ACETILSALICILO RŪGŠTIES, RAMIPRILIO IR INDAPAMIDO MIŠINIO TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ IR

(1)

DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio tyrimas taikant efektyviosios skysčių ir plonasluoksnės chromatografijos metodus“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Augustė Getautytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Augustė Getautytė

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Augusta Ževžikovienė

(2)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

Liudas Ivanauskas

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

AUGUSTĖ GETAUTYTĖ

ACETILSALICILO RŪGŠTIES, RAMIPRILIO IR INDAPAMIDO MIŠINIO TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ IR

PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Augusta Ževžikovienė

KAUNAS, 2020

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr., Ramunė Morkūnienė Data:

ACETILSALICILO RŪGŠTIES, RAMIPRILIO IR INDAPAMIDO MIŠINIO TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ IR PLONASLUOKSNĖS

CHROMATOGRAFIJOS METODUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Augusta Ževžikovienė Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Augustė Getautytė Data Data

KAUNAS, 2020

(5)

TURINYS

SANTRAUKA ... 7

SUMMARY ... 8

SANTRUMPOS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido suvartojimas ... 12

1.1.1. Tiriamųjų medžiagų suvartojimas Lietuvoje ... 12

1.1.2. Tiriamųjų medžiagų vartojimo paplitimas Baltijos šalyse ... 13

1.2. Apsinuodijimų statistika ... 14

1.3. Tiriamųjų medžiagų apžvalga ... 15

1.3.1. Acetilsalicilo rūgštis ... 15

1.3.2. Ramiprilis ... 15

1.3.3. Indapamidas ... 16

1.4. Toksiškumas ir apsinuodijimo reiškiniai ... 17

1.4.1. Acetilsalicilo rūgštis ... 17

1.4.2. Ramiprilis ... 17

1.4.3. Indapamidas ... 18

1.5. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 18

1.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido nustatymui... 19

1.7. Plonasluoksnė chromatografija... 20

1.8. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido nustatymui ... 21

2. TYRIMO METODIKA ... 23

2.1. Tyrimo objektas ... 23

2.2. Kokybinis ir kiekinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 23

(6)

2.3. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 25

2.4. Duomenų apdorojimas ... 27

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ... 28

3.2.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos specifiškumas ... 30

3.2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos rezultatų glaudumas ... 32

3.2.3. Tiesiškumas ... 33

3.2.4. Aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos ... 35

3.3. Vaistinių preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 36

3.3.1. Kokybinė vaistinių preparatų analizė ... 36

3.3.2. Kiekinė vaistinių preparatų analizė ... 37

3.4. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos pritaikymas ... 37

3.5. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos validacija ... 38

3.5.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos specifiškumas ... 39

3.5.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos rezultatų glaudumas ... 40

3.6. Kokybinė vaistinių preparatų mišinio analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 41

4. IŠVADOS ... 42

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 44

7. PRIEDAI ... 48

(7)

SANTRAUKA

A. Getautytės magistro baigiamasis darbas „Acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio tyrimas taikant efektyviosios skysčių ir plonasluoksnės chromatografijos metodus“. Mokslinė vadovė doc. dr. A. Ževžikovienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020

Raktiniai žodžiai: acetilsalicilo rūgštis, ramiprilis, indapamidas, efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, kokybinis nustatytas, kiekinis nustatymas.

Darbo tikslas: pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodikas, tinkančias acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui.

Darbo uždaviniai: pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui; Validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką bei atlikti kokybinį ir kiekinį acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido įvertinimą vaistuose; Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio, indapamido mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui; Validuoti plonasluoksnės chromatografijos metodiką ir atlikti kokybinį acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido įvertinimą vaistuose.

Tyrimo objektas: iš acetilsalicilo rūgšties („Aspirin“), ramiprilio („Ramicor“) ir indapamido („Indamax“) tablečių išgautas vaistinių medžiagų mišinys.

Metodai: efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), plonasluoksnė chromatografija (PC).

Rezultatai ir išvados: Pritaikyta ESC metodika acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui. Geriausias komponentų atskyrimas pasiekiamas naudojant ACE C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) kolonėlę, vykdant gradientinį 0,1 proc. trifluoracto rūgšties ir acetonitrilo eliuavimą; medžiagos aptinkamos naudojant fotodiodų matricos detektorių prie 220 nm bangos ilgio. Validavus efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką nustatyta, kad ji yra tinkama acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido kokybiniam bei kiekiniam įvertinimui vaistuose. Medžiagos vaistiniuose preparatuose identifikuotos pagal vidutinius sulaikymo ir UV spektrus. Kiekinio įvertinimo metu gautas medžiagų kiekis atitinka deklaruojamą ant preparatų pakuočių. Pritaikyta PC metodika acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui. Geriausias komponentų atskyrimas pasiekiamas naudojant tirpiklių sistemą, sudarytą iš tolueno, metanolio ir etilo acetato (6:4:1, v/v/v); ryškinimas atliekamas 254 nm UV spinduliuotėje. Validavus plonasluoksnės chromatografijos metodiką nustatyta, kad ji yra tinkama acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido kokybiniam nustatymui vaistuose.

Medžiagos vaistiniuose preparatuose identifikuotos pagal vidutines Rf reikšmes.

(8)

SUMMARY

Final Master‘s thesis by A. Getautytė “Analysis of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide mixture using high-performance liquid and thin-layer chromatography methods”. Scientific supervisor doc. dr. A. Ževžikovienė; Department of Analytical and Toxicological Chemistry at the Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2020

Key words: acetylsalicylic acid, ramipril, indapamide, high-performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, qualitative determination, quantitative determination.

The aim of the study: to apply high-performance liquid chromatography and thin-layer chromatography methods for acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide mixture qualitative and quantitative evaluation.

Tasks of the study: to apply a high-performance liquid chromatography method for the separation, qualitative and quantitative evaluation of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide mixture; Validate high-performance liquid chromatography method and perform a qualitative and quantitative evaluation of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide in tablet dosage forms; To apply a thin-layer chromatography method for the separation and qualitative evaluation of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide mixture; Validate thin-layer chromatography method and perform a qualitative evaluation of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide in tablet dosage forms.

The object of the study: a mixture of medicinal substances derived from acetylsalicylic acid (“Aspirin”), ramipril (“Ramicor”) an indapamide (“Indamax”) tablets.

Methods: high-performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography (TLC).

Results and conclusions of the research: HPLC methodology was applied for the separation, qualitative and quantitative evaluation of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide mixture. Optimal separation of the components is achieved on ACE C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column using gradient elution, mobile phase of 0.1 % trifluoroacetic acid and acetonitrile; substances are detected with photodiode array detector at 220 nm. Method validation showed its suitability for the qualitative and quantitative evaluation of active substances in pharmaceutical preparations. Substances in medicinal products were identified my mean retention times and UV spectra. Obtained quantities of the active substances corresponds to the quantities declared on the marketed formulation packages. TLC methodology was applied for the separation and qualitative evaluation of acetylsalicylic acid, ramipril and indapamide mixture. Optimal separation of the components is achieved using a solvent system consisting of toluene, methanol and ethyl acetate (6:4:1, v/v/v); detection is performed with UV light (254 nm). Method validation showed its suitability for the qualitative evaluation of active substances in pharmaceutical preparations. Substances in medicinal products were identified by mean Rf values.

(9)

SANTRUMPOS

AKF – angiotenziną konvertuojantis fermentas ATC – anatominė-terapinė-cheminė klasifikacija DDD – nustatyta vaisto vidutinė terapinė paros dozė ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

PC – plonasluoksnė chromatografija PSO – pasaulio sveikatos organizacija Rf – sulaikymo rodiklis

SSN – santykinis standartinis nuokrypis TS – tirpiklių sistema

UV – ultravioletinė spinduliuotė

UV-RŠ – ultravioletinė-regimosios šviesos spinduliuotė VVKT – valstybinė vaistų kontrolės tarnyba

(10)

ĮVADAS

Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis visame pasaulyje širdies ir kraujagyslių ligos yra pagrindinė mirties priežastis [16]. Vienas iš svarbiausių kardiovaskulinių ligų rizikos veiksnių – arterinio kraujospūdžio padidėjimas. Nustatyta, kad net 1,13 milijardo žmonių visame pasaulyje serga hipertenzija [34]. Daugumai pacientų hipertenzijos kontroliavimui monoterapija nėra pakankama, todėl efektyviam kraujospūdžio mažinimui pasiekti yra naudojami pagal skirtingus mechanizmus veikiantys vaistų deriniai [49].

Viena iš vaistų kombinacijų, kuriai teikiama pirmenybė, yra angiotenziną konvertuojančio fermento (AKF) inhibitorių vartojimas kartu su diuretikais. Iš grynų AKF inhibitorių Lietuvoje nemažai suvartojama ramiprilio – 25,580 DDD/1000 gyv./per dieną. Kaip diuretikas gali būti skiriamas indapamidas, kurio suvartojimas Lietuvoje užima trečią vietą tarp visų diuretikų. Papildomai, didelės kardiovaskulinės rizikos pacientams dažnai skiriama acetilsalicilo rūgštis. Jos suvartojimas Lietuvoje tarp visų kraują ir kraujodarą veikiančių vaistų 2018 metų duomenimis yra didžiausias – 51,663 DDD/1000 gyv./per dieną. Ramiprilis ir acetilsalicilo rūgštis įeina į Lietuvoje daugiausiai suvartotų vaistinių preparatų pagal bendrinį pavadinimą penketuką [25,4].

Didelis vaistų suvartojimas yra susijęs su padidėjusia apsinuodijimų jais rizika. Apsinuodijimai įvyksta dėl tyčinio perdozavimo, pasireiškusios vaistų sąveikos ar netinkamos suvartoto vaisto dozės [25]. Nustatyti intoksikaciją sukėlusias medžiagas yra svarbu, nes tai gali padėti išsiaiškinti mirties priežastį, palengvinti paciento gydymą ir sumažinti galimus mirties atvejus. Apsinuodijimą sukėlusias medžiagas reikia nustatyti greitai, tad įvykio vietoje rastų tablečių ar kapsulių veikliųjų medžiagų identifikavimas dažnai yra greitesnis nei diagnozės nustatymas atliekant kūno skysčių analizę [33]. Taip pat, yra tikslinga vieną analizės metodą pritaikyti kelių junginių nustatymui vienu metu ir taip sumažinti ne tik analizės laiką, bet ir išteklius. Moksliniuose šaltiniuose yra metodikų, skirtų pavienių ar kelių junginių nustatymui, tačiau duomenų apie bendrą acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio analizę nėra. Tam, kad būtų užtikrintas didesnis prieinamumas skirtingus išteklius ir įrangą turinčioms laboratorijoms, naudinga to paties vaistų mišinio tyrimą pritaikyti keliems instrumentinės analizėms metodams.

Šio darbo tikslas – pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodikas, tinkančias acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui.

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos ir plonasluoksnės chromatografijos metodikas, tinkančias acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui.

Darbo uždaviniai:

1. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų atskyrimui bei kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui.

2. Validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką bei atlikti kokybinį ir kiekinį acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido įvertinimą vaistuose.

3. Pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio, indapamido rūgšties mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui.

4. Validuoti plonasluoksnės chromatografijos metodiką ir atlikti kokybinį acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido įvertinimą vaistuose.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido suvartojimas

1.1.1. Tiriamųjų medžiagų suvartojimas Lietuvoje

Informaciją ir statistiką apie vaistinių preparatų suvartojimą Lietuvoje teikia Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba (VVKT). Duomenys pateikiami naudojant Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) patvirtintą ATC/DDD metodologiją. Visi vaistiniai preparatai suskirstomi pagal anatominę-terapinę- cheminę (ATC) klasifikaciją, o jų suvartojimas išreiškiamas vaisto vidutinės terapinės paros dozės skaičiumi, kuris tenka 1000 gyventojų per dieną (DDD/1000 gyv./per dieną) [4].

2018 metų vaistų suvartojimo pagal ATC grupes duomenimis, daugiausiai (41%) buvo suvartota C grupės – širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų. Šioje grupėje yra dvi darbe tiriamos vaistinės medžiagos – renino-angiotenzino sistemą veikiantis ramiprilis ir diuretikas indapamidas. B grupės (kraują ir kraujodarą veikiančių vaistų) vaistų suvartojimas sudarė 8 proc. ir užėmė ketvirtą vietą pagal kitas ATC grupes. Šioje grupėje yra kita darbe tiriama medžiaga – acetilsalicilo rūgštis [4].

2018 m. duomenimis tarp trombocitų agregaciją slopinančių vaistų (B01AC) acetilsalicilo rūgšties buvo suvartota daugiausiai (51,663 DDD/1000 Lietuvos gyv./per dieną). Acetilsalicilo rūgšties suvartojimas lenkia ir kitų pogrupių antitrombozinius vaistus (B01A). 2018 m. duomenimis tarp renino- angiotenzino sistemą veikiančių vaistų grupėje esančių grynų AKF inhibitorių pogrupio (C09A) vaistų, ramiprilis užima antrą vietą pagal suvartojimą (25,580 DDD/1000 Lietuvos gyv./per dieną). Diuretikas indapamidas pagal ATC klasifikaciją priklauso netiazidinių diuretikų pogrupiui (C03B) ir yra vienintelis šio pogrupio vartojamas vaistas Lietuvoje. 2018 metais jo suvartota 2,875 DDD/1000 Lietuvos gyv./per dieną. Iš esančių keturių diuretikų pogrupių, netiazidiniai diuretikai pagal suvartojimą užima trečią vietą.

Taip pat, indapamidas yra vartojamas ir deriniuose su AKF inhibitoriumi perindopriliu arba perindopriliu ir kalcio kanalų blokatoriumi amlodipinu. Tarp visų AKF inhibitorių derinių, perindoprilio ir indapamido derinio suvartojama daugiausiai. 2018 m. šio derinio suvartojimas siekė 24,111 DDD/1000 Lietuvos gyventojų/per dieną, o 2017 m. – 24,025 DDD/1000 Lietuvos gyventojų/per dieną. Nuo 2015 m. iki 2018 m. yra stebimas minėto derinio suvartojimo didėjimas [4].

(13)

Pagal 1 pav. pavaizduotą penkerių metų vaistų suvartojimo tendenciją, galima teigti, kad acetilsalicilo rūgšties suvartojimas svyruoja – nuo 2015 m. iki 2017 m. matomas didėjimas, tačiau 2018 m. suvartojimas šiek tiek sumažėjo. Iš pateiktos diagramos matyti, kad ramiprilio suvartojimas kasmet mažėja – 2018 m. jo suvartota 5,56 proc. mažiau nei 2017 m. Atsižvelgiant į ankstesnius metus, indapamido 2018 m. suvartota 4,14 proc. mažiau nei 2017 m.

Nepaisant kasmetinių vaistų suvartojimo pokyčių, remiantis pateikta VVKT statistika galima teigti, kad tiriamieji vaistai vis dar lieka paklausūs tarp sergančiųjų širdies ir kraujagyslių ligomis.

1.1.2. Tiriamųjų medžiagų vartojimo paplitimas Baltijos šalyse

Norint palyginti tiriamųjų vaistų suvartojimo dydį tarp Baltijos šalių, yra parengtas leidinys, kuriame pateikta išsami 2013–2015 metų vaistų suvartojimo Lietuvoje, Latvijoje ir Estijoje analizė.

Leidinio duomenimis, minėtais metais visose trijose Baltijos šalyse žmonės daugiausiai vartojo vaistų, kurie skirti širdies ir kraujagyslių sistemos ligų gydymui. Tarp 15 daugiausiai suvartotų receptinių vaistų ramiprilis užėmė pirmą vietą Estijoje – 2015 m. jo suvartojimas siekė 59,20 DDD/1000 gyv./d. Latvijoje ir Lietuvoje pagal suvartojimą ramiprilis užėmė antrą vietą – suvartota 23,92 DDD/1000 gyv./d. ir

1 pav. Acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido suvartojimas 2014–2018 metais (Sudaryta pagal [4])

52,313 51,116

52,098 53,656 51,663

33,676 30,676 28,272 27,084 25,58

4,892 3,985 3,454 2,999 2,875

0 10 20 30 40 50 60

2014 m.

2015 m.

2016 m.

2017 m.

2018 m.

DDD/1000 gyventojų/per dieną

Indapamidas Ramiprilis Acetilsalicilo rūgštis

(14)

30,99 DDD/1000 gyv./d. atitinkamai. Į daugiausiai vartotų 15 receptinių vaistų sąrašus pateko ir indapamidas, tačiau vartojamas derinyje su perindopriliu. Tokia vaisto kombinacija pagal suvartojimą 2015 metais Estijoje užėmė tryliktą vietą, Latvijoje – trečią, o Lietuvoje – ketvirtą. Nagrinėjant daugiausiai suvartotų nereceptinių vaistų sąrašus, Latvijoje ir Lietuvoje daugiausiai vartota vaistų, kurių veiklioji medžiaga yra acetilsalicilo rūgštis (Latvijoje – 66,20 DDD/1000 gyv./d., Lietuvoje – 51,12 DDD/1000 gyv./d.). Estijoje daugiausia suvartota kombinacinių vaistų su acetilsalicilo rūgštimi (48,6 DDD/1000 gyv./d.), o vaistų, sudėtyje turinčių tik acetilsalicilo rūgšties, suvartojimas užėmė ketvirtą vietą (14,6 DDD/1000 gyv./d.) [44].

Taigi, remiantis Baltijos šalių vaistų suvartojimo statistika galima teigti, kad tiriamieji vaistai plačiai vartojami ne tik Lietuvoje, bet ir kaimyninėse šalyse.

1.2. Apsinuodijimų statistika

Nacionalinio visuomenės sveikatos centro prie Sveikatos apsaugos ministerijos (NVSC) departamentų parengtoje 2017 metų I ketvirčio apsinuodijimo atvejų tyrimo protokolų apžvalgoje ištirti 354 apsinuodijimo atvejai. Nustatyta, kad apsinuodijimai medikamentais vyrauja ir suaugusiųjų, ir vaikų tarpe – ištirti 63 ir 64 atvejai atitinkamai [1]. Valstybinės ligonių kasos pateiktoje 2017 metų duomenų analizėje nurodoma, kad tarp stacionaruose gydytų apsinuodijusių pacientų, vaistai užima antrąją vietą pagal kitas apsinuodijimus sukėlusias medžiagas. Tarp stacionaruose gydytų apsinuodijusių vaikų (iki 18 m. amžiaus), daugiausiai apsinuodijimų sąlygojo vaistai. Intoksikacija medikamentais sukėlė 19 mirtinų atvejų [2].

Amerikos apsinuodijimų kontrolės centrų asociacijos 2017 m. ataskaitoje nurodoma, kad nuo 2000-ųjų metų yra stebimas apsinuodijimo širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančiais vaistais atvejų padažnėjimas [26]. Turkijoje buvo atlikta savižudiškų intoksikacijos širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančiais vaistais atvejų analizė. Nustatyta, kad daugiausiai intoksikacijų sukėlusi vaistų grupė buvo AKF inhibitoriai [6]. Amerikoje įsteigto toksikologijos tyrėjų konsorciumo bylų registro 2018 m.

ataskaitoje pažymima, kad apsinuodijimas kardiovaskulinę sistemą veikiančiais vaistais dominuoja tarp 76–85 metų ir vyresnių nei 85 metų amžiaus žmonių. Taip pat, tarp visų užregistruotų toksiškumo atvejų acetilsalicilo rūgštis užima trečią vietą neopioidinių analgetikų grupėje [46].

Taigi, remiantis Lietuvos ir kitų šalių duomenimis, galima teigti, kad apsinuodijimas medikamentais, tame tarpe ir šiame darbe tiriamais, yra aktuali problema.

(15)

1.3. Tiriamųjų medžiagų apžvalga

1.3.1. Acetilsalicilo rūgštis

Molekulinė masė:180,159 g/mol [33];

Molekulinė formulė: C9H8O4 [33];

IUPAC pavadinimas: 2-acetiloksibenzenkarboksirūgštis [33];

Fizikinės savybės: balti ar bespalviai kristalai, kristaliniai milteliai, esant drėgmei hidrolizuojasi į acto ir salicilo rūgštį, todėl gali būti jaučiamas acto kvapas. Lydosi 135℃ temperatūroje. Silpnai tirpsta vandenyje, gerai – 96% etanolyje, eteryje, chloroforme, natrio hidroksido ir natrio karbonato tirpaluose [33];

Lietuvoje registruotų preparatų pavadinimai: Abrea, Acetilsalicilo rūgštis SANITAS, Acetilsalicilo rūgštis Stirol, Acetylsalicylic acid Siromed, Acetylsalicylic acid Grindeks, Alka-Prim, Alka-Seltzer, Arocora, Aspirin, Aspirin Cardio, Aspirin-C, Heartisan, Thrombo ASS, Provapirin, Hjertemagnyl, Herz ASS-ratiopharm [3];

Vaistų forma: tabletės, skrandyje neirios tabletės, šnypščiosios tabletės [3];

Dozės: 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 160 mg, 324 mg, 325 mg, 330 mg, 500 mg [3].

1.3.2. Ramiprilis

3 pav. Ramiprilio struktūrinė formulė

2 pav. Struktūrinė acetilsalicilo rūgšties formulė

(16)

Molekulinė masė: 416,518 g/mol [33];

Molekulinė firmulė: C23H32N2O5 [33];

IUPAC pavadinimas: (2S,3aS,6aS)-1-[(2S)-2-[[(2S)-1-etoksi-1-okso-4-fenilbutan-2- il]amino]propanoil]-3,3a,4,5,6,6a-heksahidro-2H-ciklopenta[b]pirol-2-karboksirūgštis [33];

Fizikinės savybės: Balti ar beveik balti kristaliniai milteliai, mažai tirpūs vandenyje, laisvai – metanolyje. Lydymosi temperatūra 109℃ [33];

Lietuvoje registruotų preparatų pavadinimai: Ampril, Cardace, Hartil, Ramicor, Ramimed, Ramipril Actavis, Ramipril Ingen Pharma [3];

Vaistų forma: tabletės [3];

Dozės: 2,5 mg, 5 mg, 10 mg [3];

1.3.3. Indapamidas

Molekulinė masė: 365,832 g/mol [33];

Molekulinė formulė: C16H16CIN3O3S [33];

IUPAC pavadinimas: 4-chlor-N-(2-metil-2,3-dihidroindol-1-il)-3-sulfamoilbenzamidas [33];

Fizikinės savybės: Balti arba beveik balti kristaliniai milteliai, beveik netirpūs vandenyje, tirpsta 96%

etanolyje. Lydymosi temperatūra 161℃ [33];

Lietuvoje registruotų preparatų pavadinimai: Indamax, Indapamide Actavis, Indapamide Orion, Indapen SR, Indatens, Proindap, Rawel SR, Tertensif, Tertensif SR [3];

Vaistų forma: pailginto atpalaidavimo tabletės, kietosios kapsulės, plėvele dengtos tabletės [3];

Dozės: 1,5 mg, 2,5 mg [3];

4 pav. Indapamido struktūrinė formulė

(17)

1.4. Toksiškumas ir apsinuodijimo reiškiniai

1.4.1. Acetilsalicilo rūgštis

Apsinuodjimą acetilsalicilo rūgštimi sudaro simptomų triada: hiperventiliacija, spengimas ausyse ir virškinimo trakto sutrikimai. Ankstyvosiose apsinuodijimo stadijose simptomai atsiranda per 1–2 valandas ir pasireiškia galvos svaigimu, spengimu ausyse, pykinimu, vėmimu, viduriavimu, epigastriumo skausmais [13]. Vėliau atsiranda hiperventiliacija, karščiavimas, prakaitavimas, klausos sutrikimai iki kurtumo bei širdies ritmo sutrikimai [47]. Sunkios intoksikacijos metu galima ažitacija arba letargija, traukuliai, haliucinacijos. Sunkus apsinuodijimas gali sukelti trombocitopeniją, kraujavimą, hiperglikemiją. Plaučių edema ir ūmus plaučių pažeidimas gali atsirasti ypatingai vyresnio amžiaus žmonėms esant lėtiniam apsinuodijimui [13,47]. Acetilsalicilo rūgšties ūmaus toksiškumo mirtingumo rodiklis yra 2%, tačiau jis gali padidėti iki 25% dideles aspirino dozes vartojant ilgą laiką.

Mirties priežastimi paprastai būna nekardialinė plaučių edema [47]. Suaugusiems mirtina acetilsalicilo rūgšties intoksikacija gali pasireikšti po 10–30 g, o vaikams – po 3 g medžiagos suvartojimo. Laikoma, kad ūmaus apsinuodijimo aspirinu dozė yra daugiau nei 150 mg/kg pagal kūno masę [13,47]. Pediatrijoje acetilsalicilo rūgštis nėra vartojama dėl galimo Reye sindromo, tačiau vaikų apsinuodijimai gali įvykti atsitiktinai prarijus suaugusiems skirtų vaistų [35]. Užfiksuotas mirtinas apsinuodijimo aspirinu atvejis Japonijoje – atvežtos į ligoninę 30 metų moters šlapime efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta acetilsalicilo rūgšties koncentracija siekė 0,06 mg/ml. Atlikus autopsiją, skrandžio turinyje nustatyta 0,10 mg/ml acetilsalicilo rūgšties koncentracija [30].

1.4.2. Ramiprilis

Pagrindinis toksinis AKF inhibitorių, o tarp jų ir ramiprilio, poveikis perdozavus yra dėl kraujagyslių išsiplėtimo ir hipovolemijos atsiradusi stipri hipotenzija, šokas. Taip pat, galima bradikardija, inkstų funkcijos nepakankamumas, elektrolitų koncentracijos pokyčiai. Dėl sumažėjusio aldosterono išsiskyrimo, organizme gali kauptis kalis ir sukelti kliniškai reikšmingą hiperkalemiją [5].

Negydoma ūmi ir sunki hiperkalemija gali būti dėl kvėpavimo raumenų silpnumo atsirandančios tachipnėjos ar mirtinos širdies aritmijos priežastis [22,15]. Tuo tarpu, kalio susilaikymas padidina natrio išsiskyrimą ir sukelia hiponatremiją [5]. Atliktas tyrimas parodė, kad daugeliu atvejų perdozavus ramipriliu kraujospūdis sumažėja per 4–4,5 val. po vaisto suvartojimo [20]. Buvo praneštas ramiprilio sukelto hepatotoksiškumo atvejis, kuris pasireiškė padidėjusiu kepenų fermentų kiekiu ir ūmine gelta [21]. Taip pat, yra aprašytas apsinuodijimo ramipriliu atvejis, kai 17-metė išgėrė 20 tėčio vartojamų

(18)

ramiprilio tablečių. Jai pasireiškė sunki hipotenzija, kardiovaskulinis kolapsas ir hipotermija. Buvo taikytas gydymas terlipresinu ir naloksonu [43].

1.4.3. Indapamidas

Nustatyta, kad toksinio poveikio nesukelia ne didesnė kaip 40 mg indapamido dozė. Ūmaus apsinuodijimo indapamidu atveju organizme gali sutrikti elektrolitų ir vandens pusiausvyra bei pasireikšti hiponatremija ir hipokalemija. Perdozavus gali atsirasti pykinimas, vėmimas, hipotenzija, mėšlungis, galvos sukimasis, mieguistumas, poliurija arba oligurija [3]. Indapamido sukelta hipokalemija gali lemti raumenų silpnumą ir širdies aritmiją, kuri gali būti grėsminga gyvybei.

Indapamidas gali sukelti kliniškai reikšmingą hiponatremiją, kurios simptomai gali prasidėti nuo pykinimo, bendro negalavimo ir progresuoti iki galvos skausmo, letargijos, sumišimo, sąmonės užtemimo. Stuporas, traukuliai ir koma gali atsirasti, jei natrio koncentracija serume staigiai nukrenta žemiau 120 mmol/l ribos arba greitai mažėja. Netinkamai gydoma hiponatremija padidina osmosinės mielinolizės sindromo riziką [18]. Retrospektyvaus tyrimo metu buvo nustatyta, kad hipokalemijos ir hiponatremijos pavojaus grėsmė vartojant indapamidą yra didesnė senyvo amžiaus moterims, kurių kūno masės indeksas yra mažas [28]. Yra aprašyti keli vyresnių (> 80 m.) žmonių atvejai dėl apsinuodijimo indapamidu bandant nusižudyti. Jiems pasireiškė žymi diurezė, hipokalemija ir hipotenzija [14,17].

1.5. Efektyvioji skysčių chromatografija

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas (ESC) išsivystė 1960 metais iš klasikinės kolonėlinės skysčių chromatografijos, gerinant kolonėlių ir instrumentinių komponentų (siurblių, bandinio įvedimo sistemų, detektorių) technologijas. ESC metodą galima taikyti bet kurio junginio, kuris yra tirpus judančiosios fazės skystyje, analizei [41]. ESC gali būti analizinė – naudojama junginių indentifikavimui, atskyrimui, kiekinei analizei ir preparatinė – skirta junginio išskyrimui ir gryninimui.

Siekiant tikslios junginio analizės ir atsižvelgiant į junginių pobūdį bei chemines savybes nustatomi ir keičiami tokie parametrai kaip vidinis kolonėlės skersmuo, sorbento dalelių dydis, siurblio slėgis [32].

Lyginant su tradicine žemo slėgio kolonėline skysčių chromatografija, ESC pasižymi greitesne analize (iki 30 min.), platesniu nejudančiosios fazės pasirinkimu, padidėjusia rezoliucija, didesniu jautrumu (naudojami įvairūs detektoriai), lengvesniu mėginių atkūrimu [41]. ESC pranašesnė už dujų chromatografiją dėl didesnės analizuojamų medžiagų įvairovės – dujų chromatografijoje tiriamojo bandinio komponentai turi būti pakankamai lakūs ir termostabilūs [36].

(19)

1.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido nustatymui

Atlikus mokslinės literatūros analizę buvo rastos įvairios ESC metodikos, tinkančios junginių nustatymui farmacinėse vaistų formose ir biologiniuose mėginiuose atskirai arba mišiniuose su kitomis vaistinėmis medžiagomis.

Chaudhari ir kiti mokslininkai sukūrė ESC metodiką, tinkančią atorvastatino, aspirino, ramiprilio ir metoprololio sukcinato nustatymui tabletėse. Visų medžiagų analizei buvo panaudota C18 kolonėlė (250 mm x 4,6 mm), silikagelis, kurio dalelių dydis – 5 μm ir eksperimentiniu būdu optimizuota mobilioji fazė, sudaryta iš fosfatinio buferio (pH 4) ir acetonitrilo mišinio (90:10, v/v). Eliuento tekėjimo greitis – 1 ml/min. Junginių nustatymui pasirinktas UV detektorius ir 210 nm bangos ilgis [19].

Greitą ESC metodiką ramiprilio nustatymui tabletėse išvystė mokslininkas B. Yilmaz. Jis naudojo tokio paties dydžio C18 kolonėlę (250 mm x 4,6 mm, 5 μm). Mobiliąją fazę sudarė fosfatinis buferis (pH 2,5) su 0,1% trifluoracto rūgštimi ir acetonitrilas (50:50, v/v). Eliuento tekėjimo greitis buvo 1 ml/min, o junginys nustatytas naudojant UV detektorių ir 208 nm bangos ilgį. Analizė naudojant šią metodiką atlikta per mažiau nei 5 minutes [29]. Kita mokslininkų grupė sukūrė ESC metodą, skirtą ramiprilio ir telmisartano nustatymui tabletėse. Kaip ir ankstesnių straipsnių autoriai, jie naudojo analogiško dydžio (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) C18 kolonėlę. Mobiliąją fazę paruošė iš acetonitrilo ir metanolio mišinio (70:30, v/v), kurį lygiomis dalimis sumaišė su 0,5% ortofosforo rūgštimi. Mobiliosios fazės srauto greitis sutapo su anksčiau aprašytų metodikų – 1 ml/min. Junginiai aptikti naudojant UV- regimosios šviesos (RŠ) detektorių ir 210 nm bangos ilgį [40].

Paprastas ir efektyvus ESC metodas buvo išvystytas ir indapamido bei perindoprilio nustatymui tabletėse. Panaudota Hypersil-BDS C18 kolonėlė (150 mm x 4,6 mm), silikagelio dalelių dydis – 3 μm.

Eliuentu pasirinktas metanolio ir vandens (60:40, v/v) mišinys, kurio tėkmės greitis - 1 ml/min. Junginių UV spektrai užrašyti naudojant UV-RŠ spektrofotometrą ir 230 nm bangos ilgį. Taikytas gradientinis eliuavimas [37]. Kitame moksliniame straipsnyje pasiūlytas ESC metodas indapamido ir nebivololio nustatymui tabletėse. Naudota atvirkščių fazių C18 kolonėlė (250 mm x 4,6 mm, 5 μm). Mobiliąją fazę sudarė acetonitrilo ir fosfatinio buferio (pH 3) mišinys (60:40, v/v). Eliuento tekėjimo greitis – 0,8 ml/min. Atskirti junginiai nustatyti UV-RŠ spektrofotometru, 226 nm bangos ilgyje [39]. ESC metodas sukurtas ir dar vienam indapamido deriniui su amlodipino besilatu. Junginių atskyrimas ir nustatymas tabletėse atliktas naudojant C18 kolonėlę (150 mm x 4,6 mm), sorbento dalelių dydis – 5 μm.

Mobilioji fazė sudaryta iš acetonitrilo ir vandens mišinio (70:30, v/v), turinčio 0,2% trietilamino. Terpė su ortofosforo rūgštimi nustatyta iki pH 4. Eliuento tekėjimo greitis – 0,8 ml/min. Junginiai aptikti naudojant fotodiodų matricos detektorių 238 nm bangos ilgyje [45].

(20)

Aspirino nustatymui tabletėse kartu su amlodipino besilatu ir atenololiu buvo pasiūlyta naudoti izokratines ESC sąlygas. Metodui naudota C18 kolonėlė (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), mobilioji fazė santykiu 70:30 (v/v) sudaryta iš metanolio ir 10 mM fosfatinio buferio, kurio terpė su ortofosforo rūgštimi nustatyta iki pH 7. Eliuento tekėjimo greitis – 1 ml/min. Junginiai nustatyti UV-RŠ detektoriumi, naudojant 235 nm bangos ilgį [11]. Kitame straipsnyje aspirino ir prasugrelio analizei tabletėse naudota tokio paties dydžio (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) C18 kolonėlė. Tačiau, vietoje ankstesniame straipsnyje naudoto metanolio, kaip vienas iš tirpiklių buvo pasirinktas acetonitrilas.

Fosfatinio buferio terpė taip pat pakoreguota su ortofosforo rūgštimi iki pH 3. Pasirinktas mobiliosios fazės santykis – 60:40 (v/v). Eliuento tekėjimo greitis bei naudotas detektorius buvo toks pat kaip ir ankstesniame straipsnyje, tačiau šiame tyrime junginių nustatymui pasirinktas 220 nm bangos ilgis [42].

Dar vienas metodas acetilsalicilo rūgšties analizei buvo pritaikytas tabletėse ir kraujo plazmos mėginiuose. Jam naudota atvirkščių fazių C18 kolonėlė, kurios dydis atitinka daugumos aprašytų tyrimų naudotus kolonėlių parametrus (250 mm x 4,6 mm, 5 μm). Mobilioji fazė sudaryta iš acetonitrilo ir fosfatinio buferio (pH 3,4) santykiu 70:30 (v/v), tekėjimo greitis nustatytas 1 ml/min, o analitės aptikimas atliktas UV-RŠ detektoriumi 236 nm bangos ilgyje [9].

Išnagrinėjus publikuotas metodikas matyti, kad visų junginių analizei buvo naudojamas vienodas sorbento tipas – C18 silikagelis. Dažniausiai pasirinktas silikagelio dalelių dydis – 5 μm.

naudotų kolonėlių ilgis 150 mm arba 250 mm, o skersmuo – 4,6 mm. Atsižvelgiant į pasirinktas pH reikšmes, galima daryti išvadą, kad acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio analizei turėtų tikti terpė, kurios pH 4. Esant pH 3 buvo nustatyta acetilsalicilo rūgštis ir indapamidas. Beveik visose nagrinėtose metodikose kaip vienas iš mobiliosios fazės tirpiklių buvo naudotas acetonitrilas.

Didžiojoje dalyje metodikų naudotas eliuento tėkmės greitis buvo 1 ml/min, o dvejose jų – 0,8 ml/min.

Todėl galima teigti, kad atliekant acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio išskirstymą, eliuento tėkmės greitis turėtų būti ne mažesnis kaip 0,8 ml/min. Nagrinėtų straipsnių metodikose detektoriumi dažniausiai pasirinktas UV-RŠ spektrofotometras, bet naudotas ir fotodiodų matricos detektorius. Mišinių išskirstymas atliktas ir izokratiniu, ir gradientiniu eliuavimo būdu.

Metodikos, skirtos pasirinkto vaistų mišinio (acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio, indapamido) kokybinei ir kiekinei ESC analizei, nebuvo aptika, todėl ji bus išvystyta eksperimento metu, remiantis rastomis atskirų ar kelių junginių metodikomis bei jas modifikuojant.

1.7. Plonasluoksnė chromatografija

Plonasluoksnė chromatografija (PC) – tai skysčių chromatografijos atmaina, kurios metu junginių atskyrimas vyksta ant stiklo, aliuminio ar plastiko plokštelės tolygiai uždėto sorbento

(21)

(stacionarios fazės) sluoksnio. Analizės metu plokštelės įstatomos į mobiliąja faze, kurią gali sudaryti kelių tirpiklių mišinys, pripildytas chromatografavimo kameras. Eliuentas, veikiamas kapiliarinių jėgų kyla plokštele ir medžiagų atsiskyrimas įvyksta dėl skirtingos jų sąveikos su stacionaria ir mobiliąja faze. Medžiagų aptikimas yra paprasčiausias, kai dominantys junginiai yra natūraliai spalvoti, fluorescuojantys arba sugeriantys UV šviesą. Tačiau identifikavimui taip pat galima naudoti ir įvairius cheminius reagentus [31,7].

Pagrindinė nuolatinio susidomėjimo plonasluoksne chromatografija priežastis yra ta, kad medžiagų analizei atlikti nereikia sudėtingos įrangos, o komerciškai prieinamas plokšteles galima sukurti beveik bet kurioje laboratorijoje [31]. Plonasluoksnės chromatografijos metodikų kūrimas yra aktualus atliekant toksikologinę/teismo ekspertizę ir norint greitai nustatyti toksikologiškai svarbias medžiagas biologiniuose mėginiuose ar vaistiniuose preparatuose [8].

1.8. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido nustatymui

Literatūros šaltiniuose yra įvairių PC metodikų, kurios naudojamos acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido nustatymui įvairiose farmacinėse formose. Nagrinėjant PC metodikas, skirtas individualiam minėtų junginių nustatymui arba nustatymui kombinuotose dozuotose formose kartu su kitomis vaistinėmis medžiagomis, galima modifikuoti naują metodą, skirtą visų trijų tiriamųjų junginių nustatymui mišinyje.

Aspirino ir jo priemaišų nustatymui buvo validuotas PC-densitometrinis metodas. Jam buvo naudotos 10 x 20 cm dydžio, 0,25 mm storio sluoksnio silikagelio G F254 plokštelės. Geras atskyrimas buvo pasiektas naudojant mobiliąją sistemą, sudarytą iš tolueno, metanolio ir etilo acetato (2:3:5, v/v/v) [23]. Tuos pačius tirpiklius tik kitokiu santykiu (6:3:2, v/v/v) panaudojo ir kiti mokslininkai, validavę metodą, skirtą ramiprilio nustatymui dozuotoje formoje su losartano kalio druska. Naudotos 10 x 10 cm dydžio, aliuminio plokštelės, kurios taip pat buvo dengtos 0,25 mm storio silikagelio 60 F254 sluoksniu [12]. Sukurtas paprastas ir tikslus PC metodas, leidžiantis tuo pačiu metu analizuoti aspiriną ir ramiprilį kapsulėse. Junginių atskyrimas pasiektas ant 10 x 10 cm dydžio silikageliu 60 F254 dengtos plokštelės.

Mobilioji sistema buvo sudaryta iš metanolio, benzeno, etilo acetato ir ledinės acto rūgšties (0,36:5,6:4:0,04, v/v/v/v) [38].

Indapamido ir perindoprilio kombinuotos formos tabletėse atskyrimui validuota metodika, kurios metu buvo naudotos 0,25 mm storio silikagelio 60 F254 sluoksniu dengtos plokštelės (10 cm ilgio ir pločio). Tirpiklių sistema sudaryta naudojant dichlormetaną, metanolį ir ledinę acto rūgštį

(22)

(9,5:0,5:0,1, v/v/v) [10]. Publikuotas ir kitas metodas, tinkamas indapamido nustatymui tabletėse kartu su atenololiu. Šiam metodui naudotos 0,2 mm storio aliuminio plokštelės, padengtos60 F254 silikageliu.

Mobilioji fazė buvo sudaryta iš keturių tirpiklių: tolueno, etilo acetato, metanolio ir amoniako (5:3:3:0,1,v/v/v/v) [27].

Nemažai plonasluoksnės chromatografijos metodikų galima rasti ir vaistų bei nuodų analitinių duomenų šaltinyje – knygoje „Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons“. Pagal šioje knygoje pateiktą informaciją, acetilsalicilo rūgšties ir indapamido nustatymui naudojamos silikageliu dengtos plokštelės, kurių sluoksnio storis yra 0,25 mm [33]. Knygoje pateiktų ir aukščiau aprašytų galimų chromatografinių sistemų tirpiklių sudėtis ir sulaikymo rodiklių (Rf) reikšmės pateikiamos 1 lentelėje.

Atlikus plonasluoksnės chromatografijos metodologijų apžvalgą galima daryti išvadą, kad acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido atskyrimui paprastai naudojamos silikagelio sorbetu dengtos plokštelės. Mobiliąją fazę dažniausiai sudaro įvairios sudėties trijų organinių tirpiklių kombinacija. Analizuojamų medžiagų atskyrimui tinkamose sistemose dažniausiai naudojamas toluenas, metanolis ir etilo acetatas.

Literatūros šaltiniuose nebuvo rasta sistemos, kurios tinkamumas būtų įvertintas visų trijų tiriamųjų vaistų kokybinei analizei, todėl mobiliosios fazės tirpiklių sudėtis acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio atskyrimui bei analizei bus parenkama eksperimentiniu būdu.

Tirpiklių sistema Acetilsalicilo rūgšties

Rf Ramiprilio Rf Indapamido Rf

Toluenas–metanolis–

etilo acetatas (2:3:5, v/v/v) [23]

0,19 ⁻ ⁻

Toluenas–metanolis–

etilo acetatas (6:3:2, v/v/v) [12]

⁻ 0,57 ⁻

Toluenas–etilo acetatas–metanolis–

amoniakas (5:3:3:0,1, v/v/v/v)

[27]

⁻ ⁻ 0,71

Etilo acetatas [6] [33] 0,30 ⁻ 0,61

Etilo acetatas–

metanolis–amoniakas (85:10:5, v/v/v) [33]

0,09 ⁻ 0,66

Chloroformas–etanolis

(90:10, v/v) [33] 0,40 ⁻ 0,56

1 lentelė. PC tirpiklių sistemos, taikomos tiriamųjų vaistų analizei

(23)

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei kokybiniam įvertinimui plonasluoksnės chromatografijos metodu buvo tirtas iš acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido tablečių išgautas vaistinių medžiagų mišinys.

2.2. Kokybinis ir kiekinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Įranga

Medžiagų pasvėrimui naudotos analitinės svarstyklės „Shimadzu Auw 120 D“ (Vokietija).

Medžiagų ekstrakcijai iš tablečių ir tirpinimui naudota „Wise clean“ ultragarso vonelė. Paruoštų tirpalų reikiamo tūrio paėmimui naudota automatinė pipetė (Eppendorf Research, JAV). Kokybiniam ir kiekiniam tiriamųjų medžiagų mišinio vertinimui efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) būdu buvo naudotas Waters 2695 (Miliford, JAV) chromatografas. Junginių aptikimas atliktas fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (Miliford, JAV). Medžiagų atskyrimui naudota ACE C18 kolonėlė, kurios ilgis – 250 mm, skersmuo – 4,6 mm, sorbento dalelių dydis – 5 μm. Analičių detekcija vykdyta 200–400 nm bangų ilgio diapazone.

Tirpikliai

Etaloninių ir tiriamųjų acetilsalicilo rūgšties ir indapamido tirpalų ruošimui naudotas 96 proc.

etanolis (AB „Stumbras“, Lietuva) , ramiprilio tirpalų ruošimui naudotas metanolis (≥ 99,9 proc., Sigma- Aldrich, Vokietija).

Chromatografavimo eliuentų ruošimui buvo naudotas natrio dihidrofosfatas (Sigma-Aldrich, Vokietija), fosforo rūgšties tirpalas (49,5–50,5 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), trifluoracto rūgštis (≥ 99,0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), dejonizuotas vanduo, paruoštas išgryninto vandens ruošimo sistema („Millipore“, JAV) ir acetonitrilas (≥ 99,9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija).

Etaloniniai tirpalai

Etaloniniai tirpalai buvo gaminami pasvėrus po 10 mg standartinių acetilsalicilo rūgšties (≥ 99,0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija) ir indapamido (≥ 98,0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija) medžiagų ir jas ištirpinus 10 ml matavimo kolbutėje, 96 proc. etanolyje. Etaloninis ramiprilio tirpalas

(24)

pagamintas pasvėrus 10 mg standartinės ramiprilio medžiagos (≥ 98,0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), ištirpinus 10 ml kolbutėje, metanolyje. Gauta etaloninų tirpalų koncentracija – 1 mg/ml. Standartinių medžiagų mišinys buvo paruoštas sumaišius po 1 ml visų medžiagų etaloninių tirpalų. Atliekant 1 mg/ml koncentracijos tirpalų skiedimus per pusę, buvo pagaminti kiekvienos standartinės medžiagos tirpalai, kurie buvo naudojami kalibracinių kreivių sudarymui ir kiekiniam nustatymui. Acetilsalicilo rūgšties etaloninių tirpalų koncentracijos: 0,03125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml. Ramiprilio ir indapamido etaloninių tirpalų koncentracijos: 0,03125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml.

Tiriamieji tirpalai

Tiriamųjų medžiagų darbiniai tirpalai buvo paruošti iš Lietuvos vaistinėse įsigytų vaistinių preparatų.

Acetilsalicilo rūgšties darbinis tirpalas pagamintas iš vaistinio preparato „Aspirin“ (Bayer), 500 mg stiprumo tablečių. Viena tabletė (svoris 0,602 g) buvo sutrinta grūstuvėje iki homogeniškumo.

1 mg gautų miltelių perkeltas į 10 ml matavimo kolbutę ir užpilta 96 proc. etanoliu. Suspensija sonifikuota 10 min. ultragarso vonelėje, paskui iki žymės pripilta etanolio. Tirpalas nufiltruotas pro PTFE švirkštinį filtrą, kurio porų dydis 0,45μm. Taip paruoštas acetilsalicilo rūgšties darbinis tirpalas naudotas tolimesniems ESC tyrimams.

Ramiprilio darbinis tirpalas buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Ramicor“ (Hexal AG) 5 mg stiprumo tablečių. Paimta 1 tabletė (svoris 0,359 g) ir sutrinta grūstuvėje iki homogeniškų miltelių.

Milteliai perkelti į 20 ml matavimo kolbutę ir užpilti metanoliu. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 10 min., paskui praskiesta metanoliu iki pažymėtos kolbutėje ribos. Nuosėdoms šiek tiek nusistovėjus, suspensija nufiltruota pro PTFE švirkštinį filtrą, kurio porų dydis 0,45μm. Paruoštas ramiprilio darbinis tirpalas naudotas tolimesniems ESC tyrimams.

Indapamido darbinis tirpalas buvo pagamintas iš „Indamax“ (Teva Pharma B.V.) vaistinio preparato, 1,5 mg stiprumo tablečių. Grūstuvėje iki homogeniškumo sutrinta 1 tabletė (svoris 0,2083 g).

Milteliai perkelti į 20 ml matavimo kolbutę ir užpilti 96 proc. etanoliu. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 10 minučių. Po sonifikavimo iki pažymėtos ribos pripilta etanolio. Nuosėdoms nusistovėjus, filtruota pro PTFE švirkštinį filtrą, kurio porų dydis 0,45μm. Pagamintas indapamido darbinis tirpalas naudotas tolimesniems ESC tyrimams.

Tiriamųjų medžiagų mišinys buvo pagamintas iš paruoštų darbinių tirpalų, sumaišius juos po 1 ml.

(25)

Analizė

Optimalios efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygos buvo nustatytos tiriant acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido etaloninius tirpalus ir jų mišinį. Medžiagos mišinyje identifikuotos pagal sulaikymo laikus ir UV spektrus. Nustačius tinkamas metodikos sąlygas, jos buvo pritaikytos tiriamųjų medžiagų, gautų iš vaistinių preparatų, mišinio analizei.

Pritaikytam metodui naudotą judančiąją fazę sudarė 0,1 proc. trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B). Eliuavimo sistemos gradientinis kitimas pateiktas 2 lentelėje.

Nustatytas eliuento tekėjimo greitis – 1 ml/min. Palaikyta 25℃ kolonėlės temperatūra. Mėginio injekcijos tūris – 10 μl. Mišinio analičių detekcija vykdyta 200–400 nm bangų ilgio diapazone.

2.3. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu

Įranga

Medžiagų pasvėrimui naudotos analitinės svarstyklės „Shimadzu Auw 120 D“ (Vokietija).

Medžiagų ekstrakcijai iš tablečių ir tirpinimui naudota „Wise clean“ ultragarso vonelė. Paruoštų tirpalų reikiamo tūrio paėmimui naudota automatinė pipetė (Eppendorf Research, JAV). Naudotos 10 cm ilgio ir 5 cm pločio stiklinės chromatografinės plokštelės, padengtos silikagelio sluoksniu (TLC Silica gel 60 F254, Merck, Vokietija). Etaloninių ir tiriamųjų tirpalų mėginiai buvo užnešami ant plokštelių pusiau automatiniu mėginių ėmikliu „CAMAG Linomat 5“ ir 100 μl dozavimo švirkštu (Camag, Šveicarija).

Chromatografavimas atliktas 10x10 cm matmenų plokštelėms pritaikytoje stiklinėje kameroje su metaliniu dangčiu „CAMAG Twin Through Chamber“ (Camag, Šveicarija). Plokštelių džiovinimui ir kaitinimui naudota „CAMAG TLC Plate Heater III“ kaitlentė (Camag, Šveicarija). Medžiagų dėmės ir

Chromatografavimo laikas (min)

Eliuento tekėjimo

greitis (ml/min) A (proc.) B (proc.)

00:00 1 98,0 2,0

01:00 1 98,0 2,0

20:00 1 2,0 98,0

23:00 1 2,0 98,0

24:00 1 98,0 2,0

2 lentelė. Eliuento sudėties gradientinis kitimas

(26)

sulaikymo rodiklių (Rf) reikšmės įvertintos naudojantis vizualizavimo prietaisu „CAMAG TLC Visualizer“ (Camag, Šveicarija).

Tirpikliai

Etaloninių ir tiriamųjų acetilsalicilo rūgšties ir indapamido tirpalų ruošimui naudotas 96 proc.

etanolis (AB „Stumbras“, Lietuva), ramiprilio tirpalų ruošimui naudotas metanolis (≥ 99,9 proc., Sigma- Aldrich, Vokietija).

Mobiliosios fazės sudarymui naudoti šie tirpikliai: toluenas (≥ 99,9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), metanolis (≥ 99,9 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), etilo acetatas (≥ 99,5 proc., Sigma- Aldrich, Vokietija).

Etaloniniai tirpalai

Etaloniniai vaistinių medžiagų tirpalai buvo ruošiami iš standartinių acetilsalicilo rūgšties (≥ 99,0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija), ramiprilio (≥ 98,0 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija) ir indapamido (≥ 98,0 proc, Sigma-Aldrich, Vokietija) medžiagų. 10 mg acetilsalicilo rūgšties ir 10 mg indapamido užpilta 96 proc. etanoliu iki 10 ml kolbutės žymės, 20 mg ramiprilio užpilta metanoliu iki 10 ml kolbutės žymės. Pagamintų acetilsalicilo rūgšties ir indapamido etaloninių tirpalų koncentracija – 1 mg/ml, ramiprilio tirpalo koncentracija – 2 mg/ml. Standartinių medžiagų mišinys buvo paruoštas sumaišius po 1 ml visų medžiagų etaloninių tirpalų.

Tiriamieji tirpalai

Tiriamųjų medžiagų darbiniai tirpalai buvo paruošti iš Lietuvos vaistinėse įsigytų vaistinių preparatų.

Acetilsalicilo rūgšties darbinis tirpalas pagamintas iš vaistinio preparato „Aspirin“ (Bayer), 500 mg stiprumo tablečių. Paimta 1 tabletė (svoris 0,602 g) buvo sutrinta grūstuvėje iki homogeniškų miltelių. Pasvertas 12,04 mg gautų miltelių svoris, atitinkantis 10 mg grynos acetilsalicilo rūgšties, užpiltas 96 proc. etanoliu. Suspensija 10 min. sonifikuota ultragarso vonelėje. Po sonifikacijos užpilta etanolio iki 10 ml kolbutės žymės. Tirpalas nufiltruotas pro PTFE švirkštinį filtrą, kurio porų dydis 0,45μm.

Ramiprilio darbinis tirpalas buvo pagamintas iš vaistinio preparato „Ramicor“ (Hexal AG) 5 mg stiprumo tablečių. Paimtos dvi tabletės (1 tabletės svoris 0,359 g) sutrintos grūstuvėje, milteliai perkelti į 5 ml tūrio kolbutę ir užpilti metanoliu. Suspensija 10 min. sonifikuota ultragarso vonelėje, pripilta metanolio iki žymės. Tirpalas nufiltruotas PTFE švirkštiniu filtru, kurio porų dydis 0,45μm.

Indapamido darbinis tirpalas buvo pagamintas iš „Indamax“ (Teva Pharma B.V.) vaistinio preparato, 1,5 mg stiprumo tablečių. Grūstuvėje iki homogeniškumo sutrinta 1 tabletė (svoris 0,2083 g).

(27)

Milteliai perkelti į 5 ml matavimo kolbutę, užpilti 96% etanoliu. Suspensija sonifikuota ultragarso vonelėje 10 minučių. Po sonifikavimo, iki kolbutės žymės pripilta etanolio. Tirpalas, filtruotas pro PTFE švirkštinį filtrą, kurio porų dydis 0,45 μm.

Analizė

Naudojant etaloninius vaistinių medžiagų tirpalus pritaikyta tinkama PC metodika, kuri vėliau naudota tiriamųjų medžiagų, išgautų iš tablečių, mišinio kokybinei analizei. Etaloniniai ir tiriamieji tirpalai, buvo užpurškiami ant silikageliu dengtų chromatografinių plokštelių pusiau automatiniu mėginių ėmikliu. Užpurškiamo tirpalo tūris – 15 μl. Plokštelė su išdžiūvusiais mėginiais įstatoma į pasirinktos tirpiklių sistemos (TS) garais prisotintą chromatografavimo kamerą. Tirpiklių tūris kameroje – 30 ml. Plokštelė iš kameros ištraukiama, kai TS pakyla likus 1 cm iki plokštelės viršaus. Ištraukta plokštelė džiovinama ir medžiagų dėmės ryškinamos UV spinduliuotėje (254 nm).

2.4. Duomenų apdorojimas

Duomenys buvo rinkti ir analizuojami naudojant Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, JAV), Camag winCATS 1.4.9. (Camag, Šveicarija), Empower 2 Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) programas.

(28)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas

Kolonėlės ir detektoriaus parinkimas

Atsižvelgiant į moksliniuose straipsniuose ESC tyrimams dažniausiai naudotų kolonėlių dydžius, acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio analizei buvo pasirinkta ACE C18 kolonėlė, kurios ilgis – 250 mm, skersmuo – 4,6 mm, o sorbento dalelių dydis – 5 μm.

Analizuojamų junginių aptikimui pasirinktas fotodiodų matricos detektorius. Priešingai nei naudojant UV-RŠ detektorių, fotodiodų matricos detektoriumi nustatytame bangų ilgių diapazone galima aptikti visus junginius vienu kartu, todėl analizės atlikimas tampa paprastesnis ir greitesnis.

Galimybė analizuoti mėginį pasirenkant skirtingus bangos ilgius leidžia analizuoti kiekvieną junginį esant didžiausiai jo absorbcijai. Tad gautos chromatogramos smailių nuskaitymas fotodiodų matricos detektoriumi padidina metodikos specifiškumą [24].

Eliuento parinkimas

Siekiant atrasti tinkamą metodą vaistinių medžiagų mišinio komponentų atskyrimui ir nustatymui, pirmiausiai buvo remtasi validuotu ESC metodu, pritaikytu acetilsalicilo rūgšties bei ramiprilio nustatymui tabletėse [19]. Išbandytas publikuotame tyrime naudotas eliuentas, kuris buvo sudarytas iš fosfatinio buferio (pH 4) ir acetonitrilo. Naudojant minėtą eliuentą, acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio komponentų atsiskyrimas buvo pasiektas, tačiau chromatogramoje gautos analičių smailės buvo nepakankamai simetriškos.

Norint pagerinti smailių simetriškumą, nuspręsta vietoj fosfatinio buferio išbandyti 0,1 proc.

trifluoracto (TFA) rūgšties tirpalą. Pasirinktas gradientinio eliuavimo būdas, kurio mobiliosios fazės sudėties kitimas pateiktas 2 lentelėje. Nustatytas eliuento tekėjimo greitis buvo 1 ml/min. Palaikyta 25℃

kolonėlės temperatūra. Mėginio injekcijos tūris – 10 μl. Junginių aptikimas atliktas 220 nm UV spinduliuotės bangos ilgyje. Chromatografavimo trukmė – 24 minutės. Junginių analizės metu gauta chromatograma pavaizduota 5 pav.

(29)

Iš chromatogramos galima matyti, kad buvo pasiektas optimalus smailių simetriškumas, smailės yra atsiskyrusios viena nuo kitos, neužfiksuota priemaišų, todėl galima tinkamai identifikuoti mišinyje esančius junginius. Pritaikyta metodika toliau gali būti naudojama tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš tablečių, analizei.

R.V. Bhaskara su bendraautoriais yra publikavęs ESC metodiką, skirtą dviejų junginių – ramiprilio ir telmisartano mišinio išskirstymui. Jie taip pat naudojo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) kolonėlę, tačiau mobiliąją fazę paruošė iš acetonitrilo ir metanolio mišinio (70:30, v/v), kurį lygiomis dalimis sumaišė su 0,5% ortofosforo rūgštimi [40]. Kiti mokslininkai yra pritaikę ESC metodiką mišinio išskirstymui, kurį sudaro indapamidas ir amlodipino besilatas. Tam naudotas izokratinis eliuavimas ir eliuentas, sudarytas iš acetonitrilo ir vandens mišinio (70:30, v/v), turinčio 0,2% trietilamino [45]. Dar viename tyrime buvo nustatyta, kad naudojant mažesnio ilgio (150 mm) kolonėlę, turinčią 3 μm sorbento dalelių dydį, indapamido ir perindoprilio atskyrimui ESC metodu labiausiai tinka metanolio ir vandens mišinys (60:40) [37]. Tuo tarpu, šiame tiriamajame darbe naudojant 0,1 proc. trifluoracto rūgšties ir acetonitrilo gradientinį eliuavimą, pritaikyta metodika, kuri yra tinkama trijų širdies ir kraujagyslių ligoms gydyti vartojamų vaistų – acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio išskirstymui.

3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija

Pritaikytos ESC metodikos tinkamumo patvirtinimas buvo atliktas pagal Tarptautinės harmonizavimo konferencijos (ICH Q2 (R1)) analitinių procedūrų validacijos gaires [48]. Validacijos metu nustatyti šie parametrai:

5 pav. Vaistinių medžiagų etaloninių tirpalų mišinio chromatograma su analičių sulaikymo laikais, (min.)

Minutės 1. Acetilsalicilo rūgštis – 11,566

2. Ramiprilis – 13,602 3. Indapamidas – 14,182

(30)

1) Specifiškumas (angl. Specifity);

2) Rezultatų glaudumas/preciziškumas (angl. Precision):

 Pakartojamumas (angl. Repeatability)

 Tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate Precision);

3) Tiesiškumas (angl. Linearity);

4) Aptikimo (angl. LOD – limit of detection) ir kiekinio nustatymo (angl. LOQ – limit of quantification) ribos.

3.2.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos specifiškumas

Specifiškumas – tai gebėjimas vienareikšmiškai nustatyti ir įvertinti analitę net ir esant kitiems junginiams, pvz.: priemaišoms ar skilimo produktams [48]. Metodo specifiškumo įvertinimui buvo lyginamos standartinių ir tiriamųjų medžiagų mišinio chromatogramos, sulaikymo laikai bei ultravioletinės spinduliuotės (UV) absorbcijos spektrai.

B A

6 pav. A. Vaistinių medžiagų etalonų mišinys; B. Vaistinių medžiagų, išgautų iš tablečių, mišinys. 1 – acetilsalicilo rūgštis, 2 – ramiprilis, 3 - indapamidas

Minutės

(31)

Pateiktose chromatogramose (6 pav.) matyti, kad etaloninių ir tiriamųjų tirpalų analičių smailės ir jų sulaikymo laikai sutampa. Junginių identifikavimui nėra trukdančių pašalinių medžiagų smailių.

Įvertinus užregistruotus standartinių ir tiriamųjų medžiagų UV absorbcijos spektrus (7 pav.) taip pat buvo patvirtintas jų atitikimas.

Atliktas standartinių ir tiriamųjų medžiagų chromatogramų sulaikymo laikų ir UV spektrų įvertinimas parodo, kad pritaikytas ESC metodas yra specifiškas ir tinkamas tiriamųjų junginių analizei mišinyje.

7 pav. UV absorbcijos spektrai: A – acetilsalicilo rūgšties standarto, A1 – acetilsalicilo rūgšties tiriamosios medžiagos; B – ramiprilio standarto, B1 – ramiprilio tiriamosios medžiagos, C –

indapamido standarto, C1 – indapamido tiriamosios medžiagos A

A1

B

C

B1

C1

(32)

3.2.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos rezultatų glaudumas

Metodikos glaudumas, arba kitaip – preciziškumas, parodo artumą tarp rezultatų, gautų atlikus to paties mėginio pakartotinius matavimus nustatytomis sąlygomis [48]. Glaudumo įvertinimui buvo vertinamas matavimų pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas. Pakartojamumas buvo įvertintas atlikus standartinių medžiagų mišinio 5 matavimus tą pačią dieną ir tomis pačiomis sąlygomis. Tarpiniam preciziškumui nustatyti per dvi dienas buvo atlikta 10 to paties mėginio matavimų tomis pačiomis sąlygomis. Gautos chromatogramos pavaizduotos 8 ir 9 pav.

9 pav. Tarpinio preciziškumo vertinimo chromatogramos (1 - acetilsalicilo rūgštis, 2 - ramiprilis, 3 - indapamidas)

1

2 3 1

2 3

8 pav. Pakartojamumo vertinimo chromatogramos (1 - acetilsalicilo rūgštis, 2 - ramiprilis, 3 - indapamidas)

Minutės

(33)

Pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo rezultatai įvertinti pagal variacijos koeficientą, arba kitaip – santykinį standartinį nuokrypį (SSN), kuris apskaičiuotas pagal sulaikymo laiko ir smailės ploto vidurkius bei išreikštas procentais. Rezultatų pakartojamumo SSN procentinė išraiška neturėtų viršyti 5 proc., o tarpinio preciziškumo variacijos koeficientas neturėtų viršyti 10 proc. Gauti metodikos glaudumo rezultatai pateikiami 3 lentelėje.

Medžiaga

Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas SSN sulaikymo

laikui, (%)

SSN smailės plotui, (%)

SSN sulaikymo laikui, (%)

SSN smailės plotui, (%) Acetilsalicilo

rūgštis 0,1 1,8 0,1 1,2

Ramiprilis 0,1 1,1 0,1 2,5

Indapamidas 0,1 1,2 0,1 2,2

Pagal gautus rezultatus matyti, kad visų tirtų medžiagų tiek pakartojamumo, tiek tarpinio preciziškumo SSN reikšmės sulaikymo laikui yra vienodos (0,1 proc.) ir mažesnės už SSN reikšmes smailės plotui. Tad junginių sulaikymo laikų reikšmės varijuoja mažiau nei smailės plotų reikšmės.

Pagal pateiktus pakartojamumo SSN smailės plotui rezultatus, didžiausia variacija būdinga acetilsalicilo rūgščiai (1,8 proc.), mažiausia – ramipriliui (1,1 proc.). Pagal tarpinio preciziškumo SSN smailės plotui rezultatus didžiausia variacija būdinga ramipriliui (2,5 proc.), o mažiausia – acetilsalicilo rūgščiai (1,2 proc.).

Pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas atitinka keliamus reikalavimus, nes SSN reikšmės sulaikymo laikui ir smailės plotui neviršija nustatytų ribų. Apibendrinus galima teigti, kad pritaikyta metodika yra tinkama analizuojamų vaistinių medžiagų nustatymui.

3.2.3. Tiesiškumas

Tiesiškumas parodo gebėjimą tam tikrame intervale gauti rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi tiriamosios medžiagos koncentracijai mėginyje [48]. Tiesiškumo įvertinimui buvo pagaminti standartinių medžiagų skirtingų koncentracijų tirpalai ir sudarytos acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido kalibracinės kreivės, pavaizduotos 10–12 pav.

3 lentelė. Metodikos glaudumo įvertinimo rezultatai

(34)

Acetilsalicilo rūgšties kalibracinis grafikas sudarytas 0,03125–1,0 mg/ml ribose, o ramiprilio ir indapamido kalibraciniai grafikai sudaryti 0,03125–0,5 mg/ml ribose.

10 pav. Acetilsalicilo rūgšties kalibracinė kreivė

11 pav. Ramiprilio kalibracinė kreivė

12 pav. Indapamido kalibracinė kreivė

Plotas

Medžiagos koncentracija, mg/ml

Plotas

(35)

Sudarytų kalibracinių kreivių grafikai parodo, kad smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos analizuotame koncentracijų intervale yra tiesiška. Gautų kalibracinių kreivių charakteristikos pateikiamos 4 lentelėje.

Tiriamoji medžiaga Koreliacijos koeficientas (R)

Kalibracinės kreivės lygtis

Tiesiškumo ribos (mg/ml) Acetilsalicilo rūgštis 0,999974 Y = 1,25*10⁶x– 9,90*10³ 0,03125–1,0

Ramiprilis 0,999997 Y = 9,47*10⁶x + 7,79*10³ 0,03125–0,5 Indapamidas 0,999820 Y = 1,50*10⁷x + 1,16*10⁵ 0,03125–0,5

Visų medžiagų koreliacijos koeficiento (R) reikšmės yra didesnės nei 0,99 ir artimos 1, todėl atitinka metodo tiesiškumui keliamus reikalavimus. Apibendrinus rezultatus, galima daryti išvadą, kad pritaikyta ESC metodika yra tinkama acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido mišinio kiekiniam nustatymui.

3.2.4. Aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos

Aptikimo riba yra mažiausias tiriamosios medžiagos kiekis mėginyje, kurį galima aptiki, bet nebūtinai tiksliai įvertinti kiekybiškai. Kiekinio nustatymo riba yra mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį galima pakankamai tiksliai įvertinti. Pagal ICH gaires, vertinant apitikimo ribą, signalo ir triukšmo santykis turi būti 3 arba 2:1, vertinant kiekinio nustatymo ribą – 10:1 [48]. Gautos tiriamųjų medžiagų aptikimo ir kiekinio nustatymo reikšmės pateikiamos 5 lentelėje.

Tiriamoji medžiaga Aptikimo riba (μg/ml) Kiekinio nustatymo riba (μg/ml)

Acetilsalicilo rūgštis 1,399 4,666

Ramiprilis 7,966 20,332

Indapamidas 0,075 0,251

5 lentelė. Acetilsalicilo rūgšties, ramiprilio ir indapamido aptikimo ir nustatymo ribos 4 lentelė. Analizuojamų medžiagų kalibracinių kreivių charakteristikos