LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA
ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Akvilė Kunigonienė
RECIPIENTŲ ĮSIJAUTRINIMO ŽLA SISTEMOS ANTIGENAMS LABORATORINIS VERTINIMAS
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Daiva Urbonienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3
ABSTRACT ... 5
INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 14
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 15
1.1. ŽLA sistema ... 15
1.2. ŽLA antikūnų tyrimų metodų istorija ... 17
1.3. ŽLA antikūnų tyrimų metodų palyginimas ... 18
1.3.1. Ląstelių tyrimai ... 18
1.3.2. Kietos fazės imuniniai tyrimai ... 18
1.4. ŽLA antikūnų tyrimo metodų privalumai ir trūkumai... 19
1.4.1. Nuo komplemento priklausantis limfocitotoksinis tyrimas ... 19
1.4.2. Tėkmės citometrijos tyrimas ... 20
1.4.3. Kietos fazės imunologiniai tyrimai ... 20
1.4.4. Kietos fazės ŽLA antikūnų aptikimo tyrimų techniniai sunkumai ... 21
1.5. ŽLA antikūnų tyrimas prieš transplantaciją ... 22
1.6. ŽLA antikūnų tyrimas po transplantacijos ... 23
1.7. Imunologinis recipientų ir donorų ištyrimas ... 25
1.8. Kandidatų inkstų transplantacijai ištyrimas ... 26
1.9. Donorų ir recipientų statistiniai duomenys ... 27
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 30
2.1. Tiriamoji grupė ... 30
2.2. Atrankinis tyrimas antikūnams prieš žmogaus I ir II klasės leukocitų antigenus nustatyti ... 31
2.2.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas ... 31
2.2.2. Metodo esmė ... 31
2.2.3. Reagentai, tyrimų įrenginiai, matavimo ir kitos priemonės ... 32
2.2.4. Tyrimo metodikos aprašymas ... 33
2.2.5. Rezultatų įvertinimas ... 35
2.3. Antikūnų prieš žmogaus I ir II klasės leukocitų antigenus identifikavimas ... 36
2.3.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas ... 36
2.3.2. Metodo esmė ... 37
2.3.3. Reagentai, tyrimų įrenginiai, matavimo ir kitos priemonės ... 37
2.3.4. Tyrimo metodikos aprašymas ... 38
2.3.5. Rezultatų įvertinimas ... 39
2.4. Statistinė duomenų analizė ... 40
3. REZULTATAI ... 41
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 51
IŠVADOS ... 56
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 57
3
SANTRAUKA
Darbo autorius – Akvilė Kunigonienė
RECIPIENTŲ ĮSIJAUTRINIMO ŽLA SISTEMOS ANTIGENAMS LABORATORINIS VERTINIMAS
Darbo tikslas: įvertinti inkstų recipientų ikitransplantacinį įsijautrinimą ŽLA sistemos antigenams.
Uždaviniai: 1. Nustatyti ir įvertinti antikūnų prieš ŽLA sistemos I ir II klasės antigenus dažnį ir įvertinti jų ryšį su lytimi. 2. Nustatyti ir įvertinti įsijautrinimo ŽLA sistemos antigenams priklausomybę nuo ABO kraujo grupės. 3. Nustatyti ir įvertinti tiriamųjų įsijautrinimą ŽLA sistemos antigenams pagal reaktyvių antikūnų procentą (PRA) ir įvertinti jo ryšį su lytimi. 4. Nustatyti tiriamųjų įsijautrinimo ŽLA sistemos antigenams stiprumą ir įvertinti jo ryšį su lytimi. 5. Nustatyti antikūnų prieš ŽLA–A, ŽLA–B, ŽLA–C, ŽLA–DR antigenus dažnį pagal jų rūšį.
Metodai ir tyrimo objektas. Tirti inkstų recipientai, kuriems 2011 09 29–2016 02 24 LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje buvo atlikti atrankiniai antikūnų prieš ŽLA antigenus tyrimai (Gama LIFECODES LifeScreen Deluxe (LMX) (IMMUCOR, JAV)). Pacientams, kurių atrankinių tyrimų rezultatai buvo teigiami, papildomai atlikta antikūnų identifikacija (LIFECODES LSA Class I; LSA Class II (IMMUCOR, JAV)). Tyrimai buvo atlikti Luminex® technologijos pagrindu. Grupių požymių statistiniams skirtumams vertinti taikytas Mann–Whitney U testas, kokybinių požymių skirtumų reikšmingumui tarp grupių – Chi kvadratas, o mažoms imtims – Fisher testas. Statistinio reikšmingumo lygmuo – p<0,05.
Rezultatai. Tirti 76 pacientai: 36 (47,4 proc.) vyrai ir 40 (52,6 proc.) moterų. 49 (64,5 proc.) pacientams atlikti antikūnų prieš ŽLA sistemos I klasės antigenus patvirtinamieji tyrimai, 65 (85,5 proc.) pacientams – II klasės. Teigiami rezultatai gauti atitinkamai 32 (65,3 proc.) ir 36 (55,4 proc.) pacientams. Moterų įsijautrinimas ŽLA sistemos I klasės antigenams reikšmingai dažnesnis nei vyrų (atitinkamai, 23 (82,1 proc.) ir 9 (42,9 proc.), p=0,006). Įsijautrinimo ŽLA sistemos I ir II klasės antigenams reikšmingo ryšio su kraujo grupe nenustatyta.
Vertinant tiriamųjų įsijautrinimą pagal PRA, asmenys, turintys žemo reaktyvumo PRA (0 proc.<PRA<50 proc.) ŽLA sistemos I klasės antigenams, sudarė 87,5 proc. recipientų, o II klasės antigenams – 97,2 proc. PRA ryšio su lytimi nenustatyta.
Vertinant ŽLA sistemos I klasės antigenams įsijautrinimo stiprumą pagal MFI, tiek žemo (MFI<3000), tiek ir vidutinio (3000≤MFI<10000) įsijautrinimo stiprumo dažnis sudarė po 68,8 proc., II klasės – žemas įsijautrinimo stiprumas nustatytas visiems tirtiesiems. Įsijautrinimo stiprumo priklausomybė su lytimi nepatvirtinta.
4 Išvados. 1. Bendras įsijautrinimas ŽLA sistemos tiek I, tiek ir II klasės antigenams nustatytas daugiau nei pusei recipientų, laukiančių inkstų transplantacijos. Įsijautrinimas ŽLA sistemos I klasės antigenams moterų tarpe buvo reikšmingai dažnesnis, o įsijautrinimo ŽLA sistemos II klasės antigenams dažnio skirtumų tarp lyčių nenustatyta. 2. Skirtingas ABO kraujo grupes turinčių inkstų recipientų įsijautrinimo ŽLA sistemos tiek I klasės, tiek ir II klasės antigenams dažnio skirtumų nenustatyta. 3. Recipientų, laukiančių inkstų transplantacijos, grupėje didžiausią dalį sudarė asmenys, turintys žemą antikūnų reaktyvumą (0 proc.<PRA<50 proc.) tiek prieš ŽLA sistemos I klasės, tiek ir prieš II klasės antigenus. PRA ryšio su lytimi nenustatyta. 4. ŽLA sistemos I klasės antigenams įsijautrinusių inkstų recipientų grupėje didžiausią dalį sudarė asmenys, turintys mažo ir vidutinio įsijautrinimo stiprumą, o II klasės – mažo įsijautrinimo stiprumą. Nors įsijautrinimo stiprumo priklausomybė su lytimi nepatvirtinta, stebimas dėsningumas, kad stipriausią įsijautrinimą tiek I, tiek II klasės antigenams turi recipientės moterys. 5. Dažniausi antikūnai prieš ŽLA–A antigenus – A23(9), A24(9), A1, A2043, prieš ŽLA–B antigenus – B55(22), B7, B27, B46, B56(22), prieš ŽLA–C antigenus – C7, C9, C10, C8, C1, o prieš ŽLA–DR antigenus – DR52, DR9, DR18(3), DR1404.
5
ABSTRACT
The author: Akvilė Kunigonienė
LABORATORY EVALUATION OF RECIPIENT‘S SENSITIZATION TO HLA SYSTEM ANTIGENS
The goal of the study was to evaluate pretransplant sensitization of kidney recipients to HLA system antigens.
The objectives: 1. To identify frequency of antibodies to HLA system class I and class II antigens and to evaluate their relation to gender. 2. To identify and to evaluate the relation between sensitization to HLA antigens and ABO blood type. 3. To identify and to evaluate the recipient‘s sensitization to HLA antigens depending on percentage of panel reactive antibodies (PRA) and its relation to gender. 4. To determine intensity of the recipients’ sensitization to HLA antigens and evaluate its relation to gender. 5. To determine specificity and frequency of antibodies against HLA– A, HLA–B, HLA–C, HLA–DR antigens.
Methods and the study subjects. Study involved kidney recipients, which were examined in Department of Laboratory Medicine of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences (LSMU) Kauno klinikos during 2011–09–29 and 2016–02–24. Recipients with positive screening of antibodies to HLA (Gama LIFECODES LifeScreen Deluxe (LMX) (IMMUCOR, USA)) were selected for additional evaluation – identification of antibodies to HLA (LIFECODES LSA Class I; LSA Class II (IMMUCOR, USA)). All testing was based on Luminex® technology.
SPSS 20.0 software was used for statistical data analysis. Mann–Whitney U test was used for evaluation of statistical differences between groups. Chi square was used to determine qualitative differences between groups. Fisher test was used for assessment of small samples. Statistical significance was assumed at p<0.05.
Results. 76 patients were studied: 36 (47.4%) men and 40 (52.6%) women. 49 (64.5%) patients had positive antibodies to HLA class I antigens, while 65 (85.5%) patients – to HLA class II antigens determined by confirmatory tests. The positive results of these test came for 32 (65.3%) and 36 (55.4%) patients respectively. Women sensitization to HLA class I antigens was significantly more frequent than men (82.1% and 42.9%, respectively, p=0.006). No significant relation was found between sensitization to HLA class I and class II antigens and blood type.
During the evaluation of sensitization by PRA, the 87.5% of patients had a low reactivity of PRA (0%<PRA<50%) to HLA class I and 97.2% – to HLA class II. No PRA relation to gender was found.
6 During the evaluation of MFI, 68.8% of patients had low (MFI<3000) and 68.8% of patients had medium (3000≤MFI<10000) sensitization to HLA class I antigens, while for the class II – all of tested patients had low sensitization. The relation between intensity of sensitization and gender has not been confirmed.
Conclusions. 1. Overall sensitization to HLA system class I and calss II antigens has been established for more than 50 % of patients, awaiting a kidney transplant. The sensitization to HLA class I antigens was significantly higher in women compared to men, while for sensitisation to HLA class II antigens – no gender differences were confirmed. 2. No differences in frequency were determined for sensitization to HLA class I and class II antigens between kidney recipients with different ABO blood types. 3. The largest part of recipients, awaiting kidney transplant, consisted of patients with low antibody reactivity (0%<PRA<50%). 4. Kidney recipient group with sensitization to HLA class I antigens mostly consisted of patients with low to medium sensitization intensity, while to the class II –all patients had low sensitization intensity. Despite the fact that sensitization intensity has not been linked to gender, it is apperant that the highest sensitization to classes I and II is in women. 5. The most common antibodies against HLA–A group antigens – A23(9), A24(9), A1, A2043, against HLA–B antigens – B55(22), B7, B27, B46, B56(22), against HLA–C – C7, C9, C10, C8, C1, and against HLA–DR – DR52, DR9, DR18(3), DR1404.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS
8
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje, Hematologijos ir bendrosios citologijos laboratorijoje, gavus LSMU Bioetikos centro leidimą (leidimas atlikti biomedicininį tyrimą 2016 01 08, Nr. BEC– LMB(M)–186) (1 priedas).
9
SANTRUMPOS
ABO − ABO kraujo grupių sistema
Anti–ŽLA – antikūnai prieš žmogaus leukocitų antigenus
BAF – fluorescencijos fono koregavimo koeficientas (angl. background adjustment factor)
BCR – pakoreguotas fono santykis (angl. background corrected ratio) C1, C2 − komplemento komponentai
CAL1/2 – Luminex kalibravimo granulės CD4+ − T limfocitai pagalbininkai CD8+ − T citotoksiniai limfocitai
CDC − nuo komplemento priklausantis citotoksiškumas (angl. complement dependent cytotoxicity)
CON1/2/3 – kontrolinės granulės
DSA − donorui specifiniai antikūnai
ELISA − imunofermentinis tyrimo metodas (angl. enzyme−linked immunosorbent assay) g − išcentrinė jėga (angl. relative centrifuge force expressed in units of gravity) HUS − hemolizinis ureminis sindromas
Ig − imunoglobulinas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos
kba − kilobazė
LKI − limfocitų kalcineurino inhibitorius
LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos LTIN − lėtinė transplantuoto inksto nefropatija
MFI – fluorescencijos intensyvumo vidurkis (angl. mean flourescence intensity)
MHC − pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas (angl. major histocompatibility complex)
MICA – su didžiojo audinių suderinamumo komplekso I klasės grandine susijęs genas A
ºC − Celsijaus laipsnis
PRA – teigiamai su limfocitų panele reaguojančių antikūnų skaičius, išreikštas procentais (angl. panel reactive antibodies)
RNR − ribonukleino rūgštis
SAB − vienos rūšies antigenu padengta granulė (angl. single−antigen bead) SD – standartinis nuokrypis (angl. standard deviation)
10 SPI − kietos fazės imuninis tyrimas (angl. solid−phase immunoassay)
XM − kryžminė dermė (angl. crossmatch) ŽIV − žmogaus imunodeficito virusas
ŽLA − žmogaus leukocitų antigenai (angl. human leucocytes antigens) ŽLA−A/B/C − ŽLA I klasės antigenai A, B, C
ŽLA–DR/DP/DQ − ŽLA II klasės antigenai DR, DP, DQ β2m − β2 mikroglobulinas
11
ĮVADAS
Kasmet daugėja pacientų, sergančių galutinės stadijos inkstų nepakankamumu. Didžioji dalis pacientų yra gydomi dializėmis. Alogeninė inksto persodinimo operacija yra alternatyva dializėms. Inksto persodinimo operacija pagerina pacientų gyvenimo kokybę, prailgina ligonių išgyvenamumą. Be to, ilgai trunkantis gydymas dializėmis yra brangesnis nei inksto transplantacija (1).
Lietuvoje, kaip ir visame pasaulyje, kasmet daugėja pacientų, laukiančių inkstų persodinimo operacijos. Nacionalinio organų transplantacijos biuro duomenimis, 2016 m. kovo mėn. inksto persodinimo operacijos laukiančiųjų sąraše buvo 170 pacientų. Kadaverinių inkstų persodinimo skaičius Lietuvoje didėja – 2011 m. inkstas buvo persodintas 69 pacientams, 2012 m. – 76, 2013 m. −77, o 2015 m. net 106 pacientams (2).
Transplantuoto inksto išgyvenamumas nuolat ilgėja. Remiantis skirtingų klinikinių tyrimų duomenimis 5 metų transplantanto išgyvenamumas sudaro nuo 44 iki 95 proc., 10 m. – 23–95 proc., 15 m. – 35 proc., o 20 m. – vos 21–36 proc. (3). Svarbūs veiksniai, kurie lemia transplantanto išgyvenamumą yra patobulėjusi chirurginė technika, aktyvi ligonių priežiūra iki transplantacijos bei pacientui adaptuotas imunosupresinis gydymas po operacijos. Švedų autoriai nurodo, kad mažų vaikų išgyvenamumas po transplantacijos ženkliai pagerėjo – iki 1998 m. buvo 88 proc., 2012 m. jis siekė 95 proc., o 10 metų transplantuoto inksto išgyvenamumas atitinkamai kito nuo 82 proc. iki 95 proc. (4).
Paciento ir transplantanto būklė per pirmąsias paras po inkstų transplantacijos daugiausia priklauso nuo ligonio būklės prieš operaciją, ligos, kuri sukėlė galutinį inkstų nepakankamumą, taip pat nuo gretutinių patologijų, sveikatos būklės prieš pat operaciją ir donoro, kurio inkstas buvo transplantuojamas. Svarbūs donoro veiksniai yra amžius, mirties priežastis, laikas nuo smegenų mirties iki inksto paėmimo, vazopresorių dozė prieš paimant inkstą, šaltosios išemijos laikas ir kt. (5). Pagal 2005 m. Lietuvoje skelbtus tyrimų rezultatus, ūminio atmetimo rizika beveik dvigubai didesnė, jeigu donoras vyresnis nei 50 m., donoro mirties priežastis smegenų kraujagyslių patologija, o šaltosios išemijos laikas viršija 20 h. (6).
Per pirmąją pooperacinę savaitę paaiškėja transplantuoto inksto funkcija bei priderinamas imunosupresinis gydymas. Svarbu stebėti ir jei reikia koreguoti recipiento hipertenzijos ir glikemijos rodiklius, toliau matuoti diurezę, jai mažėjant – koreguoti (5). Dauguma gyvų donorų ir apie pusę kadaverinių donorų inkstų pradeda veikti labai greitai ir serumo kreatininas greitai normalizuojasi.
Vėluojanti transplantanto funkcija yra tuomet, kai inkstas po transplantacijos pradeda veikti lėčiau negu buvo tikėtasi. Vėluojanti transplantato funkcija gali pasireikšti dėl limfocitų kalcineurino inhibitorių (LKI) toksiškumo, ūminio atmetimo, trombinės mikroangiopatijos ir kitų patologijų.
12
Dažniausia vėluojančios transplantato funkcijos priežastis yra ūminė kanalėlių nekrozė. Ūminę kanalėlių nekrozę gali sąlygoti aukščiau minėti priešoperaciniai veiksniai (5). Remiantis Lietuvos nefrologų duomenimis, vėluojanti transplantato funkcija buvo nustatyta 33,3 proc. pacientų ir tai lėmė prastesnį transplantato išgyvenamumą po 1, 3 ir 5 m. (7). Siekiant išvengti vėluojančios transplantanto funkcijos, siūlomas donoro gydymas, kiek įmanoma sutrumpinti šaltosios ir šiltosios išemijos laiką, ir užtikrinti operacijos sąlygų kontrolę.
Įsijautrinimas iki transplantacijos, kai pacientas jau prieš transplantaciją turi citotoksinių antikūnų prieš žmogaus leukocitinius antigenus, yra susijęs su labai ūmiu transplantato atmetimu. Tokiais atvejais vystosi humoralinio atmetimo reakcija, kuri įvyksta tuoj po transplantato perfuzijos operacijos metu arba pirmomis dienomis po jos. Kai organizme esama antikūnų dar prieš transplantaciją, kryžminio suderinamumo reakcija būna teigiama, o ūminė atmetimo rekcija vystosi tuojau pat transplantavus inkstą. Tai ypač būdinga gimdžiusioms moterims, recipientams, kurie ilgai laukia transplantacijos ir turėjusiems kraujo transfuzijų, arba pakartotinai transplantuojamiems pacientams (8).
Ūminis atmetimas gali pasireikšti ir šiek tiek vėliau, dažniausiai pirmos savaitės pradžioje. Tai vadinama ankstyvu ląsteliniu atmetimu. Tai procesas, kai intersticiume vyksta uždegiminė reakcija, o biopsijoje stebima ląstelinė intersticiumo bei subendotelinė infiltracija. Ląstelinis atmetimas diagnozuojamas atliekant transplantuoto inksto biopsiją, o tai reiškia, kad vykstantis inksto pažeidimas yra pažengęs ir pilnai negrįštamas. Nurodoma, kad pacientams, kuriems pagal imuninę būklę numatoma didelė ūmaus atmetimo tikimybė, transplantacijos metu pradėjus taikyti indukcinę terapiją monokloniniais antikūnais žymiai sumažėjo ūminio atmetimo komplikacijų (9).
Pagrindinė transplantuoto inksto nepakankamumo priežastis – lėtinis atmetimas, kuris pasireiškia 35 proc. pacientų. (10). Šis terminas vėliau pakeistas į lėtinę transplantuoto inksto nefropatiją (LTIN) (11). Esant šiam pažeidimui stebimi histopatologiniai pokyčiai inkstuose.
Fletcherio ir kitų mokslininkų pateikiamų svarbių veiksnių, lemiančių LTIN vystymąsi, saraše yra nurodomi tokie veiksniai, kaip donoro ir recipiento ŽLA neatitikimo lygmuo, recipiento amžius, ankstesnės transplantacijos, kraujo perpylimai, rasė, limfocitų kalcineurino inhibitoriai, toksiškai veikiantys inkstų kanalėlių ląsteles, skatinantys transformuojančio augimo veiksnio–beta gamybą ir sukeliantys progresuojančią fibrozę, bei vaistų nevartojimas – ypač aktuali problema paauglystėje, vedanti į greitą transplantuoto inksto netekimą (12–14).
Pradėjus naudoti naujausius imunosupresinius vaistus ilgėja tiek pacientų po inksto transplantacijos, tiek transplantuoto inksto išgyvenamumas, tačiau didėja su infekcija nesusijusių ir infekcijos sąlygotų komplikacijų dažnis (15).
Nepaisant didelių patobulinimų potransplantacinėje pacientų priežiūroje, ilgalaikė transplantato funkcija yra mažiau nei optimali. Jungtinėse Amerikos Valstijose, dešimties metų
13
transplantato išgyvenamumo dažnis inksto persodinimo operacijose iš mirusių ir gyvų donorų atitinkamai yra tik 40,8 proc. ir 57,9 proc. (16). Antikūnų sukeltas atmetimas yra pagrindinė prasto transplantato išgyvenamumo priežastis.
Nors tradiciniai žymekliai gali padėti diagnozuojant klinikinę būklę po organo persodinimo, jie paprastai yra nespecifiniai ir dažniausiai aptinkami tik pasireiškus transplantanto pažeidimui. Yra svarių įrodymų, kad antikūnai prieš ŽLA sistemos antigenus prisideda prie lėtinio inkstų nepakankamumo vystymosi, kas yra pagrindinė priežastis inkstų transplantato atmetimui. Anksti nustatyti ir vėliau pašalinti kliniškai žalingi donorui specifiniai antikūnai (DSA), susiję su antikūnų įtakotu atmetimu, gali užkirsti kelią alotransplantato praradimui (17).
14
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Šio darbo tikslas yra įvertinti inkstų recipientų ikitransplantacinį įsijautrinimą ŽLA sistemos antigenams. Tikslui pasiekti iškelti uždaviniai:
1. Nustatyti ir įvertinti antikūnų prieš ŽLA sistemos I ir II klasės antigenus dažnį ir įvertinti jų ryšį su lytimi.
2. Nustatyti ir įvertinti įsijautrinimo ŽLA sistemos antigenams priklausomybę nuo ABO kraujo grupės.
3. Nustatyti ir įvertinti tiriamųjų įsijautrinimą ŽLA sistemos antigenams pagal reaktyvių antikūnų procentą (PRA) ir įvertinti jo ryšį su lytimi.
4. Nustatyti tiriamųjų įsijautrinimo ŽLA sistemos antigenams stiprumą ir įvertinti jo ryšį su lytimi.
15
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. ŽLA sistema
Genetinis lokusas, susijęs su svetimo organo atmetimu, yra vadinamas pagrindiniu audinių suderinamumo kompleksu (MHC) (angl. Major Histocompatibility Complex). MHC koduoja labai polimorfiškas ląstelės paviršiaus molekules. Žmogaus MHC yra vadinamas žmogaus leukocitų antigenų (ŽLA, angl. Human Leucocytes Antigen) sistema. Taigi terminai MHC ir ŽLA vartojami kaip sinonimai (18).
Žmogaus MHC yra išsidėstęs šeštosios chromosomos trumpajame petyje (6p21) ir apima apie 3600 DNR kilobazių (kba) (19). MHC yra skirstomas į 3 regionus: I, II ir III klases (1 pav.) (20). I klasės regionas apima klasikinius ŽLA–A, ŽLA–B ir ŽLA–C genus, kurie koduoja sunkiąsias I klasės molekulių grandines. II klasės regionas apima ŽLA–DR, ŽLA–DP ir ŽLA–DQ, kurių kiekviename yra A ir B genų, koduojančių atitinkamai α ir β grandines (21). DR geno šeima susideda iš vieno DRA geno ir devynių DRB genų (nuo DRB1 iki DRB9). DRA genas koduoja nekintančią α grandinę, kuri jungiasi su kintančia β grandine, koduojama DRB geno. ŽLA–DR antigeno ypatumus lemia polimorfiškos DRβ1 grandinės, koduojamos DRB1 alelių. DP ir DQ genų šeimos turi po vieną ekspresuojamą α ir β grandinę, bei neekspresuojamus pseudogenus. III klasės regionas nekoduoja ŽLA molekulių, tačiau jo sudėtyje yra genų, koduojančių komplemento komponentus (C2, C4, B faktorius), 21–hidrolazę, naviko nekrozės faktorių ir kitus (22).
I klasės ŽLA molekulės ekspresuojamos ant beveik visų branduolį turinčių ląstelių paviršiaus. II klasės molekulės aptinkamos tik ant B limfocitų, antigeną pristatančių ląstelių (monocitų, makrofagų ir dentritinių ląstelių) ir aktyvuotų T limfocitų.
I klasės ŽLA molekulės sudarytos iš glikozilintų sunkiųjų grandinių, koduojamų I klasės ŽLA genų, kurios nekovalentiškai susijungusios su ekstraląsteliniu β2–mikroglobulinu (β2m) (23). Žmogaus
β2m yra nekintantis ir koduojamas geno, esančio 15 chromosomoje. I klasės sunkioji grandinė sudaryta
iš trijų ekstraląstelinių domenų (α1, α2 ir α3), transmembraninio regiono ir intracitoplazminio domeno.
α1 ir α2 domenai sudaryti iš kintančios amino rūgščių sekos ir tokiu būdu šie domenai lemia I klasės
ŽLA molekulių antigeninį specifiškumą. Šie domenai formuoja unikalią struktūrą, sudarytą iš aštuonių antiparalelių β gijų ir dviejų antiparalelių α spiralių. Griovelis susiformuoja iš dviejų α spiralių ir dviejų β klosčių. Būtent griovelis ir yra apdoroto peptidinio antigeno jungimosi vieta (24).
16 1 pav. MHC komplekso klasių išsidėstymas (modifikuota pagal 20)
II klasės DR, DP ir DQ genų produktai yra heterodimerai, sudaryti iš dviejų nekovalentiškai susijungusių glikozilintų polipeptidinių grandinių α ir β. Ekstraląstelinė α ir β grandinių dalis susideda iš dviejų domenų α1 ir α2 bei β1 ir β2, kurie prisitvirtinę prie membranos per trumpą transmembraninį
regioną ir citoplazminį domeną. II klasės molekulių polimorfizmą lemia β1 domenas (25).
Supaprastinta I ir II klasės ŽLA molekulių struktūrinė schema pavaizduota 2 paveiksle (26).
17 Peptidų, kurie jungiasi prie I ar II klasės molekulių, prigimtis ir šaltinis yra skirtingi (27). I klasės molekulės ir peptido kompleksas, esantis ant ląstelės paviršiaus, atpažįstamas CD8+ limfocitų receptorių (28). II klasės molekulių raiška dažniausiai vyksta antigeną pristatančiose ląstelėse, įskaitant B limfocitus, monocitus/makrofagus, dentrines ir Langerhanso ląsteles. Ekstraląsteliniai egzogeniniai baltymai patenka endocitozės būdu ir yra degraduojami endosomose. II klasės molekulės ir peptido kompleksas transportuojamas ant ląstelės paviršiaus, kur yra atpažįstamas CD4+ limfocitų receptorių (29).
1.2. ŽLA antikūnų tyrimų metodų istorija
1960–ųjų metų viduryje sėkminga transplantacija priklausė nuo žinių apie humoralinį atmetimą, kuris įtakoja inksto netekimą transplantacijos metu, t. y. ūmų atmetimą. Antikūnų prieš ŽLA nustatymas suteikė galimybę tirti transplantanto tolimesnės eigos vystymąsi paprastu ir praktišku DSA tyrimu – nuo komplemento priklausomu limfocitotoksiniu (CDC) kryžminės dermės (XM) tyrimu (30). Technologijų vystymasis ir tyrėjų supratimas apie antikūnų reakcijas nuo 1970–ųjų lėmė metodų tobulėjimą, kurių dėka galima nustatyti transplantanto atmetimo prognozę. Žinios apie autologinius ir neautologinius ŽLA antikūnus, CDC XM tyrimo jautrumo didinimas naudojant tėkmės citometriją bei IgM antikūnų identifikavimas naudojant ditiotreitolą suteikė galimybę tiksliau vertinti ir prognozuoti, kurios transplantacijos gali būti sėkmingos, o kurios negali. Imunosupresinių vaistų tobulinimas 1980−1990–aisiais padėjo kontroliuoti T ląstelių sąlygojamą autoimunitetą, todėl ūminio transplantanto atmetimo dažnis žymiai sumažėjo. Šie sėkmingi atradimai atskleidė, kad trūksta antikūnų ar humoralinio atmetimo sukeltų procesų kontrolės.
Siekiant suprasti autoimuniteto biologiją, svarbu išsiaiškinti šiuos veiksnius: komplemento aktyvaciją ant transplantanto endotelio ląstelių paviršiaus, naudojant komplemento komponento C4d histologinę lokalizaciją transplantanto biopsinėje medžiagoje (31); nustatyti antikūnų specifiškumą ir jautrumą naudojant kietos fazės imunologinę analizę (SPI, angl. Solid Phase Immunoassays) (32). Dabartinių metodų tikslas rizikos rangavime yra grindžiamas antikūnų identifikavimo ir kryžminių reakcijų tyrimų rezultatais, atsižvelgiant į organo tipą ir klinikines aplinkybes, tokias kaip skubumo svarba, imunosupresijos strategijų galimybė bei donoro faktoriai (33).
18
1.3. ŽLA antikūnų tyrimų metodų palyginimas
Įvairūs tyrimai ŽLA antikūnų identifikacijai labai skiriasi nuo taikinio tipo, jautrumo ir specifiškumo. Tiksli rezultatų analizė ir klinikinė interpretacija reikalauja žinių ir patirties apie paciento imunologinę būklę, įskaitant jautrinančius veiksnius ir ankstesnę transplantacijos istoriją. Tyrimams naudojamos ląstelės, tirtos citotoksiniu arba tėkmės citometrijos tyrimais, arba tirpūs antigenai, tirti SPI. Analizuojant metodus daugiausia dėmesio skiriama tyrimų techniniams aspektams ir faktoriams, kurie turi įtakos rezultatams (33).
1.3.1. Ląstelių tyrimai
CDC ir tėkmės citometrijos tyrimai naudojami specifinių ŽLA antikūnų atrankai ir donoro kryžminės dermės ištyrimui. Šių tyrimų metu naudojamos ląstelės. Limfocitotoksinis metodas yra mažesnio jautrumo, tačiau juo galima nustatyti antikūnus, kurie įtakoja ūmų transplantanto atmetimą. Paskelbtos techninės modifikacijos, padidinusios jautrumą ir specifiškumą, tačiau nėra rutiniškai taikomos tyrimų laboratorijose (34).
Tėkmės citometrijos tyrimu aptinkami antikūnai prisijungę prie žymėtų limfocitų. Tyrimas atliekamas remiantis antrinių antikūnų fluorescencija ir vertinamas kiekybiškai. Tėkmės citometrijos kryžminės dermės tyrimas naudojamas rizikos įvertinimui. Tėkmės citometrijos modifikacijos apima skirtingų imunoglobulinų klasių ir poklasių aptikimą, ląstelių taikinių diferenciaciją, pronazės poveikį B limfocitams, siekiant sumažinti foninį nespecifinį reaktyvumą (33).
1.3.2. Kietos fazės imuniniai tyrimai
SPI tyrimams yra taikomi komerciniai rinkiniai, kuriuose naudojamos ištirpintos ŽLA molekulės, prijungtos prie kietos matricos. Matricai naudojamos titravimo plokštelės (imunofermentiniai tyrimai – ELISA) arba polistireno granulės. Tyrimas atliekamas paprastame tėkmės citometre arba „Luminex“ analizatoriuje (35, 36). ELISA tyrimo rezultatai pateikiami optinio tankio santykiu, kuris lyginamas su neigiama kontrole, taigi antikūnų jungimasis vertinamas pusiau kiekybiškai.
Granulių pagrindu atliekamuose tyrimuose naudojamos granulės, impregnuotos skirtingo fluorescencijos laipsnio dažais. Skirtingi dažai naudojami signalų sugrupavimui. Antiglobulino reagentas žymimas trečiuoju fluorescuojančiu dažu (signalas reporteris), taigi, naudojant dviejų lazerių
19 įrenginį kiekvienos granulės fluorescencijos signalas gali būti atpažintas. Tokiu būdu vienu lazeriu identifikuojama granulių populiacija, o tuo pačiu metu fiksuojama ŽLA specifinių antikūnų rišimosi fluorescencija (reporterio). Granulėmis pagrįstas tyrimas yra pusiau kiekybinis ir atliekamas Luminex platformoje. ŽLA specifinių antikūnų rišimasis išreiškiamas reporterio signalo vidutiniu fluorescencijos intensyvumu (MFI, angl. mean flourescence intensity) (33).
Trijų tipų panelės skiriasi žymėtų antigenų sudėtimi. A) Sutelktų antigenų panelėse yra dvi ar daugiau skirtingos granulių populiacijos, padengtos afiniškai išgrynintomis ŽLA I ar II klasės baltymų molekulėmis, gautomis iš skirtingų individų ląstelių. Naudojamas kaip atrankinis tyrimas ŽLA antikūnų aptikimui. B) Fenotipo panelės, kurių kiekviena granulių populiacija turi ŽLA I ar II klasės baltymus. Baltymai gauti iš vieno individo ląstelių. C) Vieno antigeno granulės (SAB, angl. single– antigen beads). Kiekviena granulių populiacija padengta molekule, kuri atitinka ŽLA I ar II klasės klonuotą alelį. Tai leidžia atlikti specifinių antikūnų analizę.
Šios panelės gali būti naudingos stebėti ŽLA specifinių antikūnų rišimosi kitimą. Fenotipinių panelių tyrimuose reikalinga didelė patirtis interpretuojant rezultatus. SAB panelės yra jautriausios ir specifiškiausios, ypač naudingos norint tiksliai identifikuoti antikūnus įsijautrinusiems pacientams (33).
1.4. ŽLA antikūnų tyrimo metodų privalumai ir trūkumai
Šiame skyriuje apžvelgti CDC limfocitotoksinio, tėkmės citometrijos bei kietos fazės imunologinių tyrimų privalumai ir trūkumai.
1.4.1. Nuo komplemento priklausantis limfocitotoksinis tyrimas
Nenuginčijamas CDC limfocitotoksinio metodo privalumas nustatant reaktyvius antikūnus ir donoro kryžminės dermės tyrimuose yra galimybė numatyti ūmų transplantanto atmetimą dėl donorui specifinių ŽLA antikūnų (37). Tyrimo trūkumai – mažas jautrumas, reikalingas santykinai didelis gyvybingų limfocitų kiekis, klaidingai teigiami rezultatai, kuriuos įtakoja kiti antikūnai. CDC metodą sunku standartizuoti. Išsamiai specifiškumo analizei reikalingas didelis ŽLA tipuotų vietinių donorų skaičius (38) arba komercinės šaldytos ląstelės. Taip pat CDC tyrimu ne visada įmanoma atskirti antikūnų specifiškumą stipriai įsijautrinusiems pacientams.
Reaktyvių antikūnų procentas (PRA, angl. panel reactive antibodies) apskaičiuojamas pagal ląstelių teigiamų reakcijų kiekį (nepriklausomai nuo specifiškumo). Procentinio antikūnų reaktyvumo
20 naudojimas pacientų alosensitizacijos vertinimui gali būti klaidinantis, nes su skirtingų ląstelių panelėmis gaunamos skirtingos tyrimo vertės, naudojant tą patį serumą (39). Dėl šios priežasties ir tikslesnio kryžminės dermės vertinimo, procentinis antikūnų reaktyvumas turėtų būti pakeistas į apskaičiuotą antikūnų reaktyvumą, kitaip – virtualų antikūnų reaktyvumą (40).
1.4.2. Tėkmės citometrijos tyrimas
Nors tėkmės citometrija, kaip ir CDC, priklauso nuo reakcijų, kurias sukelia ne ŽLA antikūnai, tačiau šis metodas yra gerokai jautresnis. Tėkmės citometrijos tyrimu galima identifikuoti pacientus, kurie turi silpną DSA. Šiems pacientams yra padidėjusi antikūnų sukelto transplantanto atmetimo rizika (41).
Tėkmės citometrijos tyrimą sunku standartizuoti dėl citometrų, fluorochromų, antiglobulino reagentų įvairovės. B ląstelių kryžminės dermės tyrimas yra susijęs su dideliu foniniu antikūnų rišimusi, kuris gali būti slopinamas inkubuojant žymėtus limfocitus su pronaze (42). Deja, pronazė gali paveikti ŽLA ekspresiją ir lemti klaidingai teigiamą T ląstelių kryžminės dermės tyrimo rezultatą (43). Taigi vertinant tėkmės citometrijos kryžminės dermės tyrimo rezultatus būtina atsižvelgti į klinikinę riziką.
1.4.3. Kietos fazės imunologiniai tyrimai
ELISA technologija jautresnė už CDC (35), o Luminex granulių technologija jautresnė ir už CDC, ir už tėkmės citometriją (44). Luminex technologija suteikia galimybę aptikti net ir mažą ŽLA specifinių antikūnų kiekį. Anksčiau nebuvo galimybės identifikuoti antikūnų specifinių epitopų ir antikūnų prieš ŽLA–Cw, ŽLA–DQA, ŽLA–DPA ir ŽLA–DPB diagnostinėse rutininėse laboratorijose ir tirti šių antikūnų svarbą inkstų alotransplantanto atmetimui (45, 46).
SPI rezultatai yra pusiau kiekybiniai ir leidžia pagal optinį tankį (ELISA), vidutinį fluorescencijos kanalą (tėkmės citometrija) ar vidutinį fluorescencijos intensyvumą (Luminex) donorui specifinių antikūnų kiekį klasifikuoti į mažą, vidutinį ir didelį. Luminex fenotipinės ir SAB panelės yra skirtos atlikti didelį kiekį serijinių tyrimų per 4 valandas, todėl šie tyrimai naudingi norint diagnozuoti humoralinį atmetimą rutininiame pretransplantacijos ir potransplantacijos stebėjime. Taip pat šis tyrimas naudingas vertinant imunosupresijos efektyvumą (47, 48). Pagrindiniai SPI techniniai aspektai pateikti 1 lentelėje.
21 1 lentelė. Luminex ŽLA SAB metodo privalumai ir trūkumai (pagal 33)
Privalumai Trūkumai
Kokybinis: galima visų serume esančių antikūnų identifikacija;
Išsamus: atskiria antikūnus visiems įprastiems aleliams ŽLA–A, ŽLA–B, ŽLA–C, ŽLA–DRB1/3/4/5, ŽLA–DQA1, ŽLA–DQB1, ŽLA–DPA1, ŽLA–DPB1;
Pusiau kiekybinis: antikūnų kiekis apibrėžiamas lygiais (didelis, vidutinis, mažas);
Jautrus: aptinkami maži antikūnų kiekiai;
Greitas: galimas realaus laiko antikūnų stebėjimas DSA;
Nespecifinių ŽLA antikūnų
aptikimas;
Imunoglobulinų klasių ir izotopų aptikimas bei diferencijavimas.
Denatūruota ŽLA gali įtakoti teigiamus rezultatus;
Atsitiktinė aukšta foninė sąveika reikalauja tyrimo kartojimų;
Kintantis ŽLA baltymų tankis ant granulių. Blokuojantys faktoriai gali įtakoti klaidingai neigiamą ar klaidinančiai žemą antikūnų kiekį;
Nestandartizuoti reagentai.
Svarbu pažymėti, kad Luminex tyrimais galima gauti pusiau kiekybinius rezultatus, tačiau jie buvo kuriami ir licencijuojami kaip kokybiniai tyrimai (33).
1.4.4. Kietos fazės ŽLA antikūnų aptikimo tyrimų techniniai sunkumai
Kaip serologiniuose tyrimuose, taip ir SPI tyrimuose yra tam tikras kintamumas. Jis stebimas tarp skirtingų komercinių rinkinių, tų pačių rinkinių skirtingų serijų ir atskirų bandymų. Šių rinkinių vartotojai gali sumažinti kintamumą griežtai laikydamiesi tyrimo sąlygų ir procedūrų, o skysčių išpilstymui pasitelkdami ne rankinį darbą, o analizatorius (33).
Atkuriamumas yra pagrindinė sąlyga, norint kuo tiksliau interpretuoti ŽLA antikūnų aptikimo tyrimus. Specifinių ŽLA antikūnų epitopų interpretacija yra sudėtinga ir reikalaujanti personalo su patirtimi ir kompetencija. Tam, kad antikūnų aptikimas būtų patvirtintas teisingai, svarbu atsižvelgti į: a) kitus atliktus antikūnų tyrimų rezultatus, gautus iš to paties paciento kito ėminio; b) aloimunizuojančius veiksnius (pvz. kraujo perpylimą, nėštumą, ankstesnes transplantacijas); c) kryžminį reaktyvumą (49).
Granulių vidutinis fluorescencijos intensyvumas parodo antikūnų rišimąsi, priklausomai nuo bendro antigenų kiekio ant granulių (įsisotinimo laipsnį). Įsisotinimas ant kiekvienos granulės skiriasi (50). Taip pat skiestuose serumuose vidutinis fluorescencijos intensyvumas gali padidėti dėl IgM, o neskiestuose serumuose dėl C1 buvimo (51, 52). Tikslus ŽLA antikūnų kiekis reikalingas terapinei pretransplantacinei desensibilizacijai ir potransplantacinio ūmaus transplantanto atmetimo
22 protokolams. Galima manyti, kad granulės ryšys su teigiama kontroline granule gali būti naudingas nustatant svarbius pokyčius ar siekiant normalizuoti vidutinės fluorescencijos intensyvumo vertes (53, 54).
1.5. ŽLA antikūnų tyrimas prieš transplantaciją
Pagrindinis uždavinys atliekant ŽLA tyrimus yra nustatyti ŽLA antigenų nesutapimus. Neigiamas kryžminis suderinamumas tikėtinas, kai yra žinomas potencialaus donoro pilnas ŽLA tipas. Antigenų nesutapimo nustatymas yra esminis žingsnis, nes organo pasiūlos tikimybė mažėja su didėjančiu antigenų nesutapimu ir todėl pacientai miršta būdami laukiančiųjų sąraše. Priešingai, nenustatyti nesutampantys antigenai dėl nejautraus ar neteisingo tyrimo lemia prastesnį transplantanto išlikimą ir bereikalingą organo transportavimą.
SAB tyrimo įvedimas leido tiksliai nustatyti nesutampančius antigenus, ko nebuvo galima padaryti anksčiau, ypač stipriai įsijautrinusiems pacientams (36). Šiuo metu asmenys, turintys daug specifinių antigenų, aptiktų SAB tyrimu, bet neigiamais CDC tyrimo rezultatais, sudaro didelę dalį transplantacijos laukiančiųjų eilėje. Daugelis recipientų su teigiamu DSA tyrimo rezultatu, gautu tėkmės citometrijos ar Luminex technologija, turi ilgalaikį funkcionuojantį transplantuotą inkstą. Dėl skirtingo recipientų įsijautrinimo intensyvumo sunku nustatyti tinkamą rizikos ribą.
Donorui specifiniai antigenai, kurie išlieka po transplantacijos taikant desensibilizacijos terapiją, yra laikomi rizikos veiksniu transplantacinei glomerulopatijai ir vėlesniam transplantato praradimui (55). Siekiant suprasti prieš transplantaciją granulių tyrimu aptiktų donorui specifinių
antigenų poveikį reikia dokumentuoti tiek trumpalaikius, tiek ilgalaikius rezultatus. Be to, šie rezultatai gali būti paveikti desensibilizuojančių ar ardančių medžiagų poveikiu, kurios ne visada buvo duotos visiems recipientams. Taigi naudojant retrospektyvius duomenis atsakyti į šiuos klausimus dažnai būna sunku.
Šiuo metu yra duomenų, kurie nurodo didesnę riziką ūmaus transplantanto atmetimo, kai transplantacija yra atliekama pacientui, turinčiam antikūnų, specifinų donorų antigenams. Dauguma duomenų yra iš retrospektyvių tyrimų, atliktų su skirtingu imunosupresiniu režimu, be to nėra kontrolinių grupių, todėl sunku objektyviai vertinti riziką (33).
Laukiantiems mirusio donoro suderinamumo, įsijautrinusiems pacientams desensibilizacija yra geriausias sprendimas, kad transplantacija būtų atlikta laiku. Atliekant gyvo donoro organo transplantaciją po desensibilizacijos numatoma didelė išgyvenamumo tikimybė ŽLA įsijautrinusiems pacientams (56). Pacientams, kurie atrinkti pagal antikūnų titrus, desensibilizacija gali būti saugiai
23
Desensibilizacijos, nesuderinamumo programos, ŽLA suderinamumo derinimas žymiai sumažina transplantacijos laukimo laiką ir lemia gerą transplantanto ir paciento išgyvenamumą (58).
Transplantacijos studijų grupė gavo rezultatus, kad net jei donoras yra ŽLA identiškas giminaitis, nemažai ligonių, kuriems padidėjęs reaktingumas, turi mažesnį transplantato išgyvenamumą. Tai rodo imuninio atsako, kuris nesusijęs su ŽLA antigenais, vaidmenį transplantato atmetime. Buvo įrodyta, kad MICA antikūnų buvimas koreliuoja su inkstų transplantato išgyvenamumu (59, 60, 61). Taip pat yra pranešimų, įrodančių, kad antikūnai prieš angiotenzino II 1
tipo receptorių (63, 64) ir endotelio ląstelių antigenai yra susiję su inkstų transplantanto atmetimu (65).
1.6. ŽLA antikūnų tyrimas po transplantacijos
Standartinis recipiento transplantanto stebėjimas susideda iš kartojamų fiziologinių transplantanto funkcijos rodiklių vertinimo. Taip pat atliekama transplantanto biopsija, kai disfunkcijos neįmanoma paaiškinti fiziologiniais tyrimais. Šiuo metu antikūnų sukelto inkstų transplantanto atmetimo diagnozei nustatyti pacientui turėtų būti atlikti du tyrimai: serumo tyrimas DSA nustatyti ir biopsija – alotransplantantui antikūnų sukeltiems pokyčiams nustatyti.
Ūminio antikūnų sukelto atmetimo kriterijai yra cirkuliuojantys DSA (donoro ŽLA ar kiti endotelio antigenai), o taip pat histologinis tyrimas su CD4+ raiška ir morfologiškai įrodyti ūminiai audinių pažeidimai (t. y. ūminė kanalėlių nekrozė, glomerulų ir kanalėlių kapiliarų uždegimas ar arterinis−transmuralinis uždegimas/fibroziniai pakitimai) (66). Antikūnų sukelti transplantuoto inksto
pažeidimai pavaizduoti 3 paveiksle. Esant lėtiniam antikūnų sukeltam atmetimui histologiniai bruožai yra transplantanto glomerulopatija, daugiasluoksnė kanalėlių kapiliarų pamatinė membrana ir transplantanto arteriopatija. CD4+ ir DSA kriterijai yra tokie patys kaip ir ūminio antikūnų sukelto atmetimo (67). Priešingai nei ūmus antikūnų sukeltas atmetimas, lėtinis atmetimas turi ilgą
subklinikinę fazę, kuri skaičiuojama nuo mėnesių iki metų. Yra vis daugiau įrodymų, kad antikūnų sukeltame transplantanto atmetime, ypač vėlesnėje ar lėtinėje fazėje, CD4+ yra neigiamas, todėl reikalingos kitos diagnostinės priemonės (68, 69).
24 3 pav. Antikūnų sukelti transplantuoto inksto pažeidimai (modifikuota pagal 70)
(A, B) Ūmūs antikūnų sukelti pažeidimai apibūdinami glomerulų mikrotrombais, glomerulų kapiliarų endotelio ląstelių aktyvacija (A: hematoksilinas/eozinas, 400×; B: elektroninė mikroskopija, 7500×).
(C, D) Lėtinis aktyvus antikūnų sukeltas atmetimas, rodantis glomerulų endotelio ląstelių pabrinkimą ir ankstyvą kanalėlių kapiliarų pamatinės membranos suplokštėjimą (C: PAS reakcija, 400×; D: elektroninė
mikroskopija, 4200×).
(E, F) Lėtinis antikūnų sukeltas atmetimas, apibūdinamas glomerulų pamatinės membranos padvigubėjimu (E: Jones 600×; F: elektroninė mikroskopija, 7500×).
Vėlaus transplantanto atmetimo priežastys dažniausiai identifikuojamos ir siejamos su imunine sistema: a) atsinaujinusi ar de novo autoimuninė liga; b) antikūnų sukeltas atmetimas su lėtiniu pažeidimu; c) intersticinė fibrozė ir kanalėlių atrofija su ar be ląsteliniu atmetimu ar poliomoviruso nefropatija (71). Praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos tikimybė aptikti vėlų transplantato funkcijos sutrikimą atliekant kraujo serume ŽLA antikūnų tyrimą (DSA) yra didesnė nei atliekant kreatinino koncentracijos serume tyrimus ar įvertinant naujai išsyvysčiusią proteinurija. Tai yra ypač aktualu, jei pacientui nebuvo taikyta imunosupresija (72).
25
1.7. Imunologinis recipientų ir donorų ištyrimas
Recipientams ir donorams bent vieną kartą ŽLA tipą rekomenduojama nustatyti molekuliniu būdu, siekiant išvengti klaidų klasifikuojant ŽLA antigenus. Siekiant išvengti logistikos klaidų geriausia ŽLA tipą nustatyti 2 kartus iš skirtingų mėginių, paimtų skirtingomis sąlygomis. Ruošiant transplantacijai sensitizuotą recipientą, rekomenduojama atlikti papildomą serologinį potencialaus donoro ląstelių ŽLA tipavimą, kad būtų įvertinta ląstelių–taikinių ŽLA antigenų ekspresija. Labai sensitizuotiems recipientams, turintiems aleliams specifinius antikūnus, siūloma svarstyti galimybę atlikti didelės skiriamosios gebos tipavimą molekuliniu būdu tiek recipientams, tiek ir donorams (73).
Recipientą ir donorą siūloma derinti pagal ŽLA−A, ŽLA−B ir ŽLA−DR antigenus. Priimant sprendimą dėl potencialaus transplantato tinkamumo, rekomenduojama atsižvelgti ne tik į ŽLA tipą, bet ir į kitus veiksnius, turinčius įtakos recipiento ir transplantato išgyvenamumui. Pirmenybę rekomenduojama teikti ŽLA identiškai donoro ir recipiento porai. Siūloma daugiau svarbos teikti ŽLA−DR sutapimui, negu ŽLA−A ar ŽLA−B. Daugiau dėmesio skiriama jaunesnių recipientų ŽLA suderinamumui, siekiant išvengti didelės ŽLA sensitizacijos ir nepabloginti pakartotinos transplantacijos rezultatų. Jei recipientas turi antikūnų prieš ŽLA−DQ, ŽLA−DP ir ŽLA−C antigenus, tuomet donorui atliekamas šių antigenų tipavimas. Rutiniškai tirti MICA ir kitų ne ŽLA antigenų recipientams ir donorams būtinybės nėra (73, 74).
Siekiant padidinti sėkmingos transplantacijos tikimybę ŽLA įsijautrinusiems recipientams, rekomenduojama sudaryti programas donorų parinkimui, prieš kuriuos recipientai neturi antikūnų. Transplantuojant iš mirusio donoro, šis tikslas gali būti pasiektas, sudarius „priimtino nesutapimo“ programas. Transplantuojant iš gyvo donoro, šis tikslas gali būti pasiektas, vykdant „porų keitimosi“ programą. Recipientui, turinčiam donorui specifinius antikūnus, rekomenduojama transplantaciją atlikti tik tuomet, jei anksčiau minėtos priemonės negali būti įgyvendintos, ir tik po sėkmingo specialaus paruošimo (73).
ŽLA sensitizuotiems recipientams rekomenduojama atlikti CDC kryžminės dermės tyrimą, siekiant išvengti labai ūmios atmetimo reakcijos. Kryžminės dermės tyrimo galima neatlikti recipientams, kuriems nerasta anti−ŽLA antikūnų visų rutininių tyrimų metu (tiriant 4 kartus per metus), išskyrus atvejus, jei po paskutinio tyrimo buvo sensitizuojančių įvykių. CDC kryžminės dermės tyrimą siūloma vertinti kaip tikrai teigiamą tik tuomet, kai yra nustatyti DSA.
Siekiant pagerinti transplantacijos išeitis recipientams, kuriems numatoma atlikti gyvo ABO netapataus donoro inksto transplantaciją, rekomenduojama prieš transplantaciją slopinti antikūnų gamybą ir kartu šalinti ABO antikūnus. Rekomenduojama ABO netapataus inksto transplantaciją atlikti tik tuo atveju, jeigu ABO antikūnų titras po skirto gydymo yra mažesnis negu 1:8. Jei yra galimybė, siūloma apsvarstyti porinius mainus (73).
26
1.8. Kandidatų inkstų transplantacijai ištyrimas
Europoje ir JAV apie 1 proc. pacientų, sergančių lėtine inkstų ligos stadija, yra infekuoti žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) (75). Nuo 1996 metų, kai labai aktyvus antiretrovirusinis gydymas tapo plačiai prieinamas, ŽIV infekcijos prognozė ženkliai pagerėjo. Šiuo metu ŽIV užsikrėtusiems kandidatams transplantacija yra atliekama, jei infekcija gerai kontroliuojama, t. y. per paskutinius 3 mėnesius CD4 + T ląstelių skaičius didesnis nei 200/µl ir yra nekintantis bei neaptikta ŽIV RNR, o per paskutinius 6 mėnesius nebuvo oportunistinių infekcijų epizodų (76).
Pacientams, kuriems diagnozuota hiperparatirozė, prieš transplantaciją atlikta paratiroidektomija sumažino mirties santykinę riziką po transplantacijos 3 kartus. Paratiroidektomija po transplantacijos yra susijusi su blogėjančia inksto funkcija. Rekomenduojama, kad pacientai, esantys laukiančiųjų inkstų transplantacijai sąraše, būtų gydomi laikantis esamų lėtinės inkstų ligos − mineralų ir kaulų sutrikimų gydymo gairių, įtraukiant ir paratiroidektomijos atlikimą, jei tam yra indikacijų (77).
Patvirtintas tipinis, su Escherichia coli produkuojamu Šiga toksinu susijęs hemolizinis ureminis sindromas (HUS), nėra kontraindikacija inkstų transplantacijai nei iš gyvo, nei iš mirusio donoro. Siūloma transplantaciją apsvarstyti kaip priimtiną gydymo galimybę šiais atvejais: a) pacientams su atipiniu HUS ir patvirtinta membranos kofaktoriaus baltymo mutacija; b) pacientams, kuriems nustatomi autoantikūnai prieš komplemento faktorių H. Pacientui, sergančiam atipiniu HUS, kiekvienu konkrečiu atveju rekomenduojama įvertinti galimybę atlikti transplantaciją iš gyvo, genetiškai nesusijusio donoro. Ši galimybė turėtų būti svarstoma tik po deramos recipiento ir donoro konsultacijos, įvertinant ligos atsinaujinimo riziką transplantate.
Moterims, kurios suvartoja >40 g per dieną alkoholio ir vyrams, kurie suvartoja >60 g per dieną alkoholio, rekomenduojama visiškai nutraukti arba sumažinti alkoholio vartojimą žemiau nurodytų ribų. Šiuos pacientus galima įtraukti į laukiančiųjų inkstų transplantacijos sąrašą, tačiau jie turėtų būti kruopščiai prižiūrimi, ar sumažino alkoholio vartojimą. Pacientų, turinčių priklausomybę nuo alkoholio ar narkotikų, rekomenduojama neįtraukti į laukiančiųjų inkstų transplantacijos sąrašą. Taip pat kandidatams inkstų transplantacijai rekomenduojama mesti rūkyti.
Kriterijai, kuriais remiantis parenkami gyvi inkstų donorai siekiant optimaliausio naudos– rizikos santykio pateikiami 4 paveiksle.
27 4 pav. Gyvų inkstų donorų kriterijai, kuriais remiamasi siekiant optimaliausio naudos–rizikos
santykio
Donorus, sergančius arterine hipertenzija, kuriems yra įrodytas organų – taikinių pažeidimas (kairiojo skilvelio hipertrofija, hipertenzinė retinopatija ir mikroalbuminurija), rekomenduojama vertinti kaip netinkamus gyvai donorystei. Kūno masės indeksą >35 kg/m2 siūloma vertinti kaip kontraindikaciją donorystei, o cukrinį diabetą vertinti kaip kontraindikaciją gyvai donorystei, išskyrus išimtinius atvejus.
Akivaizdi proteinurija vertinama kaip kontraindikacija gyvai donorystei (>300 mg/24 h arba vienkartiniame šlapimo tyrime albumino/kreatinino santykis >30 mg/mmol). Potencialūs gyvi donorai, kuriems nuolat randama (tiriant nustatoma daugiau kaip 3 kartus per 3 mėnesius) proteinurija <300 mg/24 h, toliau tiriami, nustatant albuminurijos dydį ir taip įvertinant jų riziką esant gyvai donorystei. Išliekančią (tiriant nustatoma daugiau kaip 3 kartus per 3 mėnesius) albuminuriją (30 – 300 mg/24 h) siūloma vertinti kaip didelės rizikos veiksnį donorystei. Išliekančią glomerulinės kilmės hematuriją vertinti kaip kontraindikaciją gyvai donorystei, nes tai gali rodyti donoro inkstų ligą (73).
1.9. Donorų ir recipientų statistiniai duomenys
Organų transplantacija atliekama tada, kai kiti gydymo metodai yra nebeefektyvūs. Lietuvoje įteisintos dvi organų donorystės rūšys – donorystė po mirties (donorystė po smegenų mirties, neplakančios širdies donorystė) ir gyvoji donorystė (inkstą dovanoja sutuoktinis arba artimas giminaitis, arba porinė donorystė). Porinė donorystė ir neplakančios širdies donorystė teisiškai reglamentuoti, tačiau kol kas dar netaikomi.
Hipertenzija
Proteinurija
Gliukozės
tolerancijos
sutrikimas
Donoro rizikos
veiksniai
Nutukimas
Hematurija
28 Smegenų mirtis – tai tokia būklė, kai kraujotaka smegenyse nutrūksta ir jos atkurti nebepavyksta. Kai kurie organai, prijungti prie medicininės aparatūros, dar gali funkcionuoti. Nustačius smegenų mirtį konstatuojama žmogaus mirtis. Tokiu atveju įmanoma organų ir audinių donorystė.
Sustojus kvėpavimui ir nutrūkus kraujotakai, sustoja žmogaus širdis. Tokiu atveju konstatavus mirties faktą įmanoma neplakančios širdies donorystė. Tuomet atliekamos tam tikros medicininės procedūros, kurių metu donoriniai organai yra aprūpinami krauju su maistinėmis medžiagomis ir deguonimi, tokiu būdu tam tikrą laiką jie yra išlaikomi gyvybingi. Gyvosios donorystės atveju transplantacijai tinkami mirusiojo vidaus organai, o širdis transplantacijai nėra tinkama.
Gyvoji organų donorystė – kai recipientui persodinamas gyvo žmogaus inkstas arba gali būti persodinama dalis kepenų (Lietuvoje dalies kepenų transplantacijos neatliekamos, recipientai vaikai tokioms transplantacijoms yra siunčiami į užsienio klinikas). Recipientui inkstą dovanoja artimas giminaitis arba sutuoktinis.
Lietuvos Respublikos žmogaus audinių, ląstelių ir organų donorystės ir transplantacijos įstatymas įteisina ir porinę donorystę. Tai dviejų porų pasikeitimas donoriniais organais, kai vienos tarpusavyje nesuderinamos poros donoro organas tinka kitos tarpusavyje nesuderinamos poros recipientui, o antrosios poros donoro organas tinka pirmosios poros recipientui (78).
Nuo 2008 iki 2015 metų pabaigos potencialių donorų skaičius Lietuvoje išaugo 97 proc. Efektyvių donorų skaičius daugiau nei dvigubai mažesnis lyginant su potencialiais. Potencialių ir efektyvių donorų skaičiaus Lietuvoje pokyčiai nuo 2004 iki 2015 metų pabaigos atvaizduoti 5 paveiksle.
5 pav. Potencialių ir efektyvių donorų skaičiaus Lietuvoje pokytis nuo 2004 iki 2015 metų pabaigos
20 40 60 80 100 120 D o n o rų skai či u s Metai
Potencialių ir efektyvių donorų skaičius Lietuvoje
Efektyvių donorų skaičius Potencialių donorų skaičius
29 Remiantis Lietuvos Nacionalinio Transplantacijos Biuro duomenimis 2016 metų kovo mėnesį laukiančiųjų transplantacijos sąraše yra 170 pacientų laukiančių inkstų, 125 ragenos, 60 kepenų, 35 širdies, 9 plaučių, 6 kasos ir inksto komplekso bei 5 širdies ir plaučių komplekso transplantacijos. Taigi inkstų transplantanto poreikis yra didžiausias. Dažniausiai inkstas transplantuojamas iš kadaverinio donoro. Gyvosios donorystės ir donorystės po mirties inkstų transplantacijos palyginimas pateiktas 6 paveiksle.
6 pav. Mirusių ir gyvų inkstų donorų skaičiaus kitimas Lietuvoje nuo 2004 iki 2015 metų pabaigos Kadaverinio donoro inksto transplantacijos atliekamos žymiai dažniau nei gyvo donoro. 2013 metų pabaigoje Europos Sąjungoje (ES) buvo 63 tūkstančiai recipientų, iš kurių net 50 tūkstančių laukė inkstų transplantacijos. 4100 recipientų mirė nesulaukę transplantacijos. Siekiant, kad kuo daugiau recipientų turėtų galimybę gauti donorinį organą, yra skatinama gyvoji donorystė. Nuo 2004 iki 2013 metų ES gyvosios donorystės atvejų padaugėjo 86 proc.
Visame pasaulyje 2012 metais buvo atlikta beveik 115 tūkstančių transplantacijų, iš kurių 78 tūkstančiai – inkstų. Tuo metu Europos Sąjungoje atlikta beveik 31 tūkstantis transplantacijų, iš kurių 19 tūkstančių – inkstų. Europos Sąjungoje daugiausiai inkstų transplantacijų atliekama Jungtinėje Karalystėje, Vokietijoje, Ispanijoje, Prancūzijoje bei Turkijoje (60).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 D o n o rų skai či u s Metai
Mirusių ir gyvų inkstų donorų transplantacijos
Mirusio donoro Gyvo donoro
30
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tiriamoji grupė
Tyrimui buvo atrinkti inkstų recipientai (laukiantys transplantacijos ir transplantuoti), tirti LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje nuo 2011 metų rugsėjo mėnesio 29 dienos iki 2016 metų vasario mėnesio 24 dienos.
Visiems tiriamiesiems buvo vertinti demografiniai duomenys (amžius, lytis, kraujo grupė) ir atlikti antikūnų prieš ŽLA sistemos I ir/ar II klasės antigenus atrankiniai tyrimai. Pacientams, kurių atrankinių tyrimų rezultatai buvo teigiami, papildomai buvo atlikti antikūnų prieš ŽLA sistemos I ir/ar II klasės antigenus identifikacijos tyrimai (7 pav.).
7 pav. Antikūnų prieš ŽLA antigenus identifikacinių tyrimų schema
Paaiškinimas: 1+ ar II+ − teigiami antikūnų prieš ŽLA I klasės ar II klasės antigenus rezultatai, 1- ar II- − neigiami antikūnų prieš ŽLA I klasės ar II klasės antigenus rezultatai
ŽLA sistemos II klasei priklauso DR, DP ir DQ antigenai, tačiau vertinant recipientų, laukiančių inkstų transplantacijos, įsijautrinimą buvo vertinti tik antikūnai prieš DR antigenus, kurių
31 reikšmė inkstų transplantacijoje yra visuotinai pripažinta. Antikūnų prieš DP ir DQ antigenus svarba inkstų transplantacijoje yra abejotina ir parenkant recipiento–donoro poras šie antikūnai nėra vertinami.
2.2. Atrankinis tyrimas antikūnams prieš žmogaus I ir II klasės leukocitų
antigenus nustatyti
Ši tyrimo metodika aprašo antikūnų prieš I ir II klasės ŽLA nustatymo tvarką imunofermentiniu (granulių) metodu. Naudojamas reagentų rinkinys Gama LIFECODES LifeScreen Deluxe (LMX) (IMMUCOR, JAV).
2.2.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas
Kraujas tyrimui imtas standartinėmis sąlygomis periferinės venos punktacijos būdu į vakuuminus mėgintuvėlius be priedų (Vacutainer ®; BD, JAV).
Serumas atskirtas leidus kraujui pilnai sukrešėti ir centrifugavus jį standartinėmis sąlygomis 1800× g 15 min. Atskirtas serumas užšaldytas ir laikytas −20ºC temperatūroje iki tyrimo atlikimo.
2.2.2. Metodo esmė
LIFECODES LifeScreen Deluxe granulės skirtos IgG antikūnų prieš ŽLA I ir II klasės antigenus nustatymui. LIFECODES LifeScreen Deluxe granulės yra konjuguotos su išgrynintais I klasės ŽLA ir II klasės ŽLA glikoproteinais.
32 Atitinkamas granulių kiekis buvo inkubuojamas su tiriamu serumu. Granulės nuplautos ir taip pašalinti neprisijungę antikūnai. Buvo pridedama žmogaus IgG antikūnų, žymėtų fikoeritrinu. Schematinis metodo vaizdas pavaizduotas 8 paveiksle (79). Po pakartotinos inkubacijos mėginiai buvo skiedžiami ir atlikta analizė Luminex analizatoriumi. Kiekvienos granulės signalo intensyvumas palygintas su neigiamos kontrolės signalo intensyvumu siekiant nustatyti ar granulių, susietų su aloantikūnais, signalo intensyvumas teigiamas ar neigiamas.
2.2.3. Reagentai, tyrimų įrenginiai, matavimo ir kitos priemonės
Reagentai:
„LIFECODES LifeScreen Deluxe“ rinkinys (96 testams), kurio sudėtyje yra:
LifeScreen Deluxe Beads (480 μl) – granulės konjuguotos I ir II klasės ŽLA glikoproteinais. Sudėtyje yra keturios kontrolės;
Conjugate Concentrate (550 μl) – konjugato koncentratas (10×) su fikoeritrinu konjuguotu ožkos anti−žmogaus IgG;
Wash Buffer (150 ml) – buferinis plovimo tirpalas; Positive Control Serum (80 μl) – teigiama kontrolė; Negative Control Serum (80 μl) – neigiama kontrolė;
Papildomai naudoti reagentai:
Luminex Sheath Fluid – Luminex skystis 1×;
Luminex Calibration Kits – Luminex kalibravimo rinkinys; Izopropanolis 70 proc.
Tyrimų įrenginiai:
Analizatorius – Luminex® 200TM, LuminexCorporation; Mikro centrifuga – Herolab MicroGen 16;
Rotacinė purtyklė plokštelėms – BIOSAN; Sūkurinė maišyklė – BIOSAN/Bio Vortex V1;
Vakuuminis aspiratorius – Multiscreen vacuum manifold.
Matavimo ir kitos priemonės:
Automatiniai dozatoriai 2−20 µl, 10−100 µl;
33 Spiritinis termometras −30−50°C, padalos vertė 1°C.
Mikrocentrifuginiai mėgintuvėliai 1,5−2,0 ml; Laikmatis;
Vienkartinės pirštinės.
2.2.4. Tyrimo metodikos aprašymas
2.2.4.1. Mėginio ruošimas ir laikymas
Kraujas buvo centrifuguojamas 15 min. 1800× g. Pastero pipete serumas atskirtas nuo eritrocitų. Serumas tinkamas tyrimui laikomas −20°C ir žemesnėje temperatūroje. Tyrimui nebuvo naudojami mikrobiologiškai užteršti, hemolizuoti, lipeminiai ir termiškai paveikti serumai. Preparatų Remicade (Centocor), Rituxin (Genentech), Zenapax (Roche), Campath (Genzyme) ir Gammaguard (Baxter) vartojimas tyrimo rezultatų neįtakoja. Tyrimo rezultatai gali būti klaidingai teigiami, jeigu vartojamas timoglobulinas.
1. Reagentai buvo šildomi iki kambario temperatūros 20−24°C. apsaugojant nuo šviesos.
2. Pagal darbo protokolą buvo paruoštas reikiamas šulinėlių skaičius. Kiekvienoje tyrimų serijoje buvo 1 neigiama ir 1 teigiama kontrolės.
3. Tyrimui nenaudojami šulinėliai buvo uždengti lipniu lapeliu.
4. Į tiriamuosius šulinėlius buvo įpilta po 100−300 μl distiliuoto vandens. Inkubuota 2−5 min. kambario temperatūroje.
5. Atsargiai aspiruota naudojant vakuuminį aspiratorių.
6. Paruoštos granulės (LifeScreen Deluxe Beads): buteliukas trumpai (~30 s) centrifuguotas 600−800× g. Kruopščiai ~1 min. sumaišytas sūkurine maišykle.
7. Įpilta po 40 μl buferinio plovimo tirpalo (Wash Buffer) ir į atitinkamus šulinėlius po 12,5 µl serumo, teigiamos, neigiamos kontrolės.
8. Įpilama po 5 µl granulių. Kas 2 min. granulės sumaišomos sūkurine maišykle.
9. Plokštelė buvo uždengta lipniu lapeliu, apsaugota nuo šviesos. Buvo inkubuojama 30 min. kambario temperatūroje (20−24°C) ant rotacinės purtyklės (200 aps./min.). Purtyklės 1 pozicija atitinka ~150 aps./min., 2 pozicija ~300 aps./min.
10. Įpilta po 250 µl buferinio plovimo tirpalo. Aspiruota naudojant vakuuminį aspiratorių. Kartojama du kartus. Plovimas atliktas iš viso 3 kartus.
34 11. Įpilta po 50 μl praskiesto konjuguojančio tirpalo. Apsaugojome nuo šviesos (uždengėme dangteliu). Inkubavome 30 min. kambario temperatūroje (20−24°C) ant rotacinės purtyklės (200 aps./min.).
12. Įpylėme po 150 µl buferinio plovimo tirpalo ir sumaišėme.
13. Analizė buvo atlikta per 3 h, vadovaujantis Luminex vartotojo vadovo rekomendacijomis.
2.2.4.2. Reagentų, darbinių tirpalų ruošimas ir laikymo sąlygos
Konjuguojantis tirpalas buvo ruošiamas prieš pat naudojimą. Paimta 1 dalis koncentruoto (10×) konjugato koncentrato ir 9 dalys buferinio plovimo tirpalo. Sumaišėme. Saugojome nuo šviesos. Laikėme 2−8°C temperatūroje tamsoje iki 3 h.
2.2.4.3. Kalibracija
Kalibracija atliekama 1 kartą per 2 savaites, pasikeitus reagentų serijos numeriui ir kai delta kalibracinė temperatūra viršija +/−3°C. Kalibracijai naudotas Luminex kalibravimo rinkinys – Luminex Calibration Kits.
Kalibracinės granulės ir kontrolės sumaišėme sūkurine maišykle. Į CoStar plokštelės šulinėlo A1 poziciją buvo įlašinti 5 lašai kalibratoriaus 1, į B1 – 5 lašai kalibratoriaus 2, į C1 – 5 lašai kontrolės 1, į D1 – 5 lašai kontrolės 2. Plokštelė uždėta ant plokštelės laikiklio į nurodytą padėtį. Ekrane pasirinkome skirtuką “Home” atidarėme langą “New CAL targ.” Kalibracinio rinkinio kontrolių ir kalibratorių serijos duomenų reikšmes tiksliai suvedėme į atitinkamus langelius. Patvirtinome “OK”. Paspaudėme “Cal1”. Vykdėme kalibraciją. Atlikome plovimą su Luminex skysčiu iš rezervuaro. Paspaudėme “Cal2”. Vykdėme kalibraciją. Atlikome plovimą su Luminex skysčiu iš rezervuaro. Paspaudėme “CON1”. Vykdėme kontrolę. Atlikome plovimą su Luminex skysčiu iš rezervuaro. Paspaudėme “CON2”. Vykdėme kontrolę. Atlikome plovimą su Luminex skysčiu iš rezervuaro. Jei kalibracijos ar kontrolės reikšmės neatitiko parametrų – matėme pranešimą “Diagnostic” lange. Tokiu atveju kalibraciją kartojome. Po kalibracijos plovimą su Luminex skysčiu atliekome 3 kartus.
Įvertinome kalibracijos rezultatus, duomenis atspausdinome ir įsegėme į segtuvą „In vitro diagnostikos tyrimų įrangos kalibravimo duomenų registracijos žurnalas (Luminex)“.
35 2.2.4.4. Tyrimo kokybės kontrolė
Kiekvienai mėginių serijai buvo naudojama 1 teigiama ir 1 neigiama kontrolė, esanti rinkinio sudėtyje. Kontrolių paruošimą žr. 2.1.7.1. Teigiamas kontrolinis serumas reaguoja su ŽLA I klasės (PROBE I – 01) ir II klasės (PROBE II – 01) konjuguotomis granulėmis, kurių minimalus vidutinis fluorescencijos intensyvumas apie 10 000. Neigiamas kontrolinis serumas turi būti neigiamas su ŽLA I ir II klasės antikūnais. Jei kontrolės neatitinka šių kriterijų – tyrimas turi būti kartojamas.
Granulių mišinyje yra trys neigiamos kontrolės granulės (CON) ir viena teigiamos kontrolės granulė (Probe 77). CON granulių matavimas yra tyrimo pagrindas ir yra naudojamas normalizuoti ŽLA rutuliukų signalą. Šių granulių vidutinis fluorescencijos intensyvumas (MFI, angl. mean flourescence intensity) turi būti žemas.
Priimtinos neigiamos kontrolės reikšmės nurodytos rinkinio Lot specifiniuose registravimo lapuose. Rezultatai gauti už leistinų intervalo ribų turi būti peržiūrimi.
Teigiamos kontrolės granulė Probe 77 yra konjuguota su žmogaus IgG ir rodo, kad mėginyje konjuguojantis tirpalas įpiltas gerai. Kontrolės Probe 77 fluorescencijos intensyvumas turi būti ≥10 000 MFI. Reikšmė mažesnė nei 10 000 MFI gali būti dėl nepakankamo plovimo ir neįvykusios konjugacijos. Pacientų mėginiai turi plataus diapazono reaktyvumą su teigiamos kontrolės granulėmis (Probe 77), tačiau turi rodyti > 3 500 MFI signalą. Jei įpiltas per mažas kiekis serumo, Probe 77 signalas bus stiprus, o likusiųjų granulių vidurkis bus maždaug 50 MFI arba mažesnis. Tokių mėginių paruošimą reikia kartoti.
2.2.5. Rezultatų įvertinimas
Vertinant ar mėginyje yra specifiniai I ar II klasės antikūnai prieš ŽLA, pirma įvertinome atskiras ŽLA granules, siekiant nustatyti, ar jos yra teigiamos ar neigiamos IgG antikūnams. Nustatant ar ŽLA granulės yra teigiamos, granulės MFI padalinome iš kiekvienos neigiamos kontrolinės granulės MFI (CON1, CON2, CON3). Iš šių dalmenų atėmėme atitinkamos granulės (CON1, CON2, CON3) fluorescencijos fono koregavimo koeficientą (BAF). BAF yra nustatytas kiekvienos granulės/CON kombinacijos MFI santykis, skirtas foniniams trikdžiams, atsirandantiems dėl granulių pakitimų, koreguoti. BAF reikšmės pateikiamos rinkiniui specifiniuose duomenų registravimo lapuose. Pavyzdys:
Atskiros granulės MFI − (BAF) = Pakoreguotas santykis 1 Neigiama kontrolinė granulė 1 (CON1) MFI
36 Atskiros granulės MFI − (BAF) = Pakoreguotas santykis 2
Neigiama kontrolinė granulė 1 (CON2) MFI
Atskiros granulės MFI − (BAF) = Pakoreguotas santykis 3 Neigiama kontrolinė granulė 1 (CON3) MFI
PROBE I−01 ir PROBE II−01 viena teigiama bet kurio iš šių skaičiavimų reikšmė rodo teigiamą granulės reakciją.
Kitų granulių (PROBE I−02, 03, 04, 05, 06, 07 ir PROBE II−02, 03, 04, 05) dvi teigiamos bet kurio iš šių skaičiavimų reikšmės rodo teigiamą granulės reakciją.
Neigiamos visų trijų skaičiavimų reikšmės rodo neigiamą reakciją.
Tiriamo mėginio vertinimas:
Mėginį laikėme teigiamu I klasės ŽLA specifiniams antikūnams, jei bent viena iš septynių I klasės ŽLA granulių buvo teigiama.
Mėginį laikėme teigiamu II klasės ŽLA specifiniams antikūnams, jei bent viena iš penkių II klasės ŽLA granulių buvo teigiama.
Mėginį laikėme neigiamu ŽLA specifiniams IgG antikūnams, jei visos ŽLA granulės nustatytos kaip neigiamos.
2.3. Antikūnų prieš žmogaus I ir II klasės leukocitų antigenus identifikavimas
Ši tyrimo metodika aprašo antikūnų prieš I ir II klasės žmogaus leukocitų antigenus (ŽLA) identifikavimo tvarką imuninės analizės su granulėmis metodu. Naudojamas reagentų rinkinys LIFECODES LSA Class I; LIFECODES LSA Class II (IMMUCOR, JAV).
2.3.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas
