukšlės tampa plokščios, plonesnės ir suapvalėja. Gleivinės spalva svyruoja nuo šviesiai raudonos iki rausvai pilkos (10 pav.) (34).

10 pav. Makšties gleivinės endoskopinis vaizdas porujo metu (34)

Ramybės periodo metu makšties gleivinė pasidaro plona, rausva, sausa ir plokščia be ryškių raukšlių (11 pav.) (34).

20 11 pav. Makšties gleivinės endoskopinis vaizdas ramybės periodo metu (34).

1.5 Kalių gimdos patologijos ir jų reikšmė ovuliacijos pasireiškimui

Didžioji dalis kalių gimdos patologijų yra aptinkamos atliekant ovariohisterektomiją ir pašalintų audinių histopatologinius tyrimus. Dažniausiai nustatomos gimdos patologijos yra cistinė endometriumo hiperplazija, piometra, endometritas, adenomiozė, mukometra, hidrometra, bei navikinės ligos (39–42). Uždegiminiai, hiperplaziniai ar neoplastiniai gimdos gleivinės pažeidimai gali būti nevaisingumo priežastimis (43).

1.5.1 Cistinė endometriumo hiperplazija

Cistinė ėndometriumo hiperplazija (CEH) tai gimdos gleivinės patologija, kuri siejama su endometriumo liaukų proliferacija ir hiperplazija, cistų susidarymu ir padidėjusia sekrecija. CEH pasireiškia mažiau nei 4 proc. iki 3 metų amžiaus kalių, tačiau vyresniame amžiuje ši patologija pasireiškia daugiau nei 50 proc. kalių (42, 44).

Tiksli patogenezė nėra žinoma, tačiau manoma, kad priežasčių yra daug (45). Cistinė endometriumo hiperplazija gali būti sukeliama pernelyg didelės ir ilgai trunkančios endogeninės ar egzogeninės estrogenų stimuliacijos. Įtakos turi bendras steroidinių hormonų (progesterono ir estrogeno) veikimas skirtingais lytinio ciklo etapais (46). Nors progesteronas vaidina pagrindinį vaidmenį CEH atsiradime, tačiau estrogenai sustiprina gimdos receptorių progesteonui sintezę. Progesterono jungimasis su gimdos receptoriais skatina gleivinės liaukų proliferaciją, jų sekreciją, mažina raumeninio sluoksnio susitraukimus ir skatina gimdos kaklelio užsidarymą (39, 41, 47, 48).

CEH gali išsivystyti panaudojus ilgo veikimo progestageninius preparatus (47). Taip pat šios patologijos išsivystymui gali turėti įtakos gimdos endotelinėse ir miometriumo raumeninėse ląstelėse aptinkamas padidėjęs kiekis insulino augimo faktoriaus-1 (IGF-1), kuris turi mitogeninį poveikį gimdos gleivinei ir skatina endometriumo proliferaciją. (49, 50).

21 Tiriant mikroskopiškai pagrindinis endometriumo hiperplazijos bruožas yra liaukų dydžio ir skaičiaus padidėjimas. Gleivinės liaukos intensyviai proliferuoja ir formuoja cistas. Gleivinės stroma edemiška ir infiltruota uždegiminėmis ląstelėmis (45, 46).

Cistinė endometriumo hiperplazija yra viena iš nevaisingumo priežasčių (41, 42, 44, 48, 51). Sergančių kalių vaisingumas mažėja dėl nepakankamos gimdos kraujagyslių vazodiatacijos poravimosi metu ir sumažėjusių gimdos susitraukimų, kurie sumažina gimdos skysčio klirensą palyginti su sveikomis kalėmis. Ankstesni tyrimai parodė, kad kalės, kurioms nustatytas CEH, apsivaisina blogiau ir rečiau iš pirmo karto, jos atveda mažiau jauniklių (44, 48). CEH ne tik sumažina vaisingumą, bet jos metu vykstantys degeneraciniai pokyčiai gimdos audinyje gali sudaryti palankias sąlygas gimdos infekcijai atsirasti (5).

1.5.2 Endometritas

Endometritas apibrėžiamas kaip gimdos gleivinės (endometriumo) uždegimas, apimantis ne gilesnį nei vidurinį (stratum spongiosum) gimdos gleivinės sluoksnį. (52). Endometritą sunku diagnozuoti, nes jis retai būna susijęs su gimdos padidėjimu, o sumažėjęs vaisingumas gali būti vienintelis ligos požymis (42, 43). Endometriumo pokyčiai gali blokuoti singamiją, modifikuodami gimdos terpę, turėti neigiamos įtakos vaisiaus implantacijai, embriono ir vaisiaus vystymuisi (43).

Dauguma kalių endometritų yra bakterinės kilmės ir yra sukeliami Escherichia coli ir Streptococcus spp. bakterijų, retai Mycoplasma spp. bakterijų, grybų. Endometrito priežastimi gali būti ir pseudošuningumas (50). Mokslininkas England ir kt. (53) teigia, kad dažniausiai endometritus sukelia E. Coli patogeninės bakterijos.

Patino priedinių lytinių liaukų sekretas ir sperma patekus į gimdą taip pat sukelia kalės gimdos kraujagyslių išsiplėtimą, neutrofilų migraciją. Todėl kartais po kergimo gali išsivystyti endometritas.

Literatūroje aprašoma, kad kliniškai sveikos kalės, kurių makšties citologijoje neaptinkama uždegiminių ląstelių, iš tiesų gali sirgti endometritu. Tai įrodė atlikti sveikų kalių histopatologiniai endometriumo tyrimai, kurių metu buvo nustatytas uždegimas (54).

Endometriumo epitelio ir stromos uždegimininiai pažeidimai histologiškai klasifikuojami kaip ūminiai, poūminiai ir lėtiniai.

Tiriant mikroskopiškai ūminis endometritas nustatomas tada, kai paviršinio endometriumo epitelio mėginio 40 x lauke randama mažiausiai 4 neutrofilai, hiperemija ar stromos edema. Poūminio endometrito metu stebima edema, randama polimorfonuklearinių ir mononuklearinių ląstelių. Lėtiniam endometritui būdingos plazminių ląstelių sankaupos bei daug limfocitų ir makrofagų paviršiniame endometriumo epitelyje ir intersticinė fibrozė (51, 52, 54, 55).

Endometritas gali progresuoti ir apimti raumeninį gimdos sluoksnį - miometriumą arba apimti visus gimdos sluoksnius. Tada išsivysto metritas. Gimdos gleivinės uždegimas gali komplikuotis ir

22 išsivystyti piometra, cistinė endometriumo hiperplazija, septicemija ir / ar nevaisingumas (42, 50, 56).

1.5.3 Adenomiozė

Gimdos adenomiozė yra gerybinis neoplastinis pažeidimas, atsirandantis dėl endometriumo liaukų ir stromos invazijos į gimdos miometriumą (57, 58). Gyvūnai, sergantys gimdos adenomioze, gali turėti arba neturėti klinikinių požymių. Nors adenomiozė yra lėtinė gerybinė liga, tačiau gali sukelti ir nevaisingumą (57, 59).

Ši liga paprastai nustatoma atsitiktinai, atliekant ovariohisterektomiją. Vertinant makroskopiškai, gimdos adenomiozę galima supainioti su gimdos navikais, tokiais kaip gimdos lejomioma ar adenoma. Galutinė diagnozė patvirtinama tik histopatologiniu tyrimu. Adenomiozei yra būdinga proliferuojančios endometriumo liaukos į miometriumą, apsuptos jungiamojo audinio (58, 60).

Adenomiozės atveju pasireiškia nenormalus endometriumo liaukinių ląstelių augimas, invazija ir migracija į miometriumą. Padidėjusios eutopinės endometriumo ląstelių proliferacinės ir invazinės savybės yra pagrindiniai patogeniniai adenomiozės veiksniai. Šie pokyčiai padidina endometriumo epitelio ląstelių ir stromos ląstelių infiltraciją į miometriumą. Nepertraukiama endometriumo ląstelių proliferacija, migracija bei periferinių raumenų ląstelių kompensacinė hipertrofija ar hiperplazija padidina adenomiozės židinių skaičių ir sukelia difuziškai arba lokaliai sustorėjusią gimdos sienelę (57). Adenomiozė susijusi su kiaušidžių ar gimdos patologijomis, tokiomis kaip cistinė endometriumo hiperplazija, piometra, granuliozinių ląstelių navikais ir kiaušidžių cistomis (58). 1.5.4 Mukometra

Mukometra tai gimdos gleivinės patologija, kuomet gimdos kūne ir raguose kaupiasi sterilus įvairios konsistencijos gleivėtas sekretas, kurio tipas priklauso nuo mucino hidratacijos laipsnio. Ši patologija aptinkama atsitiktinai, kuomet atliekama ovariohisterektomija arba tiriant ultragarsu gretutinių ligų atveju. Mukometra dažnai siejama su CEH, nes šios patologijos metu padidėja gimdos liaukų sekrecija (61).

Tai gali būti paaiškinama tuo, kad organizme dominuojant progesteronui, didėja endometriumo liaukų sekrecija ir mažėja miometriumo susitraukimas. Gimdos kaklelis užsivėręs, dėl to skysčiai kaupiasi gimdoje (61). Mukometros metu nėra bakterinės infekcijos, tačiau yra maža endotoksemijos ir sepsio atsiradimo rizika (62).

23

2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Tyrimas buvo atliktas 2019 m. rugsėjo – 2020 m. lapkričio mėnesiais, vienoje Kauno miesto privačioje smulkiųjų gyvūnų veterinarijos klinikoje ir LSMU Veterinarijos akademijos Veterinarijos fakulteto Veterinarinės patobiologijos katedros Patologijos centro histopatologinių tyrimų laboratorijoje.

12 pav. Tiriamojo darbo schema

Kalių reprodukcijos parametrų vertinimas PIRMAS TYRIMŲ ETAPAS

Gyvūnų šeimininkų anketinė apklausa N = 150 Kalių reprodukcijos parametrų STATISTINĖ ANALIZĖ Amžius Svoris Kergimo / sėklinimo kartai vienos rujos

metu Atvedamų palikuonių skaičius Apsivaisinimo sėkmingumas Kalės apvaisinimui naudojamas būdas Rujos dažnis Ovuliacijos laiko nustatymo būdas Mėginių paruošimas histomorfologiniam vertinimui Mėginių histomorfologinis vertinimas OHE Mėginių surinkimas Kliniškai sveikos

kalės anestrus stadijos metu

ANTRAS TYRIMŲ ETAPAS

N = 35

Histopatologinių pokyčių gimdos gleivinėje STATISTINĖ ANALIZĖ:

• Pasireiškimo dažnis • Patologijos rūšis

• Priklausomybė nuo patelės amžiaus

Kliniškai sveikų kalių gimdos gleivinės histomorfologinis vertinimas anestrus stadijos metu

24

2.1 Tyrimų atlikimo eiga

Pirmame tyrimų etape buvo atliekamas kiekybinis tyrimas – anketinė apklausa. Apklausoje dalyvavo į kliniką dėl gyvūno gydymo kreipęsi 150 gyvūnų savininkų.

Apklausos būdu buvo siekiama įvertinti veislynuose laikomų kalių reprodukcinius parametrus. Buvo prašoma nurodyti gyvūno amžių, svorį, rujos dažnį, apvaisinimui naudojamą būdą ir kergimo ar sėklinimo kartus vienos rujos metu, apsivaisinimo dažnį ir atvedamų palikuonių skaičių bei naudojamus kalių ovuliacijos laiko nustatymo būdus: subjektyvius – išskyrų spalva, makšties konsistencija, makšties citologinis tyrimas; empirinius – paties savininko atliekamus patino reakcijos ar kalės elgsenos stebėjimo būdus ir objektyvius – progesterono koncentracijos nustatymas. Apklausos anketos pavyzdys pateikiamas 1 priede.

Antrąjame tyrimų etape buvo renkami kalių gimdos histologiniai mėginiai iš įvairaus amžiaus kliniškai sveikų kalių, kurioms klinikoje planine tvarka buvo atliekama ovariohisterektomija.

Surinkti mėginiai buvo tiriami histologiškai, norint įvertinti kalių gimdos gleivinės histopatologinę būklę anestrus stadijos metu ir nustatyti histopatologinių pokyčių gimdos gleivinėje dažnį ir rūšį įvairaus amžiaus kalių tarpe. Iš augintinių savininkų gauti sutikimai dėl audinių panaudojimo mokslo tikslams (2 priedas).

Iš viso buvo surinkti ir histologiškai ištirti 35 kalių gimdos mėginiai.

Histopatologinio tyrimo metodika.Atlikus ovariohisterektomiją tiriamoji medžiaga (gimdos kūnas ir ragai) nedelsiant buvo fiksuojama vienkartiniuose plastikiniuose indeliuose 10 proc. formaldehido tirpale. Mėginiai pristatyti į LSMU Patologijos centro histopatologinių tyrimų laboratoriją. Po 72 val. fiksavimo patologinė medžiaga buvo supjaustyta, sudėta į biopsines kasetes ir 24 val. pamerkta į šaltą tekantį vandenį, kad iš mėginių būtų išplautas formaldehido tirpalas.

Tuomet biopsinės kasetės su mėginiais sudėtos į audinių įmirkymo procesorių „Shandon Pathcentre, USA“, kuriame biopsinėse kasetėse esantys mėginiai buvo 2–3 val. dehidratuojami didėjančios koncentracijos 60º, 80º ir 96º etilo alkoholiu ir 1–3 val. izopropanolio alkoholiu. Vėliau tiriamieji mėginiai 1–3 val. buvo skaidrinami chloroforme. Procesas truko apie 24 val. Po dehidratavimo ir skaidrinimo mėginiai buvo įlieti į parafino blokus, naudojant „TES 99 Medite Medizintechnik“ įrangą.

Parafininiai blokeliai su mėginiais, siekiant išgauti reikiamą mėginių tvirtumą, atvėsinti ant šaldomojo stalelio iki – 9 ºC temperatūros.

Naudojant pusiau automatinį rotacinį mikrotoną Sakura Accu-Cut® SRM ™, Japonija iš paruoštų suformuotų parafininių blokų buvo atpjaunami 4 μm storio mikropjūviai. Pjūvis adatėlimis pernešamas į termostatinę vonelę su 37 ºC temperatūros vandeniu, kurioje ištiesinamas ir perkeliamas ant objektinio stiklelio, kur buvo džiovinamas 24 val. 37 ºC temperatūroje.

25 Paruošti pjūviai ant objektinio stiklelio buvo dažomi hematoksilino-eozino (HE) dažais naudojant histologinių pjūvių automatinį dažymo įrenginį Sakura Tissue-Tek® DRS ™, Japonija.

Nudažyti mėginiai, ant objektinio stiklelio buvo uždengti ilgalaikio saugojimo dengiamąja terpe Thermo Shandon Consul-Mount histology formulatio.

Paruoštų mėginių histologinis vaizdas buvo vertinamas ir analizuojamas mikroskopu Olympus BX641. Histologinių vaizdų nuotraukos darytos naudojant Olympus DP72 BX63 analizatorių. Tyrimų rezultatuose naudojamos nuotraukos yra šio baigiamojo darbo autorės.

Tyrimo duomenų statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS statistics for Windows, Version 22.0 (SPSS Inc., JAV, 2008) programą. Kiekybiniai rodikliai aprašyti pateikiant jų procentinį pasiskirstymą naudojant aprašomąją statistiką (aritmetinis vidurkis, standartinis nuokrypis). Diagramoms pavaizduoti ir duomenų procentinei išraiškai paskaičiuoti buvo naudojama Microsoft Office Excel 2019 programa. Duomenų statistiniam patikimumui bei sąsajoms tarp analizuojamų veiksnių įvertinti buvo naudojamas Chi kvadrato testas. Tiesinio ryšio stiprumas bei koreliaciniai ryšiai tarp kintamųjų buvo įvertinti naudojant Pearsono koreliacinę matricą.

26

3 TYRIMŲ REZULTATAI

Tyrimų metu buvo apklausta 150 veislines kales laikančių gyvūnų savininkų, norint išsiaiškinti laikomų gyvūnų amžių, svorį ir reprodukcinius rodiklius: rujos dažnį, ovuliacijos laiko nustatymo būdus, apvaisinimui naudojamą būdą, kergimo / sėklinimo kartus vienos rujos metu, apsivaisinimo dažnį ir atvedamų palikuonių skaičių.

3.1 Kalių reprodukcijos rodiklių vertinimas

Veislei naudojamų kalių amžiaus ir svorio įvertinimas. Nustatyta, kad didžioji dalis (66 proc.) veisimui naudojamų kalių buvo vidutinio – 4–6 metų amžiaus, 25 proc. buvo jaunos – 1,5–3 metų amžiaus ir tik 9 proc. buvo senos – 7–9 metų amžiaus veisimui naudojamos pateles. Pagal tai jos suskirstytos į 3 grupes.

Taip pat buvo nustatytas kalių svoris (13 pav.): 40,7 proc. tyrime dalyvavusių kalių svėrė daugiau nei 25 kg, 26,7 proc. – nuo 10 iki 25 kg imtinai bei 32,6 proc. kalių svėrė mažiau nei 10 kg.

13 pav. Tiriamųjų kalių pasiskirstymas pagal svorį, kg

Kalių rujos pasireiškimo dažnis (14 pav.). Nustatyta, kad nepriklausomai nuo patelės amžiaus, dažniausiai (80,67 proc.) ruja pasireiškė 2 kartus per metus. Tris kartus per metus rujojo tik 4,67 proc. patelių ir tik vidutinio ir vyresnio amžiaus grupėse. Jauniausioms – 1,5–3 metų amžiaus patelėms 3 kartus ruja nebuvo pasireiškusi nei karto.

49 40 61 0 10 20 30 40 50 60 70 < 10 kg 10 - 25 kg > 25 kg K ali ų sk aičiu s

27 14 pav. Kalės amžiaus įtaka rujų skaičiui per metus

Įvertinus kalių rujų skaičiaus vidurkį, nustatyta, kad per metus kalės, nepriklausomai nuo amžiaus, vidutiniškai rujojo 1,9 ± 0,42 karto (15 pav.).

Įvertinus kalės amžiaus įtaka rujų skaičiui per metus nustatyta žema teigiama r = 0,181, statistiškai patikima (p < 0,027) koreliacija, kuri parodė, kad rujų skaičius didėja, didėjant patelės amžiui.

15 pav. Vidutinis rujų skaičius per metus priklausomai nuo kalės amžiaus 10 12 0 28 82 11 0 4 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1,5 - 3 m. 4 - 6 m. 7 - 9 m. Patelių skaičius Am žiu s

Rujoja 3 kartus Rujoja 2 kartus Rujoja 1 kartą

2,21 1,91 1,73 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 V id u tin is ru jų sk aičiu s

Patelių amžius metais 7-9 m. 4-6 m. 1,5 – 3 m.

28 Ovuliacijos laiko nustatymo būdai ir jų įtaka apsivaisinimui. Atlikus tyrimą buvo nustatyta, kad didžioji dalis (65 proc.) respondentų savo laikomų veislinių kalių ovuliacijos laikui nustatyti renkasi objektyvų metodą (progesterono koncentracijos nustatymą kraujo serume). Tyrimas parodė (16 pav.), kad ovuliacijos laikui nustatyti naudojant objektyvų būdą, apsivaisinimas būna 20,46 proc. sėkmingesnis, lyginant su subjektyviais (išskyrų spalvos, makšties konsistencijos arba makšties citologiniu tyrimu) ovuliacijos laiko nustatymo būdais. Ovuliacijos laiko nustatymas naudojant progesterono tyrimą buvo net 47,86 proc. sėkmingesnis už empirinius būdus (paties savininko atliekamus patino reakcijos ar kalės elgsenos įvertinimo).

16 pav. Ovuliacijos laiko nustatymo būdo įtaka apsivaisinimui

Atlikus palyginimą tarp sėkmingų apvaisinimų procento atsižvelgiant į ovuliacijos laiko nustatymo būdą (subjektyvus / objektyvus / empirinis) nustatyta, jog ovuliacijai naudojant objektyvų būdą, sėkmingų apvaisinimų procentas patikimai teigiamai didėja (r = 0,728, p < 0,02).

Tačiau, kaip parodė tyrimas, net 35 proc. respondentų yra linkę rizikuoti pasirinkdami ne tokį efektyvų – subjektyvųjį ar mažai efektyvų – empirinį ovuliacijos laiko nustatymo būdą (16 pav.).

Ovuliacijos nustatymo būdo įtaka atvedamų palikuonių skaičiui. Analizuojant apklausų metu gautus atvestų šuniukų skaičiaus rezultatus priklausomai nuo ovuliacijos nustatymo būdo nustatyta, kad nors ir renkantis objektyvų būdą atvedamų šuniukų skaičiaus vidurkis buvo didesnis (5,65 ± 1,89 šuniukai vadoje) nei renkantis subjektyvų būdą – 5,33 ± 2,05 šuniukai vadoje, šie duomenys statistiškai patikimai nesiskyrė (p > 0,05).

65 26 9 83,57 63,11 35,71 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70

Objektyvus Subjektyvus Empirinis

S ėk m in gų ap sivai sin im ų p roc . Ovu li ac ijos n u stat ym o b ū d o n au d ojim as, p roc .

29 Tyrimo metu buvo įvertinta kalių apvaisinimui naudojamo būdo įtaka apvaisinimui (17 pav.). Nustatyta, jog statistiškai patikimai (p < 0,05) 1,5 karto dažniau kalių apvaisinimui naudojamas natūralus kergimas, lyginant su kitais būdais.

17 pav. Kalių apvaisinimo būdai, proc. (* – p < 0,05)

Išanalizavus veisėjų nuomonę, kodėl jie renkasi tokį būdą kalės apvaisinimui, net 51,3 proc. respondentų teigė, kad kalės apvaisinimo būdą renkasi spontaniškai ir jis kiekvieną kartą gali skirtis. 14 proc. respondentų natūralaus kergimo nesirenka dėl baimės užkrėsti kalytę nuo patino infekcinėmis ligomis kergimo metu, o 34,7 proc. respondentų kales kergia tik natūraliai dėl to, kad neigiamai vertina apvaisinimą dirbtiniu būdu.

Mūsų atlikta analizė parodė, kad nors statistiškai patikimų skirtumų tarp apvaisinimo būdų nustatyta nebuvo (p > 0,05), tačiau kalių apvaisinimui naudojant sėklinimą šaldyta šuns sperma, sėkmingų apsivaisinimų vidurkis buvo didžiausias – 2,63 ± 1,06. Kalės sėklinimą šaldyta šuns sperma renkasi tik 5 proc. apklaustųjų.

Sėklinant kalę šviežia šuns sperma, sėkmingų apvaisinimų vidurkis yra 2,48 ± 1,89, ir tokį būdą renkasi 27 proc. visų apklaustų respondentų.

Didžioji dalis apklaustųjų (60 proc.) renkasi natūralų kergimą, nors sėkmingų apsivaisinimų vidurkis kergiant yra tik 1,96 ± 1,0. Dar mažesnis (1,92 ± 1,08) apsivaisinimų vidurkis nustatytas kalę sėklinant atvėsinta sperma (17 pav.).

Išanalizavus kalės sėklinimų skaičiaus vienos rujos metu įtaką apsivaisinimui, nustatyta, jog atvejų, kuriais kalės sėklinamos arba kergiamos 2 kartus yra net 2,1 karto daugiau (p < 0,05), nei tokių, kai kalė sėklinama arba kergiama tik 1 kartą (18 pav.).

60* 27 8 5 0 10 20 30 40 50 60 70

Kergiant natūraliai Sėklinant šviežia sperma Sėklinant atvėsinta sperma Sėklinant šaldyta sperma P roc en tai Apvaisinimo būdas

30 18 pav. Kalių sėklinimo / kergimo skaičius vienos rujos metu (* - p < 0,05)

Įvertinus kiek iš viso kartų kalės buvo kergtos ar sėklintos nustatyta, jog tyrime dalyvavusių kalių kergimo ar sėklinimo skaičiaus vidurkis vienos rujos metu buvo 2,95 ± 1,38 kartai, o sėkmingų apsivaisinimų procentinė tikimybė yra lygi 72,46 proc. Nustatytas stiprus (r = 0,609), statistiškai patikimas (p < 0,01) teigiamas koreliacijos ryšys tarp sėklinimo skaičiaus ir sėkmingo apsivaisinimo skaičiaus, kuris parodė, kad kalę sėklinant daugiau nei vieną kartą, apsivaisinimo tikimybė didėja.

Nustatyta, kad sėklinimų / kergimų skaičius silpnai (r = 0,086) teigiamai, tačiau statistiškai nepatikimai koreliuoja (p = 0,298, p > 0,05) su atvedamų palikuonių skaičiumi, kas rodo, kad atvedamų palikuonių skaičius nepriklauso nuo kalės sėklinimų / kergimų skaičiaus.

3.2 Kliniškai sveikų įvairaus amžiaus kalių gimdos gleivinės histopatologinės

būklės vertinimas anestrus stadijos metu

Siekiant įvertinti kliniškai sveikų kalių histopatologinius pokyčius gimdos gleivinėje, buvo atliekama planinė ovariohisterektomija anestrus stadijos metu. Surinkti 35 mėginiai ir įvertinti histomorfologiškai.

Didžiausias histopatologinių pokyčių procentas (46 proc.) buvo nustatytas 7–9 metų amžiaus patelėms, 39 proc. – vidutinio amžiaus (4–6 m.) ir tik 15 proc. jaunų – 1,5–3 metų amžiaus kalėms gimdos gleivinės mėginiuose (19 pav.).

31,3 66* 2,7 0 10 20 30 40 50 60 70 1 kartą 2 kartus 3 ir > kartų Atvejų skaičius K alės sė k li n im ų / k er gim ų k ar tai r u jos m etu

31 19 pav. Kalės amžiaus įtaka histopatologinių pokyčių gimdos gleivinėje pasireiškimui ir jų dažniui

anestrus stadijos metu

Patologinių pokyčių kliniškai sveikų, anestrus stadijoje esančių kalių gimdoje neaptikta tik 25,7 proc. atvejų. Vyriausio (7–9 m.) amžiaus kalių tarpe nebuvo rasta nei vieno atvejo, kad gimdos gleivinėje nebūtų patologinių pokyčių, o jauniausių kalių grupėje net 63,64 proc. kalių buvo sveikos.

Sveikos gimdos gleivinės histomorfologinija pateikiama (20 pav.)

20 pav. Kalės gimda be patologinių pakitimų (gimdos ragas) Dažyta hematoksilinu ir eozinu (HE), x4 (200 µm) (Nuotrauka M. Maslauskės) 1 6 4.2 4.1 2 3 5 7 1 2 1 0 0 2 2 4 2 1 1 0 3 4 3 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Be pat. pokyčių CEH Lėtinis endometritas Ūminis endometritas Adenomiozė Mukometra At ve jų sk aičiu s 1,5 - 3 m. 4 - 6 m. 7 - 9 m.

32 Sveikos gimdos gleivinės histomorfologinėje nuotraukoje yra matyti gimdos spindis (1), endometriumas (endometrium) (2), gimdos liaukos (glandulae uterinae) (3), vidinis žiedinis raumenų sluoksnis (4.1), išorinis išilginis raumenų sluoksnis (4.2) miometriumo (myometrium) raumenų sluoksniai. Tarpe jų yra kraujagyslinis sluoksnis (stratum vasculare) (5), o išorėje – perimetriumas (perimetrium) (6).

Dažniausiai nustatoma patologija buvo lėtinis endometritas (21 pav.) – 28,5 proc. atvejų ir ūminis endometritas (22 pav.) – 17,2 proc. atvejų. Iš viso endometritas (lėtinis ir ūminis) nustatytas net 16 kalių, kurios buvo kliniškai sveikos.

21 pav. Lėtinis endometritas

Dažyta HE, x10 (100 µm), x20 (50 µm) (Nuotraukos M. Maslauskės)

Lėtinio endometrito histomorfologinėje nuotraukoje (21 pav.) matoma hiperemija (1), kuri nebuvo vertinama kaip patologija, nes ji buvo sukelta ovariohisterektomijos metu naudojamų spaustukų, kurie sąlygojo mechaninį pažeidimą. Gimdos gleivinėje matyti ryški fibrozė (jungiamasis audinys ir kolageninės skaidulos) (2), gimdos liaukos nutolusios viena nuo kitos, o gleivinės jungiamajame audinyje matomos limfocitų ir plazmocitų sankaupos (3). Miometriume taip pat

1 2

3

33 matoma ryški fibrozė (4), išvešėjęs jungiamasis audinys bei pluošteliai suspaustų lygiųjų raumenų ląstelių.

Ūminio endometrito (22 pav.) nuotraukoje matoma hiperemija (1), kuri taip pat buvo sąlygota operacijos technikos, bei hemoragija gimdos gleivinės jungiamajame audinyje (4), gleivinės jungiamojo audinio edema (2) ir uždegiminių ląstelių (neutrofilų) infiltracija (3) gleivinės jungiamajame audinyje.

22 pav. Ūminis endometritas

Dažyta HE, x10 (100 µm), x10 (100 µm) (Nuotrauka M. Maslauskės)

Cistinė endometriumo hiperplazija (CEH) (23 pav.) nustatyta 17,1 proc. atvejų. Atvejų skaičius daugėjo didėjant patelės amžiui. Paveiksle matomos įvairaus dydžio ir formos stipriai išsiplėtusios, hiperplazuotos plonasienės cistos. Gimdos spindis ir gimdos gleivinė su įprasto spindžio normaliomis (1) ir išsiplėtusiomis (2) gimdos gleivinės liaukomis, virtusiomis cistomis. Didesnioji cista (parodyta ilgąja rodykle) užpildyta šviesiai rausvai pilkos spalvos gleivėmis.

4 3

1

34 23 pav. Gimdos gleivinės cistinė hiperplazija

Dažyta HE, x4 (200 µm) (Nuotrauka M. Maslauskės)

Gimdos adenomiozė (24 pav.) buvo nustatyta 8,6 proc. sterilizuojamų kalių, o mukometra tik 2,9 proc. atvejų (25 pav.)

24 pav. Gimdos adenomiozė, nedidelio laipsnio Dažyta HE, x10 (100 µm) (Nuotraukos M. Maslauskės)

1 2 1 3 1 2

35 Nuotraukoje (24 pav.) matoma gleivinės liauka (1), „grimstanti“ į gimdos raumeninį sluoksnį (miometriumą) (2), bei intensyviai proliferuojančios hiperplastiškos gleivinės liaukos (3).

25 pav. Endometriumo gleivinės metaplazija Dažyta HE, x20 (50 µm) (Nuotrauka M. Maslauskės)

Nuotraukoje (25 pav.) matyti išsiplėtusi gimdos gleivinės liauka (1), pripildyta gleivių (rausvi fragmentai). Liaukos epitelis metaplazavęs, o įprastai sutinkamas kubiškasis liaukos epitelis šiuo metu yra virtęs stulpiškuoju-gleives gaminančiu epiteliu (nuotraukoje ląstelės šviesia citoplazma) (2), kurios intensyviai produkuoja gleives. Metaplazavusio epitelio ląstelių sekretuojamos gleivės kaupiasi liaukų ir gimdos spindyje sukeldamos mukometrą.

1

36

4 REZULTATŲ APTARIMAS

Šio mūsų darbo tikslas buvo nustatyti veislinių kalių reprodukcinius parametrus ir įvertinti jų ir ovuliacijos laiko nustatymo būdo bei gimdos gleivinės histopatologinių pokyčių reikšmę reprodukcijai.

Tyrimo metu mes nustatėme, kad nepriklausomai nuo amžiaus kalė vidutiniškai rujoja 1,9 ± 0,42 karto, tačiau rujų daugėja, didėjant patelės amžiui (r = 0,181, p < 0,27), todėl padarėme prielaidą, jog kuo vyresnė kalė, tuo dažniau ji rujoja. Tam įtakos gali turėti padidėjusi estrogenų gamyba - folikulų cistos, kiaušidžių navikai (13).

Mūsų tyrimo metu nustatyta, kad net 65 proc. respondentų savo laikomų veislinių kalių ovuliacijos laikui nustatyti renkasi objektyvų progesterono koncentracijos nustatymą kraujyje, 26 proc. renkasi subjektyvų metodą, o likusieji 9 proc. respondentų nesikreipia pas veterinarijos gydytoją, o ovuliacijos laiką nustato naudodami tokius būdus kaip patino reakcija ar kalės elgsena (empiriškai). Ovuliacijai nustatyti naudojant objektyvų būdą, sėkmingų apvaisinimų procentas buvo 20,46 proc. geresnis lyginant su subjektyviu ir 47,86 proc. lyginant su empiriniu būdu (r = 0,728, p < 0,02).

Mokslininkas Labib ir kt. (3) 2018 metais atliko tyrimą, kurio tikslas buvo išvengti galimo kalių nevaisingumo, nustatant ovuliacijos laiką. Tyrimo išvada, kad progesterono koncentracijos nustatymas kraujo serume yra tikslus metodas prognozuoti ovuliacijos laiką ir pasiekti didesnį skaičių sėkmingų apsivaisinimų, mokslininkai pagrindė kalės apsivaisinimą įvertinę ultragarsu. Nustatyta, kad apsivaisino 12 iš 13 tyrime dalyvavusių kalių ir tai sudarė net 92,3 proc.

Priklausomai nuo ovuliacijos laiko nustatymo būdo, mes nustatėme, kad renkantis objektyvų būdą atvedamų šuniukų skaičiaus vidurkis buvo didesnis nei renkantis subjektyvų būdą, bet šis skirtumas nebuvo statistiškai patikimas (p > 0,05). Sėkmingų apsivaisinimų procentinė tikimybė buvo lygi 72,46 proc.

Labai panašius rezultatus gavo mokslininkas Fontbonne (1), Prancūzijoje atlikto tyrimo metu. Jis nustatė, kad ovuliacijos laiką nustatant pagal makšties citologiją ir progesterono koncentraciją kalių kraujo serume, sėkmingų apvaisinimų procentinė tikimybė siekė 75,4 proc., o vidutinis vados dydis buvo 5,6 jaunikliai. Mokslininkai Hollinshead ir Hanlon (63), ištyrė 1146 patelių ir nustatė, kad kalių sėkmingų apvaisinimų vidurkis siekė 74 proc., o vidutinis vados dydis buvo 5,8 ± 3,1 šuniukų, kai ovuliacijos laikui nustatyti buvo naudojamas progesterono tyrimas.

Mūsų atlikta analizė parodė, kad kalių apvaisinimui naudojant sėklinimą šaldyta šuns sperma, sėkmingų apsivaisinimų vidurkis buvo didžiausias (p > 0,05). Tačiau nustatėme, kad kalės sėklinimą šaldyta šuns sperma renkasi tik 5 proc. apklaustųjų. Didžioji dalis apklaustųjų (60 proc.) renkasi natūralų kergimą, nors sėkmingų apsivaisinimų vidurkis kergiant yra mažesnis. Dar mažesnis

37 apsivaisinimų vidurkis nustatytas kalę sėklinant atvėsinta sperma. Mūsų tyrimų rezultatai skyrėsi, nuo aprašytų atvejų literatūroje (63), kuriame buvo nustatyta, kad kalių, apvaisintų šaldyta, atvėsinta sperma, apsivaisinimo lygis buvo žymiai mažesnis (71 proc.) lyginant su kalėmis, kurios apvaisintos šviežia sperma (80 proc.) (p < 0,001).

Išanalizavę kalės sėklinimų skaičiaus vienos rujos metu įtaką apsivaisinimui, mes nustatėme, jog atvejų, kuriais kalės sėklinamos arba kergiamos 2 kartus yra net 2,1 karto daugiau (p < 0,05), nei tokių, kai kalė sėklinama arba kergiama tik 1 kartą. Galima teigti, kad 2 kartus kergimas yra kartojama tam, kad padidinti sėkmingo apvaisinimo tikimybę. Nustatėme, kad kalę sėklinant daugiau nei vieną kartą, apsivaisinimo tikimybė didėja (r = 0,609, p < 0,01).

Atliekant kliniškai sveikų kalių gimdos gleivinės histomorfologinį įvertinimą mes nustatėme, kad iš 35 atvejų tik 26 proc. kalių gimdos gleivinėje patologinių pokyčių aptikta nebuvo. Mokslininkas Mir ir kt. (43), ištyrę 21 atvejį taip pat rado mažą kiekį (14,3 proc.) gimdos gleivinės mėginių be patologinių pakitimų. Tai įrodo, kad norint įsitikinti, kad veislinė kalė yra tikrai sveika, nors ji ir nerodo jokių klinikinių ligos požymių, yra verta atlikti gimdos gleivinės biopsiją.

Mokslininkas Gifford su bendraautoriais (56), atliko 399 kalių gimdos biopsijos mėginių histomorfologinę analizę. Atlikę tyrimus jie nustatė, kad dažniausia nustatyta patologija buvo endometritas – 42,6 proc. atvejų ir cistinė endometriumo hiperplazija – 33,3 proc. atvejų. Šie tyrimai sutampa su mūsų atlikto tyrimo metu gautus rezultatus, (kad ir su mažesniu skaičiumi mėginių), nes mūsų tyrime endometritas buvo nustatytas taip pat didžiausiai daliai kalių (45,7 proc.), o cistinė endometriumo hiperplazija – 17,1 proc. kalių.

Gifford ir kt. (56) nustatė, kad net 52,4 proc. (n = 89) endometrito atvejų buvo lėtiniai, nes gleivinėje vyravo limfocitai ir plazmocitai, bei 17,6 proc. (n = 30) atvejų nustatytas ūminis endometritas, kurio metu gleivinėje vyravo neutrofilų ar eozinofilų arba mišri infiltracija. Likusiais 30,0 proc. (n = 51) atvejais jie nustatė mišrų uždegiminį procesą.

Rezultatai yra panašūs su mūsų gautus rezultatus. Mūsų atveju lėtinis endometritas buvo nustatytas 29 proc. atvejų, o ūminis endometritas 17 proc. atvejų. Mišrių uždegiminių procesų mes nenustatėme. Tiek iš mūsų, tiek iš Gifford ir kt. (56) gautų rezultatų galima daryti prielaidą, kad kalių nevaisingumo dažniausia priežastimi būna ūminis arba lėtinis endometritas, neturintis klinikinių požymių.

Panašūs rezultatai gauti ir mokslininko Praderio su bendraautoriais (52), kurie atlikę gimdos histopatologinį tyrimą 50 kalių, 54 proc. jų nustatė endometritą, 4 proc. cistinę endometriumo hiperplaziją. Sveikos buvo tik 18 kalių. Šie rezultatai dar kartą patvirtino hipotezę, kad endometritas be klinikos yra dažna gimdos gleivinės patologija, kuri gali būti siejama su neaiškiomis aplinkybėmis pasireiškiančiu kalės nevaisingumu ar nesėkminga vaisiaus implantacija (52).

38 Adenomiozė ir mukometra mūsų tyrimo metu buvo nustatyta tik pavieniais atvejais (3 ir 1 atitinkamai) iš 35 tirtų kalių. Nedidelį skaičių šių patologijų identifikavo ir kiti mokslininkai (43) savo atliktose studijose. Iš 17 atvejų mukometrą jie nustatė 11,7 proc. (n = 2), o adenomiozę tik 5,8 proc. (n = 1) atvejų.