LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS
GYVULIŲ GENETIKOS KATEDRA
Gediminas Vagonis
B – LAKTOGLOBULINO GENO POLIMORFIZMAS
VIETINĖSE LIETUVOS AVIŲ VEISLĖSE
Magistro darbas
Darbo vadovas:
dr. J. Kučinskienė
TURINYS
1. ĮVADAS... 5
2. AVININKYSTĖS SITUACIJA PASAULYJE IR LIETUVOJE ... 7
2.1. Lietuvos vietinės avių veislės... 8
2.1.1 Lietuvos vietinės šiurkščiavilnės avys... 9
2.1.2 Lietuvos vietinės juodgalvės avys ... 9
3. AVIŲ PIENAS ... 11
3.1 Avių pieno maistinė vertė... 12
3.2 Avių veislių įtaka pieno kiekybiniams ir kokybiniams rodikliams ... 12
4. AVIŲ NAUDINGŲ POŽYMIŲ GENETINIAI ŽYMENYS ... 14
4.1 Avių mėsingumo genetiniai žymenys ... 14
4.2 Avių atsparumo ligoms genetiniai žymenys... 14
4.3 Genetinė β – LG analizė... 15
4.3.1 β-LG įtaka pieningumo požymiams. ... 19
4.3.2 β-LG variantų poveikis priaugimo bei atsparumo ligoms savybėms. ... 20
5. DARBO ATLIKIMO VIETA IR METODIKA... 21
5.1 DNR skyrimas iš vilnos svogūnėlių. ... 21
5.2 DNR skyrimas iš kraujo ... 21
5.3 DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas. ... 22
5.4 Izoelektrinio fokusavimo metodas (IEF)... 22
5.5 PGR-RFIP... 23
5.6 Statistinė analizė... 23
6. REZULTATAI... 24
7. IŠVADOS (PASIŪLYMAI)... 27
NAUDOTŲ LEIDINIŲ SĄRAŠAS ... 28
PRIEDAI ... 34
PADĖKA ... 35
1. ĮVADAS
Paskutiniais dešimtmečiais genetika kaip mokslas stipriai pasistūmėjo į priekį, pritaikyta daug naujų tyrimo metodų, sudarytas žmogaus genų žemėlapis, tiriami žemės ūkio gyvulių genomai. Panaudojus žmogaus genų žemėlapį, galima žymiai greičiau ištirti gyvulio genomą, nustatyti ekonomiškai naudingus požymius ir genetinius defektus nulemiančius genus ar jų grupes. Šiuo metu tiriant genomą daugiausia dėmesio skiriama galvijams, tuo tarpu avių genomas dar tik pradedamas tyrinėti. Avių skaičius Lietuvoje stipriai sumažėjo lyginant praeito amžiaus pradžią ir pabaigą. Stiprų avių skaičiaus sumažėjimą galėjo lemti tai, kad Lietuvoje didesnis dėmesys buvo skirtas galvijininkystei bei kiaulininkystei, nes Lietuvoje sąlygos palankesnės būtent šioms gyvulininkystės šakoms vystyti. Šiuo metu vėl pradedama domėtis avimis, nes auga avių mėsos bei pieno paklausa. Pastaruoju metu pasaulyje yra išvesta nemažai mėsinės krypties avių veislių, o vilnos krypties veislių avims gerinamos mėsinės bei penėjimosi savybės. Į Lietuvą yra įvežamos Romanovo, Prekosų ir kitų veislių avys, tobulinama Lietuvos juodgalvių avių veislė mėsinių savybių atžvilgiu. Anksčiau tai buvo daroma tik veisimo metodais, bet šiais laikais veislių tobulinimui yra pasitelkiami įvairūs genetiniai tyrimo metodai, kurių pagalba dar net negimus palikuoniui, galima pasakyti ar jis bus produktyvus, ar turės sveikatos sutrikimų. Gyvulininkystėje svarbiausias genetikų uždavinys yra nustatyti biologiškai svarbius ir ūkiškai naudingus požymius nulemiančius genus. Vienas iš įvertinimo metodų yra gyvulių vertinimas pagal genetinius ir fiziologinius žymenis. Šis metodas apima vertinimą pagal kraujo grupes, polimorfines baltymų sistemas ir paskutiniu metu pagal genetinius žymenis. Gyvūnų genotipų skirstymas pagal alelius leidžia nustatyti ,,genus kandidatus”, apsprendžiančius kokybinius požymius. Tokių genų nustatymas leidžia juos panaudoti kaip žymenis žyminčius kokybinius požymius, o tai žymiai padidina selekcinio darbo efektyvumą. Iš ūkiškai naudingų požymių didelį mokslo susidomėjimą kelia pieno baltymus apsprendžiančių genų polimorfizmo tyrimas. Galvijininkystėje jau yra nustatytas ryšys tarp pieno baltymų ir kokybiškai naudingus požymius nulemiančių genų įvairavimo. Kitose pieninės gyvulininkystės šakose tokio pobūdžio tyrimai vyksta ne taip intensyviai (Bočkariov V.V., 1998).
Pasaulyje vyksta naujų veislių bei veislinių grupių kūrimas bei esamų veislių gerinimas. Ieškoma būdų, kaip sukurti produktyvesnes bandas ir jas išsaugoti. Technologijoms žengiant į priekį kuriami nauji atrankos bei gyvūnų veislinės vertės gerinimo principai bei metodai. Paskutiniu metu populiarėjant genetikos mokslui, pasitelkta genetinių žymeklių vertinimo metodika, gerinant vieną ar kitą norimą požymį ypač tokius požymius, kurių pagerinimas ar
išgryninimas yra labai sudėtingas naudojant paprastą fenotipinį atrankos modelį. (Meuwissen and Goddard, 1996; Meuwissen and Van Arendonk, 1992).
Vietinės Lietuvos šiurkščiavilnės ir juodgalvės avys saugotinos pasauliniu mastu ir yra įtrauktos į pasaulio saugotinų veislių knygą „World watch list“(Scherf B.D. (ed.), 2000). Moksliniu požiūriu yra įvertinti Lietuvos juodgalvių avių produktyvumo rodikliai ir padaryta išvada, kad šią veislę reiktų toliau gerinti selekciniais bei genetiniais metodais didinant avių mėsingumą ir vislumą (Zapasnikienė B., 1996)
Darbo tikslas: Įvertinti beta β – laktoglobulino geno polimorfizmą vietinėse Lietuvos juodgalvių avių ir Lietuvos šiurkščiavilnių avių veislėse.
Uždaviniai:
1. Įsisavinti DNR skyrimo metodus, polimerazės grandininės reakcijos– restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (PGR – RFIP) metodą, susipažinti su izoelektrinio fokusavimo (IEF ) metodu.
2. Įvertinti β–laktoglobulino geno alelių polimorfizmą Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos šiurkščiavilnių avių tarpe.
Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių β – laktoglobulino geno polimorfizmo tyrimai atlikti Lietuvos veterinarijos akademijos K.Janušausko Gyvūnų genetikos laboratorijoje, Lietuvos juodgalvių avių veislės β – laktoglobulino geno polimorfizmo tyrimus atliko dr. I. Tapio Justus-Liebig Universiteto Gyvulių veisimo ir genetikos departamente Giessene (Vokietija) ir gautus duomenis leido naudoti ruošiant bendrą straipsnį, tezes tarptautinei konferencijai bei magistro darbą.
2. AVININKYSTĖS SITUACIJA PASAULYJE IR LIETUVOJE
Šių dienų naminės avys susiformavo domestikavimo proceso dėka, kurio metu žmogaus reikmėms buvo prijaukinta tik nedidelė laukinių avių populiacijos dalis. Tačiau vėlesnės izoliacijos, genų dreifo, natūralios ir dirbtinės selekcijos įtakoje susiformavo genetiškai skirtingos avių veislės, prisitaikiusios prie skirtingų gamtinių ir laikymo sąlygų (Grigaliūnaitė I., 2003).
Nors pirmosios avys buvo prijaukintos daugiau kaip 8 tūkst., metų pr. Kr., tačiau mėsinių avių atsiradimą sąlygojo vėlesnės socialinės ir ekonominės prielaidos. Greit bręstančių mėsinių avių veislės susiformavo tik XVIII-XIX a., išsivysčius kapitalizmui. Pradžioje visos naminės avys buvo mišrinamos tarpusavyje, ir taip susiformavo pusiau plonavilnių ir pusiau šiurkščiavilnių avių veislės (Zapasnikienė B., 2003).
Vietinės avių veislės gerai adaptavosi prie esamo klimato sąlygų, pašaro, buvo atsparios ligoms, tenkino vietos gyventojų maisto bei kitų buityje naudojamų žemės ūkiokilmės produktų poreikį (Grigaliūnaitė I., 2003).
Šiuo metu didžiausią perspektyvą turi vislios, greit bręstančios ir riebalų nekaupiančios mėsinių veislių avys. Avienos ir ėrienos gamybai prekinėse mėsinio tipo avių bandose plačiai naudojamas gamybinis kryžminimas (pramoninis mišrinimas). Avių augintojų tikslas yra, panaudojant genetines bei technologines priemones, siekti, kuo didesnio raumeningumo, sunaudojant kuo mažiau pašarų (Zapasnikienė B., 2003).
Sparti pramonės plėtra, pasauliniu mastu suvienodinti žemės ūkio gyvulių laikymo ir veisimo standartai bei nuolatos didėjantis poreikis žemės ūkio produktams, paskatino kurti modernias gyvulininkystės sistemas, susijusias su keleto produktyvių komercinių veislių veisimu, kai tuo tarpu vietinėms mažo produktyvumo žemės ūkio gyvulių veislėms iškilo išnykimo grėsmė (Grigaliūnaitė I., 2003).
Istoriniuose šaltiniuose nurodoma, kad II tūkst., pr. Kr. pradžioje Lietuvos teritorijoje, sprendžiant iš likusių gyvulių kaulų, tuometiniai gyventojai jau turėjo prisijaukinę avį. Daugiau ir tikslesnių žinių apie avininkystės raidą pateikiama vėlesniuose dokumentuose (Duisburgo kronikoje, įvairiuose metraščiuose ir kt.). Ilgą laiką Lietuvos avių ūkis buvo ekstensyvus, dominavo vietinės šiurkščiavilnės avys. Buvo veisiamos Polimeranijos, lenkiškosios ilgauodegės, liesauodegės (ovis leptura) ir šiaurės trumpauodegės (ovis brachyurae borealis) avys. Tai menko produktyvumo, nereiklios ir gerai prisitaikiusios prie vietos sąlygų avys.
XVIII a. Lietuvoje pradeda reikštis Vakarų Europos įtaka. Lietuvos iždininkas A. Tyzenhauzas įvežė į Lietuvą plonavilnes rambuljė, negrečių ir lektoralų veislių avis. Jis ragino
ir kitus įsivežti iš užsienio veislinių avių ir jomis gerinti vietines bandas. Tačiau importinės avys Lietuvoje neišplito. Daugiausia jų būta Kauno ir Šiaulių gubernijų dvaruose.
1912 m. vykusiame pirmame Rusijos avininkystės suvažiavime buvo pasiūlyta Pabaltijo gubernijose plėtoti mėsinę avininkystę ir steigti anglų mėsinių avių veislynus. Deja, šis suvažiavimo nutarimas praktiškai nebuvo įgyvendintas (Zapasnikienė B., 2003).
Rio de Žaneire 1992 metais Lietuva pasirašydama Biologinės įvairovės konvenciją įsipareigojo saugoti nacionalinius naminių gyvūnų genetinius išteklius. Todėl yra tikslinga atlikti genetinius tyrimus vietinėms gyvulių rūšims, jų tarpe ir Lietuvos juodgalvėms bei Lietuvos vietinėms šiurkščiavilnėms avių veislėms, nustatyti genetinius žymenis žyminčius požymius įtakojančius gyvulių ir jų produkcijos kokybinius ir kiekybinius rodiklius. Atlikus tokius tyrimus būtų žinomos veislių panaudojimo galimybės tolimesniam gyvulininkystės plėtojimui. Išsaugant veislinę gyvūnų įvairovę užtikrinamas kur kas didesnis gyvūnų genetinis potencialas ir įvairesnės jo panaudojimo galimybės. Lietuvoje vietinėmis avių veislėmis laikomos Lietuvos vietinės šiurkščiavilnės ir Lietuvos juodgalvės avys.
2.1. Lietuvos vietinės avių veislės
VĮ „Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras“ duomenimis Lietuvoje didžiausią auginamų avių skaičių sudaro Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių veislių avys (1 lentelė).
1 lentelė. Lietuvoje auginamos avių veislės (ŽŪIKVC duomenys 2005 m sausio 1 d.). Eil.
Nr. Veislės pavadinimas Gyvulių skaičius
1. Lietuvos juodgalvės 13 486
2. Lietuvos viet. šiurkščiavilnė 13 190
3. Prekosai 1 205 4. Romanovo 6 358 5. Ostfryzai (melžiamos) 339 6. Latvijos tamsiagalvės 5 7. Vokietijos juodgalvės 585 8. Sufolkai 718 9. Berišon-Diušer 166 10. Tekseliai 49 11. Vokietijos merinosai 54 12. Dorperio 18 13. Šarole 223 14. Lenkijos žemumų 60 15. Vokietijos baltagalvės 31 16. Oksfordo žemumų 100 Viso: 36 587
2.1.1 Lietuvos vietinės šiurkščiavilnės avys
Šios mažo produktyvumo nereiklios avys buvo auginamos Lietuvoje XIX a. pabaigoje – XX a. pradžioje. Nuo vienos avies buvo prikerpama 1 – 1,5 kg pilkos, baltos, rusvos, juodos, šiurkščios vilnos. Avys svėrė po 30 – 40 kg, vedė po 2 – 3 ėriukus. Jau 1935 m. buvo planuojama šią veislę pakeisti produktyvesne, o nuo 1949 m. uždrausta avis kergti su vietinių šiurkščiavilnių veislės avinais. Todėl 1995 m., kad neišnyktų, Lietuvos gyvulininkystės institute pradėjus formuoti vietinių avių bandelę, buvo sunku rasti grynaveislių gyvulių. Pradžioje buvo nupirktos 2 ėriavedės ir 1 avinas. Šiuo metu institute yra laikoma apie 30 avių ir tiriamos jų biologinės – ūkinės ypatybės.
Dabartinės Lietuvos šiurkščiavilnės avys yra stambesnės (sveria 40-50 kg), nuo jų prikerpama daugiau (iš viso apie 3 kg 30 cm ilgumo) ir plonesnės vilnos, palyginti su aborigeninėmis avimis. Beje, jas reikia kirpti 2 kartus per metus – pavasarį ir rudenį. Nors šios avys už aborigenines yra produktyvesnės ir greičiau bręsta, tačiau jos liko atsparios ligoms ir nereiklios laikymo sąlygoms, taip pat išlaikė vietinių avių išvaizdą (6 – 65 cm ilgumo ragus, pilką, rusvą ir juodą vilną, siaurą nosį, plačią kaktą ir trumpokas ausis), nesezoninę rują (rujoja ištisus metus, gali ėriuotis 2 kartus per metus) ir atvesti po 1 - 3 ėriukus. Atvesti jaunikliai sveria 2,5-3,0 kg, nujunkyti – 18 – 23 kg, metiniai – 34 – 41 kg. Dažniausiai šios avys ėriuojasi kas 7 – 10 mėnesių. Vietinės avys nekaupia riebalų, nėra mėsingos, jų skerdenos išeiga tėra 41 %.
Gyvulininkystės institute saugoma genofondinė vietinių avių banda jau kelinti metai yra pripažinta veisline. Pastaruoju metu jau yra pakankamai gyvulių, kad būtų galima išlaikyti šios veislės genealoginę struktūrą. Todėl kasmet čia galima įsigyti po keletą avių veislei. Be to, po keletą šios veislės avių yra laikoma Kauno zoologijos sode bei Lietuvos liaudies buities muziejuje Rumšiškėse.
Šios egzotiškos avys labai tiktų kraštovaizdžiui pagyvinti nacionaliniuose parkuose, kaimo turizmu užsiimančiose sodybose ir kitose žmonių lankomose vietose (Zapasnikienė 2002 a).
2.1.2 Lietuvos vietinės juodgalvės avys
XX a. viduryje mišrinant vietines šiurkščiavilnes avis su vilniniais Anglijos šropšyrais ir mėsiniais Vokietijos juodgalviais avinais, buvo išvesta Lietuvos juodgalvių avių veislė. Nuo pat veislės sukūrimo pradžios avys buvo gerinamos produktyviais importinių veislių avinais (1958 m. iš Anglijos buvo įvežti 5 oksfordaunų ir 5 Sufolkų veislės, o 1961 m. – paskutinį kartą įvežti
6 Vokietijos juodgalviai avinai) ir atliekant griežtą gyvulių atranką bei porų paranką. Todėl Lietuvos juodgalvės gana mėsingos, greitai bręsta ir jau pirmaisiais metais jas galima parduoti mėsai. Skerdenos išeiga sudaro apie 50 %. Suaugusios avys sveria 50 – 60 kg, avinai – 80 – 90 kg. Nuo jų prikerpama po 3 – 4 kg 8 – 10 cm ilgio ir 30 – 40 mikrometrų storio baltos vilnos. Plautos vilnos išeiga – 48 – 66 %.
Pačios geriausios grynaveislės juodgalvės avys yra sukoncentruotos avių veislyne – VĮ „Šeduvos avininkystė“.
Lietuvos juodgalvių avių veislė yra gana perspektyvi, nes priklauso sunkiasvorių avių kategorijai. Deja keletą paskutinių dešimtmečių šios avys buvo veisiamos grynuoju veisimu, tuo tarpu latviai, estai, vokiečiai ir kiti išmėgino visus kryžminimo variantus su importiniais mėsinių veislių gyvuliais.
Taigi dabartinės Lietuvos juodgalvės avys yra mažesnio produktyvumo negu Estijos ir Latvijos tamsiagalvės, ypač Vokietijos juodgalvės, Sufolkai, Šropšyrai, Tekseliai ir kitų mėsinių veislių avys. O kaip žinia, šiuo metu pačios perspektyviausios yra mėsinės, greitai bręstančios, vislios, riebalų nekaupiančios avys. Todėl Lietuvos juodgalves būtina kergti su Vokietijos juodgalviais, Sufolkais ar kitais mėsingais avinais ir tokiu būdu pradėti kurti perspektyvų mėsinės avies modelį. (Zapasnikienė B., 2002 a).
Įvertinus avių amžiaus bei ėriavimosi sezono įtaką vislumui ir prieauglio svoriui, nustatyta, kad Lietuvos juodgalves avis tikslingiausia kergti vasaros pabaigoje ir bandoje laikyti kuo daugiau 4-6 metų amžiaus ėriavedžių (Zapasnikienė B., 2002 b). Įvertinus Lietuvos vietinių avių veislių genetinę įvairovę mikrosatelitinių žymeklių ir mitochondrinės DNR sekos palyginimo pagalba, nustatyta, kad Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių ir Lietuvos juodgalvių avių populiacijos pasižymi didele viduveisline įvairove, o Lietuvos vietinės šiurkščiavilnės avys sudaro genetiškai vientisą populiaciją (Grigaliūnaitė I., 2003).
3. AVIŲ PIENAS
Daugelyje šalių avių pienas vartojamas maistui. Jis geriamas šviežias arba perdirbamas į įvairių rūšių sūrius ar jogurtą. Avių pienas arba jo produktai paplitę Prancūzijoje, Anglijoje, Turkijoje, Italijoje, Portugalijoje, Ispanijoje, Bulgarijoje, Rumunijoje, Kroatijoje, Čekijoje, Škotijoje, Olandijoje, Graikijoje, Belgijoje, Moldovoje, Armėnijoje, Uzbekijoje, Tadžikijoje, Maroke, Irane, Irake, Izraelyje, Indijoje, ir kitose šalyse. Čia melžiamos įvairiausių veislių avys.
Kasmet pasaulyje iš avių primelžiama apie 8 mln. tonų pieno. Avių pienas yra vienas maistingiausių produktų, kuriame yra daug riebalų, baltymų ir vitaminų. Jis beveik dvigubai riebesnis nei karvių ir ožkų pienas, o pieno riebalai gerai pasisavinami. Be to, pieno riebaluose nėra karotino pigmento, todėl avių pienas yra baltas.
Avių pienas labai tinkamas sūrių gamybai, nes jame yra daug kazeino, išrūgų baltymų, albumino ir globulių, kurie dalyvauja susidarant sutraukai ir pagerina gaminio maistinę vertę. Norint gauti 1 kg kieto sūrio, reikia tik 4 l avių pieno.
Iš avių pieno pagamintas jogurtas yra riebus, ne toks rūgštus ir labai tinka vaikų bei pagyvenusių žmonių mitybai. Tačiau iš avių pieno sumušti sviestą yra sunku. Be to, jis turi avies pieno prieskonį, būna minkštas ir nepatvarus. Specifinį skonį ir aromatą pienui ir jo produktams teikia pieno riebalai.
Kadangi avių pienas yra labai koncentruotas ir homogeniškas, tai gerai tinka ilgalaikiam užšaldymui. Ir labai žemoje temperatūroje tiek pienas, tiek iš jo pagaminti produktai ir atšildyti nepraranda ankstesnių savybių, neatsiskiria riebalai ir nepakinta skonis.
Avių pienas nesukelia žmonėms alergijos, o jame esanti oroto rūgštis gali pagelbėti nuo vėžio ligų. Taip pat jame gausu vitaminų ir mineralinių medžiagų, ypač kalcio (Zapasnikienė B. 2002a).
Palyginus su kitų naminių gyvulių pienu, avių pienas koncentruotesnis ir riebesnis (žr. 2 lentelę). Jame gausu amino rūgščių, B grupės, A, C, D, E, vitaminų ir mineralinių medžiagų, ypač kalcio.
2 lentelė. Pieno cheminė sudėtis % Naminiai
gyvūnai medžiagos Sausosios Riebalai Baltymai Pieno cukrus Mineralinės medžiagos Kilokolorijos
Avis 17,9 6,7 5,8 4,6 0,8 1060
Ožka 13,0 4,1 3,5 4,6 0,8 761
Karvė 12,5 3,8 3,3 4,7 0,7 696 Kumelė 10,0 1,0 2,0 6,7 0,3 448 Kiaulė 18,6 7,2 5,7 4,9 0,8 1212
Nors pačios pieningiausios buvo ostfryzų veislės avys ir jų mišrūnės, tačiau vietinių avių piene buvo daugiau sausųjų medžiagų ir riebalų. Pieninių veislių avys duoda daugiau, tačiau kur kas liesesnio pieno.
3.1 Avių pieno maistinė vertė
Žemės ūkio federacijos biuro (Commonwealth Agricultural Bureaux (CAB) pasauliniu mastu yra paskelbęs nemažai publikacijų apie avių pieną, avių sūrį ir alergijas kurias iššaukia avių pienas, tačiau šių publikacijų skaičius toli gražu neprilygsta straipsnių apie karvių pieną skaičiui. Žinoma yra žymiai daugiau publikacijų skelbtų ankstesniais metais, tačiau jos paremtos kur kas paprastesniais tyrimo metodais. Straipsniai apie avių pieno mitybinę vertę rodo tik rodiklių augimą, tačiau trūksta juose detalesnės informacijos apie specifiškesnius unikalius komponentus įtakojančius žmonių mitybą, taip pat prekybiniuose žurnaluose yra nemažai pranešimų, kurie dar laukia mokslinių pagrindimų.
Dauguma vadovėlių apie pieną yra orientuoti į galvijų pienininkystę, bei į studijas apie žmogaus pieną (Kon ir Cowie, 1961; Falconer, 1971; Renner, 1982; Gravert, 1983). Didžioji dauguma informacijos apie pieninės avininkystės tyrimus randama tik įvairiuose biuleteniuose bei Tarptautinės pienininkystės federacijos seminarų vykusių Graikijoje nuo 1985 iki 1995 protokoluose (IDF, 1983; 1986; 1996).
3.2 Avių veislių įtaka pieno kiekybiniams ir kokybiniams rodikliams
Tarp daugiau nei 25 pripažintų pieninių avių veislių, kurių daugiausiai yra Viduržemio jūros regione, vyrauja didelė genetinė įvairovė pieno sudėties, laktacijos ilgio, pieno kiekio ir pieno produkcijos sezoniškumo atžvilgiu. Pieno išeiga tarp veislių gali skirtis apie 10 kartų laktacijos ilgis gali įvairuoti 100 proc., tai rodo, kad genetinis potencialas, norint atlikti atranką, yra pakankamai didelis. Netgi normaliai avių pieno sudėtis gali svyruoti tarp 6-9 proc., riebumo, 4-7 proc., baltymingumo, 4-6 proc., laktozės bei 17-21 proc., viso sausų medžiagų (5 lentelė žr. priede) (Dario et al., 1995; Margetin, 1996; Simos et al., 1996). Sūrių gamintojams labai svarbūs yra avių pieno baltymų polimorfizmą lemiantys genai, nes nuo jų priklauso, varškės stangrumas, koaguliacijos trukmė, kazeino kiekis ir sūrio išeiga. Daugybė karvių ir ožkų pieno baltymų tyrimų parodė, kad genetinė atranka baltymų polimorfizmo atžvilgiu duoda naudą sūrių gamyboje, tačiau apie avių pieno baltymus bei jų polimorfizmą žinoma dar labai nedaug. Naujos analitinės technologijos per paskutinius 5 metus įgalino nustatyti avių pieno baltymų polimorfizmą (Pirisi et al., 1999b). Avių pieno baltymai pagrinde susideda iš: kazeinų
ir išrūgų baltymų beta – laktoglobulino, alfa – laktoalbumino, serumo albumino bei imunoglobulino. Kazeinai būna keturių pagrindinių frakcijų, alfa s-1, alfa s-2, beta ir kapa, kiekvienas iš jų turi po keletą genetinių polimorfizmo variantų, kurie priklauso nuo baltymų fosforiliacijos lygio, amino rūgščių kaitos, gliukosiliacijos skirtumo, elektros krūvio pokyčių, molekulinio svorio ir hidrofobiškumo. Alfa s-1 kazeino polimorfizmas apsprendžiamas heterogeniškai kitaip tariant jį lemia keletas genų A, B, C, D, E arba F genų (Pirisi et al., 199b), kurie perduodami iš abiejų tėvų. D genas Lacaune avių veislės populiacijoje pasireiškia <0.01 dažnumu, o Sarda avių populiacijoje 0.03, šis genas gali būti susijęs su mažu pieno riebumu, mažu baltymingumu bei sunkiai iš tokio pieno formuojasi varškė. CC avių piene buvo 3,5 proc., didesnis kazeino kiekis nei CD ir 8,6 proc., nei DD avių. CC pienas taipogi pasižymėjo aukštesniu baltymingumu, riebumu, mažesnio diametro kazeino micelėmis ir geresnėmis sutraukimo savybėmis. Yra aptikti 3 beta – laktoglobulino genotipai, iš kurių homozigotinis AA davė didesnę sūrio išeigą buvo riebesnis nei AB ar BB genotipą turinčių individų (Pirisi et al., 1999a). Kapa kazeinas turi 2 variantus A ir B, Alfa s-2 kazeinas 3 variantus A, B ir C, ir beta kazeinas 3 variantus beta-1, 2 ir 3 (Martin and Addeo, 1996).
4. AVIŲ NAUDINGŲ POŽYMIŲ GENETINIAI ŽYMENYS
4.1 Avių mėsingumo genetiniai žymenys
Panaudojus PGR ir viengubo pluošto konformacijos polimorfizmo (SSCP) tyrimo metodus, IGF-I gene buvo ieškoma mutacijų, kurios gali įtakoti kūno masės priaugimą ir gimstančių ėriukų kiekį. Insulino tipo augimo faktoriai yra baltymai, ir jie yra priskiriami baltymams, transportuojantiems maisto medžiagas kraujyje. Pavadinimas „insulino tipo augimo faktorius“ yra priskiriamas toms molekulėms, kurios yra panašios savo struktūra į patį insuliną. Šiuo metu būtent šioms mikrodalelėms yra skiriamas labai didelis dėmesys gyvulininkystės tyrimų sferoje, nes jos turi labai didelę įtaką įvairiems metaboliniams procesams gyvulių organizme. Insulino tipo augimo faktorius–I (IGF-I) yra polipeptidas, didinantis ląstelių proliferaciją ir cukraus įsisavinimą organizme. Kadangi DNR yra sukaupta visa ląstelės informacija, tai būtų galima ieškoti DNR mutacijų, nulemiančių IGF-I baltymo išraišką. Ankstesni tyrimai parodė, kad galvijų IGF-I genas turi du alelius. Nustatyta, kad vienas alelis nulemia didelę IGF-I koncentraciją kraujo serume, tuo tarpu kitas mažą. Taigi prieita išvados, kad šie aleliai galėtų būti naudojami kaip markeriai IGF-I koncentracijos kraujo serume nustatymui. Remiantis atliktais galvijų tyrimais, tie patys metodai (SSCP) ir tie patys pradmenys buvo panaudoti ieškant šių markerių avių genome. (Svoboda M.E., and Van Wyk J.J., 1983; Poggi C., Le-Marchand B., and Zapf J., 1979)
4.2 Avių atsparumo ligoms genetiniai žymenys
Ieškant asociacijų tarp genetinių markerių ir atsparumo ligoms, susikoncentruota ties atsparumu nematodams. Avyse yra dviejų tipų hemoglobino aleliai A ir B ir tyrimais nustatyta, kad gyvuliai turintys AA (HbAA) tipą yra atsparesni H.cotortus infekcijai už gyvulius, turinčius heterozigotinę alelių formą HbAB, kurie savo ruožtu yra atsparesni už gyvulius, turinčius HbBB. Tačiau kiti tyrinėtojai nesugebėjo rasti patvirtinančių įrodymų. Teigiama, kad hemoglobino tipas negali būti traktuojamas kaip rezistentiškumo infekcijoms markeris – bent jau H.cotortus infekcijos atžvilgiu. (Albers G.A.A. and. Gray G.D., 1986; Blattman A.N., Hulme D.J., Kinghorn B.P., Woolaston R.R., Gray G.D. and Beh K.J, 1993).
Taip pat MHC (major histocompatibility complex) komplekso genai yra priskiriami prie genų kandidatų, kurie yra atsakingi už atsparumą įvairių susirgimų atžvilgiu, nes ši genų grupė yra stipriai susijusi su imunine sistema. Buvo ištirtas MHC polimorfizmas ir jo vaidmuo atsparumui nematodams: 1 MHC variantas yra susijęs su CD-8 ląstelių diferenciacija ir citotoksiškais T limfocitais. 2 MHC varianto molekulės yra atsakingos už antigeno atsiradimą ir
C–D4 ląstelių diferenciaciją. Šiuos tyrimus 1992 metais atliko Wetherall ir Groth bei Hohenhaus ir Outterridge 1995 metais. 1985, 1986, 1988 metais Outterridge ir kiti mokslininkai nustatė, kad esant avių 1 MHC varianto antigenams, žymiai padidėja atsparumas T. colubriformis. Panašūs pastebėjimai buvo užfiksuoti mokslininko Stear ir kitų 1995 metais, nustačius teigiamą 1 MHC varianto įtaką Ostertagia circumcicta atsparumui. Tačiau mokslininkas Cooper ir kiti 1989 metais nerado jokių atsparumo H. contortus įrodymų šešių avinų palikuonyse. R.R. Woolaston, G.D. Gray, H.W. Raadsma ir P.M. Outteridge (nepublikuoti duomenys) taip pat negavo patikimų įrodymų atsparumo vidaus parazitams 40-ies avinų 400-uose palikuonių. Taip pat Douch ir Outteridge 1989 ir Outteridge 1991 metais nustatė, kad avių leukocitų antigenas nepadidina atsparumo visais atvejais. Tačiau visiškai atmesti šios hipotezės negalima, nes ji iki galo dar nėra įrodyta. Antrojo MHC varianto įtaka atsparumui dar labiau miglota. Hulme ir kolegos 1991 metais nustatė, kad 2 MHC variantas turi įtakos atsparumui. Tyrimui panaudota žmogaus komplementarios DNR MHC DQA, DQB ir DRB mišinys bei pridėta fermentų Taq I, PvuII ir HinIII ir tai parodė, kad genai, esantys MHC komplekse, yra stipriai susiję su atsparumu T. colubriformis infekcijai. 1993 metais Blattman ir kiti nurodė ryšį tarp MHC 2 varianto polimorfizmo, aptikto panaudojus žmogaus MHC tyrimo duomenis, ir atsparumo H. contortus infekcijai Merinosų veislės avių šeimoje (Cooper D.W., Van Oorschot R.A.H., Piper L.R. and Le Jambre L.F.,1989). Smarkaus molekulinės genetikos vystymosi dėka avininkystėje, analizuojant visą genomą - nustatytų potencialių markerių vaidmuo, norint rasti reikiamus genus, yra tiesiog neįkainuojamas mokslo pasiekimas, galimas panaudoti praktikoje (D.W., Van Oorschot R.A.H., Piper L.R. and Le Jambre L.F., 1989; Hulme D.J., Windon R.G., Nicholas F.W. and Beh K.J., 1991; Outerridge P.M., 1991).
4.3 Genetinė β – LG analizė
Pieno baltymų genų polimorfizmo genų ištyrimas kelia didelį susidomėjimą mokslo ir praktikos srityje. Jau nustatytas galvijų pieno baltymų variantų ryšys su ūkiškai naudingais požymiais. Su kitomis gyvūnų rūšimis šie darbai dar nėra taip intensyviai atliekami.
β – LG pirmąkart išskirti 1934 m. kristaline forma iš galvijų pieno (Palmer A.H.., 1934) nuo to laiko šis baltymas randamas įvairių gyvūnų rūšių piene. Šiuo metu β – LG jau aptiktas karvių (Aschaffenburg R., Drewry J., 1955), ožkų (Askonas V.A., 1954), avių (Bell K., McKenzie H.A., 1964;1967), buivolų (Sen A., Sinha N.K., 1961), kiaulių (Kessler E., Brew K., 1970), muflonų (Godovac-Zimmermann J. et al., 1987), arklių (Conti A et al., 1982), piene, tačiau graužikų bei žmonių piene β – LG nenustatytas. β – LG pirminė struktūra nustatyta pas galvijus (Braunitzer G. et al., 1972; Frank G., Braunitzer g., 1967), ožkas (Preaux g. et al., 1979
b), avis (Kolde H. J., Braunitzer G., 1983 b; Preaux G. et al., 1979 a), muflonus (Godovac-Zimmermann J. et al 1987).
Pas porakanopius ir kengūras β – LG sutinkamas kaip stabilus dimeras kai pH 3,0 ir 7,0, tuo tarpu vienkamerinio skrandžio gyvūnai turi tiktai monomerinį β – LG (Liberatori J., 1977). Pas atrajotojus dimeras disocijuoja į dvis sudėtines dalis kai rūgštinė terpė mažesnė už pH 3,0 (Jeness R., 1982).
Avių β – LG susideda iš 162 amino rūgščių (Bell K., et al., 1968; Kolde H. J., Braunitzer G., 1983). Neskaitant keturių tarpusavyje dvejomis disulfidinėmis jungtimis susijungusių cisteino molekulių yra penktoji cisteino molekulė su laisva tioline grupe (Bell K. et al., 1968).
Lyginant visus šiuo metu jau sekvenuotus baltymus išaiškėja, kad jų pirminė struktūra sutampa tik 13 % avių β – LG B variantas identiškas muflonų β – LG, nuo ožkų skiriasi tik viena amino rūgštimi ir nuo galvijų β – LG aštuoniomis amino rūgštimis. Buivolo, avies ir ožkos β – LG C variantas yra identiškas arba atitinkamai skiriasi nuo galvijų β – LG tik vienu amino rūgšties pasikeitimu baltymo pradžioje ir pabaigoje (Comvin E. et al., 1977). Bisenov U.K. (1992) parodė, kad avių ir galvijų β – LG genai yra beveik visiškai homologiški ir gali molekulinėje hibridizacijoje vieni kitus pakeisti panaudojant juos kaip zondus. Bell K. McKenzie H.A. (1964, 1967) atskleidė β – LG polimorfizmą avių piene, ko pagrindas yra vienos amino rūgšties pasikeitimas dvidešimtoje pozicijoje (Godovac-Zimmermann J. Braunitzer G., 1987; Kolde H.J., Braunitzer G., 1983 a,b). A variantas turi tirozino likutį tuo tarpu B variante toje vietoje yra histidinas. Erhardt G. et al. (1989) pas merinosų tipo avis aptiko C variantą, kuris yra atvirkščias B variantui su papildomu amino rūgšties pakeitimu 148 pozicijoje (Arg>Gln). Šitie baltymų variantai koduojami autosominiame lokuse kodominantiniais aleliais, kurie paveldimi pagal Mendelio dėsnius (Bell K., McKenzie H. A., 1967). Polimorfizmas aptiktas pas visų rūšių gyvūnus, tačiau dar neatrastas pas ožkas, buivolus ir kengūras (Godovac-Zimmermann J. et al., 1987; Presnell B. et al., 1990). Pas arklius (Godovac-Zimmermann J. et al., 1985 b) heterozigotiškumas tarp variantų aiškinamas vieno geno alelio mutacijomis, o skirtingų genų buvimas keletu alelių kiekviename lokuse.
Mercier J.C. et al. (1985), Gaye P. et al. (1986) iš laktuojančių avių tešmens išskyrė mRNR ir nustatė nukleotidinę kDNR β – LG seką. Avies β – LG mRNR susideda iš 540 nukleotidų koduojančių signalinį peptidą bei struktūrinį baltymą. 5’ – galas ir nekoduojantis mRNR 3’ – galas susideda atitinkamai iš 39 ir 206 nukleotidų + apie 20 nukleotidų.
Polimorfizmas aptiktas amino rūgšties kodone 20 (His>Tir), o taip pat amino rūgšties pozicijoje 85 (Acn>Asn) (Bočkariovas V.V., 1998).
Genetinė avių β – LG struktūra pilnai ištirta Ali S., Klark A.J. (1988) ir Harris S., et al. (1988). Avies β – LG genas susideda iš 4662 nukleotidų, susiskirstęs į 6 nekoduojančius intronus ir 7 koduojančius egzonus. Genas aptiktas 11 chromosomoje (Ansari et al., 1994; Erchardt G. et al., 1994; Hayes H.C., Petit E. J., 1993). Dviejuose sektoriuose nustatyti bazių susikeitimai (amino rūgštis 20 : His> Tir; amino rūgštis 85: Asp>Asn) (Ansari H.A. et al., 1994). Presnell B. (1990) panaudodamas skystąją chromatografiją, pakartotiniu bandymu nesugebėjo patvirtinti polimorfizmo 85 pozicijoje. Mutacija įrodyta tik po bandymų su laboratorinėmis transgeninėmis pelėmis panaudojant genų persodinimą. Transgeninės pelės savo piene gamino avių β – LG dideliais kiekiais (Wilde C.J. et al., 1992). Šių transgeninių pelių tyrimai parodė, kad specifinės branduolinių faktorių reguliuojančios genetinę ekspresiją jungtys, yra panašios kaip pavyzdžiui MGF (pieno geležies faktoriaus), MPBF (pieno baltymų surišimo faktorius), PMF (nėštumas – specifinis žinduolių branduolinis faktorius) ir MAF (žinduolių ląsteles aktyvuojantis faktorius), tik dalinai aptinkami pernešamajame promotoriniame regione. (Bočkariovas V.V., 1998).
Ali S. et al., (1990) endonukleazės Hind III ir Sph I fermentų pagalba nustatė restrikcinių avių β – LG fragmentų ilgio polimorfizmą (RFIP). Sph I alelyje B turi restrikcinę vietą, tuo tarpu A alelyje tokia vieta neaptikta. Lyginant β – LG amino rūgščių sekas matomas beveik visiškas homologiškumas su žmogaus retinolį rišančiais baltymais (RBP) (Godovac-Zimmermann J. et al., 1985 b). Rentgenokristalografinė trimatė struktūrinė analizė parodė, kad galvijų ir avių β – LG yra giminingi (Monaco H.L. et al., 1987).
Aptikta, kad sutampa ne tik trimatė struktūra, bet ir genetinės struktūros yra beveik vienodos (Ali S., Clark A.J., 1988). Abu proteinai susideda iš aštuonių antiparalelinių β grandinių su išgaubta struktūra (grandinės A-H), po jų seka triskart susisukusi alfa grandinė ir kita beta grandinė (I). Grandinės tarpusavyje išsidėstę konuso pavidalu. Ortotrombinėje β-LG kristalo formoje, I grandinė sudaro dimerus su atitinkama kita monomerine polipeptidine grandine (Papiz M.Z. et al., 1986)
Manoma, kad biologinė β-LG funkcija yra pernešti vitaminą A. Šią hipotezę patvirtina retinolio β-LG komplekso receptorių atradimas mažų veršelių skrandyje (Papiz M.Z. et al,. 1986). Tačiau in vitro atrajotojų β-LG suriša ilgagrandinines riebiąsias rūgštis (Spector A.A., Fletcher J.C., 1970; Perez M.D. et al., 1989, 1993) bei trigliceridus (Smith L.M. et al., 1993). Diaz de Villegas M.C. et al., (1987) parodė, kad šis išrūgų baltymas in vivo suriša įvairius
lipidus pagrinde ilgagrandinines riebiąsias rūgštis, kurios konkuruoja su retinoliu (Puyol et a., 1991). Be viso to β-LG stimuliuoja prieskrandžio arba stemplinės lipazės aktyvumą (Perez M.D. et al., 1992, 1993). Ši lipazė ypač svarbi ką tik gimusiam palikuoniui, nes pankreatito lipazė bei tulžies rūgšties druskos yra sintetinamos labai mažais kiekiais. Prieskrandinė lipazė tiesiogiai veikia pieno riebalų lašelius ir tokiu būdu juos padaro labiau prieinamus pankreatininei lipazei (Bernback S. et al., 1987). Dėl laisvų riebiųjų rūgščių, kurios veikia kaip inhibitoriai surišimo ir transportavimo β-LG sudaro sąlygas jaunikliams virškinti riebalus. (Bočkariovas V.V. 1998)
β-LG labai stabilus bei atsparus rūgštims ir virškinamiesiems fermentams ir dėl to pereina per skrandį be žymesnių funkcinių bei struktūrinių pakitimų (Reddy L.M. et al., 1988). Baltymo molekulės ir jo peptidų fragmentai gali pereiti per žarnyno sieneles tokiu būdu sukeldamas alergines reakcijas naujagimiams (Makinen-Kiljunen S., 1994). β-LG laikomas potencialiu alergenu tiek karvių tiek avių piene (Freier R. et al., 1969). Aukštas antikūnų titras prieš β-LG ir α-laktoalbuminą nustatytas gyvulių sergančių diabetu kraujo serume (tipas I). Šie du proteinai sudaro palankią terpę vystytis insulinu gydomam diabetui (Ball G. et al., 1994).
Viena svarbiausių β-LG technologinių savybių yra reakcija su κ-kazeinu ant micelės sienelės veikiant temperatūrai (lėtas pieno sutraukimas) bei gelio sudarymas serumo tirpaluose kaitinant. κ-kazeino ir β-LG kompleksas bei didelės β-LG koncentracijos neigiamai veikia pieno sutraukimo greitį bei jo atsparumą kaitinimui (Pearce R.J., 1979).
β-LG naudojamas kaip indikatorius tiriant pieno ir jo produktų sufalsifikavimo atvejus (De Frutos M. et al., 1992; De Jong N. Et al., 1993).
Pas avis aptinkami 2 A ir B β-LG variantai. Jie aptikti pas visas tirtas avių veisles. Trečiasis tipas C, Erhardt G. (1989) nuomone rastas tik pas merinosus ir jų mišrūnus. Vienok Alijev G.A. ir Kolotiova R.S. (1973) rado C variantą pas šiurkščiavilnes Tadžikijos avis. Variantai vienas nuo kito skiriasi tik keletu atskirų bazių pasikeitimais DNR iš ko seka amino rūgščių kaita baltyme. Alelių dažnis skiriasi priklausomai nuo veislės. Taip Alijev G.A. ir Kolotiova R.S. aptiko tris Tadžikijos avių β-LG variantus, kurių sintezę lemia trys A, B ir C aleliai. Didžioji šių avių populiacija yra B varianto nešiotojai (62,4 %), kuris sutinkamas tiek homozigotinėje tiek heterozigotinėje būklėje bei junginiuose su β-LG geno A ir C variantais. Daugelyje avių B variantas aptinkamas homozigotinėje būklėje BB bei heterozigotinėje BC leido padaryti prielaidą, kad B alelis lemia pageidaujamus požymius pagal kuriuos atlikta atranka.
Stambekov S.Ž. ir kt., (1975) tyrė β-LG polimorfizmą Sovietinio merinoso ir Latvijos juodgalvės avies genomuose. Jie pažymėjo, kad β-LG geno koncentracija abiejose šiose
veislėse yra labai panaši. Atitinkamai Latvijos juodgalvių avių aleliai A ir B – 0,595;0,405 ir Sovietinio merinoso – 0,5725; 0,4275. Macha J. ir Novackova I. (1974), pranešė, kad alelių dažnumas jų tirtose avių veislėse atitinkamai A ir B buvo toks: Stavropolio veislė – 0,7582; 0,2418, mėsinių vilninių merinosų – 0,9048; 0,0925, cigajaus – 0,5853; 0,4147, Romanovo – 0,4286; 0,5714.
Taniova A. (1993) pranešė apie ištirtus 272 trijų veislių avių β-LG genotipus. β-LG lokuse A ir B aleliai atitinkamai užfiksuoti tokiu dažnumu: cigajaus – 58 % ir 42 %, karakulinių avių – 69,4 % ir 30,6 % ir vakarų Baikalo avių 60,6 % ir 39,4 %. Šeimų analizė patvirtino, kad šie aleliai paveldimi kodominantiškai β-LG sistemoje. Pažymima, kad heterozigotų dažnumas (42,4 – 48,7 %) atitinka Hario – Vainbergo dėsnį. Α – laktoglobulino sistemoje polimorfizmas neaptiktas.
4.3.1 β-LG įtaka pieningumo požymiams.
Per paskutinius 10 metų labai tiksliai ištirta kaip susijusi galvijų pieno sudėtis su kiekybiniais rodikliais (Ehrmann S., 1993). Jei baltymų kiekį (%) jų kiekį piene (kg) ir β-LG kiekį lemia AA genotipas tai BB genotipas apsprendžia riebalų kiekį (%) jų kiekį piene (kg) bei kazeinų kiekį. Alelių pasiskirstymas tirtas simentalių bei juodmargių galvijų bandose (Ehrmann S., 1993). Šichovas I. J. (1966) nustatė glaudų ryšį tarp baltymų, riebalų ir cukraus kiekio bei β-LG kiekio galvijų piene. Labiau produktyvūs gyvuliai turėjo didesnį β-β-LG kiekį ir atvirkščiai. Koreliacijos koeficientas tarp ūkiškai naudingų požymių ir β-LG kiekio buvo +0,804. Taip pat yra nustatytas β-LG alelių ryšys su pieno techninėmis savybėmis. Rūgimo ir sutraukimo laikas ir sutraukos tvirtumas yra veikiamas BB varianto, kai tuo tarpu stabilumas kaitinant yra apsprendžiamas AA varianto. Taip pat nustatytas koreliacijos ryšys tarp β-LG bei atsparumo susirgimams ir ilgaamžiškumo. Tačiau pagal pastaruosius požymius atranka negalima, kadangi geriausi rezultatai gauti aleliams esant heterozigotinėje AB būklėje.
Nedidelis publikacijų apie β-LG avių populiacijoje poveikį ūkiškai naudingiems požymiams rodo prieštaringus rezultatus. Tuo laiku kai Bolla P. et al., (1988) aptiko kad gyvuliai turintys genotipą BB (BB>AB>AA) davė didžiausią pieno produkciją ir riebiausią pieną, Di Stasio L. et al., (1992) nustatė kad didžiausią produkciją duoda gyvuliai su genotipu AB (AB>BB>AA). Ištyrę 918 Mačega veislės avių Garson A.I. ir Martinez nustatė, kad alelių A ir B β-LG lokuse dažnumas yra atitinkamai 60,8 % ir 39,2 %.
Yra duomenų, kad BB genotipo gyvulių piene yra mažesnis bendras β-LG kiekis nei AB ir AA (atitinkamai 55,91 g/kg; 59,82 ir 56,68 g/kg) ir kazeino (atitinkamai 42,33 – 46,06 ir 45,18 g/kg). Heterozigotų pranašumas šių požymių atžvilgiu gali būti paaiškinamas heterozės
efektu. Iš to išeina, kad alelis B homozigotinėje būklėje turi neigiamą poveikį sūrių gamybos ir kokybės atžvilgiu. Taip pat nustatytas gana aiškus koreliavimas tarp pieno produktyvumo požymių. Nustatytas neigiamas ryšys tarp laktacijų skaičiaus ir bendros pieno baltymų išeigos ir atskirai kazeino išeigos. Tai rodo, kad kaip baltymų ir kazeino išeiga taip ir šio požymio ryšys su laktacijų skaičiumi priklauso nuo β-LG genotipo. Norima ištirti gaunamų duomenų veikimo mechanizmą lemiančių tokią priklausomybę ir galimybes daryti kryptingą atranką atsižvelgiant į šį markerį (Garzon, A., 1994) gyvūnai su β-LG BB variantu visuose tyrimuose rodo aukščiausią produktyvumą pieno riebumo atžvilgiu (Bolla P. et al., 1988; Di Stasio L. et al., 1992). Didžiausia bendra baltymų ir kazeino išeiga nustatyta sūryje gautame iš β-LG AB tipo avių pieno (AB>AA>BB) (Garzon, A., Martinez, J., 1992). Sarda avių piene nustatytas didžiausias baltymų procentas BB tipo gyvuliams (Bolla, P. et al., 1988). Nemažas atsparumas terminiams poveikiams bei didesnė avių pieno išrūgų baltymų frakcijos denatūracija pastebėta veikiant 85° C temperatūrai esant AA genotipui (Rampilli M. et al., 1989). BB varianto pienas sutraukiamas lėčiau nei AB ir AA variantai bei skiriasi kazeino sudėtimi ir tinkamumu sūrio gamybai (Garson, A., Martinez J., 1992).
4.3.2 β-LG variantų poveikis priaugimo bei atsparumo ligoms savybėms.
Atliekant atranką pagal genotipą reikia kreipti dėmesį ne tik į atskirus požymius, bet ir jų tarpusavio sąveiką. Galvijų β-LG lokusas yra nežymiai susijęs su kraujo grupės lokusu – J ir taip pat su histosuderinamumo kompleksu (Nikiforov V.S., 1995). Avių β-LG sąryšis dar nenustatytas. Alijev G.A. ir Kotoliova R.S. (1973) Tadžikijos avims BB nustatė kur kas didesnę kūno masę nei avių turinčių genotipą AB (Alijev G.A., Kotoliova R.S., 1974). Tačiau Stambekovas S.Ž. et al., (1975) nustatė kur kas didesnį masės priaugimą iki nujunkymo pas AB tipo aveles (AB>BB>AA). β-LG genas galvijų selekcijoje laikomas atsparumo mastitui markeriu pieninėms avims iki šiol tokie tyrimai neatlikti.
5. DARBO ATLIKIMO VIETA IR METODIKA
Tyrimui paimta 21 Lietuvos juodgalvių veislės avis ir 26 Lietuvos vietinės šiurkščiavilnės avys. Lietuvos juodgalvių avių pieno mėginiai surinkti VĮ „Šeduvos avininkystė, o Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių avių vilnos mėginiai surinkti iš pavienių avių augintojų Švenčionių rajone.
Lietuvos veterinarijos akademijos Gyvūnų veisimo ir genetikos katedros K. Janušausko laboratorijoje busvo įsisavinti DNR skyrimo metodai, turėję būti naudojami tolimesniame darbe.
5.1 DNR skyrimas iš vilnos svogūnėlių.
Nukirpti vilnos svogūnėliai buvo patalpinami į mėgintuvėlį. Paruošiamas lizuojantis mišinys (Proteinazė K:lizuojantis buferis = 1:5) ir užpilamas mėgintuvėlio turinys. Mėgintuvėlis su mišiniu maišomas 30 s maišykle “Vortex”. Vėliau centrifuguojamas 10 s 13500 aps./min greičiu. Mėginys buvo inkubuotas termostate 56 ˚C temperatūroje. Po inkubacijos mėginys buvo 10 min pakaitinamas iki 94 ˚C temperatūros ir atšaldomas iki kambario temperatūros bei centrifuguojamas 13 500 pas/min greičiu 10 s. Iš vilnos svogūnėlių išskirta DNR nusiurbiama, paliekant plaukų nuosėdas, ir perpilama į kitus mėgintuvėlius.
5.2 DNR skyrimas iš kraujo
Chloroforminis – fenolinis DNR skyrimo metodas. Kraujas buvo imamas į vakuuminį mėgintuvėlį su konservantu – EDTAxK3. Įjungus centrifugą, mėginys buvo atvėsinamas iki 4°C. Į mėgintuvėlį buvo įpilama 10 ml kraujo ir 30 ml buferio A. Mėgintuvėlio turinys sumaišomas lengvai vartant. Toliau jis 30 min buvo inkubuojamas ledo vonioje, maišant vartymo būdu kas 5-10 min. Vėliau centrifuguojamas 10 min, 4 °C temperatūroje, 3000 pas/min greičiu. Centrifugatą nupylus, ant nuosėdų buvo užpilama 10 ml buferio A ir gerai išmaišoma pipete. Mišinys centrifuguojamas 10 min, 4 °C temperatūroje, 3000 pas/min greičiu. Nupylus paviršiuje esantį skystį, ant nuosėdų buvo užpilama 10 ml 0,15 M KCl ir gerai išmaišoma pipete. Mišinys vėl centrifuguotas 10 min, 4 °C temperatūroje, 3000 pas/min greičiu, vėliau paviršiuje esantis skystis nupilamas, o ant nuosėdų buvo užpilama 10 ml 0,15 M KCl ir gerai išmaišoma su pipete. Po centrifugavimo 10 min, 4 °C temperatūroje, 3000 pas/min greičiu, nupylus paviršiuje esantį skystį, ant nuosėdų užpilama 5 ml buferio B, 500 µl 10 % SDS, 150 µl fermento Proteinzė K, visas mišinys gerai išmaišomas pipete. Toliau mėginys inkubuojamas per naktį 37 °C (arba 2 h 55 °C) temperatūroje. Po inkubacijos mėginys
užpilamas 1,4 ml 6 M NaCl tirpalu ir 15 s maišomas maišykle “Vortex”. Į mėgintuvėlį buvo įpilama 4 ml chloroformo ir maišoma iki baltos vienalytės masės susidarymo. Toliau mėginys centrifuguojamas 20 min 22 °C temperatūroje 4000 pas/min greičiu, nusiurbus mikropipete atsargiai viršutinį sluoksnį (DNR), jis perpiltas į kitą mėgintuvėlį ir užpiltas tokiu pat tūriu 96 % etilo alkoholio (-20 °C). Mėgintuvėlis sandariai uždaromas, o turinys išmaišomas vartant. Iškritusi DNR išimama kilpelės pagalba, perplaunama 70 % etilo alkoholiu ir perkeliama į mėgintuvėlį su 100 ml dejonizuoto H2O. Mėgintuvėlis paliekamas nakčiai purtyklėje kambario
temperatūroje, kad DNR visiškai ištirptų.
5.3 DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas.
DNR koncentracija ir švarumas buvo nustatomi spektrofotometru Gene Quant II (Pharmacia Biotech, Švedija), buvo ruošiamas tiriamos DNR mėginys: paėmėme 10 μl išskirtos DNR ir 90 μl dejonizuoto vandens. Vėliau mikropipetės pagalba mišinys buvo patalpintas į 0,5 ml Eppendorfo mėgintuvėlį, sumaišytas maišykle ir centrifuguotas 13000 aps./min. Paruoštas mėginys buvo perkeltas į spektrofotometro kiuvetę. Buvo matuojami šie rodikliai:
• absorbcija, esant 260 nm bangos ilgiui; • baltymų ir DNR santykis;
• DNR koncentracija (μl/ml);
• DNR baltymų koncentracija (mg/ml).
5.4 Izoelektrinio fokusavimo metodas (IEF).
Nugriebto pieno fenotipavimas buvo atliktas izoelektrinio fokusavimo būdu 0,3 mm poliakrilamido gelyje naudojant amfolitinius nešėjus kaip nurodyta Erhardt (1989) metode. Gelio paruošimui buvo paimta 8,4 ml koncentruoto gelio tirpalo (5,78 % akrilamidas, 0,15 % NN´metileno-bisakrilamidas, 51 % šlapalas karbamidas) ir 0,644 ml mišinio turinčio amfolitų: 15,5 % (vol/vol) Servalito (Servalyte) pH 2.5-5; 34,9 % (vol/vol) Farmalito (Pharmalyte) pH 4,5-5,4 ir 25 % Amfolito (Ampholyte) pH 6,5. Katalizacijai pridėta 1 ml amonio persulfato (0,7 % wt/vol) ir 15 μl TEMED. Priešfokusavimas atliktas 150Vh 3000 V riboje, esant 20 mA srovės stiprumui. 10 μl mėginio, paruošto iš 10 % (vol/vol) pieno ir 2,7 % (wt/vol) vandenyje ištirpinto 2-β-merkaptoetanolio, buvo patalpinta ant gelio 3 mm prieš anodą. Galutinis fokusavimas atliktas esant pastoviai 3000Vh srovei iki 40 mA ribos. Genetiniai variantai buvo įvertinti po gelio dažymo Coomassie Brilliant Blue R-250 dažais pagal Erhardt (1989) metodą.
5.5 PGR-RFIP
PGR reakcija buvo vykdoma termocikleryje GeneAmp®PCRSystem 2700 (Applied Biosystem, JAV). Į vieno 30 µl mėginio sudėtį įėjo: 100ng DNR, 10×PGR buferis, 25 mM MgCl2, 2 mM dNTP, BSA (20 mg/ml), pradmenys 1- 5’-AAA AGC CCT GGG TGG GCA
GC-3’ ir 2- 5’-TTG GGT TCA GTG TGA GTC TGG -3’ ir 2U Taq-polimerazės (MBI Fermentas). Amplifikacija vyko naudojant programą: 95 oC 5 min; 95 oC 50 s, 65 oC 40 s, 72
oC 40 s - 33 ciklai ir 5 min 72 oC. 10 μl PGR produkto (452 bp) sukarpyta restrikciniu
fermentu RsaI (5U) (MBI Fermentas) inkubuojant 1 val. 37 oC temperatūroje. Restrikciniu fermentu sukarpytas DNR mėginys frakcionuotas 2 % agarozės gelyje (Top Vision™GQ Agarose, MBI Fermentas), dažomas etidžio bromidu ir vertintas UV šviesoje. AA genotipą rodė keturi 175 bp, 170 bp, 66bp ir 41bp dydžio fragmentai. AB genotipą - penki 236 bp, 175 bp, 170 bp, 66 bp ir 41bp dydžio fragmentai. BB genotipą - 236 bp, 175 bp ir 41 bp dydžio fragmentai (3 lentelė).
3 lentelė. Po polimerazės grandininės reakcijos gauti genotipų fragmentai. Genotipas Fragmento dydis AA AB BB 236 - - 175 - - - 170 - - 66 - - 41 - - - 5.6 Statistinė analizė
Alelių A ir B dažniai bei genotipų dažniai buvo apskaičiuoti naudojant FSTAT 2,93 (Goudet, 1995) programą. Vidutinis nustatytas heterozigotiškumas (Hobs) ir teorinis heterozigotiškumas (Hexp) įvertinti naudojant Pop100gene programą:
6. REZULTATAI
Lietuvos juodgalvių avių populiacijoje rasti du A ir B β laktoglobulino aleliai. Alelio A dažnis tirtoje populiacijoje - 0,52, o alelio B dažnis - 0,48. Genotipas AA aptiktas pas 4 individus ir tai sudarė 19,5 % tirtos avių grupės (4 lentelė).
lentelė 4. β-laktoglobulino genotipo alelių pasiskirstymas ir dažniai Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių avių veislėse.
Lietuvos juodgalvė Lietuvos vietinė šiurkščiavilnė
Genotipas AA 4 12 AB 14 12 BB 3 2 Genotipo dažnumas AA 0.19 0.46 AB 0.67 0.46 BB 0.14 0.08 Alelių dažnumas A 0.52 0.69 B 0.48 0.31 P-vertė 0.20 0.06
Genotipas AB sudarė 66,4 % tirtos individų grupės, o BB - 14,1 % (1 pav.)
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 AA AB BB Lietuvos šiurkščiavilnės avys
Lietuvos juodgalvės avys
%
1 paveikslas. β laktoglobulino genotipų dažniai Lietuvos šiurkščiavilnių ir Lietuvos juodgalvių avių tarpe.
Juodgalvių avių tarpe vidutinis nustatytas heterozigotiškumas (Hobs) buvo 0,511, o teorinis heterozigotiškumas (Hexp) – 0,667. Lietuvos šiurkščiavilnių avių populiacijoje taip pat rasti du A ir B β laktoglobulino aleliai. Alelio A dažnis tirtoje populiacijoje - 0,69, o alelio B dažnis - 0,31. Mažiausias paplitimo dažnis genotipo BB – 7,8 %. Genotipai AA ir AB sudarė
po 46,1 % tirtos avių grupės atitinkamai (1 pav.). Šiurkščiavilnių avių tarpe vidutinis nustatytas heterozigotiškumas (Hobs) buvo 0,461 ir jis artimas teoriniam heterozigotiškumui (Hexp) – 0,434. Nukrypimo nuo Hardy-Weinberg pusiausvyros nenustatyta nei vienoje iš tirtų avių veislių.
β-LG geno lokuso polimorfizmas Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos šiurkščiavilnių avių veislėse lyginant su kitų tirtų pieninių vilninių avių veislių rezultatais aprašytais literatūroje yra labai panašus. Panašus kiekis heterozigotinių individų (>50 %) pastebėtas tiriant Pago (Cubric-Curik V., et al., 2002) ir Karakulines avių veisles (Nassiry M.R., et al., 2002) (2 pav.).
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Lithuan ian Bl ackfac e Pag Gheze l Karak ul Lacaun e Tsiga y Lithuan ian Na tive Co arsew ooled Hunga rian Me rino Romn ey-Ma rsh British Milks heep BB AA AB
2 Paveikslas. β-LG genotipų pasiskirstymas Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos šiurkščiavilnių avių veislėse bei palyginimas su kitomis veislėmis
Tačiau AA genotipo dažnumas Lietuvos juodgalvių avių veislėje yra mažesnis lyginant su Romni maršų (Bocharev V.V, 1998), pieninėmis Britų, Vengrijos merinosų (Anton I., et al., 1997) bei Suomijos landrasų veislėmis (Nassiry M.R., et al., 2002), kuriose minėtas genotipas buvo sutinkamas 79 % dažnumu. Rezultatai gauti BB Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos šiurkščiavilnių avių genotipo atžvilgiu buvo panašūs į rezultatus tiriant pieninių Britų, Vengrijos merinosų (Anton I., et al., 1997) ir Ghezel avių (Elyasi G., et al., 2004) veisles. Nassiry et al., (2002) neaptiko BB genotipo pas Rusijos karakulines avis. Didžiausias BB genotipo dažnis aptiktas Lacaune avių veislėje (Anton I., et al., 1997). Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių avių genome dažniausias buvo A alelis (3 lentelė). Alelis A Ispanų Mačenga ir Segurena bei Italų Barbaresca-siciliana ir Massene avių veislėse (Cubric-Curik V., et al., 2002) užfiksuotas atitinkamai 0,68; 0,67; 0,62; 0,62 dažnumu.
Aptiktas aukštas AB genotipo pasikartojimas mėsos-vilnos tipo Lietuvos juodgalvių ir Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių avių veislėse gali būti siejamas su Bochkarev V.V. (1998) gautais stebėjimais, kad β-LG AB variantas lemia didesnę kūno masę, kadangi Lietuvos juodgalvių avių išvedimo prioritetu laikomas mėsinių savybių gerinimas. Tačiau galutinai įrodyti šiuos teiginius reikėtų atlikti detalesnius tyrimus.
7. IŠVADOS (PASIŪLYMAI)
1. Ištyrus Lietuvos juodgalvių avių populiaciją izoelektrinio fokusavimo metodu (IEF) β - laktoglobulino geno polimorfizmo atžvilgiu, nustatyta, kad A ir B aleliai aptikti beveik vienodu dažniu, atitinkamai 0,52 ir 0,48.
2. Ištyrus Lietuvos šiurkščiavilnių avių populiaciją polimerazės grandininės reakcijos – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo metodu (PGR-RFIP) pastebėta, kad A alelis (0,69) paplitęs didesniu dažniu už B (0,31).
3. Didžiausiu dažniu Lietuvos juodgalvių avių populiacijoje aptiktas β - laktoglobulino genotipas AB, kurį turėjo 66,4 % tirtų individų. Mažiausiu dažniu Lietuvos šiurkščiavilnių avių tarpe paplitęs BB genotipas (7,8 %.).
Pasiūlymas: Lietuvos juodgalvių avių veislę reikėtų gerinti mėsingumo kryptimi, ir kadangi nustatytas β – LG sąryšis su mėsingumo bei vilnos kokybės požymiais, o kaip žinome Lietuvos vietinės veislės yra mėsinio vilninio tipo reikėtų detaliau atlikti mūsų vietinių avių genotipų tyrimus ir jų sąsajas bei įtaką veislių produktyvumui.
NAUDOTŲ LEIDINIŲ SĄRAŠAS
1. Albers G.A.A. and. Gray G.D. Breeding for worm resistance: a perspective. / International Journal of Parasitology 17. 1986. 559-566.
2. Ali S., Clark A.J. Chraracterisation of the gene encoding ovine β-LG A and B / Gene. 1990 V. 91 P. 201.
3. Alichanidis, E., Polychroniadou, A. 1996. Special features of dairy products from ewe and goat milk from the physicochemical and organoleptic point of view. In: Proceedings, Production and Utilization of Ewe and Goat Milk, Crete, Greece, Oct. 19-21, 1995, International Dairy Federation Publ., Brussels, Belgium, p. 21-43.
4. Anifantakis, EM. 1991. Greek Cheeses. Nat. Dairy Committee of Greece Publ., Athens, Greece, 96 pp.
5. Ansari H.A., Bosma A.A. Bunch T.D. Long S.E. Popescu C.P. Clarification of chromosome nomenclature in the sheep. // Cytogennet. Cell Genet. – 1994. V. 67 p.114-.
6. Anton I., Zsolnai A., Kulkovics S., Molnar A., Fesüs L. Genetic polymorphisms of milk proteins in Hungarian dairy sheep breeds and crosses. Sheep and Goat Production in Central and Eastern European countries. Proceedings of the workshop held in Budapest, Hungary. 1997. P. 224-226
7. Aschaffenburg R., Drewry J., 1955 Occurence of different β – LG in cow‘s milk. // 218-.
8. Askonas V.A. Crystalization of goat β – LG //Biochem. J. – 1954. – V.58.-P.332-. 9. Ball G. Shelton M.J., Walsh B.J. Heal D. J., Hosting C.S., Houden M.E.H., A major contionous alergenic epitope of bovine β-LG recognized by human Ig E binding // Clin. Exp. Al – 1994 V. 24 P. 758.
10. Blattman A.N., Hulme D.J., Kinghorn B.P., Woolaston R.R., Gray G.D. and Beh K.J. A research for associations between major histocompatibility complex restriction fragment length polymorphism bands and resistance to Haemonchus contortus in sheep. / Animal Genetics 24. 1993. 277-282.
11. Bell K., McKenzie H.A., 1964 // Na.-V. 204- P 1275-.
12. Bell K., McKenzie H.A., 1967 The whet proteins of ovine milk: β – LG A and B // Biochim. Biophys. Acta. – 1967. V. 147. – P. 1275-.
13. Bell K. and McKenzie H.A.. The whey proteins of ovine milk β – lactoglobulins A and B. / Biochimica et Biophysica Acta. 1970. 147, 123-134
14. Bell K., Mc Kenzie H.A. Shaw D.C. Amino acid composition and peptide maps of β – LG variants // Biochim. Biophys. Acta. – 1968- V. 154. p. 284 -.
15. Berger, Y.M. 1998. An economic comparison between a dairy sheep and a non-dairy sheep operation. In: Proceedings, 4th Great Lakes Dairy Sheep Symposium, D.L.Thomas and C.Rowe, ed., Spooner, WI, June 26-27,1998, Spooner Agr. Res. Sta. Publ., Spooner, WI, p. 32-39.
16. Bochkarev V.V. The molecular analysis of β-lactoglobulin locus in the different sheep breeds. Dubrovicy. Doctoral thesis. 1998. P 1-93
17. Bolla P., et al., Milk protein markers and production in sheep // 21 st. Int. Conf. On animal blood groups and biochem polimorph – Turin Italy 1988 p.78
18. Conti A., liberatori J., Napolitano L., Heterogeny of equine β – LG // Milchwiss 1982 V. 37 p. 338-.
19. Cooper D.W., Van Oorschot R.A.H., Piper L.R. and Le Jambre L.F., No association between the ovine leukocyte antigen (OLA) system in the Australian Merino and susceptibility to Haemonchus contortus infection. / International Journal of Parasitology 19. 1989. 695-697.
20. Dario, C., Laudadio, V., Bufano, G. 1995. Characteristics of Leccese sheep. II. Quantitative and qualitative variations in milk during lactation. Latte 20: 1266-1269.
21. De Frutos M. et al., 1992 Rapid analinis of whey proteins from different animal species by reversed phase high – performance liquid chromotography // Z. Lebensmittelunters U. Forsch V. 195 p. 326.
22. De Jong N. Et al., 1993 Determination of milk proteins by capillary electrophoresis // J. Chomatogr. V. 625 p. 207.
23. Di Stasio L. G., et al., β-LG types in milk production in sheep // 23 Rd. Int. Conf. of ISAG interlacen Switzerland 1992 p. 106.
24. Douch P.G. and Outteridge P. The relationship between ovine lymphocyte antigens, parasitological and production parameters in Romney sheep./ International Journal of Parasitology 19. 1989. .35-41.
25. Erhardt G. Evidence for a third allele at the β-LG locus of sheep and its occurrence in different breeds. Animal Genetic. 1989. Vol. 20. P 197-204.
26. Falconer, I.R. 1971. Lactation. Proceedings, International Symposium on Lactation, University of Nottingham, 1970, Pennsylvania State University Press, University Park, PA, 467 pp.
27. Freier R., Kleter B., Gerry I., Lebenthal E., Geifman M., ntolerance to milk protein // J. Pediatr. 1969 v. 75 p. 623.
28. Garzon, A., Martinez, J., 1992 β-LG in Manchega sheep breed relationship with milk technological indexes inhancraft manufacture of Manchego cheese // Anim. Genet. V. 23 Nr. 1 P.106.
29. Garzon, A., Martinez, J., 1992 β-LG genetic variants and lactation number effect on quality // auantitative characteristic of sheep milk production // anim. Genet. 1994 V 25 suppl. 2 P. 61.
30. Gravert, H.O. 1983. Die Milch. Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart, 387 pp.
31. Grigaliūnaite I. 2003 Genetic Diversity in Baltic Sheep Breeds. Doctoral thesis. Lithuanian Veterinary Academy, Kaunas, Lithuania.. P 126.
32. Godovac-Zimmermann J. et al., 1987 The complete amino – acid sequence of dimeric β – LG from mouflon milk // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. -V.368 – p. 1313-.
33. Hohenhaus M. and Outteridge P. The imunogenetics of resistance to Trichostrongylus colubriformis and Haemonchus contortus parasites in sheep./ British Veterinary Journal 151. 1995. 119-120.
34. Hulme D.J., Windon R.G., Nicholas F.W. and Beh K.J. Association between MHC Class II RFLP and Trichostrongylus resistance. / In: G.D Gray and R.R. Woolaston (eds) Breeding for Disease Resistance in Sheep. Australian Wool Corporation, Melbourne. 1991. 115-120.
35. Jeness R., 1982 Inter – species comparison milk proteins // Applied Science Publishers. – 1982. London. – p. 87-.
36. Kessler E., Brew K., 1970 The whey proteins of pig‘s milk. 1. Isolation and characterization of β – LG // Biochim. Biophys.. Acta. -V. 200. p. 449-.
37. King, J.W.B. 1988. Directory of Current Research on Sheep and Goats. Commonwealth Agricultural Bureaux International Publ., Wallingford, Oxon, U.K., 271 pp.
38. Kolde H.J., Braunitzer G. The primary structure of ovine β – LG. Isolation of peptides and sequences // Michwiss – 1983 a. V. 38 – P. 18-20.
39. Kolde H.J., Braunitzer G. The primary structure of ovine β – LG. 2. Discusion and genetic aspects // Michwiss 1983 b.- V.38 p. 70-.
40. Kon, S.K., Cowie, A.T. 1961. Milk: the Mammary Gland and its Secretion. Academic Press, New York, NY, 2 vol., 938 pp.
41. Liberatori J. β – LG. Chemical and structural studies // Folia Vet. Lat. – 1977. V. 7- P. 463 –
42. Makinen-Kiljunen S., 1994 detection and characterization of atopic alergens // Ann. Med. V. 26 p. 283.
43. Margetin, M. 1996. Present state in sheep breeding in Slovakia with regard to somatic cell counts. In: Proceedings, International Symposium, Somatic Cells and Milk of Small Ruminants, R. Rubino, ed., Bella, Italy, Sept. 25-27, 1994, Wageningen Pers, EAAP Publ. No. 77, p. 321-322.
44. Martin, P., Addeo, F. 1996. Genetic polymorphism of casein in the milk of goats and sheep. In: Proceedings, IDF Seminar, Production and Utilization of Ewe and Goat Milk, Crete, Greece, Oct. 19-21, 1995, IDF Publ., Brussels, p. 45-58.
45. Mills, 0. 1989. Practical Sheep Dairying. Thorsons Publ. Group, Wellingborough, Northamptonshire, U.K., 320 pp.
46. Monako H.L., Zanotti G., Spadon P., Bolognese P., Sawier L., Crystal structure of the trigonal from of bovine β-LG and its complex with retinol at 2,5 A resolution / J. Mol. Biol. 1987. V. 197 P. 695-.
47. Nicholas F.W. and Blattman A.N. Application of genetic markers for parasites. / In: Gray G.D., Woolaston R.R.and Eaton B.T. (eds) Breeding for Resistance to Infectious Diseases in Small Ruminants. ACIAR Monograph No. 34, ACIAR, Canberra, Australia. 259-274.
48. Outerridge P.M. Ovine lymphocyte antigens and resistance to parasites./ Gray G. and Woolaston R. (ed) Breeding for Disease Resistance in Sheep. Australian Wool Corporation, Melbourne. 1991 30-38.
49. Palmer A.H., The preperation of a crystaline globulin from the albuman fraction of cow‘s milk // J. Biol. Chem. – 1934. V. 104. – P. 359-.
50. Path, J. 1995. Cheese making 101. In: Proceedings, 1st Great Lakes Dairy Sheep Symposium, D.L. Thomas et al., Madison, WI, March 30, 1995, Wisconsin Sheep Breeders Coop. Publ., Rio, WI, p. 46-49.
51. Papiz M.Z., Sawier L., Eliopoulos E.E., Nort A.C.T., Findlay J.B.C., Jones T.A., Newcomer M.E., Kraulis P.J., The structure of the β-LG its similarity to plazma retinol – binding protein N.a. – 1986 – V. 324. p. 383-385.
52. Pearce R.J., 1979 Heat stability in concentrated and non – concentrated milk – te effect of urea and β-LG levels and the influance of preheating // J. Dairy Res. – V 46 p. 385-.
53. Peeters, R., Buys, N., Robijns, L., Vanmontfort, D., Van Isterdael,J. 1992. Milk yield and milk composition of Flemish Milksheep, Suffolk and Texel ewes and their crossbreds. Small Rmin. Res. 7: 279-288.
54. Pirisi, A., Fraghi, A., Piredda, G., Leone, P., Barillet, F., Zervas, N.P. 1999a. Influence of sheep AA, AB and BB beta-lactoglobulin genotypes on milk composition and cheese yield. In: Proceedings, 6th International Symposium, Milking of Small Ruminants, Athens, Greece, Sept.26 - Oct. 1, 1998, Wageningen Pers, EAAP Publ. No. 95, p. 553-555.
55. Pirisi, A., Piredda, G., Papoff, C.M., Salvo, R. di, Pintus, S., Garro, G., Ferranti, P., Chianese, L. 1999b. Effects of sheep alpha s-1 casein CC, CD and DD genotypes on milk composition and cheesemaking properties. J. Dairy Res. 66: 409-419.
56. Poggi C., Le-Marchand B., and Zapf J., 1979. Effects of binding of insulin-like growth factor-I in the isolated soleus muscle of lean and obese mice: Comparison with insulin. / Endocrinology 105:723.
57. Presnel B., Onti A., Erhardt G., Krause I., Godovac-Zimmermann J., A rapid microbore HPLC method for determination of primary structure of β – LG genetic variants // J. Biochem. And Biophys. Methods. 1990 V. 20. – 325 - .
58. Rampilli M. et al., 1989 Study on heat stability and coagulation properties of milks with different protein genotipe // milk proteins – Steinkopf Verlag Darmschtadt p. 251
59. Reddy L.M., Kella N.K.D., Kinsella J.E., Structural and conformational basis of the resistance of β – LG to peptic and chimotriptic digestion // J. Agric. Food Chem. 1988 V. 36 p.737
60. Renner, E. 1982. Milk and Milk Products in Human Nutrition. Volkswirtschaftlicher Verlag GmbH Publ., Munich, Germany, 467 pp.
61. Scherf B.D. (ed.). 2000 World Watch List for domestic animal diversity. 3 rd edition. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), Rome, Italy.
62. Sen A., Sinha N.K., 1961 Comparison of the β – LG of buffalo‘s and cow‘s milk // Na. V. 190. p. 343-.
63. Simos, E.N., Nikolaou, E.M., Zoiopoulos, P.E. 1996. Yield, composition and certain physicochemical characteristics of milk of the Epirus mountain sheep breed. Small Rumin. Res. 20: 67-74.
64. Shlee P., Krause I., Rottmann O. Genotyping of ovine β-LG A and B using the PGR. Arch. Tierz. 1993. V. 36. P 519-523.
65. Svoboda M.E., and Van Wyk J.J., 1983 Purification of somatomedin-C/insulin-like growth factor I. / Methods in Enzymology, 109:798.
66. Wendorff, B. 1995. Economic potential for sheep dairy products in the U.S. In: Proceedings, 1st Great Lakes Dairy Sheep Symposium, D.L. Thomas et al., ed., Madison, WI, March 30, 1995, Wisconsin Sheep Breeders Coop. Publ., Rio, WI, p. 57-67.
67. Zapasnikienė., B. 2002 a Avių ūkis – Vilnius: UAB „Valstiečių laikraštis“ – 64 psl. ISBN 9986-847-53-2
68. Zapasnikienė B., 2002b Avių amžiaus bei ėriavimosi įtaka vislumui ir prieauglio svoriui./ Veterinarija ir zootechnika.. T19 (41). P. 112-115
69. Zapasnikienė B., 1996 Lietuvos juodgalvių avių selekcija pagal produktyvumo kryptis./Gyvulininkystė.. P 95-103.
70. Zapasnikienė. B., Mėsinės avys. Lietuvos gyvulininkystės institutas Baisogala, 2003, p. 151. ISBN 9955-9428-3-5.
71. Alijev G. A., Kolotiova R.S. Genetičeskoje raznoobrazije β-laktoglobulina v moloke ovec // doklady 1973 Nr. 4
72. Nikiforov V.S., 1995 Analiz sceplenija meždu lokusami β- LG i J – sistemy grupy krovi u krupnovo rogatovo skota // Genetika T 31 Nr. 11 p. 1582
73. Stambekov S. Ž., Šapiro J.O., Mandrusova E.E., Polimorfizm belkov moloka ovec sovietskovo merinosa i latvijsko temnogolovy sviazi ich s choziaistvennych priznakami // S. V. Rabot / Leningradskij vet. In-t – 1975 V. 42 p. 214.
74. Taniova A. Genetičen polimorfizm na proteiny v mlekoto na meste parody I atrodije ovce // Genet. I Selek. 1993 T. 26 Nr. 4 p.301
PRIEDAI
5 lentelė. Įvairios avių veislės ir keleto iš jų pieno sudėtys (%) (Mills, 1989 Anifantakis, 1991; Peeters et al 1992, Alichanidis and Polychroniadou, 1996)
Riebalai Baltymai Viso s.m. Pelenai Laktozė Graikų: Boutsico 7.68 6.04 19.30 0.93 4.80 Vlahiko 9.05 6.52 20.61 0.95 4.09 Karagouniko 8.70 6.60 20.31 0.93 4.08 Chios 7.90 6.20 19.08 0.92 4.06 Friesland x Local 6.40 5.71 17.59 0.87 4.61 Artikis* 7.59 5.94 18.98 0.89 4.56 Apirus 7.85 6.56 20.13 0.95 4.77 Slovakų: Cigajaus 7.41 5.45 18.75 0.90 4.99 Ispanų: Churra Latxa Manchega 7.78 6.01 18.98 0.90 4.29 Vasca Prancūzų: Basco-Bearnaise Corsica Lacaune 7.40 5.63 18.63 0.93 4.67 Manech Belgų, Britų: Pieninės avys 6.80 5.16 18.60 0.95 5.69 Italų: Comisana Sarda Portugalų: Serra Estrella Vokiečių: East Friesian Olandų: Texel 9.27 4.53 20.13 0.95 5.38 Turkų: Karaman Saudo Arabijos:
Nadjii, Najdi 5.31 4.71 15.36 0.86 4.48
* mišrūnės
PADĖKA
Esu labai dėkingas savo darbo vadovei dr. Jūratei Kučinskienei už nuoširdžią pagalbą ruošiant šį magistro darbą, dr. Ilmai Tapio už leidimą naudotis savo atliktų tyrimų duomenimis. Savo artimiesiems už moralinį palaikymą bei visiems geranoriškiems žmonėms, kurie vienaip ar kitaip prisidėjo rengiant šį magistro darbą.
SUMMARY
Genetic polymorphism of β-lactoglobulin in Lithuanian Native sheep
Gediminas Vagonis
Department of Animal Breeding and Genetic, Lithuanian Veterinary Academy, Tilžės 18, LT-47181
Supervisor of master work – Jūratė Kučinskienė. Number of pages – 35, tables – 5, graphics – 2.
The aim of the present study was to describe the genetic polymorphism of the β-LG milk protein locus in the Lithuanian Blackface sheep breed obtained using isoelectric focusing (IEF) method and in the Lithuanian Native Coarsewooled sheep – using PCR-RFLP method.
The results of study as folows: in Lithuanian Blackface sheep two genetic variants A and B with allele frequencies of A=0.52 and B=0.48 were identified. The most frequent genotype in Lithuanian Blackface breed, detected in 66.7 % of studied individuals, was heterozygous genotype AB. Homozygous genotypes AA and BB were observed at frequencies of 19.0 % and 14.3 %, respectively. In Lithuanian Native Coarsewooled sheep two genetic variants A and B with allele frequencies of A=0.69 and B=0.31 were identified. The BB genotype was not frequent (7.8 %) in Lithuanian Native Coarsewooled breed. The genotypes AA and AB were observed at frequency of 46.1 %. Mean observed heterozygosity value (Hobs=0.511) in Lithuanian Blackface sheep was slightly lower than mean expected
heterozygosity (Hexp=0.667). In Lithuanian Native Coarsewooled sheep mean expected
heterozygosity value (Hobs=0.461) was similar to the mean observed heterozygosity
(Hexp=0.434). The deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was not detected in any of those
breeds.
Conclusions: the detected high frequency of genotype AB in meat-wool type Lithuanian Blackface and Lithuanian Native Coarsewooled sheep might be in agreement with the observations made byBocharev. Since the priority in the development of this breed is given to the improvement of the meat traits, the associations between β-LG variant AB and higher body weight are possible. However, in order to prove this observation, further analyses are needed.
