LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
BIOLOGINöS CHEMIJOS KATEDRA
Guoda Giedraityt÷
MIKROORGANIZMŲ SĄVEIKOS YPATUMAI
PORTUGALIŠKŲ FERMENTINIŲ SŪRIŲ BRANDINIMO METU
Magistro darbas
Darbo vadovas: e.doc.p. dr. Aldona Baltušnikien÷
LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
BIOLOGINöS CHEMIJOS KATEDRA
Magistro darbas atliktas 2008-2010 metais Lietuvos veterinarijos akademijos Biologin÷s chemijos katedroje, Portugalijoje, mikrobiologijos laboratorijoje, Katalikiškajame universitete, chemijos laboratorijoje, Lisabonos universitete ir Idanha a Nova sūrių fabriko laboratorijoje.
Magistro darbą paruoš÷: Guoda Giedraityt÷ _________________
Magistro darbo vadovas: e. doc. p. dr. Aldona Baltušnikien÷
( LVA Biologin÷s chemijos katedra) _________________
Recenzentas (ai):
(Vardas, pavardė) (parašas)
SANTRAUKA
Mikroorganizmų sąveikos ypatumai portugališkų fermentinių sūrių brandinimo metu Buvo tirti Sera da Estrella, Serpa ir jiems analogiški tradiciniai portugališki sūriai, pienarūgšt÷s bakterijos, jų išskiriamos antimikrobin÷s medžiagos. Tyrimai atlikti Portugalijoje, Porto miesto Katalikiškame Biotechnologijos Universitete, Idanha a Nova kaimelyje, sūrių fabrike, ir Lisabonos mieste, Lisabonos Universitete. Atliktos Serpa ir Serra da estrela sūrių chemin÷, mikrobiologin÷ ir juslin÷ analiz÷s. Idanha a Nova sūrių fabrike iš 116 pienarūgščių bakterijų (PRB) išskirtos 4 bakterijos, su stipriausiu antimikrobiniu poveikiu 4 pasirinktiems kontroliniams patogenams: Serratia sp., S. aureus, E. coli, L. inoccua. PRB buvo identifikuotos. Didžiausią slopinantį poveikį Seratia sp., L. inoccua, E. coli ir S. aureus veiklai tur÷jo Lactobacillus brevis ir Lactobacillus curvatus. Buvo stebimas PRB 7013, identifikuotos kaip Lactobacillus brevis, antimikrobinis veikimas in vivo. Lisabonos Universitete tirta PRB išskirtų bakterijų antimikrobin÷ medžiaga: jos atsparumas karščiui, kokią įtaką jos veikimui daro fermentai, buvo atlikta aukšto patikimumo skysčių chromatografijos analiz÷, leidžianti daryti prielaidą, kad bent viena iš 4 PRB sintetina bakteriociną.
Mikrobiologinio tyrimo metu nustatyta, kad visą sūrių nokimo laikotarpį, dominavo abiejuose produktuose pienarūgšt÷s bakterijos. Tai patvirtina faktą, jok pienarūgšt÷s bakterijos yra linkusios būti dominuojančiomis.
Pasteb÷ta, kad galutinis produktas priklauso nuo mikroorganizmų veiklos. Serra da Estrela sūryje vystęsi mikroorganizmai suformavo lengvą, švelnų aromatą su įdomiu pikantišku skoniu. Tuo tarpu Serpa sūryje veikę mikroorganizmai suformavo stipresnio kvapo ir aštresnio skonio sūrį.
Reikšminiai žodžiai: mikrobiota, pienarūgšt÷s bakterijos (PRB), koliformin÷s bakterijos (Serratia sp., E. coli), Pseudomonas spp., S. aureus, L. inoccua, bakteriocinai.
SUMMARY
Peculiarity interaction between microorganisms due to Portuguese fermented
cheeses ripening time
There were investigated Serpa, Serra da Estrela and analogical Portuguese cheeses. Researches have been done in Porto Catholic Biotechnological University, in a cheese factory - Idanha a Nova village, at the University of Lisbon.
Serpa and Serra da Estrela cheeses were investigated by doing chemical, microbiological and sensory analyses. There were isolated 116 lactic acid bacteria (LAB) strains in a cheese factory of Idanha a Nova and selected 4 LAB strains with the best inhibitory activity against 4 control pathogens: Serratia sp., S. aureus, E. coli and L. inoccua. LAB strains were identified as Lactobacillus brevis and Lactobacillus curvatus. The antimicrobial compound`s heat, enzym resistance and HPLC analyses have been done.
The amount of microorganism intensity at different stages of cheeses ripeness has been observed and there were established that lactic acid bacterias were dominated due to all maturating time. The amount of Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Staphylococus spp. decreased while cheeses maturing time.
The technology of cheese making is responsible for the final product as well as the activity of microorganisms in it.
Key words: Lactic acid bacteria (LAB), Enterobacteriaceae (Serratia sp., E. coli), Pseudomonas sp., S. aureus, L. inoccua.
TURINYS
ĮVADAS...1
1. LITERATŪROS APŽVALGA...3
1.1 Pienarūgščių bakterijų charakteristika……….3
1.2 Pienarūgščių bakterijų reikšm÷ sūrių gamyboje………..4
1.3 Pienarūgščių bakterijų antibakterinis pritaikymas………..5
1.4 Bakteriocinų apžvalga………...6
1.5 Bakteriocinų klasifikacija...6
1.5.1 I bakteriocinų kategorija………..7
1.5.2 II bakteriocinų kategorija...7
1.5.3 III bakteriocinų kategorija...8
1.5.4 IV bakteriocinų kategorija...8
1.5.5 Gram - neigiamų bakterijų išskiriami bakteriocinai...8
1.6 Bakteriocinų chemin÷s ir fizikin÷s savyb÷s……….…..9
1.7 Bakteriocinų veikimo būdas ………..9
2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS...12
2.1 Tyrimų vykdymo vieta………..12
2.2 Tyrimų objektai...12
2.3 Serra da Estrela ir Serpa sūrių gamybos technologija………...…12
2.4 Tyrimų metodai……….…….12
2.4.1 Chemin÷ analiz÷ – rūgštingumo nustatymas……….…….…12
2.4.1.1 Sūrio titruojamojo rūgštingumo nustatymas……….….……13
2.4.1.2 Sūrio aktyviojo rūgštingumo (pH) nustatymas………..……13
2.4.2 Juslin÷ analiz÷ ……….….….13
2.4.3 Mikrobiologin÷ analiz÷………..15
2.4.4 Antibakterinio pienarūgščių bakterijų poveikio nustatymas………..……16
2.4.4.1 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷ tik÷tinam antimikrobiniam poveikiui nustatyti………..………16
2.4.4.2 “Medaus korio” mikrol÷kštel÷s paruošimas tyrimui………..………17
2.4.4.3 Antimikrobinio poveikio nustatymas Petri l÷kštel÷se………17
2.4.4.5 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas………18
2.4.4.6 Aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)………18
2.4.4.7 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu identifikavimas…18 2.4.4.8 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis in vivo………...………19 3. DARBO REZULTATAI………...……….20
3.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estrela sūrių mikrobiologin÷ analiz÷ ………….20
3.2 Juslin÷ Serra da Estrela ir Serpa sūrių analiz÷……….…………..21
3.3 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷………..24
3.4 Antimikrobinio pienarūgščių bakterijų intensyvumo nustatymas Petri l÷kštel÷se………..27
3.5 Aktyvumo ir prigimties tyrimai...30
3.6 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas………32
3.7 Tyrimas aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)………...33 3.8 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu identifikavimas………..………….35 3.9 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis sūryje………..…………..35 4. REZULTATŲ APTARIMAS……….…………..39 4.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estela sųrių mikrobiologinio tyrimo
aptarimas…...39 4.2 Pienarūgščių bakterijų sintetinmos antimikrobin÷s medžiagos apibūdinimas…40 5. IŠVADOS…...42 LITERATŪROS SĄRAŠAS………..….43
ĮVADAS
Sūris - tai maisto produktas gaminamas iš karvių, ožkų bei avių sutraukinto pieno - varšk÷s. Nors pieno sutraukinimo procesai išaiškinti tik dvidešimto amžiaus pradžioje, tačiau pieną ir iš jo pagamintus pieno produktus žmon÷s vartojo nuo seno (Gudonis, 1997).
Fermentiniai sūriai yra labai vertingi pieno produktai, turintys lengvai virškinamų baltymų, riebalų, įvairių mineralinių medžiagų ir vitaminų. Jie plačiai paplitę įvairiose šalyse su savitomis gamybos technologijomis ir įvairiu asortimentu (Masteikien÷, 2006).
Fermentiniai sūriai gaunami, traukinant pieną didelį proteolitinį aktyvumą turinčiais fermentais (šliužo fermentu ar jo pakaitalais) ir dedant pienarūgščių bakterijų raugo, o kai kuriais atvejais ir propionrūgščių, gleivių bakterijų, pel÷sinių grybų (Masteikien÷, 2006).
Sūrių gamyboje mikrobiologiniai procesai vaidina vieną svarbiausių vaidmenų. Čia išskirtin÷s yra pienarūgšt÷s bakterijos. Sūrių gamybos technologijos proceso metu jos dauginasi ir tampa pagrindine subrandintų sūrių mikrobiota (Masteikien÷, 2006). Pienarūgščių bakterijų grup÷ susideda iš 13 Gram – teigiamų bakterijų genčių: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weissella (Jay, Loessner, Golden, 2001).
Pienarūgšt÷s yra sporų nesudarančios anaerobin÷s bakterijos ir gali būti rutulin÷s ar lazdelin÷s formos. Fermentuodamos produkte esančius angliavandenius, jos kaip pagrindinį galutinį produktą gamina pieno rūgštį (Jay, Loessner, Golden, 2001). Kai kurios iš šių bakterijų yra homofermentin÷s – pagamina daugiau kaip 85 % pieno rūgšties, o kitos heterofermentin÷s – tik apie 50 % pieno rūgšties, gana didelį kiekį etanolio, šiek tiek acto rūgšties ir CO2. Pienarūgšt÷s bakterijos turi fermentus β-galaktozidazę, glikolazes ir laktodehidrogenazę (LDH), kurios iš laktoz÷s gamina pieno rūgštį. Pieno rūgštis žmogaus organizme atlieka tokias naudingas funkcijas kaip:
a) pagerina pieno baltymų virškinamumą,
b) gerina kalcio, geležies ir fosforo pasisavinimą, c) stimuliuoja skrandžio sulčių sekreciją
(http://www.fao.org/docrep/x0560e/x0560e10.htm).
Nepaisant pieno produktų naudingumo žmogaus mityboje, svarbu žinoti kokie patogeniški mikroorganizmai gali daugintis pieno produktuose ir sukelti nepageidautinas ligas:
salmoneliozę, stafilokokines maisto toksikoinfekcijas, listeriozę, bruceliozę, juodligę, tuberkuliozę, Q karštinę, kampilobakteriozę, erkinį encefalitą, enterohemoraginius kolitus ir kitas (Jay, Loessner, Golden, 2001 ). Enterobacteriaceae šeimai priklausančių genčių nariai yra įvardijami kaip patogeniškiausi ir dažniausiai sutinkami mikroorganizmai klinikin÷je mikrobiologijoje. Šios gram-neigiamos lazdel÷s paprastai siejamos su virškinamojo trakto
infekcijomis, bet jos taip pat yra paplitusios ir aplinkoje, kaip normali mikroflora. Ši
Enterobacteriaceae šeima apima Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Edwardsiella ir Citrobacter gentis. Visos šios šeimos nar÷s yra gliukoz÷s fermentuotojos ir azoto mažintojos (http://www.merck.com/mmhe/sec17/ch190/ch190h.html).
Kiekviename žingsnyje žmogus susiduria su mus supančia mikropasaulio veikla. Mikroorganizmai įtakoja ne tik geruosius ar bloguosius procesus žmogaus organizme, gamtoje, bet yra ir labai svarbus veiksnys daugelio produktų gamyboje. Besivystantys mikroorganizmai fermentiniuose sūriuose lemia ne tik jų tinkamumą vartoti, bet ir skonį bei aromatą. Mikroorganizmai, dalyvaujantys į sūrių brandinime, gamina įvairius lakius komponentus, kurie suteikia būdingą aromatą ir skonį – tai nulemia tokią sūrių įvairovę.
Darbo tikslai ir uždaviniai. Mūsų tyrimų tikslas - nustatyti mikroorganizmų sąveikos ypatumus portugališkų fermentinių sūrių brandinimo metu. Tikslui pasiekti buvo numatyti šie uždaviniai:
• Steb÷ti besivystančių mikroorganizmų kaitą Serra da Estrela ir Serpa portugališkuose sūriuose.
• Atlikti juslinę sūrių analizę įvairiais sūrių subrendimo tarpsniais. • Nustatyti, kokią įtaką mikroorganizmai daro sūrio kokybei.
• Išskirti pienarūgštes bakterijas, stipriausiai įtakojusias Seratia sp., L. inoccua, E. coli ir S. aureus veiklą.
• Tirti, kokia chemin÷ medžiaga baktericidiškai ar bakteriostatiškai veik÷ patogenų veiklą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pienarūgščių bakterijų charakteristika
Pienarūgšt÷s bakterijos (PRB) yra vienos iš geriausiai žinomų ir ištyrin÷tų antagonistinių mikrobų. PRB yra gram-teigiami, sporų nesudarantys, katalaz÷s - neigiamos reakcijos mikroorganizmai. Jos yra anaerobin÷s, tačiau toleruoja deguonį, rūgštį ir sukelia rūgimą. Pieno rūgštis yra pagrindin÷ galutin÷ angliavandenių fermentacijos metu išskirta medžiaga. Pieno rūgštį gaminančios bakterijos apima Lactobacillus, Bifidobacterium gentis, Enterococcus feacalis, Enterococcus feacium, Lactococcus lactis, Streptococcus cricetus, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus ir kitas. Visos išvardintos rūšys išskyria baltymines medžiagas, vadinamas bakteriocinais. Pastaruoju metu bakteriocinai naudojami pieno, m÷sos ir kitų produktų gamyboje. Pieno rūgštį gaminančios bakterijos maisto gaminime atlieka ne tik apsauginę funkciją, jų veikla suteikia maistui išskirtinį kvapą, skonį bei konsistenciją (Line ir kt., 2008).
Skirtingose terp÷se, pvz., tokiose kaip žarnynas, pienarūgšt÷s bakterijos (PRB) gamina įvairių antimikrobinių medžiagų: organines rūgštis, bakteriocinus ir t.t. PRB, tinkamu kiekiu
pasiskirsčiusios organizme ir teigiamai veikiančios šeimininką, priskiriamos probiotikams (Sigrid ir kt., 2006). Probiotikais vadinami gyvi mikroorganizmai, kurių tam tikras kiekis
organizme yra naudingas sveikatai. Jie tapo svarbiausia tema PRB tyrin÷jime per pastaruosius 10 m. Tipiškais probiotikais galima įvardinti Lactobacillus ir Bifidobacterium gentis. Naudingas probiotikų poveikis pagrįstas tuo, kad šie mikroorganizmai apima tokių patogenų slopinimą, kaip Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas spp. ir Helicobacter spp. Be to, buvo pasteb÷tas kitas teigiamas probiotikų poveikis organizmui: maž÷ja laktoz÷s netoleravimas, slopina alergines ligas, stiprina imuninę sistemą, pasireiškia priešv÷žinis poveikis ir veikia kaip prevencin÷
priemon÷ prieš uždegimines žarnų ligas (Zoumpopoulou ir kt., 2008). Pasteb÷ta, kad probiotikai teigiamai įtakoja sveikatą, tačiau mažai žinoma, kas lemia pager÷jusią savijautą. Probiotikų veikimas priklauso nuo pačio probiotiko paderm÷s ir aplinkos sąlygų. Jų veikimas priklauso nuo pagaminamos antimikrobin÷s medžiagos, konkuravimo d÷l maisto medžiagų, konkurencin÷s sąveikos su patogenais ir sukeltos imunin÷s sistemos moduliacijos (Todorov ir kt., 2005; Albano ir kt., 2007).
1.2 Pienarūgščių bakterijų reikšm÷ sūrių gamyboje Pienarūgšt÷s bakterijos sūrių gamyboje atlieka šias funkcijas:
• Keičia pagrindinius pieno komponentus (pieno cukrų, baltymus, riebalus) į junginius, lemiančius skonines ir aromatines sūrių savybes, jų maistinę ir biologinę vertę;
• Skatina šliužo ir kt. pieną traukinančių fermentų veiklą ir sutraukos sinerezę, nes perstumia pH reikšmę į sritį, kurioje šliužo fermentas geriausiai veikia;
• Dalyvauja sūrio konsistencijos susidarymo ir išakijimo procesuose;
• Sudaro nepalankias sąlygas žalingai mikrobiotai vystytis (Albano ir kt., 2007). Tuo pačiu skaidomi pieno riebalai, kurių hidroliz÷s produktai yra svarbūs sūrio skoniui, aromatui ir konsistencijai susidaryti.
1890 m E. Freudenreichas nurod÷, kad sūrių brendimui pagrindinę reikšmę turi pieno rūgšties bakterijos. Kiti autoriai kritikavo tokią mokslininko pažiūrą, nurodydami, kad pieno rūgšties bakterijos neturi proteolizinių fermentų, kurie gal÷tų skaldyti baltymus. V÷liau buvo nustatyta, kad pieno rūgšties bakterijos turi proteolizinių endofermentų, kurie, žuvus ląstelei, išsiskiria į aplinką ir hidrolizuoja baltymus.
Nokinimo metu susidariusios laisvosios aminorūgštys suteikia sūriui būdingų juslinių savybių. Be to, bakterijų fermentų veikiamos aminorūgštys kinta toliau ir sudaro įvairių junginių, kurie taip pat turi nemažą įtaką sūrių kokybei. Ypač aktyviai aminorūgštis skaido endofermentai, kurie išsiskyria autolizuojantis bakterijoms. Tiek pienarūgščių, tiek kitų mikroorganizmų fermentų veikiamos aminorūgštys gali deaminintis, dekarboksilintis, dalyvauti peramininimo reakcijose. Šių kitimų produktai – organin÷s rūgštys, amoniakas, aldehidai, ketonai, aminai – svarbūs sūrių skonį ir aromatą formuojantys junginiai (Masteikien÷, 2006);
Daugelio sūrių ydų atsiradimo priežastis yra mikrobiologin÷s kilm÷s (Macedo, 1993). Svarbiausi sūrių ydų suk÷l÷jai yra koliformin÷s, sviestarūgšt÷s, psichrotrofin÷s, proteolitin÷s bakterijos, miel÷s ir pel÷siniai grybai. Didel÷ pašalinių mikroorganizmų dalis žūva pasterizuojant pieną, tačiau jie gali patekti į sūrius antrinio užteršimo metu – nuo įrenginių, darbuotojų rankų ir rūbų, vandens ir iš oro (Roseiro ir kt., 2003).
Psichrotrofin÷s bakterijos – tai daugiausia gram - neigiamos, porų nesudarančios lazdel÷s, kurios vyrauja piene d÷l nepakankamos įrenginių švaros ir vandens patekimo į pieną.
Psichrotrofų išskiriami fermentai termostabilūs ir tod÷l gali tur÷ti įtakos sūrių kokybei. Šių bakterijų augimas sūriuose, kaip ir kitų technologiškai žalingų mikroorganizmų (koliforminių, sporinių anaerobinių), priklauso nuo pienarūgščio rūgimo aktyvumo, psichrotrofų, kaip ir koliforminių bakterijų, randama mažiau (Rizzello ir kt., 2005).
Patekę į sūrius, pašaliniai mikroorganizmai dauginasi ir gali sukelti skonio ir kvapo, konsistencijos ir išakijimo ydas (Tavaria ir kt., 1999). Sūriuose gali pasitaikyti ir patogeninių bakterijų. Jos patenka į sūrius iš pieno, kai jis pasterizuojamas žemesn÷je kaip 74°C temperatūroje. Be to, stafilokokai gali išlaikyti ir aukštą pasterizavimo temperatūrą. Tačiau dauguma besporių patogeninių bakterijų ilgo nokinimo metu (kieti sūriai) žūva, o minkštuose sūriuose neišsilaiko d÷l rūgštaus pH, nors pasitaiko Listeria monocytogenes bakterijų. Jas sunaikinti galima kruopščiai dezinfekavus visus įrenginius (Masteikien÷, 2006).
1.3 Pienarūgščių bakterijų antibakterinis pritaikymas
Susidom÷jimas pienarūgšt÷mis bakterijomis auga, tiriamas jų geb÷jimas būti natūraliais konservantais maisto pramon÷je. PRB medžiagų apykaitos metu išskiriamos antimikrobinį aktyvumą turinčios medžiagos - organin÷s rūgštys (pieno r., acto r. ir pan.), vandenilio peroksidas, antimikrobiniai fermentai, bakteriocinai, reuterinai ir kt. (Albano ir kt., 2007). Dauguma PRB yra aktyvios prieš PRB ir kitas gram-teigiamas bakterijas. Bakterijų išskiriami bakteriocinai dažnai yra aktyvesni prieš bakterijas, kurios yra genetiškai artimesn÷s bakteriociną išskyrusiai padermei (Line ir kt., 2008, Ralph ir kt., 1995). Yra daugyb÷ straipsnių, kuriuose teigiama, kad bakteriocinai gali būti aktyvūs ir prieš gram-teigiamas, ir prieš gram-neigiamas bakterijas (Todorov ir kt., 2005; Oscariz, Pisabarro, 2001; Oh ir kt., 2000, Maldonado ir kt., 2004).
Pastaraisiais metais buvo pagrįstas bakteriocinų, kaip bio-konservantų, naudojimas maisto pramon÷je. Labai s÷kmingai buvo panaudoti tam tikri bakteriocinai įvairiame maiste L. monocytogenes slopinimui, pvz. Nizinas - Kamemberto sūryje. Jis Listeria monocytogenes sumažino 3x3 log grame, o paruoštose valgymui Cezario salotose 1x4 log ir panašiai. Daugelyje straipsnių stebimas ženklus Listeria monocytogenes bakterijų sumaž÷jimas maiste, panaudojus PRB išskiriamus bakteriocinus, tokius kaip: nizinas, pediocinas PA-1, lakticinas3147 (O`Sullivan ir kt., 2006). Bakteriocinais domimasi ir kaip farmaciniais preparatais. Šioje srityje pagrindinis bakteriocinų panaudojimo privalumas gal÷tų būti jų saugumas organizmui (Sine´, 2007; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC429093/?page=2).
1.4 Bakteriocinų apžvalga
Bakteriocinai yra ribosomose sintetinamos antimikrobin÷s baltymin÷s medžiagos, gaminamos daugelio mikroorganizmų. Dauguma bakteriocinų yra mažos molekulin÷s mas÷s, aktyvios katijonin÷s membranos komponentai. Jų peptidai formuoja membranose poras, sukeldami ląstelių žūtį. Toks apsisaugojimo mechanizmas, kada ląstel÷s išskiria katijoninius peptidus gynybos tikslams, yra aptiktas ir augaluose bei gyvūnuose. Įvairūs autoriai pateikia šiek tiek skirtingas bakteriocinų klasifikacijas
(http://www.answers.com/topic/bacteriocin; http://en.wikipedia.org/wiki/Antimicrobial_peptides;
http://www.teagasc.ie/research/reports/dairyproduction/4207/eopr-4207.asp; http://cmdr.ubc.ca/bobh/peptides.html).
Antagonistin÷ sąveika tarp konkuruojančių bakterijų pasteb÷ta jau 1877 metais, kuomet Pasteras ir Joubertas atkreip÷ d÷mesį, kad kai kurios Escherichia coli atmainos trukdo augti Bacillus anthracis abiejomis bakterijomis užkr÷stuose gyvūnuose, tačiau bakteriocinai pirmą kartą buvo aptikti tik 1925 m. Andre Gratia pasteb÷jo, kad kai kurių virulentiškų E. coli štamų veiklą stabdo viena antibakterin÷ medžiaga, kurią jis pavadino kolicinu V. V÷liau kolicinas V buvo apibūdintas, kaip atspari karščiui baltymin÷ medžiaga. 1954 m. Piero Frederiko pasteb÷jo bakteriocinų genetinio gyvavimo mechanizmą, panašų į ląstelių lytinį dauginimąsi. Reikšmingos apsaugin÷s antimikrobin÷s peptidų savyb÷s pasireiškia d÷l juose esančios išskirtin÷s
aminorūgščių sekos. Daugelį bakteriocinų galime apibūdinti kaip mažos molekulin÷s mas÷s, katijonines, hidrofobines, karščiui atsparias baltymines medžiagas. Visi jie yra koduoti struktūrinių genų, kurie laisvas aminorūgštis ribosomose transliuoja į peptidus (Oscariz, Pisabarro, 2001; Michaelidou ir kt., 1998).
Antimikrobiniai peptidai, išskirti bakterijų, buvo sugrupuoti į kelias skirtingas klases, atsižvelgiant į molekulinį dydį, peptidą išskiriantį organizmą, cheminę struktūrą ir jo veikimo metodą. D÷l skirtingų klasifikacijų atsirado ir keletas skirtingų antimikrobinių peptidų
pavadinimų, tokių kaip: mikrocinai, kolicinai, bakteriocinai, lantibiotikai, tiolbiotikai,
cystibiotikai, kurie gali skirtingose klasifikacijose tur÷ti kitokį pavadinimą (Jack ir kt., 1996). 1.5 Bakteriocinų klasifikacija
Gram-teigiamų bakterijų išskiriamoms skirtingoms antimikrobin÷ms medžiagoms sugrupuoti buvo panaudota keletas klasifikavimo kriterijų. Bakteriocinai buvo sugrupuoti į 4
grupes: 1 grupei priklauso antibiotikai su neįprastomis, po transliacijos pakeistomis, aminorūgštimis, tokiomis kaip dehidroalaninas, dehidrobutirinas, lantioninas, ar β-metil-lantioninas (lantibiotikai). 2 grup÷s antibiotikai (cystobiotikai) savo sud÷tyje turi nors vieną disulfidinį (S-S) tiltelį – pagrindinį veiksnį, lemiantį jų veiklą. 3 grupei priklauso dariniai savo struktūroje turintys vieną SH radikalą. Kad antibiotikai veiktų, jie tur÷tų būti redukuotoje formoje (tiolbiotikai). 4 grupei priklauso antibiotikai be cisteino radikalo (Jack ir kt., 1995; Abee, 1995).
Tikrasis cisteino radikalo poveikis bakteriocino aktyvumui n÷ra galutinai aiškus, tačiau yra nustatyta, kad kuo daugiau disulfidinių tiltelių bakteriocinas turi, tuo platesnis jo veikimo spektras (Oscariz, Pisabarro, 2001).
Daugiausia nagrin÷ti ir ištirti pienarūgščių bakterijų išskiriami bakteriocinai, d÷l jų galimo panaudojimo kaip maisto biokonservantų ir d÷l vis dažn÷jančių maisto sukeltų infekcinių ligų (Michaelidou ir kt., 1998).
Remiantis Klaenhammeriu, bakteriocinai gali būti skirstomi į 4 kategorijas, atsižvelgiant į jų molekulinę masę, termostabilumą, jautrumą fermentams, po transliacijos pasikeitusias aminorūgštis ir veikimo metodą (Oscariz, Pisabarro, 2001).
1.5.1 I bakteriocinų kategorija
Ši grup÷ susideda iš lantibiotikų ir gali būti padalinta į 2 pogrupius, atsižvelgiant į jų struktūrą ir elementą, lemiantį jų aktyvumą.
Ia – maži katijoniniai peptidai esti sraigto formos, amfipatiniai, jų veikimas priklauso nuo sukuriamo elektinio lauko tarp lastelių membranos taikinių ir bakteriocino. D÷l nenustatytos sąveikos su ląstel÷mis taikiniais sudaro poras, sukurdami įtampą ląstelių membranose.
Ib – susideda iš anijoninių arba rutuliškos formos neutralių peptidų. Šio pogrupio
bakteriocinų molekulin÷ mas÷ apima ribas nuo 1,959 (duramicinas) iki 4,635 (didžiausias iki šiol aprašytas lantibiotikas karnocinas UI49) (Maragkoudakis ir kt., 2009; Oscariz, Pisabarro, 2001).
1.5.2 II bakteriocinų kategorija
Šis tipas apima karščiui atsparius peptidus, sudarytus iš nemodifikuotų aminorūgščių, kurių molekulin÷ mas÷ mažesn÷ už 10 kDa. Šios grup÷s bakteriocinai yra skirstomi į dar 3 pogrupius:
II a pogrupiui priklauso anti-listeriniai peptidai, tokie bakteriocinai kaip: pediocinas AcH/PA1, mesentericinas Y 105, sakacinas A, sakacinas P ir karnobakteriocinas B2. Šie
komponentai yra baktericidiniai, nes jie sugriauna citoplazmos membranos vientisumą, sukelia joninį disbalancą ir organinio fosfato pralaidumą, taip sukeldami ląstel÷s žūtį.
II b grupei priklauso poras formuojantys bakteriocinų kompleksai, kurie susideda iš 2 peptidų. Šie du peptidai gali veikti ir po vieną, tačiau jų kompleksas veikia sinergetiškai (pvz.: enterocinas L50A ir L50B).
II c grupei priklauso 2 bakteriocinų tipai: antibiotikai su 1 ar 2 cisteino radikalais (tiolbiotikai ir cystibiotikai) ir antibiotikai be cisteino (laktokocinas A ir acidocinas B) (Jack ir kt., 1996; Oscariz, Pisabarro, 2001).
1.5.3 III bakteriocinų kategorija
Šiai klasei priklauso peptidiniai antibiotikai, kurie yra karščiui neatsparūs, jų molekulin÷ mas÷ yra didesn÷ nei 30 kDa. Daugelis jų yra gaminami Lactobacillus genties bakterijų. Šiai bakteriocinų grupei priklauso helveticinas J sintetinamas L. helveticus 481 ir lacticinas B gaminamas L. acidophilus (Gottlieb ir kt., 2008).
1.5.4 IV bakteriocinų kategorija
Šiai grupei priklauso glikoproteinai (laktocinas 27) arba lipoproteinai (lakstrepcinai), kurių aktyvumas priklauso nuo nebaltymin÷s bakteriocino dalies, t.y. nuo prie baltymo prisijungusių oligosacharidų ar lipidų (Oscariz, Pisabarro, 2001).
1.5.5 Gram-neigiamų bakterijų išskiriami bakteriocinai
Mokslininkai Kolter ir Moreno daugiausia dom÷josi bakteriocinais, išskiriamais iš gram-neigiamų bakterijų. Kolicinai ir mikrocinai buvo lengvai apibūdinti d÷l mažos molekulin÷s mas÷s, mikrocinai mažesni nei 10 kDa, o kolicinai vos didesni. Kolicinai ir mikrocinai yra sintetinami Enterobacteriaceae šeimos bakterijų ir slopina, būtent, gram-neigiamų mikroorganizmų veiklą. Pirmasis atrastas bakteriocinas - kolicinas yra apibr÷žiamas, kaip siauro spektro antibiotikas, kurio bakteriocidinis aktyvumas atsiskleidžia, sąveikaujant su specifiniais ląstelių membranose esančiais receptoriais. Kai kurie bakteriocinai yra labai saviti, nes jų sintez÷ yra kontroliuojama SOS-signalui pavaldaus mechanizmo, kuris įtraukia ir bakteriociną išskyrusios ląstel÷s susinaikinimą. Mikrocinai turi daug panašumų su II kategorijos bakteriocinais: jų molekulin÷ mas÷ mažesn÷ nei 10 kDa, jie sintetinami stacionariosios faz÷s metu ir neturi nelaim÷s signalo. Turintys būdingiausius bruožus šios rūšies bakteriocinai yra 2: kolicinas V, pats pirmasis aprašytas bakteriocinas, nes jo molekulin÷ mas÷ yra apie 6 kDa ir
mikrocinas C7, modifikuotas heptapeptidas, kuris yra laikomas mažiausiu iki šiol aprašytu antibakteriniu peptide (Fahimdokht, 2008; Oscariz, Pisabarro, 2001; Charles M. ir kt., 2007).
1.6 Bakteriocinų chemin÷s ir fizikin÷s savyb÷s
Letalinei misijai įgyvendinti, I ir II kategorijoms priklausantys bakteriocinai turi atitikti 2 pagrindinius reikalavimus - būti katijoniniai ir stipriai hidrofobiniai. Dauguma mažos molekulin÷s mas÷s bakteriocinų yra veiklūs gana plačiose terp÷s pH r÷muose (3.0-9.0) ir kurį laiką gali nesuirti tokiose ekstremaliose pH reikšm÷se kaip pH 1.0 (acidocinas B) arba pH 11.0 (bavaricinas A). Pasteb÷ta, kad beveik visi bakteriocinai yra katijoniniai prie pH 7.0, kol kas tik laktocinas S išimtinai buvo pasteb÷tas neutraliame pH, turintis -1 joninį krūvį. Dar vienas ryškus mažos molekulin÷s mas÷s antimikrobinių peptidų bruožas yra jų atsparumas karščiui. Junginiai, susidedantys iš monosulfidų ir disulfidų tarpmembraninių jungčių, padeda stabilizuoti baltymus (entropinis efektas). Žvelgiant į bakteriocinų molekulinę sud÷tį, tarpmolekulinių tiltelių efektyvumas priklauso nuo jų kiekio. Kuo didesnis jų skaičius bakteriocine, tuo didesnis peptido stabilumas. Cintas ir kt. (Cintas ir kt., 1995) ištyr÷, kad dauguma supernatantinių bakteriocinų struktūrų, sujungtų tokiais tilteliais, yra atsparios karščiui - net autoklavavimui (100-121ºC). Žinoma, kai kurie bakteriocinai išskirti Lactobacillus genties (helveticinas J) buvo inaktyvuoti 10-15min pakaitinus 60-100ºC. Bakteriocinai gali būti nesunkiai atkurti ne vien iš klasikinių bakterijų kultūrų, bet taip pat ir iš ryžių luobel÷s pelenų. Iš jų rūgštimi buvo išskirtas pediocinas PA-1.
Daugiausia išstudijuotas bakteriocinas – nizinas, atrastas 1928 m. Jis gaminamas
Lactococcus lactis ir susideda iš 34 aminorūgščių, turi 5 lantionino tiltus. Nizino stabilumas labai priklauso nuo pH ir temperatūros santykio. Prie pH 2.0 nizinas yra tirpus, antimikrobiškai
aktyvus ir termostabilus (išliko aktyvus 10 min kaitinant 100ºC temperatūroje). Tačiau nesunkiai neutralizuojamas prie pH 7.0. D÷l nizino jautrumo virškinimo fermentams jo nebuvo galima panaudoti klinikin÷je praktikoje, bet jis s÷kmingai pritaikytas kaip maisto konservantas (E-234) (Barnby-Smith, 1992; Aly ir kt., 2006).
1.7 Bakteriocinų veikimo būdas
D÷l įvairios bakteriocinų chemin÷s struktūros jie paveikia skirtingas ląstelių būtinąsias funkcijas (transkripciją, transliaciją, replikaciją ir ląstel÷s sienel÷s biosintezę), tačiau dauguma jų veikia formuodami ląstelių membranose kanalus ar poras, taip sunaikindami ląsteles
Nizinas (pagal Klaenhammerį priskiriamas grupei Ia) yra bakteriocinas, kurio veikimo mechanizmas buvo geriausiai išnagrin÷tas. Šis katijoninis lantabiotikas siejasi elektrostatiškai su neigiamo membranos krūvio fosfolipidais. Lizinas yra katijonin÷ aminorūgštis, dalyvaujanti šioje elektrostatin÷je sąveikoje. Tarp hidrofobin÷s nizino dalies ir bakterijos membranos taikinio yra sukuriamas nespecifinis joninis kanalas, kurio formavimui padeda aukštas transmembraninis potencialas ir anijoninių lipidų buvimas, esant mažesniam kiekiui katijoninių. Porų formavimas maž÷ja, esant dvivalenčiams katijonams (Mg2+ ar Ca2+), nes jie neutralizuoja fosfolipidų neigiamą krūvį, sumažindami membranos nestabilumą. Nizino sukurtos poros membranoje leidžia vykti pasyviai jonų difuzijai (K+ ir Mg2+), aminorūgščių (glutaminui, lizinui) ir ATP, bet ne dideliems citoplazminiams proteinams, lengvai pasiduodantiems membranos paj÷gumo ir protonų siurblio išeikvojimui, po ko įvyksta ląstel÷s žūtis (Oscariz, Pisabarro, 2001).
II a klas÷s bakteriocinų veikimo schema yra panaši į nizino. Šios klas÷s bakteriocinai yra antilisteriniai, atsižvelgiant į YGNGV eil÷s tvarką aminorūgšties N-gale. Dabartin÷ šio
bakteriocino veikimo mechanizmo hipotez÷ yra jo elektrostatinis apvadas, sąveikaujantis su ląstelių membranos taikiniais – receptorin÷m molekul÷m, nors, šių specifinių receptorių svarbumas dar yra ginčytinas. Sp÷jami ląstelių receptoriai būtų reikalingi, atpažįstant peptide esantį YGNGV antilisterinį motyvą (Ennahar ir kt., 2000).
Pagal Klaenhammerio bakteriocinų klasifikavimą IIc pogrupis gali būti padalintas į dar 2 dalis, priklausomai nuo to, juose yra ar n÷ra tarpmolekulinių disulfido tiltelių. IIc pogrupio abiejų dalių veikimas gali ženkliai skirtis. Laktokocinas A (šis bakteriocinas yra be cisteino radikalo) veikia bakterijos membraną, formuodamas joje poras. Cereino 7/8 (cystibiotiko) aktyvumas maž÷ja, kuomet jį supančios terp÷s osmosinis sl÷gis did÷ja. Kaip ir įprasta bakteriocinams, šis taip pat veikia ląstel÷s membraną. Platus šių junginių veikimo spektras leidžia daryti prielaidą, kad membranos išor÷je esantys specifiniai receptoriai n÷ra būtini. Visoje II c klas÷je yra teigiamai įkrautos aminorūgštys. Triptofanas hidrofiliniame N-gale gali palengvinti neįprastą sąveiką su neigiamai įkrautais fosfolipidais ląstelių membranos taikiniuose, be to, sulygina tarpmembranines poras. Cereino 8 atveju 3 triptofano liekanos ir 1 lizino liekana lokalizuojasi aštuntame amino rugšties N – gale ir skatina statybinę funkciją. Šis galas seka paskui stipriai hidrofobinę C galo dalį, kuri gali dalyvauti formuojant transmembranines poras panašiu būdu, kuriuo veikia Pediocinas PA1 (II a klas÷). Cystibiotikai priklausantys II c klasei (cereinas 7/8, enterocinas B, karnobakteriocinas A ir divergicinas A) tur÷tų būti antrin÷s stukrūros, kuriai
būdinga ilga kilpa, užimanti beveik visą hidrofobinę dalį. Visose klas÷se pirmas cysteino radikalas yra po teigiamai įkrautu lizino radikalu hidrofobinio ploto gale ir antrasis radikalas trečioje paskutin÷s eil÷s pozicijoje. Disulfido tiltai, kurie būtini antibakteriniam bakteriocino poveikiui, tur÷tų glaustis su proteino C galo dalimi, su kompaktiška hidrofobine struktūra, praturtinta glicino radikalais, kurie yra stuktūriškai lankstūs. Toks lankstumas sudaro galimybę molekul÷ms pereiti iš β formos į α formą, atsakingą už hidrofobiškumą aplinkai. Hidrofobin÷s kilpos ilgio užtenka prasiskverbti pro citoplazmos membraną ir, susitelkus daugiau tokių kilpų, padaryti mirtiną porą membranoje (Ennahar ir kt. 2000; Yanagida ir kt., 2005; Oscariz,
2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS
2.1 Tyrimų vykdymo vietaTyrimai buvo atliekami Portugalijoje, Porto miesto Katalikiškojo Biotechnologijos Universiteto mikrobiologijos laboratorijoje. Toliau tyrimas buvo tęsiamas Portugalijos Idanha a Nova kaimelyje, sūrių fabrike, ir Lisabonos mieste, Lisabonos Universitete.
2.2 Tyrimų objektai
Tyrimų objektai: Sera da Estrella, Serpa ir jiems analogiški tradiciniai portugališki sūriai; pienarūgšt÷s bakterijos, jų išskiriamos antimikrobin÷s medžiagos.
2.3 Serra da Estrela ir Serpa sūrių gamybos technologija Serra da Estrela ir Serpa sūriai buvo tiriami nuo 1 iki 60
sunokimo dienos. Abiejų sūrių gaminimo technologija yra labai panaši. Žalias avių pienas gamybos metu sutraukinamas Cynara cardunculus L. (žr. 2.3.2 pav.) ekstraktu 30°C temperatūroje. Po pieno koaguliacijos (nustatoma iš akies) jis yra supjaustomas nevienodų formų gabalais, kurie perpilami į r÷tį, kad nuvarv÷tų išrūgos. Galiausiai yra įtrinama druska abiejose sūrio pus÷se ir sūris paliekamas 30-45 dienoms nokti be temperatūros ar dr÷gm÷s kontrol÷s (žr 2.3.1 pav.). Brandinimo metu sūriai yra kasdien apverčiami, o plaunami šiltu vandeniu kartą per savaitę.
2.4 Tyrimų metodai
2.4.1 Chemin÷ analiz÷ – rūgštingumo nustatymas
Rūgštingumas yra rodiklis, kuris priklauso nuo sūryje
esančių baltymų savybių, baltymų kiekio sūryje, sūrio rūgšties kiekio, sūryje esančių druskų (rūgštinių ar šarminių) savybių ir jų kiekio. Rūgštingumas yra nustatomas titravimo bei indikatorinių popier÷lių (ekspres) metodais ir matuojamas pH – metru. Naudojant titravimo ar indikatorinių popier÷lių metodus, rūgštingumas išreiškiamas Ternerio laipsniais (°T) arba pieno rūgšties procentais. Naudojant pH-metrą, nustatomas aktyvusis sūrio rūgštingumas. Jis parodo vandenilio jonų koncentraciją sūryje ir išreiškiamas pH dydžiu.
2.3.2 pav. Cynara Cardunculus L. 2.3.1pav. Sūriai nokinimo metu
2.4.1.1 Sūrio titruojamojo rūgštingumo nustatymas Metodo esm÷. Šiuo metodu nustatomas bendras sūrio rūgštingumas. Natrio hidroksido tirpalu, naudojant indikatorių fenolftaleiną, neutralizuojamos laisvosios rūgštys, rūgščiosios druskos, laisvosios baltymų rūgštin÷s grup÷s ir sūryje ištirpęs CO2 (žr. 2.4.1.1 pav).
2.4.1.2 Sūrio aktyviojo rūgštingumo (pH) nustatymas Sūrio aktyvusis rūgštingumas yra laisvųjų vandenilio jonų koncentracija, išreikšta neigiamu logaritmu ir žymima pH vienetais. Sūrio aktyvusis rūgštingumas matuojamas pH-metru (žr. 2.4.1.2 pav.).
2.4.2 Juslin÷ analiz÷
Juslin÷ analiz÷ – tai produktų organoleptinių savybių tyrimas jutimo organais. Juslin÷s analiz÷s laboratorija (žr. 2.4.2.1 pav.) turi atitikti bendruosius reikalavimus:
• Laboratorijai geriausiai tinka pastovaus ir vienodo intensyvumo dienos apšvietimas.
• Pagalbin÷s vietos m÷giniams ruošti ir plauti indams turi būti izoliuotos nuo vietos, kurioje atliekama juslin÷ analiz÷.
• M÷ginius analizei reikia pateikti šviesiuose induose, kad nebūtų blaškomas vertintojų d÷mesys.
• Laboratorijoje turi būti prietaisai, rodantys patalpos santykinę oro dr÷gmę ir temperatūrą.
Kiekvienas juslinio vertinimo dalyvis vadinamas vertintoju (Gudonis, 2004).
Serra da Estrela ir Serpa sūrių juslin÷ analiz÷ buvo
atliekama pagal 2.4.2.2 pav. pavaizduota schemą.
2.4.1.1pav. Sūrio titruojamojo rūgštingumo nustatymas
2.4.1.2pav. Sūrio aktyviojo rūgštingumo nustatymas
2.4.2.1 pav. Juslin÷s analiz÷s laboratorijų pavyzdžiai
2.4.2.2 pav. Juslin÷s analiz÷s atlikimo schema Serra da Esrela ir Serpa sūriams
Vienuolikos atrinktų ir apmokytų vertintojų grup÷ atliko juslinę analizę. Vertintojai buvo atrinkti, atsižvelgiant į jų juslinius geb÷jimus. Kandidatų atrankai buvo naudojami šie testai: ageuzijos (nepilnai išvystytų skonio dirgiklių) nustatymo testas ir anosmijos (nepilnai išvystytų uosl÷s dirgiklių) nustatymo testas. Dalyviai buvo apmokomi atlikti standartinį kvapų nustatymą tam, kad jutimų organai priprastų prie pieno produktų juslinių savybių. Buvo paruoštas šešiolikos įprastų pieno produktų kvapų sąrašas. Juslin÷s analiz÷s dalyviai per kelias nuoseklias sesijas tur÷jo atlikti Serra da Estrela ir Serpa sūrių analizę. Šių regionų sūriai buvo pateikti nuo 1 iki 60-tos subrendimo dienos iš dviejų pieninių. Susitelkę ties kvapų sąrašu, vertintojai tur÷jo identifikuoti ir išmatuoti pagrindinius sūrių aromatus. Kiekvienas iš analizuotojų uost÷ pavyzdžius, išmatavo ir vertino skaičiais nuo 0 iki 7 . Čia 0 reiškia, kad toks aromatas visai nejaučiamas, o 7 – labai stiprus kvapas.
Vertintojų atranka juslinei analizei atlikti
Jutimų lavinimas Juslinių rodiklių sąrašo sudarymas Juslin÷ analiz÷ Pieno produktų pavyzdžiai
2.4.3 Mikrobiologinis tyrimas
Buvo tirti portugališki Serpa ir Serra da Estrela sūriai jų nokinimo metu. Brandinimo trukm÷ tęs÷si iki 60 dienų. Per šį laikotarpį buvo stebimas mikroorganizmų vystymasis, kiekis ir skirtumai abiejuose sūriuose. Atskirais brandinimo tarpsniais buvo skaičiuojamas atskirų mikroorganizmų kiekis. Steb÷jome:
• Bendrą mikroorganizmų kiekį sūryje; • Koliforminių bakterijų kiekį;
• Pieno rūgšties bakterijas: Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Enterococcus spp. ir Leuconostoc spp.;
• Pseudomonas spp.; • Staphylococcus spp.; • Mieles ir pel÷sinius grybus.
1, 7, 15, 30, 45 ir 60 sunokimo dieną buvo paimti pasirinktų Serra da Estrela ir Serpa sūrių pavyzdžiai. Pašalinama žiev÷, tada atpjaunama plona riek÷ sūrio iš giliausių jo sluoksnių, po to iš vidutinio gilumo ir, galiausiai, atriekiama sūrio skiltel÷, esanti arčiausiai krašto. Visų šių trijų skiltelių bendra mas÷ tur÷tų būti apie 10 g. Jos įdedamos į vienkartinį plastikinį maišelį kartu su 2 % (w/v) natrio citratu (90 g), kuris naudojamas, kaip ekstrahuojantis buferinis tirpalas, ir 2 min homogenizuojamos Stomacher Lab-Blender 400 (žr.
2.4.3.1 pav.). Po to, pipete paimamas 1ml taip apdoroto sūrio ir dar 10 kartų praskiedžiamas steriliame 0,1 % (w/v) peptoninio vandens tirpale. Tada skiedinys yra pas÷jamas ant keleto skirtingų terpių (žr. 2.4.3.2 pav.): PCA – Plate Count Agar, mitybos terp÷ bendram mikroorganizmų skaičiui nustatyti (pagal LST EN ISO 4833); VRTL – violetiškai raudonas tulžies ir laktoz÷s agaras, mitybos terp÷ koliformin÷ms (Enterobacteriaceae) bakterijoms nustatyti (pagal LST ISO 5541 – 1); RA – Rogoso agaras, parūgštintas ledine acto rūgštimi (96 %) iki pH 5,5. Ši mitybin÷ terp÷ skirta Lactobacillus spp. nustatyti; M17A – M17 agaras Lactococcus spp. atpažinimui; Mayeux, Sandine ir Elliker Agaras (MSEA) – Leuconostoc spp.; Kanaycine Azide Agar (KAAA) – Enterococcus spp.; Baird-Parker Agar (BPA), sumaišytas su 50 ml L-1 sterilaus kiaušinio trynio, skirtas Staphylococcus spp. augti; Potato Dextrose Agar
2.4.3.2pav. Petri l÷kštel÷s su įvairiom mitybos terp÷mis mikrobiologinei analizei atlikti
2.4.3.1pav. Stomacher Lab-Blender 400
(PDA), prarūgštintas 10 ml L-1 10 % (v/v) sterilia pieno rūgštimi, naudojamas miel÷ms ir pel÷siniams grybams atpažinti; Pseudomonas Agar Base (PAB), sumaišytas su 10 ml L-1 CFC priedais, naudojamas Pseudomonas spp. atpažinimui.
2.4.4 Antibakterinio pienarūgščių bakterijų poveikio nustatymas
Antibakteriniam PRB poveikiui nustatyti buvo pasirinkti 4 patogeniniai mikroorganizmai: 2 gram - teigiami ir 2 gram – neigiami. Visi panaudoti mikroorganizmai buvo išskirti iš avies ir ožkos pieno, išskyrus referencinius kamienus - Listeria inoccua ATCC 33090 ir Escherichia coli ATCC 8739. Išskirtos mikroorganizmų kultūros buvo užšaldytos atitinkamame sultinyje, patalpintos į šaldiklį ir laikomos -20ºC temperatūroje. Paruoštos naudojimui kultūros buvo laikomos 4ºC temperatūroje. Tyrin÷jimams buvo panaudotos lentel÷je Nr. 2.1 pateiktos bakterijos:
2.1 lentel÷. Tyrimui naudotos indikatorinių mikroorganizmų kultūros
Mikroorganizmai Gauta iš
Serratia sp. “Lauko paderm÷” (iš avies pieno)
Staphylococcus aureus “Lauko paderm÷” (iš avies pieno)
Listeria inoccua Užpatentuotas ATCC 33090 šablonas
Escherichia coli Užpatentuotas ATCC 8739 šablonas
Buvo tiriamas šių tik÷tinų PRB veiksmingumas: Lactococcus spp., Lactobacillus spp. ir Leuconostoc spp.
2.4.4.1 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷ tik÷tinam antimikrobiniam poveikiui nustatyti
Greitam antimikrobiniam min÷tų bakterijų poveikiui steb÷ti, buvo panaudoti mikroorganizmai: Serratia spp., Staphylococcus aureus, Listeria inoccua ATCC 33090 ir E. coli ATCC 8739. Tyrimai atlikti, naudojant aukšto patikimumo atrankos analizę (High Throughput Screening Assay) Bioscreen C aparatu.
Pasirinkti tyrimui mikroorganizmai buvo auginami TSB (Tryptic Soy Broth) 30ºC temperatūroje 24 val., išskyrus Serratia spp., buvo inkubuojama 25ºC temperatūroje. Bakterijų kolonijos skaičiuojamos CFC Pseudomonas Selective Agar – Serratia spp., Baird Parker Agar + RPF priedu - Staphylococcus aureus, Oxoid Chromogenic Listeria Agar - Listeria inoccua skaičiavimams ir Rapid E.coli Agar 2 - E.coli su būdingu dešimtainiu atskiedimu peptoniniame
vandenyje 0,1%. Pieno rūgšties bakterijų (PRB) Lactobacillus ir Leuconostoc gentys buvo auginamos MRS sultinyje, o Lactococcus genčiai auginti panaudotas M17 sultinys. Abi terp÷s su mikroorganizmais laikytos 30ºC temperatūros termostate 24 val. – 48 val. PRB kiekiui nustatyti panaudoti MRS ir M17 agarai.
PRB filtratas išgautas MRS ar M17 sultiniuose, per naktį auginant anksčiau nurodytas PRB kultūras ir filtruojant jas steriliu “Filtropur S 0,2 µm membrane” filtru. Filtratas buvo panaudotas aukšto patikimumo atrankos analizei, testuojant jį prieš pasirinktus patogeninius mikroorganizmus. “Medaus korio” mikrol÷kštel÷s su paruoštomis tikrinimui mikroorganizmų-filtratų kultūromis buvo inkubuojamos į Bioscreen C aparatą 24-48 val. 30ºC temperatūroje su l÷kštelių pakratymu ir optinio tirštumo plačiabang÷s OD 450-580nm bangos nustatymu kas 30 min. Antimikrobinis filtratų poveikis buvo matomas d÷l skirtingo mikroorganizmų augimo kontrolin÷je srityje ir srityje su filtratais. Kiekvienas bandymas buvo atliktas 3 kartus.
2.4.4.2 “Medaus korio” mikrol÷kštel÷s paruošimas tyrimui
Sterili “medaus korio” mikrol÷kštel÷ (žr. 2.4.4.2.1 pav.) su 100 duobučių buvo paruošiama analizei steriliame laminariume, padalinus jį į 2 dalis, kad vienu metu būtų galima tikrinti tuos pačius filtratus dviems patogenams. Į Bioscreen C aparatą d÷jome dvi “Medaus korio” mikrol÷kšteles, kad vienos analiz÷s metu gal÷tume matyti pasirinktų PRB filtratų aktyvumą visiems keturiems kontroliniams patogenams.
Tuo pat metu gal÷jome išsiaiškinti 10 filtratų aktyvumą
mikroorganizmams. Viena mikrol÷kštelių eil÷ buvo padalinama į 4 dalis. Buvo įpilama 50µl PRB filtrato į 200µl TSB terp÷je per naktį užaugintų indikatorinių mikroorganizmų. Nuo viršaus į pirmas 3 duobutes įšvirkšdavome 250µl indikatorinių mikroorganizmų, kad bendras jų kiekis būtų vienodas testuojamose ir kontrolin÷se
duobut÷se. Paskutin÷, 10-oji duobut÷, buvo paliekama, kaip kontrolin÷, į ją įšvirkščiant 250µl strerilaus TSB.
2.4.4.3 Antimikrobinio poveikio nustatymas Petri l÷kštel÷se
Pienarūgšt÷s bakterijos, kurių filtratai pirmuoju bandymu parod÷ patogenus slopinantį poveikį, buvo dar kartą tikrinamos kitu metodu. Bandymas buvo atliekamas Petri l÷kštel÷se (15 cm skersmens), pas÷jant 1ml patogeninio mikroorganizmo kultūros ir jį atskiedžiant 10 kartų su Mueller-Hinton agaru. Terpei sustingus, joje padaromas atitinkamas skylučių kiekis į kurias
2.4.4.2.1 pav. „Medaus korio“ mikrol÷kštel÷
įšvirkščiamas filtratas ar kita pasirinkta testavimo medžiaga, kaip pvz,: pieno rūgštis pH 3. Kultūros 30ºC temp. termostate buvo paliekamos augti 24 val. Pasibaigus inkubavimo laikui, antimikrobinis poveikis buvo matuojamas skaidriu plotu apie padarytą agare skylę.
2.4.4.4 Bakteriocino aktyvumo ir prigimties tyrimai
Tam, kad įsitikintume, jog antimikrobinį poveikį sąlygojo baltymin÷ medžiaga, bandymai buvo dar kartą pakartoti PRB filtratus paveikus fermentais: proteaze, papainu, tripsinu ir chimotripsinu. Į 1ml filtrato įd÷jome 100µl proteazių. M÷gintuv÷lis buvo lengvai pavartomas ir įdedamas į 70ºC temperatūros vonelę, kurioje laikomas 2 valandas. V÷liau tyrimai buvo kartojami iš naujo ir stebimas antimikrobinio poveikio pasikeitimas.
PRB filtratai buvo veikiami ir karščiu: 121ºC temperatūroje 20 min autoklavuojami ir atv÷sus v÷l buvo tiriamas filtrato antibakterinis poveikis mikroorganizmams.
2.4.4.5 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas
PRB filtratas, rodantis didžiausią antimikrobinį poveikį, buvo paveiktas butanu, izobutanu bei eteriu, kad atskirti vandenyje tirpią ir netirpią organinę filtrato dalis. M÷gintuv÷liai centrifuguojami, organin÷ dalis atskiriama nuo vandenin÷s dalies, tyrimai kartojami ir stebima, kurioje dalyje yra antimikrobin÷ medžiaga. V÷liau buvo atliekami HPLC tyrimai su pasirinktu filtratu, kurio antimikrobin÷ medžiaga buvo aptikta jo organin÷je dalyje.
2.4.4.6 Aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)
HPLC tyrimai buvo atlikti su Skysčių chromatografu FinniganTM Surveyor® Plus Modular LC System parengta su Purospher® STAR RP-18 kolon÷le iš Merck ir Xcalibur programin÷s įrangos. Ekstraktai buvo analizuojami HPLC metodu, įšvirkščiant 25 µl ir naudojant gradientą, sudarytą iš tirpalo A (0.1% tūrio dejonizuotas vanduo), tirpalo B (TFA praskiesta 1000 kartų dejonizuotu vandeniu) ir tirpalo C (metanolio). Tirpalų kiekio paskirstymas laike: 0 min 90% A, 10% B; 50 min 5% A, 80% B, 15% C.
2.4.4.7 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu identifikavimas
Tos kultūros, kurių antimikrobinis poveikis patogenin÷ms bakterijoms buvo didžiausias, buvo identifikuojamos panaudojus API 50 CH metodą. Patalpinamos termostate 37ºC temperatūroje 48 valandoms. Atpažinimas atliekamas pagal spalvų intensyvumą tam tikrose sunumeruotose duobut÷se.
2.4.4.8 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis in vivo
Atliekant bandymus su PRB in vivo, buvo gaminamas sūris, atsižvelgiant į tradicinio portugališko sūrio gaminimo technologiją. Jam pagaminti buvo naudojami du kibirai pasterizuoto avių pieno, į juos įpylus komercinio sūrių starterio mišinio rekomenduojamo tokio tipo sūriams gaminti. Tada mišinys pašildomas iki 32ºC temperatūros. Į abu kibirus pieno įpyl÷me po 1ml kiekvieno indikatorionio mikroorganizmo, kurie buvo auginami TSB: E. coli, Staphylococcus aureus, Listeria inoccua ir Serratia spp. Aktyviausios pienarūgšt÷s bakterijos veiksmingumui patikrinti, tokiame kolonizuotame patogeniniais mikroorganizmais sūryje, vieną pieno kibirą papild÷me 1ml per naktį MRS terp÷je užauginta PRB 7013 kultūra. Abu kibirai pieno buvo sutraukinti Cynara cardunculus L. ekstraktu ir pagal įprastą gaminimo technologiją pagaminti 300g sūriai. Jie supresuoti ir po 2 valandų įtrinti druska bei patalpinti 8-11ºC temperatūros 90-95% santykinio dr÷gnio kameroje. Po 13 dienų sūriai buvo perkelti į 12-14 ºC temperatūros ir 85-90% dr÷gnumo kamerą, ten laikomi iki 30-tos sūrių brandinimo dienos. M÷giniai tyrimams buvo imami 1, 7, 15, 30 ir 75-tą surių brandinimo dieną. Buvo nustatomas sūrių pH pagal anksčiau aprašytą metodą pH-metru ir skaičiuojami mikroorganizmai abiejuose sūriuose (kontroliniame ir su PRB 7013). Bakterijos buvo skaičiuojamos CFC Agare Serratia spp. nustatyti, Baird Parker Agare + RPF priedu Staphylococcus aureus, OCLA Listeria inoccua, Rapid E.coli Agaras 2 - E.coli ir MRS agaras Lactobacillus spp. bakterijoms suskaičiuoti.
3. DARBO REZULTATAI
3.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estrela sūrių mikrobiologinis tyrimas Steb÷tas mikroorganizmų vystymasis, kiekis ir skirtumai Serpa ir Serra da Estrela sūriuose atskirais brandinimo tarpsniais. 3.1.1 ir 3.1.2 paveiksl÷liuose pateiktos min÷tų sūrių stebimos mikrobiotos dauginimosi dinamika.
Bendrai apžvelgus abiejų nokinamų sūrių mikroorganizmų vystymąsi, matome, jog pienarūgšt÷s bakterijos buvo dominuojančios visą sūrio brandinimo periodą. Enterobacteriaceae šeimos bakterijų, Staphylococcus spp. ir Pseudomonas spp. kiekiai, bręstant sūriui, maž÷jo, išskyrus Staphylococcus spp. Serra da Estrela sūryje.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 7 15 30 45 60 Laikotarpis dienomis lo g (k s v /m l)
Bendras mikroorganizmų skaičius Enterobacteriaceae Lactobacillus
Lactococcus Enterococcus Leuconostoc
Pseudomonas Staphylococcus Miel÷s ir pel÷siniai grybai
0 2 4 6 8 10 12 1 7 15 30 45 60 Laikotarpis dienomis lo g ( U F C /m l)
Bendras mikroorganizmų skaičius Enterobacteriaceae Lactobacillus
Lactococcus Enterococcus Leuconostoc
Pseudomonas Staphylococcus Miel÷s ir pel÷siniai grybai
3.1.2 pav. Serra da Estrela sūrio mikroorganizmų dauginimosi dinamika.
3.2 Juslin÷ Serra da Estrela ir Serpa sūrių analiz÷
Pasirinkti 16 skirtinų kvapų, kurie pavaizduoti 3.2.1 ir 3.2.2 paveiksl÷liuose, nustatyti Serra da Estrela ir Serpa sūrių jusliniams rodikliams skirtingais nokinimo tarpsniais. Iš žemiau pateikto paveiksl÷lio matome, kad Serra da Estrela sūris per visą nokimo laikotarpį savyje išlaik÷ visus galimus kvapų variantus.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Šviežias pienas, šviežia grietin÷
Virintas pienas
Jogurtas, kefyras, prarūgusi varšk÷
Žol÷s
G÷lių, floros
Džiovintų vaisių
Alyvuogių aliejaus, alyvuogių Avies, gyvulio odos, vilnos
Rūgšties Sudusęs, gaižus, apkartęs
Muilo Kepimo mielių Purvinų kojų Kūdikio v÷malų V÷malų Puv÷sių 1d 7d 15d 30d 45d 60d
3.2.1pav. Serra da Estrela sūrio juslin÷s analiz÷s diagrama
Šie kvapai buvo jaučiami skirtingo intensyvumo. Tai leidžia sugrupuoti sūrį į 2 brandinimo tarpsnius su jauno ir subrendusio sūrio kvapais.
• Sūryje nuo 0 iki 15 brandinimo dienos buvo juntami kvapai: šviežaus pieno kvapas, virintas pienas. Aitriausiai jaut÷si parūgšt÷jusios varšk÷s, jogurto kvapai. Šiuos kvapus būtų galima pavadinti jauno sūrio kvapais.
• Subrendusio sūrio kvapai buvo juntami nuo 30-tos iki 60-tos nokinimo dienos t.y.: v÷malų, purvinų kojų, kultūrinių mielių, rūgšties kvapas, o intensyviausi šiuo periodu buvo alyvuogių aliejaus, alyvuogių kvapai.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Šviežias pienas , š viežia grietin÷
Virintas pienas
Jogurtas , kefyras , prarūgus i varš k÷
Žol÷s
G÷lių, floros
Džiovintų vaisių
Alyvuogių aliejaus , alyvuogių Avies, gyvulio odos , vilnos
Rūgš ties Sudus ęs , gaižus , apkartęs
Muilo Kepim o m ielių Purvinų kojų Kūdikio v÷malų V÷malų Puv÷s ių 1d 7d 15d 30d 45d 60d
3.2.2pav. Serpa sūrio juslin÷ diagrama
Pagrindiniai įgyti aromatai buvo: alyvuogių aliejaus, prarūgusios varšk÷s, purvinų kojų ir v÷malų. Ryškiausiai juntami kvapai per brandinimo periodą 0, 7, 15, 30, 45 ir 60 dienų buvo:
• 0 dienų. Visi galimi kvapai buvo gana silpnai juntami, ryškiausiai buvo juntamas šviežio pieno kvapas.
• 7 dienų. Labai aiškiai buvo juntami rūgšties ir prarūgusios varšk÷s kvapai.
• 15 dienų. Visų kvapų ryškumas sumaž÷jo, tačiau puv÷sių, alyvuogių aliejaus ir avies kvapai šiuo tarpsniu buvo juntami aiškiausiai.
• 30 dienų. Labai stipriai juntamas alyvuogių aliejaus, alyvuogių kvapas. • 45 dienų. Intensyviausias v÷malų kvapas.
• 60 dienų. Ryškiausias buvo alyvuogių aliejaus kvapas, aiškiai juntami ir dvokiančių p÷dų bei v÷malų kvapai.
Nesubrendusiam Serpa sūriui yra būdingi prarūgusios varšk÷s, prarūgusio jogurto, išrūgos, šviežio pieno, varšk÷s, grietin÷s, šviežio sviesto, kultūrinių mielių, kūdikio v÷malų,
puv÷sių kvapai; tuo tarpu kai subrendęs sūris pasižymi alyvuogių aliejaus, v÷malų ir purvinų kojų kvapais.
3.3 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷
Išskyr÷me 116 pieno rūgštį gaminančių bakterijų iš sūrio ir avies pieno naudojamo PDO Beira Baixa sūriams gaminti. PRB filtratai buvo testuojami prieš indikatorinius mikrobus, minimus 2.1 lentel÷je. N÷ viena iš numanomų išskirtų 49 Lactococcus spp. ar 18 numanomų Leuconostoc spp.paderm÷s mikroorganizmų netur÷jo slopinančio poveikio tyrimui pasirinktiems patogenams. Keturi iš numanomų Lactobacillus genties bakterijų pažym÷tų skaičiais 7013, 7014, 7015 ir 7043 paveik÷ gram – teigiamų (Listeria inoccua ir S.aureus) ir gram-neigiamų (E.coli ir Serratia sp.) bakterijų veiklą (žr. 3.3.1 pav). Šių bakterijų filtrato aktyvumas buvo patikrintas ir prieš Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Lactobacillus brevis referencinį kamieną ATCC 8287 ir Salmonella spp. Visų jų augimas buvo slopinamas, išskyrus, toks pat išliko Lactobacillus brevis ATCC 8287 atveju.
3.3.1 pav. Procentinis skirtingų pinarūgščių bakterijų filtratų veikimas, slopinant patogenų veiklą
3.3.1 pav. tęsinys. Procentinis skirtingų pienarūgščių bakterijų filtratų veikimas, slopinant patogenų veiklą
Visų 4 PRB filtratų poveikis kontroliniams patogenams buvo panašus. Žemiau pateiktuose paveiksl÷liuose (žr. 3.3.3, 3.3.4, 3.3.5, 3.3.6 pav.) galima steb÷ti, kad patogenų sustojusio vystymosi faz÷ truko daugiau nei 100 valandų E. coli ir S. aureus bakterijoms, o Listeria inoccua ir Serratia sp. bakterijoms ši faz÷ truko trumpiau. Akivaizdu, kad filtratuose esanti antimikrobin÷ medžiaga skirtingai veik÷ skirtingus patogenus, tačiau netur÷jo įtakos ar patogenas buvo gram-teigiamas, ar gram-neigiamas. E. coli visuose filtratuose buvo paveikta bakteriocidiškai, paveiksl÷lyje nesimato net užuominos apie galimą bakterijų augimą. Kiti patogenai, greičiausiai, buvo paveikti bakteriostatiškai arba juos veikusios medžiagos koncentracija buvo per maža.
%
Lactobacillus spp.
3.3.3 pav. S. aureus vystymasis paveikus 7043 pienarūgščių bakterijų filtratu
3.3.5 pav. L. inoccua vystymasis, paveikus 7013 pienarūgščių bakterijų filtratu
3.3.6 pav. E. coli vystymasis, paveikus 7015 pienarūgščių bakterijų filtratu
Iš pateiktų rezultatų grafikuose matome, kad pienarūgščių bakterijų filtratai 7013, 7014, 7015 ir 7043 tur÷jo slopinantį poveikį prieš E.coli, S.aureus, Serratia sp. ir Listeria inoccua.
3.4 Antimikrobinio pienarūgščių bakterijų intensyvumo nustatymas Petri l÷kštel÷se PRB filtratai, kurie rod÷ didžiausią indikatorinių mikroorganizmų slopinimą, tiriant Bioscreen C aparatu, buvo patikrinti Petri l÷kštel÷je, specialiai jautrumui antibiotikams tirti
skirtoje terp÷je - Mueller-Hinton agare. Visi 4 PRB filtratai tur÷jo švarią zoną apie agare išskobtą skylutę, tačiau mūsų tiriamos antimikrobin÷s medžiagos paliktas apvadas apie skylutę, gal÷tų būti suskirstytas į 2 zonas. Pirma zona, esanti arčiau išskobtos skylut÷s, buvo visiškai skaidri, bet labai siaura, o antroji zona, šiek tiek apsinešusi bakterijomis, tačiau kur kas platesn÷ (žr. 3.4.1 ir 3.4.2pav.).
Pienarūgščių bakterijų 7013, 7014, 7015 ir 7043 filtratai, kuomet jų pH nuo 3.7 iki 3.9, demonstruoja platų antimikrobinį veikimą, tačiau, pak÷lus pH iki 7, visas antimikrobinis veikimas neutralizuojamas (žr. 3.1 lentel÷).
3.1 lentel÷ – Skaidraus apvado skersmuo (mm) Mueller-Hinton agare PRB filtratai Indikatorinis mikroorganizmas 1 m÷nesio senumo filtratai* 1 savait÷s senumo filtratai* pH 7 Autoklavuotas filtratas L. inoccua 9 9 0 7 Serratia sp. 8 8 0 8 E. coli 8 7 0 6 7013 S.aureus 8 8 0 7 L. inoccua 10 9 0 9 Serratia sp. 9 8 0 8 E. coli 8 8 0 7 7014 S.aureus 8 8 0 7 L. inoccua 10 10 0 10 Serratia sp. 9 9 0 8 E. coli 8 8 0 7 7015 S.aureus 9 9 0 9 L. inoccua 10 9 0 9 Serratia sp. 9 7 0 7 E. coli 8 7 0 7 7043 S.aureus 8 8 0 8 (* laikyti 4ºC temperatūroje)
PRB filtratai yra antimikrobiškai veiksnūs, juos laikant 4ºC temperatūroje bent 1 m÷nesį, ir lieka aktyvūs prieš visus indikatorinius patogenus. Visų PRB filtratų pH yra žemas, palyginus su PRB filtratais neturinčiais antimikrobinio poveikio. Ištyr÷me ryšį tarp filtratų pH ir skaidrios zonos skersmens agare. Iš gautų rezultatų matome, kad PRB filtratai yra aktyvūs tik tuomet, kai jų pH žemesn÷ už 4, tačiau antimikrobinis aktyvumas, maž÷jant filtratų pH, nedid÷ja (žr. 3.4.3 pav.).
3.4.1 pav. Pienarūgščių bakterijų filtratais veikiama Serratia spp. Viršuje kair÷je pus÷je: 1 m÷nesio senumo filtratai; Viršuje, dešin÷je pus÷je: 1 savait÷s senumo filtratai ir MRS sultinys sumažinus jo pH iki 3,5; Apačioje kair÷je: neutralizuoti pienarūgščių bakterijų filtratai pak÷lus pH iki 7 ir pieno rūgštis pH 3,5; Apačioje dešin÷je: autoklavuoti pienarūgščių bakterijų filtratai.
3.4.2 pav. Pienarūgščių bakterijų filtratų veikiama L. inoccua. Viršuje kair÷je: 1 m÷nesio senumo filtratai; Viršuje dešin÷je: 1 savait÷s senumo filtratai ir MRS sultinys pH 3,5; Apačioje kair÷je: neutralizuoti pienarūgščių bakterijų filtratai sumažinus pH iki 7 ir pieno rūgštis pH 3,5; Apačioje dešin÷je: autoklavuoti pienarūgščių bakterijų filtratai.
3.4.3 pav. pH įtaka pienarūgščių bakterijų filtratams, slopinant indikatorinius mikroorganizmus 3.5 Aktyvumo ir prigimties tyrimai
Autoklavavus pienarūgščių bakterijų filtratus 20 min 121ºC temperatūroje, buvo tikrinamas jų antimikrobinis veikimas Biocreen C aparate ir Petri l÷kštel÷se, matuojant skaidrią zoną apie išskobtą skylutę. Tyrimas parod÷, kad mūsų antimikrobin÷ medžiaga yra atspari karščiui.
3.5.1 pav. Paveiktų ir nepaveiktų karščiu pienarūgščių bakterijų filtratų antimikrobinis aktyvumas
Atlikus dar vieną tyrimą su fermentais, iš gautų rezultatų paaišk÷jo, kad papainas paveikia mūsų antimikrobinę medžiagą 7015 PRB filtrate (žr. 3.5.2 pav. ir 3.2 lentelę).
Poveikio zona (mm) S. aureus zona (mm) L. inoccua zona (mm) E. coli zona (mm) Serratia sp. zona (mm) Vidurkis % S. aureus
Analogiški rezultatai gauti 7015 PRB filtratą veikiant tais pačiais fermentais, stebint Serratia sp., S. aureus ir L. inoccua veiklą.
3.5.2 pav. E. coli vystymasis paveikus 7015 pienarūgšt÷s bakterijos filtratą fermentais Iš žemiau pateiktos lentel÷s duomenų matome, kad 7015 PRB filtratas, paveikus papainu, visiškai prarado savo antibakterinį poveikį 3 patogenams. S. aureus išlaik÷ 15 mm skersmens apsinešusią zoną apie agare išskobtą skylutę, tačiau skaidrios zonos nebuvo matyti. Tik÷tina, kad S. aureus gal÷jo būti jautresnis organin÷ms rūgštims, kurios suk÷l÷ koncentrišką jo depresiją, prasiskverbdamos į agarą.
Įprastas E. coli augimas
3.2 lentel÷ Fermentų poveikis filtratų aktyvumui prieš kontrolinius mikroorganizmus
Chimo-tripsinas Papainas Proteazė Trypsinas Mikroorganizmai Tiriamas PRB filtratas skaidri zona apsinešusi zona skaidri zona apsinešusi zona skaidri zona apsinešusi zona skaidri zona apsinešusi zona Serratia sp. 7013 * 0 11 0 10 7 12 7 13 Serratia sp. 7014 8 15 6 15 7 13 8 14 Serratia sp. 7015* 8 16 0 0 8 16 8 15 Serratia sp. 7043 9 14 8 15 8 16 7 13 E. coli 7013 * 0 9 0 10 0 11 0 11 E. coli 7014 7 13 0 11 0 13 7 12 E. coli 7015 * 6 15 0 0 7 14 7 14 E. coli 7043 7 14 7 15 6 15 0 11 S. aureus 7013 * 15 16 10 8 S. aureus 7014 10 0 7 11 S. aureus 7015 * 13 0 15 11 11 S. aureus 7043 10 11 12 0 L. inoccua 7013 * 0 9 0 10 8 11 8 15 L. inoccua 7014 9 12 8 13 6 11 9 14 L. inoccua 7015 * 8 13 0 0 9 15 8 15 L. inoccua 7043 8 13 9 15 8 14 12 12
3.2 lentel÷je palikti neužpildyti langeliai vaizduoja situaciją, kada nebuvo galima vizualiai tiksliai nustatyti skirtumo tarp dviejų patogenų slopinimą vaizduojančių zonų. Pažym÷ta tik aiškiai matoma apsinešusi zona.
Žalia ir raudona žvaigždut÷mis pažym÷jau PRB, su kuriomis būtų įdomu toliau tęsti bandymus.
3.6 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas
Šio bandymo tikslas - išsiaiškinti, kurioje filtrato dalyje yra antimikrobin÷ medžiaga. Vandenin÷je ar organin÷je, t.y. tirpi ar netirpi vandenyje. Deja, šis bandymas nedav÷ norimų rezultatų. Aptikome tik vandenyje tirpių organinių rūgščių tam tikrą poveikį patogenams. Paveikus mūsų filtratą eteriu, butanu, izobutanu ir centrifugavimu atskyrus organinę ir vandeninę dalis, neaptikome tik÷tino bakteriocino poveikio organin÷je dalyje.
3.3 lentel÷ PRB filtratų organin÷s ir vandenin÷s dalių aktyvumas
Izobutanas Eteris Butanas
Mikroorganizmai PRB
filtratai
Organin÷ (o)/ vandenin÷ (w)
dalis Skaidri zona
Apsinešusi zona Skaidri zona Apsinešusi zona Skaidri zona Apsinešusi zona Serratia sp. 7013 w 0 10 0 10 0 0 Serratia sp. 7013 o 0 0 0 0 0 0 Serratia sp. 7015 w 0 11 0 11 0 11 Serratia sp. 7015 o 0 0 0 0 0 0 E. coli 7013 w 0 9 0 9* 0 0 E. coli 7013 o 0 0 0 0 0 0 E. coli 7015 w 0 9* 0 10* 0 0 E. coli 7015 o 0 0 0 0 0 0 S. aureus 7013 w 0 0 0 0 0 0 S. aureus 7013 o 0 0 0 0 0 0 S. aureus 7015 w 0 0 0 0 0 0 S. aureus 7015 o 0 0 0 0 0 0 L. inoccua 7013 w 0 10 0 9* 0 9 L. inoccua 7013 o 0 0 0 10* 0 10 L. inoccua 7015 w 0 9* 0 10* 0 10* L. inoccua 7015 o 0 0 0 0 0 8
O - organin÷ dalis; w – vandenin÷ dalis
3.7 Tyrimas aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)
Atlikus bandymus aukšto efektyvumo skysčių chromatografu, pasteb÷jome, kad MRS terp÷s pikai skiriasi nuo pikų, kuriuos demonstruoja 7015 PRB filtratas, turintis antimikrobinį poveikį. Akivaizdu, kad besivystydamos MRS terp÷je pieno rūgšties bakterijos suvartoja tam tikras maisto medžiagas ir sintetina naujas, jas apsaugančias medžiagas. MRS terp÷je, nuo 20 iki 26 min pastebimas vienas aiškus medžiagos pikas (pav. 3.7.1). Filtratas, su antibakteriniu poveikiu (pav. 3.7.2), atlikus aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją, tame pačiame laiko tarpe rodo du pikus. Apie 22 min išryšk÷jęs pikas gali būti patogenus slopinančios medžiagos pliūpsnis. Piko registracijos metu buvo surinkta medžiaga “x” ir pakartoti bandymai jos veiksmingumui nustatyti. Medžiaga “x” patogenus veik÷ slopinančiai.
RT:0.00 - 115.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Time (min) -20000 -10000 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 120000 130000 140000 150000 u A U 39.37 24.94 5.05 33.34 4.68 23.69 26.30 5.78 45.3146.86 30.37 20.70 19.92 48.82 49.64 16.11 55.74 13.55 56.41 8.81 62.26 63.71 65.77 NL: 1.53E5 Total Scan PDA 210909_01
3.7.1 pav Tiriama MRS terp÷
RT:0.00 - 115.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Time (min) 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 u A U 39.62 22.33 25.08 18.08 33.52 26.41 6.77 14.53 42.36 48.79 55.74 56.57 62.18 63.67 NL: 1.88E5 Total Scan PDA MRS21090 9_02
3.8 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu identifikavimas Pienarūgšt÷s bakterijos 7013, 7014, 7015 ir 7043 buvo identifikuojami API 50 CHL metodu. Nustatyta: 7013 – Lactobacillus brevis; 7014 - Lactobacillus curvatus (99,5%); 7015 – Lactobacillus brevis; 7043 - Lactobacillus curvatus (99,9%).
3.9 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis sūryje
Pateiktuose paveiksl÷liuose (žr. 3.9.1, 3.9.2, 3.9.3, 3.9.4 ir 3.9.5 pav.) matome, kad buvo pasirinktas neapgalvotai didelis patogeninių mikroorganizmų kiekis sūryje. Natūraliai esant tokiam patogenų kiekiui sūryje, jis laikomas supuvusiu.
Apžvelgus visų patogenų vystymąsi iki 70-tos sūrių brandinimo dienos, matome, kad geresni rezultatai gauti sūryje, kuriame panaudojome PRB 7013. Kontroliniame sūryje patogenų kiekis taip pat maž÷jo, nes žymus Lactobacillus genties mikroorganizmų kiekis pateko iš specialaus pieno raugo, kurį naudojome sūrių gaminime. Tokio starterio sud÷tyje yra Lactobacillus delbrueckii ir Lactobacillus bulgaricus. Patogenų kiekis abiejų sūrių paviršiuje nokstant buvo panašus. Tai galima paaiškinti tuo, kad po gaminimo sūriai yra įtrinami druska, kuri yra labai geras konservantas. Sūriams nokstant, jų paviršiuje vandens kiekis yra mažesnis, tod÷l patogenų vystymuisi ši terp÷ yra mažiau palanki.
Lactobacillus spp. kiekis did÷jo tiek kontroliniame, tiek sūryje su PRB 7013, tačiau, pasiekus 70-tą brandinimo dieną, pastarajame sūryje Lactobasillus spp. kiekis buvo net 2 log didesnis.
Iki 30-tos sūrių brandinimo dienos abiejuose sūriuose pH skyr÷si nedaug. Listeria inoccua vystymosi diagramoje stebimas staigus populiacijos smukimas tik sūryje papildytame PRB 7013 kultūra. Greičiausiai PRB 7013 gamina kažką, kas stipriai slopina patogenus ir tai n÷ra tik organin÷s rūgštys. Nuo 7 iki 30-tos brandinimo dienos sūryje su 7013 PRB pH išsilaik÷ toks pats. Kaip tik šiomis dienomis įvyko ryškiausias L. inoccua bakterijos smukimas. Nuo 30-tos iki 70-30-tos brandinimo dienos L. inoccua kiekis sūryje nebekito, kai tuo tarpu pH sūriuose išsiskyr÷ labia aiškiai (žr. 3.9.6 pav.).
Iš gautų rezultatų matome, kad PRB 7013 baktericidiškai, t.y. žudančiai, veik÷ E.coli, Listeria inoccua ir Serratia sp. patogenus, o S. aureus buvo paveiktas bateriostatiškai. Jo veikla buvo slopinama (žr. 3.9.2 pav. 70d rezultatus), bet kiekis pakankamai nesumaž÷jo.
PRB 7013 gaminamos medžiagos, jautrios neutralioms pH sąlygoms, buvo įtrauktos į patogenus slopinantį mechanizmą sūrių brandinimo metu.
3.9.1 pav. E. coli vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame pienarūgšte bakterija 7013
3.9.2 pav. S. aureus vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame pienarūgšte bakterija 7013
Log (ksv/ml)
Log (ksv/ml)
