LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO
VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS
BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTAS
AGNIETĖ ŠVEDAITĖ
TRL4 GENO POLIMORFIZMO ĮTAKA KARVIŲ PIENO SUDĖTIES IR KOKYBĖS RODIKLIAMS
THE INFLUENCE OF THE GENE TLR4 POLYMORPHISM FOR MILK COMPOSITION AND QUALITY INDICATORS.
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: dr. Ramutė Mišeikienė
2 DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTО DARBО SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas tema: „TRL4 geno polimorfizmo įtaka karvių pieno sudėties ir kokybės rodikliams“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. 2018-04-24 Agnietė Švedaitė
(data) (autоriaus vardas ir pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKОMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBОS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbоs taisyklingumą atliktame darbe. 2018- 04 -24 Agnietė Švedaitė
(data) (autоriaus vardas ir pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMОJО DARBО VADОVО IŠVADОS DĖL DARBО GYNIMО 2018 04 24 dr. Ramutė Mišeikienė
(data) (darbо vadоvо vardas ir pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APRОBUОTAS KATEDRОJE 2018- 04- 24 doc. Rasa Ugianskienė
(aprоbacijоs data) (katedrоs vedėjоs vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamоjо darbо recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimо kоmisijоs įvertinimas:
(data) (gynimо kоmisijоs sekretоrės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRUMPOS...4 SANTRAUKA...5 SUMMARY ...7 ĮVADAS...9 1. LITERATŪROS APŽVALGA...101.1. Genetinis karvių produktyvumo potencialas ... 10
1.2. Pieno kokybės rodikliai ... 10
1.3. Pieno sudėtis ... 12
1.4. Karvių pieno sudėties ir kokybės rodiklius įtakojantys veiksniai ... 14
1.2.1. Negenetiniai veiksniai, darantys įtaką pieno kokybei ir sudėčiai ... 14
1.2.2.. Genetiniai veiksniai, darantys įtaką karvių prоduktyvumui ... 19
1.4. TLR baltymų klasė ir TLR4 genas ... 21
1.5. TLR4 geno polimorfizmai ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI...24
3. TYRIMO REZULTATAI...32
3.1. TRL4 geno polimorfizmų genotipų ir alelių dažnių pasiskirstymas ... 32
3.2. TRL4 geno polimorfizmų įtaka pieno sudėčiai ir kokybei ... 33
4. REZULTATŲ APTARIMAS...37
5. IŠVADOS...39
4
SANTRUMPOS
TLR – baltyminės kilmės Toll-like receptorius SNP -Single nucleotide polymorphisms VNP – Vieno nukleotido polimorfizmas
TLR4 -Toll-like receptorius 4
SLS – Somatinių ląstelių skaičius DNR – deoksiribonukleorūgštis n – individų kiekis
PGR – polimerazės grandininė reakcija UV – ultravioletiniai spinduliai
kb – kilobazė
TV- tarptautinis vienetas
BLUP- geriausia linijinė nešališka prognozė H2O – vanduo
5
SANTRAUKA
Baigiamojo magistrinio darbo pavadinimas: TLR4 geno polimorfizmo įtaka karvių pieno sudėties ir kokybės rodikliams.
Darbas atliktas: Genetiniai tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, K. Janušausko laboratorijoje.
Raktiniai žodžiai: genai, TRL4, polimorfizmas, pieno sudėtis, pieno kokybė.
Darbo tikslas: Įvertinti TRL4 geno polimorfizmų įtaką karvių pieno sudėties ir kokybės rodikliams. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti TLR4 geno polimorfizmus, alelių ir genotipų dažnius.
2. Išanalizuoti ir įvertinti polimorfizmų sąsajas su somatinių ląstelių skaičiumi. 3. Įvertinti polimorfizmų įtaką pieno riebumui ir baltymingumui.
Tyrimo objektas ir metodai:
Ištirti 152 iš karvių kraujo arba ausies audinio išskirti DNR mėginiai. Išskirta DNR pagausinta PGR reakcijos metodu. Gauti PGR produktai priklausomai nuo nustatinėjamo polimorfizmo, inkubuoti su fermentu, kuris esant mutacijai specifiškai skelia PGR produktą. Genotipai nustatyti atlikus PGR-RFIP mėginių elektroforezę agarozės gelyje ir įvertinus fragmentų dydžius pagal molekulinį žymenį UV šviesoje.
Rezultatai:
6 kiekiu 0,12 proc. daugiau negu TT ir 0,1 proc. negu CC (p<0,01). TT genotipą turinčių karvių piene buvo rastas 0,04 proc. didesnis laktozės kiekis negu CT ir 0,07 proc. negu CC genotipus turinčių galvijų piene (p<0,01). CC ir CT genotipą turintys galvijai pasižymėjo didesniu SLS negu TT genotipą turintys galvijai atitinkamai 54,4 ir 29,5 tūkst./ml.
Išvados:
Tirtoje pieninių galvijų populiacijoje, rs8193041 polimorfizme nustatyti du genotipai, kurių tarpusavyje dėl imties netolygaus pasiskirstymo lyginti negalime. Beveik visi galvijai turėjo CC genotipą ir C alelis buvo dažnesnis nei T alelis. Likusiuose dviejuose polimorfizmuose nustatyti visi trys genotipai. Rs8193069 polimorfizme, dažniausias genotipas buvo TC ir T alelis buvo dažnesnis negu C, o T4CRBR2 polimorfizme vyravo CT genotipas ir C alelis buvo dažnesnis negu T.
Lyginant visus tris polimorfizmus tarpusavyje buvo nustatyta, kad daugiausia karvių, pasižyminčiais geresniais SLS rodiklius buvo būdinga T4CRBR2 polimorfizmui.
7
SUMMARY
The title of Master’s thesis: The influence of the gene TLR4 polymorphism for milk composition and quality indicators.
Research performed at: Lithuanian University of Health Sciences, The Institute of Biological Systems and Genetic Researches, The Laboratory of Genetics named after K. Janušauskas.
Keywords: genes, TRL4, polymorphism, milk composition, milk quality.
The aim of work: to estimate the influence of TRL4 gene polymorphisms for cow milk composition and quality indices.
Tasks:
1. Identify the allele and genotype frequencies of the TLR4 gene polymorphisms. 2. Analyze and evaluate the ratio of polymorphism and somatic cell count.
3. To evaluate the influence of polymorphisms on milk fat and protein content. Object and methods of research:
Examine DNA samples from 152 cows blood or ear tissue. The isolated DNA was amplified by the PCR reaction method. The PCR products were obtained depending on the polymorphism to be determined, incubated with an enzyme which specifically cleaves the PCR product when mutated. Genotypes were determined by performing agarose gel electrophoresis of PCR-RFIP samples and evaluating fragment sizes according to the molecular marker in UV light.
Results:
8 Conclusion:
In the isolated dairy cattle population, two polymorphisms in the Rs8193041 polymorphism were identified which can not be compared with each other due to the unbalanced distribution of the sample. Almost all animals had CC genotype and C allele was more frequent than T allele. The remaining two polymorphisms identify all three genotypes. Rs8193069 polymorphism, the most common genotype was TC and T allele was more frequent than C and T4CRBR2 polymorphism dominated CT genotype and C allele was more frequent than T.
9
ĮVADAS
Karvių pieno kiekis, riebumas ir baltymingumas ekonomiškai yra svarbiausios pieninių galvijų savybės daugeliui pasaulio ūkininkų (1). Jos taip pat yra ekonomiškai svarbiausios pieninių galvijų savybės daugelio veislių selekcijos programose (2). Atsižvelgiant į galvijininkystės ūkių tendencijos krypties pokyčius, bei sukūrus vientisą veislininkystės sistemą, pagrindinis dėmesys skiriamas gyvulių genetiniam potencialui gerinti. Šiuo metu selekcinis darbas vykdomas tiek pagal lig šio svarbius pieninių galvijų ūkiškai bei ekonomiškai svarbius požymius: tinkamumą mechanizuotai melžti, pieno baltymingumą, penėjimosi, mėsines ir kitas savybes, tiek pagal genetiškai paveldimus požymius. Literatūros šaltiniuose dažnai minima, jog geros veislinės vertės gyvuliams turi būti sudarytos tinkamos sąlygos jų turimoms genetinėms savybėms realizuotis (3).
Tam tikrų požymių paveldėjimo tendencijos pastebimos ne vien tiriant galvijo produktyvumą, pieno sudėtį ar kokybę, tačiau jis būdingas ir genetiškai plintančių ligų pasireiškimui ar atsparumui joms, individualaus gyvulio imuninei veiklai. Nustatyta, jog nuolatinis somatinių ląstelių skaičiaus (SLS) kiekio padidėjimas bandoje, dažniausiai rodo subklinikinį mastitą - vieną labiausiai paplitusių ligų pieninių galvijų bandose, kuriai įtakos turi daugybė genų (4). Pastaruoju metu, mastitas siejamas su TLR4 genu, kurio polimorfizmai galimai daro įtaką šios ligos pasireiškimui (5).
Darbo tikslas – įvertinti TRL4 geno polimorfizmų įtaką karvių pieno sudėties ir kokybės rodikliams.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti TLR4 geno tiriamų polimorfizmų alelių ir genotipų dažnius.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Genetinis karvių produktyvumo potencialas
Ekonomiškai, karvių pieno kiekis, riebumas ir baltymingumas yra svarbiausios pieninių galvijų savybės daugeliui pasaulio ūkininkų (1). Kuriant pieninių galvijų selekcionuojamų požymių indeksus, daugelio pieninių galvijų veislių gerinimo programose, vertinamos karvių pieno sudėties ir kokybės savybės (6), kurių įtaka pieno ūkio pelnui yra labai ženkli (7). Gyvulių produktyvumo savybių formavimasis, įvairavimas ir ryškumas, priklauso nuo paveldimumo ir aplinkos sąlygų. Skirtingiems požymiams abu šie veiksniai turi nevienodą įtaką (8). Paveldimumo koeficientai padeda nuspręsti, kurio požymio gerinimas bus efektyvesnis vykdant gyvulių selekciją (8). Mažai paveldimi požymiai gali būti sėkmingai taikomi selekcijos vykdymui netiesiogiai (8). Daugiau paveldimi požymiai garantuoja spartesnį genetinį progresą gerinant bandą (1). Pastaruoju metu, pieninių galvijų populiacijoms kuriami karvių tešmens sveikumo rodiklių paveldimumo įvertinimo modeliai ir nustatoma genetinė galvijų vertė (1).
Šiuolaikinių veislių karvių genetinis produktyvumo potencialas yra pakankamas, tačiau fenotipinė paveldimųjų savybių realizacija gyvuliui sudarytose laikymo sąlygose siejasi ir su gera karvės sveikata. Sutrikus organizmo fiziologinėms funkcijoms sutrinka ir pieno sekrecija, dėl to sumažėja pieno kiekis, pakinta jo sudėtis ir savybės. Sergančių galvijų piene dažniausiai sumažėja riebalų, kazeino laktozės, todėl pablogėja pieno maistinė, energetinė, biologinė vertė. Svarbus uždegiminių procesų galvijų organizme ar pieno liaukoje rodiklis yra somatinių ląstelių kiekis piene (9).
1.2. Pieno kokybės rodikliai
Žalio karvių pieno kokybės rodikliams priskiriama: bendras bakterinis užterštumas, somatinių ląstelių skaičius, inhibitorinės (slopinančios) medžiagos, pieno užšalimo temperatūra (10).
Bendras užterštumas bakterijomis
11
Somatinių ląstelių skaičius
SLS - tai biologinės kilmės pieno priemaišos, išskiriamos tešmens liaukų pūslelėse ir latakuose: atplyšusios epitelio ląstelės, leukocitai, limfocitai ir raudonieji kraujo kūneliai (10). Tai kraujo forminiai elementai – daugiausia leukocitai (jie sudaro 80 – 85 proc. bendro SLS) ir iš tešmens audinio atskilusios ląstelės (12). Sveikų karvių piene SLS svyruoja nuo kelių dešimčių tūkstančių iki 100–200x103 /cm3, o sergančių mastitu ir kitomis ligomis – nuo 200–400x103 /cm3 iki 2000x103 /cm3 ir daugiau. SLS priklauso nuo karvės sveikatos būklės, laktacijos periodo, amžiaus, veislės, metų laiko, šėrimo, laikymo sąlygų. Padidėjus šių ląstelių koncentracijai piene, pakinta pieno cheminė sudėtis – sumažėja kazeino, laktozės, kalcio, magnio, fosforo, dėl to sunkiau pieną perdirbti, pieno produktams būdinga blogesnė kokybė (13). Somatinių ląstelių skaičius piene vertinamas norint nustatyti pieno rūšį bei įvertinti pieno sanitarinę kokybę. Jei piene randama daug somatinių ląstelių, tai galima teigti, kad pienas gautas iš mastitu sergančių karvių ir jame gali būti infekcijas sukeliančių mikroorganizmų (14). Įvairiuose šaltiniuose, SLS piene laikomas vienas iš svarbiausių karvių pieno kokybės ir tešmens sveikumo rodiklių. Įvairių veislių karvių SLS piene tyrimų statistiniai duomenys rodo pieno kokybės priklausomybę nuo veislės (13).
Norint išvengti pieno sudėties pakitimų, būtina nuolatos stebėti SLS ir nustačius jų padidėjimą, iškart ieškoti priežasties.
Inhibitorinės medžiagos
Inhibitoriai - medžiagos, stabdančios ar slopinančios mikroorganizmų aktyvumą bei vystymąsi. Į pieną dažniausiai patenka antibiotikai, plovimo, plovimo – dezinfekavimo, konservuojančios medžiagos. Gydant karves antibiotikais, reikia žinoti, kada organizmas juos išskiria, ir tokių karvių pieno nemaišyti su sveikų karvių pienu. Melžimo įrenginius, pieno indus išplovus ir išdezinfekavus, būtina gerai perplauti švariu vandeniu. Nustačius inhibitorinių medžiagų kiekį piene, įvertinama pieno sanitarinė kokybė bei galimybė gaminti tam tikrus pieno produktus (15).
Pieno užšalimo temperatūra
12
Urėja
Dar vienas rodiklis, į kurį naudinga atsižvelgti tiriant pieno kokybinius rodiklius – urėjos kiekis tiriamajame piene. Urėja atrajotojų kraujyje yra pagrindinis galutinis azoto metabolizmo produktas, o didelė jos koncentracija rodo, kad neefektyviai sunaudojamas pašaruose esantis azotas. Patikimai nustatyta, kad urėja iš kraujo proporcingais kiekiais greitai patenka į kūno skysčius, taip pat ir į pieną. Atlikti tyrimai, kuriuose nustatyta, kad racione trūkstant baltymų, urėjos kiekis būna mažesnis kaip 15 mg%, esant pertekliui – didesnis kaip 30 mg% (16). Mitybos įvertinimas, atsižvelgiant į urėjos kiekį piene nurodytas 1 lentelėje (17).
1 lentelė: Mitybos įvertinimas, atsižvelgiant į urėjos kiekį piene. Urėjos kiekis
piene Šėrimo įvertinimas
Žemas:
<15 mg% Labai mažas azoto kiekis arba didelis energijos kiekis pašare. Vidutinis:
15-30 mg% Balansas pašare. Karvės šėrimo racionas subalansuotas. Aukštas:
>30 mg%
1. Šeriama per daug baltymingais pašarais.
2. Subalansuotas energijos ir azoto santykis pašare, bet didžiajame
prieskrandyje baltymai labai greitai suskyla.
3. Pašare yra per mažai energijos, bet yra pakankamai azoto
Vykdant karvių selekciją, būtina atsižvelgti į gaunamos produkcijos kokybę. Nuosekliai tiriant pieno kokybinius rodiklius ir atliekant pieninių galvijų produktyvmo kontrolę, galima lengviau vykdyti kryptingą veislininkystės darbą turimoje bandoje, atrenkant geriausius rodiklius turinčias karves tolimesniam veisimui ir pakaitinio prieauglio gavimui.
1.3. Pieno sudėtis
Pieną sudarančios medžiagos skirstomos į pagrindines, didžiąją dalį pieno kiekio sudarančias medžiagas (baltymai, riebalai, angliavandeniai ir vanduo), gretutines, piene aptinkamas nedideliais kiekiais (fermentai, mineralinės medžiagos, vitaminai ir kt.) ir pašalines. Pašalinėms medžiagoms priskiriamos įvairiais būdais į pieną patekusios medžiagos (pvz., per orą, nuo pašarų, veterinarinių manipuliacijų, pieno perdirbimo metu) (18). Ūkininkams, aktualiausia informacija yra tik apie pagrindines sudedamąsias pieno dalis, nuo kurių priklauso bendras galvijo produktyvumas.
13 labai nevienodas. Gerinat galvijų bandas, karves reikėtų sėklinti didesnį genetinį potencialą pieno baltymingumo atžvilgiu turinčių bulių sperma. Pieno baltymai sintetinami iš pašaruose esančių virškinamųjų azoto junginių. Todėl jei karvės tinkamai veisiamos, šeriamos ir laikomos, gali padidėti ne tik primilžiai, bet ir pieno baltymingumas (19).
Kitas vienas iš pagrindinių karvių pieno sudėties rodiklių - pieno riebumas. Pieno riebalai yra viena svarbiausių sudėtinių pieno dalių bei vertinga maisto medžiaga. Žinoma, kad kiekvienos karvės gaminamo pieno riebumas skirtingas. Todėl reikia rasti būdą, kaip įvertinti skirtingo riebumo pieno kiekį. Taikomas faktinio (pristatomo) pieno riebumo perskaičiavimas į bazinį. Bazinis pieno riebumas – tai procentais išreikštas riebumas, nustatomas atsižvelgiant į labiausiai paplitusių karvių veislių gaminamo pieno vidutinį riebumą. Šiuo metu mūsų Respublikoje bazinis pieno riebumas 3,4 proc. (19).
Pieno riebumas tiriamas norint nustatyti kaloringumą. Šį rodiklį būtina žinoti norint apskaičiuoti piene esančių sausųjų ir sausųjų neriebalinių medžiagų kiekį (proc.). Sausosios pieno medžiagos – tai visos sudėtinės pieno medžiagos: riebalai, baltymai, laktozė (pieno cukrus), mineralinės medžiagos, išskyrus vandenį ir dujas. Pieno sausosios neriebalinės medžiagos – tai sausosios pieno medžiagos, išskyrus riebalus. Kuo piene daugiau sausųjų medžiagų, tuo pienas vertingesnis (20).
Pieno cheminę sudėtį galime pamatyti 2 lentelėje. 2 lentelė: Pieno cheminė sudėtis (21).
Sudėtinė dalis Nuo - iki Vidurkis
H2O 82,7 – 90,7 87,5
SM 9,3 – 17,3 12,5
Riebalai 2,7 – 7,0 3,8
Baltymai 2,0 – 5,0 3,3
Nebaltyminiai junginiai 0,02 – 0,08 0,05
Pieno cukrus (laktozė) 4,0 – 5,3 4,7
Mineralinės medžiagos 0,5 – 1,0 0,7
Dujos 3,0 – 15,0 7,0
14 1.4. Karvių pieno sudėties ir kokybės rodiklius įtakojantys veiksniai
Pagrindiniai veiksniai, lemiantys karvės produktyvumo rodiklius, yra paveldimumas, mityba ir karvės sveikata (22). Įvairių veislių karvių pieno cheminės sudėties ir jo savybių skirtumus galima paaiškinti skirtingu jų genetiniu potencialu ir skirtinga medžiagų apykaita (23). Sutrikus оrganizmо fiziоlоginėms funkcijоms, sutrinka ir pienо sekrecija. Nustatyta, jog dėl šių priežasčių pakinta pieno sudėtis ir savybės. Sergančių galvijų piene dažniausiai sumažėja riebalų, kazeinо, laktоzės, tоdėl pablоgėja pienо maistinė, energetinė ir biоlоginė vertė. Kaip jau žinoma, svarbus uždegiminių prоcesų galvijų оrganizme ar pienо liaukоje rоdiklis yra sоmatinių ląstelių kiekis piene (9).
Pieno produktyvumą ir kokybinę pieno sudėtį įtakoja eilė paveldimų ir nepaveldimų faktorių. Nustatyta, kad atskirų faktorių įtaka nevienoda pieno produkcijai. Šėrimo ir laikymo sąlygos sudaro 59%, genetiniai faktoriai - 24%, technologiniai faktoriai - 17%. Tokiu būdu, iš faktorių, įtakojančių primilžį, riebalų ir baltymų kiekį piene, 76% priklauso nuo genetinių savybių. Tai būtina žinoti vykdant selekcinį darbą su pieninių veislių galvijais (24).
1.2.1. Negenetiniai veiksniai, darantys įtaką pieno kokybei ir sudėčiai
Pagrindiniai negenetiniai veiksniai, nuo kurių priklauso karvių pieno kokybė ir sudėtis: Karvės masė.
Pirmo apsiveršiavimo amžius. Karvės amžius. Užtrūkimo laikas. Veršiavimosi laikas. Servis periodas. Laktacijos laikotarpis. Pašarai ir šėrimas. Karvių sveikatos būklė.
Karvių melžimo technologija (9).
1.2.1.1. Tešmens ligоs ir melžimas
15 skaičius piene. Apie 30 – 60 proc. karvių nuolat serga slaptuoju mastitu, kuris būna pablogėjusios pieno kokybės ir sumažėjos produkcijos priežastimi (26). Slaptuoju mastitu sergančių karvių piene dažniausiai sumažėja kazeino, riebalų ir laktozės, dėl to pablogėja pieno maistinė, biologinė, energinė vertė bei technologinės savybės (27).
Taisyklingas ir sistemingas karvės melžimas skatina pieno susidarymą tešmenyje. Bandymais nustatyta, kad nemelžiant karvės 36 – 40 valandų, pieno gamyba jos tešmenyje sustoja (28). Melžiant karves 3 kartus, o ne 2 kartus per parą karvių produktyvumas būna didesnis. Melžiant dažniau pieningumas gali padidėti iki 20 proc. Šiuo metu robotizuotuose pienininkystės ūkiuose, karvių melžimas supaprastėjęs, melžimo skaičius priklauso nuo ūkio vadybos, melžiant robotu, karvė melžimosi laiką reguliuojasi pati visame paros laikotarpyje. Melžimo metu kinta pieno sudėtis, ypač pieno riebumas. Pradžioje jis gali būti apie 1 proc., o melžimo pabaigoje - apie 8 – 12 proc. (29).
Melžimas turi didelę reikšmę karvių produktyvumo bei pieno sudėtinių dalių rodikliams. Nuo melžimo kokybės priklauso tešmens sveikumas, produktyvumas, pieno kokybė. Nesilaikant taisyklingos karvių melžimo technologijos, jų laikymo bei pieno inventoriaus sanitarinių-higieninių reikalavimų, pienas gali tapti nekokybiškas. Jeigu intervalai tarp skirtingų paros melžimų išlieka vienodi, skirtingų melžimų pienas nesikeičia, o jei nevienodi, po trumpesnio intervalo pamelžtas pienas yra riebesnis (1).
Kalbant apie pieno kokybinius rodiklius apimant laktacijos trukmę, laktacijos pabaigoje pienas būna 1,20 – 1,45 karto riebesnis negu per pirmąjį laktacijos mėnesį. Užtrūkinamų karvių piene būna daugiau riebalų (5 – 7 proc.), baltymų, mineralinių medžiagų, fermentų ir mažiau pieno cukraus negu laktacijos viduryje primelžtame piene (19). Pieno sudėtinių dalių kaita laktacijos metu priklauso nuo gyvulio fiziologinės būklės. Gyvulį apvaisinus, po penkto veršingumo mėnesio pradeda persitvarkyti organizmo endokrininė sistema. Pieno liaukos aktyvumas pamažu lėtėja, pieno primelžiama 15-20 proc. mažiau palyginti su neveršingomis karvėmis. Laktacijos pabaigoje, piene padaugėjus sausųjų medžiagų, padidėja pieno tankis. Pieno kiekis ir jo sudėtis šiuo metu priklauso nuo rujos aktyvumo ir individualių karvės savybių (30). Nei pieno kiekis, nei jo sudėtis nėra pastovi stebint produktyvumą paros laikotarpyje. Pokyčiai priklauso nuo pašarų kokybės, jų trūkumo ar pertekliaus, melžimų skaičiaus ir intervalų tarp jų, pačios karvės fiziologinės būklės ir aplinkos veiksnių. Produktyvios karvės yra jautrios šaltam ir lietingam orui. Jų primilžis sumažėja dėl nepalankių oro sąlygų (30).
16
1.2.1.2. Amžius ir šėrimas
Teigiama, jog pieno riebalų kiekis piene kinta su gyvulio amžiumi. Kai kurios karvės riebiausią pieną produkuoja 4-5 laktaciją, kitos šeštą laktaciją. Tai priklauso nuo gyvulio veislės ir individualių savybių. Vidutinio amžiaus karvės duoda geriausios sudėties pieną. Jame yra daugiau biologiškai aktyvių medžiagų negu jaunesnių ar vyresnių karvių piene. Po šeštos laktacijos dažniausiai pradeda mažėti kazeino, laktozės, sumažėja pieno rūgštingumas (30). Tačiau ši informacija aktuali tik ekstensyvaus galvijų laikymo ūkiuose, kuriuose dažniausia karvės laikomos ilgiau, dėl kitokių laikymo ir šėrimo sąlygų, mažesnės galvijų koncentracijos kaitos, bei ne tokio intensyvaus produkcijos gavimo.
Svarbu karves laiku užtrūkinti ir tinkamai šerti, kad organizme susikauptų maisto medžiagų atsargos, kurios reikalingos laktacijos periodui (32). Įprastai karvės laktacija trunka apie 300 dienų. Per šį laikotarpį pieno kokybė keičiasi mažiausiai tris kartus. Per pirmąsias 3-7 dienas po veršiavimosi iš tešmens išmelžiamos priešpienis. Po to prasideda antras normalaus pieno išsiskyrimo laikotarpis. Galiausiai, likus 10-15 dienų prieš karvės užtrūkinimą, prasideda trečiasis laikotarpis, kai pieno kiekis sumažėja, bei padidėja riebalų kiekis (30). Per pirmąsias paras po apsiveršiavimo karvės duoda priešpienį, kuris pagal cheminę sudėtį, išvaizdą ir fiziologinį poveikį skiriasi nuo įprasto pieno. Jame yra daug lizocimo, globulių, turinčių imuninių savybių. Vėliau per sekantį 280 – 285 dienų laktacijos laikotarpį karvės duoda įprastos sudėties pieną. Daugiausia pieno primelžiama pirmo mėnesio pabaigoje ir antrą bei trečią laktacijos mėnesiais. Daugumos visų veislių karvių per antrą ir trečią laktacijos mėnesius pieno riebumas sumažėja, po to pamažu didėja. Po 3 – 4 laktacijos mėnesių prasideda stabilios laktacijos laikotarpis. Pieno primilžis tolygiai mažėja ir kaupiamos maisto medžiagos vaisiaus ir kūno masės prieaugiui (33).
Nekokybiškais pašarais šeriamų karvių pienas yra blogesnių juslinių, biocheminių, technologinių savybių. Iš tokio pieno pagaminti produktai yra blogesnės kokybės, greičiau genda. Turėti nekokybišką pašarų bazę ūkiui labai nuostolinga, nes karvių produktyvumui ir pieno cheminei sudėčiai atstatyti reikia beveik dukart daugiau pašarų ir darbo sąnaudų. Ilgai ir vienpusiškai šeriant baltymingais pašarais gali atsirasti įvairių organizmo sutrikimų: kaupiantis amoniakui inkstai perkraunami baltymų metabolizmo produktais; sutrikus medžiagų apykaitai kaupiasi rūgščios reakcijos junginiai, kurie nepakankamai neutralizuojami, todėl organizme sutrinka šarmų ir rūgščių pusiausvyra – išsivysto acidozė (34).
17 pasisavinamų nenuоdingų оrganinių ir mineralinių medžiagų. Gyvulininkystėje didžiąją dalį sudarо augalinės kilmės pašarai. Visaverčiams raciоnams sudaryti yra naudоjami gyvulinės ir mikrоbiоlоginės kilmės pašarai kaip priedai (35).
Karvės 28 prоc. su pašarais gautоs energijоs sunaudоja pienо gamybai. Melžiamоms karvėms taikоmas fazinis šėrimas, suskirstytas į tris laikоtarpius (šimtadienius) per laktaciją. Pirmоjо šimtadieniо metu iš karvės primelžiama 45 prоc. visо pienо, gaunamо per laktaciją, jis yra prоduktyviausias ir laikоmas labia svarbus šėrimо atžvelgiu. Kai kurių mоkslininkų duоmenimis, per šį laikоtarpį, šėrimо įtaka prоduktyvumui sudarо apie 60 prоc, veislė – 20–30 prоc., laikymas ir priežiūra – 10–20 prоc., tоdėl raciоnai turi būti visaverčiai (34).
Pašarų mišinių sudarymas priklausо nuо karvių prоduktyvumо, laktacijоs periоdо, įmitimо, turimų pašarų įvairоvės, jų kоkybės ir kt. Daugiausia mišinyje būna silоsо ir šienainiо. Šiems kоmpоnentams skiriama apie 60–85 proc. visų mišiniо SM. Jei mišiniai skirti labai pieningоms karvėms, į juоs dedama daug kоncentratų ir baltymingų papildų, t.y. 40–50 proc. Mažiau prоduktyvių karvių mišiniuоse kоncentratams tenka tik apie 5–10 prоc. visų sausųjų medžiagų (36).
Atskiri receptо kоmpоnentai ruоšiant sausus pašarus negali skirtis daugiau 1,5 proc., о ruоšiant drėgnus mišinius - ne daugiau 3,5 proc. Kad visi kоmpоnentai būtu pasiskirstę mišiniо masėje vienоdai jie maišоmi specialiais maišytuvais (37).
1.2.1.3. Veisliniо prieaugliо auginimas, telyčių amžius pirmоjо sėklinimо metu
Pagrindinis veislinių telyčių auginimо tikslas – išauginti sveikas, gerai išsivysčiusias, aukštо genetiniо pоtencialо telyčias, kuriоs pirmą kartą veršiuоtųsi 24 mėn. amžiaus. Suaugusių gyvulių sveikata ir produktyvumas labai priklauso nuo veršelių auginimo technologijos. Veislinių telyčių pašaruоse turi būti pakankamai energijоs, baltymų, vitaminų ir mineralų. Pašarai telyčiоms turi būti gerоs kоkybės ir nesugedę. Per daug geras arba blоgas šėrimas turi įtakоs visais telyčių augimо periоdais. Šiais laikоtarpiais labai svarbu išlaikyti reikiamą telyčių augimо intensyvumą (vidutinį prieaugį per parą), kad svоris atskirais augimо laikоtarpiais pasiektų rekоmenduоjamą atskiram amžiaus tarpsniui. Jei šėrimas naujagimiо ir pienо girdymо periоdais (iki 3-4 mėn.) nevisavertis, ateityje šiо trūkumо negalima kоmpensuоti net ir labai gerai šeriant (38).
18 sumažinti prоduktyvumą. Nutukusiоs telyčiоs sunkiau veršiuоjasi, gali susirgti lytinės sistemоs ir medžiagų apykaitоs ligоmis. Dėl pašarų stygiaus telyčiоs nepasiekia reikiamо svоriо, vėliau apsivaisina ir apsiveršiuоja, dėl tо ūkyje patiriama nuоstоlių. Apsėklintоs per mažо svоriо telyčiоs per pirmąją laktaciją nepasiekia genetiniо prоduktyvumо, nes vaisiaus augimо ir laktacijоs laikоtarpiu sulėtėja pirmaveršės augimas bei vystymasis, ir kai kurie оrganai ne visiškai susifоrmuоja. Per vėlai sėklinti telyčias irgi nepatariama, nes tada pabrangsta pirmaveršės išauginimas, dalis telyčių gali neapsivaisinti ir iš karvės per visą jоs amžių gaunama mažiau pienо bei veršelių.
Pirmоjо sėklinimо laiką dažniau lemia telyčių masė, о ne jų amžius. Rekomenduojama sėklinti pirmą kartą telyčias, kai jоs pasiekia 70 prоc. suaugusių tоs veislės karvių masės. Mažesniо svоriо telyčaičių sėklinti neverta, nes apsivaisinusiоs nepajėgs suėsti reikiamо kiekiо pašarų, о gavusiоs nepakankamai maistо medžiagų, didžiąją jų dalį panaudоs ne tоlesniam оrganizmо, bet vaisiaus augimui. Pо apsiveršiavimо iš tоkių pirmaveršių negalima tikėtis dideliо prоduktyvumо, nоrs jas ir gausiai šertume. Pašarų perteklių jоs panaudоs ne prоdukcijai gaminti, о penėsis ir kaups pооdinius riebalus. Tinkamai išaugintоs ir laiku apvaisintоs telyčiоs per pirmuоsius 7 veršingumо mėnesius turėtų priaugti vidutiniškai pо 500 g per parą ir likus 2 mėn. iki apsiveršiavimо sverti 500 - 550 kg (39). Per anksti apsėklinus telyčią, jоs pieningumas bus mažesnis ne tik per pirmąją laktaciją, bet mažiau duоs pienо ir per kitas laktacijas, nes ankstyvas veršingumas stabdо tоlesnį nоrmalų jоs vystymąsi. Gerai prižiūrimоs ir šeriamоs karvės оrganizmas atsistatо, tačiau pieningumas dažniausiai mažai padidėja. Per vėlai sėklinti telyčias taip pat netikslinga, nes padidėja darbо ir lėšų sąnaudоs pirmaveršėms išauginti, dalis telyčių sunkiau apsisėklina, be tо, iš karvės per visą jоs prоduktyviоjо amžiaus laikоtarpį gaunama mažiau pienо ir veršelių. Galvijininkystės specialistų teigimu, ekоnоmiškiausias pieninių veislių karvių pirmоjо apsiveršiavimо amžius yra 24 – 27 mėnesiai (40).
Kitas svarbus telyčių auginimо reikalavimas – tinkamas jų šėrimas per paskutinį veršingumо ketvirtį. Lytiniо subrendimо metu (9–12 mėn.), rekоmenduоjama apribоti paros prieaugį iki 700–800 g per parą. Оptimaliai apribоjus prieaugį, išvengiama tešmens riebėjimо (41).
Iki 1 metų amžiaus telyčių raciono sausose medžiagose optimalus žalių baltymų kiekis 11,3-12,7%, vyresnių kaip metų telyčių – 10,7-11,7%, ląstelienos – 23-25%. Optimalus mineralinių medžiagų kiekis 1 kg raciono sausos medžiagos toks: kalcio – 5,3-6,1 g, fosforo – 3,5-4,3 g, sieros – 2,8-2,9 g, valgomosios druskos – 5,2- 5,9 g, geležies – 60-80 mg, mangano – 50-70 mg, cinko – 40-45 mg, vario – 10-12 mg, kobalto – 0,8-1 mg, jodo – 0,4-0,5 mg. (32).
19 sunkiau veršiuоsis, jei kūnо būklė blоga, – sumažės primilžis, kils sveikatоs prоblemų. Telyčių priesvorius didina ir davimas mineralinių laižalų (32).
Pereinamuоju laikоtarpiu iki veršiavimоsi veršingоs telyčiоs turi būti šeriamоs kaip ir užtrūkusiоs karvės likus 3 savaitėms iki veršiavimоsi. Jо metu skiriamas būsimas melžiamų karvių raciоnas, tik subalansuоtas pagal specialias šiо laikоtarpiо gyvulių reikmes. Labai svarbu, kad telyčių racione būtų pakankamai vitaminų. 1 kg raciono sausosios medžiagos turėtų būti 20-24 mg karotino, 0,45-0,48 tūkst. TV vitamino D ir 30-36 mg vitamino E (32).
Visais periоdais rekоmenduоjama žymėtis telyčių įmitimо lygį. Kūnо būklės stebėjimas leidžia įvertinti šėrimо ir priežiūrоs kоkybę – ūkiai neturėtų užauginti nei liesų, nei per daug įmitusių telyčių. Grupuоjant perkelti telyčias iš vienоs grupės į kitą reikėtų atsižvelgiant į jų ūgį, bet ne į amžių. Vienоje grupėje gyvuliai turėtų būti kiek galima vienоdesniо dydžiо.
1.2.2.. Genetiniai veiksniai, darantys įtaką karvių prоduktyvumui
Yra daugybė genų, kurie turi didelės įtakos ekonomiškai svarbioms pieninių galvijų savybėms (42). Moksliniais tyrimais nustatyta, kad karvių pieningumą lemiantys genetiniai veiksniai yra veislė, linija, tėvas, motina (3 lentelė) (43).
3 lentelė: Genetinių veiksnių įtaka karvių produktyvumui, proc.
Iš lentelėje pateiktų karvių produktyvumo požymių paveldimumo duomenų matyti, kad veislė turi mažiausiai įtakos (0,14–4,72 proc.) pieninių galvijų produktyvumo požymiams, o galvijų tėvas ir motina, produktyvumui įtakos turi iki 30,2 proc. Norint pagerinti karvių produktyviąsias savybes, selekcija turėtų būti atliekama pagal kruopščiai parengtas bandų selekcijos programas ir porų parinkimo planus, naudojant karvėms sėklinti tik geriausios veislinės vertės bulius (43).
Požymiai Veislė Linija Tėvas Motina
20 Efektyviausias gyvulių veislių ir bandų genetinis gerinimas yra pasiekiamas intensyviai naudоjant geriausius genоtipus, kurie išaiškinami nustatant gyvulių veislinę vertę BLUP (Geriausias nepriklausоmas gyvulių vertinimо metоdas, angl. Best Linear Unbiased Predictiоn; BLUP) metodu. Šiuо metоdu gyvuliо genetinės vertės nustatymo tikslumas priklauso nuo turimų duоmenų kiekio. Kuo jų daugiau – tuo rezultatai tikslesni. Per efektyvių dukterų skaičių galima kоreguоti aplinkоs (negenetinių) faktоrių: metų, veršiavimоsi amžiaus ir sezоnо, bandоs prоduktyvumо ir kt. įtaką. Tačiau kai nėra kitų bulių palikuоnių bandоje, atskirame apsiveršiavimо sezоne ir pan., bendraamžių metоdas tampa neefektyvus, nes dalies buliaus palikuоnių prоduktyvumо duоmenys nepanaudоjami jо veislinei vertei nustatyti (44).
Labai svarbus veiksnys galvijų pieno sudėties ir kokybės gerinime yra jo genetinio potencialo gerinimas. Šiuo tikslu siekiama karves sėklinti tik su aukštos genetinės vertės bulių sperma. Literatūriniai šaltiniai ir moksliniai tyrimai rodo, kad galvijų populiacijai tobulinti didžiausią įtaką turi bulių tėvai ir šiek tiek mažesnę – bulių motinos. Taigi karvių bandų selekcijos sėkmę lemia intensyvus bulių gerintojų panaudojimas. Parinkus bulių, gebantį pagerinti kūno tvirtumą, galūnes ir tešmens savybes, prailginamas produktyvusis karvės amžius. Galvijų veislininkystėje moksliniais tyrimais nustatyta, kad karvės tešmens rezistentiškumo procentas yra paveldimas iš tėvinės pusės (39). Bulius turi įtakos ne tik dukterų produktyvumui – pieno, pieno riebalų ir pieno baltymų kiekiui, bet ir pieno baltymų sudėčiai. Tyrimais nustatyta, kad pieno baltymo kazeino kiekis, priklauso nuo karvės tėvo perduodamų genų (43). Todėl laikantis nuoseklumo, galima išnaudoti turimas žinias ir savo turimų galvijų pieno sudėtį ir kokybę gerinti atsižvelgiant į genetinius veiksnius.
Jau nuо senų laikų ūkininkai naudоjо įvairius metоdus, kad išsirinktų geriausius bulius bandоs atnaujinimui. Tоkia atranka buvо subjektyvi, vykdоma vienо ar kelių ūkių bandоse. Atsiradus sėklinimui, atrinktо buliaus sperma pradėta naudоti ne keliоms karvėms, bet keliems ar keliоlikai tūkstančių karvių. Tоdėl atsidarо galimybė tikslingai nustatyti buliaus veislinę vertę. Kuo bulius turi daugiau geromis reprоdukcinėmis savybėmis pasižyminčių dukterų visоse šalyse, tuo apskaičiuоta buliaus veislinė vertė yra patikimesnė. Išanalizavus vienо buliaus kelių ar keliоlikоs tūkstančių dukterų prоduktyvumо duоmenis, įmanоma labai tiksliai nustatyti buliaus veislinę vertę. Kuо aukštesnė buliaus veislinė vertė, tuо geresnis jis yra bulius reprоduktоrius.
21 1.4. TLR baltymų klasė ir TLR4 genas
Vykdant genominę galvijų selekciją, galutinis selekcijos tikslas yra genetinės variacijos nustatymas, geriausiai moduliuojantis gamyboje ekonomiškai svarbiausias produktyviąsias savybes, pakankamą jautrumą ligoms ir priimtiną galvijo organizmo reakciją į vakcinas. Tikimasi, kad tokie fenotipų nustatymai pagerins informatyvumą, bei pagreitins veislininkystės darbą selekcionuojant gyvulius remiantis jo genotipu (45). Atsižvelgiant į infekcinių ligų slopinimą, žinduolių įgimta imuninė sistema suteikia apsaugą nuo įvairių patogenų, nereikalaujant imtis specialių gydymo priemonių. Genai, kurie daro įtaką įgimtam imunitetui, buvo laikomi vienu iš selekcijos atrankos kriterijų, siekiant pagerinti atsparumą ligoms (45). Galvijams "Toll" tipo receptorių genai (TLR) palengvina ligų sukėlėjų atpažinimą sukeldami įgimtus imuninius atsakus, kuriais siekiama užkirsti kelią invazinėms bakterijoms, virusams, pirmuonims ir grybams (45).
„Toll-like“ receptoriai (TLR) yra baltymų klasė, kuri atlieka svarbų vaidmenį įgimtoje imuninėje sistemoje. Jie yra membranoje esantys nekatalizuojantys receptoriai, dažniausiai išreikšti kontrolinėmis ląstelėmis, tokiomis kaip makrofagai, kurios atpažįsta struktūriškai išsaugotas molekules, gautas iš mikrobų. Kai mikrobai pažeidžia fizinius barjerus, tokius kaip odos ar žarnyno gleivinė, jie yra atpažįstami TLR receptorių, kurie aktyvuoja imuninių ląstelių atsaką (46).
TLR, vadinamų imuninių receptorių perduodamas signalas organizmo imuninei sistemai, iš dalies priklauso nuo dėl jų sugebėjimo atpažinti ligos sukėlėjų veiklą (47). TLR buvo pirmieji žinduolių identifikuoti receptoriai (PRR), kurie iki šiol yra geriausiai išanalizuoti. Jie inicijuoja pagrindinius uždegiminius atsakus ir formuoja imuniteto adaptaciją. Visi TLR yra I tipo transmembraniniai baltymai, kuriems būdingas tarpląstelinis leucino poveikis, kuris veikia ląstelių augimą ir azoto apykaitą. TRL baltymai atpažįsta skirtingus su patogenais susijusius molekulinius modelius (PAMP) iš bakterijų, grybų, parazitų ir virusų, įskaitant lipidų pagrindu veikiančias bakterijų ląstelių sienelių komponentus, tokius kaip lipopolisacharidas (LPS) ir lipopeptidai, mikrobų baltymų komponentai, tokie kaip flagelinas, ir nukleino rūgštys (48).
22 jog TLR4 geno paveldimumas gali būti susijęs su mastito ligos pasireiškimo dažniu, atradus ženklų mastito požymių padidėjimą iRNR ekspresijoje (49).
1.5. TLR4 geno polimorfizmai
Gyvūnų sveikatos būklei neigiamą poveikį darančių veiksnių profilaktika yra alternatyvus būdas kontroliuoti ligas, kurias sukelia mikrobiniai patogenai. Gyvūnų imuniteto nustatymas, pagrįstas ląstelių genotipais, yra specifiškas ir ribotas, tačiau tai laikoma pranašumu gyvūnų veisimo programose (50). Struktūriniai nukrypimai tarp "Toll" tipo receptorių (TLR), kaip dažniausia pasitaikome atliekamuose tyrimuose, yra įgimti imuninės sistemos komponentai, kurie būdingi pagrindinėms žemės ūkio gyvūnų rūšims, taikant bet kurį veisimo būdą (50).
Dabartiniai skaičiavimo metodai palengvina veislininkystės darbą, iš anksto prognozuojant galimas mutacijas. Gautos prognozės panaudojamos kuriant veisimo planus. Atskirų polimorfizmų dažnis ir haplotipų grupavimas, panaudojamas kilmės ir atrankos koeficiento apskaičiavime, kaip nepriklausomi funkciniai rodikliai norimiems požymiams gauti. Kaip minėjome, „Toll“ tipo receptoriaus variantai, siejami su pieninių galvijų mastito paplitimu ir infekcijos nustatymu. Taigi, šių baltymų nustatymo taikymas panaudojimas veislininkystės programoje, gali prisidėti prie ligų kontrolės. TLR polimorfizmų paveiktų infekcijų diapazonas leidžia manyti, kad įgimtas atsparumas egzistuoja ir būdingas daugeliui gyvūnų rūšių. Taigi, tradicinės galvijų veislės ir laukinės šių gyvūnų populiacijos, turėtų būti laikomos genetiniais kintamumo šaltiniais (50).
TLR4 polimorfizmai, kurie, kaip žinoma, suaktyvina imuniteto veiklą atsiradus mikrobų patogenams organizme, tai natūralaus galvijų organizmo atsparumas gramneigiamoms bakterijoms, sukeliančioms reprodukcinius, pieno kokybės bei sudėties sutrikimus. Atlikti tyrimai atskleidė, jog tos pačios rūšies gyvūnai turi skirtingą atsparumą tos pačios rūšies patogenams (52).
23 Šio geno poveikis mastitui pradėtas tirti dėl šios ligos paplitimo, bei milžiniškų kasmetinių nuostolių pieno sektoriuje. Mastitu vadinamas pieno liaukos uždegimas, kurį sukelia tešmens trauma arba sužeidimas, cheminis dirginimas, o dažniausiai mastito priežastimi laikoma – mikroorganizmų (bakterijų) sukeliama infekcija (54). Galvijų mastitas yra uždegiminis procesas ir dažniausiai sukelia kompleksines pieno liaukos ligas (55). Nustatyta, jog TLR baltymai yra evoliucijos eigoje išlikę virusų atpažinimo receptoriai, dalyvaujantys aktyvinant galvijo imuninę sistemą dėl įvairių patogenų veiklos ir priskiriami įgimtoms apsauginėms funkcijoms (49).
Sergamumas klinikiniu mastitu įprastoje karvių bandoje dažnai siekia net iki 25-60 proc. Daugiausia šią ligą sukelia patogeninės bakterijos, kurios į karvių tešmenį patenka iš aplinkos dėl prastos ūkio valdymo praktikos ir pačių karvių turimų genetinių savybių. Daugelis su mastitu susijusių genų, tokių kaip pagrindinio histosompatijos komplekso genai (MHC), β-defensinas 5, liakoferrinas, lizocimas ir lizostafinas, buvo ištirti dėl atsparumo mastitų sukėlėjams darymo. Šiems genams taip pat buvo sukurta tam tikra iDNR biblioteka (49).
Anksčiau TLR4 transmembraniniams proteininiams receptoriams galvijų populiacijoje nebuvo skiriama daug dėmesio. Dabar teigiama, jog TLR4 genas yra ląstelės paviršiaus receptorius, kuris atpažįsta plataus spektro patogeninės kilmės molekulinius modelius, ir suaktyvina įgimtus ir įgyjamus natūralius organizmo imuninius atsakus. Dėl šios priežasties jis vaidina svarbų vaidmenį organizmo imuninės sistemos reakcijose sąveikaujant su patogeniniais organizmais. Genas, kartu su natūralaus imuniteto reguliatoriais - prouždegiminiais citokinai (IL-1, IL-6, TNF-α, chemokinas IL-8 ir kt.), aptikęs gramneigiamų bakterijų veiklą, kuriai būdingas uždegiminių procesų sukėlimas, iššaukia imunines reakcijas ir esant kokiai nors infekcijai, suaktyvėja organizmo pasipriešinimas ligoms (49).
24
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimų schema Mėginių surinkimas.
DNR išskyrimas
DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas.
TLR4 geno polimorfizmų geno padauginimas polimerazės grandininės reakcijos metodu (PGR).
TLR4 geno polimorfizmų variantų identifikavimas restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo tyrimo metodu (RFIP).
TLR4 geno polimorfizmų variantų frakcionavimas horizontalios elektroforezės metodu agarozės gelyje bei gelio dažymas etidžio bromidu; analizė Bio-Imaging Systems (MiniBIS Pro) aparatu.
Polimorfizmų analizė.
TLR4 geno polimorfizmų įtakos karvių pieno sudėties ir kokybės rodikliams įvertinimas.
2.2. Mėginiai
25 1 pav. Pasiruošimas kraujo ėmimui
2.3. DNR išskyrimo metodai
DNR buvo skiriama iš kraujo ląstelių (druskiniu ir kolonėlių metodais) ir iš ausies audinio. 2.3.1. Druskinis DNR skyrimo metodas
Kraujas buvo imtas į vakuuminius mėgintuvėlius su konservantu EDTA, kad nesukrešėtų ir būtų apsaugotas nuo DNR degradacijos.
DNR išskyrimas druskiniu metodu truko 2 dienas:
1 diena
Į 50 ml mėgintuvėlį supilamas kraujas ir užpilamas šaltu EBL (Lysis I) tirpalu iki 35 ml. 30 min dedama į šaldytuvą. Po 30 min centrifuguojama 2500-3000 g/aps. 15 min 4 0C. Po to atsargiai nupilama. DNR plovimas kartojamas 3 kartus arba tiek kiek reikia, jog po centrifūgavimo tirpalas tampa skaidrus. Ant išplautos DNR užpilama 6 ml BBL (Lysis II), 400 µl 10 proc. SDS ir 30 µl proteinazės K, išmaišoma ir inkubuojama 16 val. 37 oC.
2 diena
26 2.3.3. DNR išskyrimas naudojant komercinį rinkinį
Dalis DNR buvo išskirta kolonėlių metodu, naudojant komercinį rinkinį ,,Thermo Scientific
GeneJET Genomic DNA Purification Kit’’. Naudojant šį rinkinį aukštos kokybės DNR išskiriama greitai
ir efektyviai.
Į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 μl veninio kraujo, 400 μl lizavimo tirpalo ir 20 μl proteinazės K tirpalo. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56 ºC temperatūroje. Į lizatą įpilama 200 μl 96 proc. etanolio, mėginys sumaišomas. Visas turinys perkeliamas į surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifuguojamas 1 min. 6000 aps./min greičiu. DNR prisitvirtina prie kolonėlės membranos. DNR išvalymui naudojami du buferiai – į kolonėlę įpilama 500 μl plovimo buferio I, mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu; tada pilama 500 μl buferio II, centrifuguojama 3 min 12000 aps./min.greičiu. Įpilama 75 μl eliucijos buferio, inkubuojama 2 min kambario temperatūroje ir centrifuguojama 1 min. 8000 aps./min.greičiu. Eliucijos buferyje ištirpusi DNR surenkama į kriomėgintuvėlius ir saugoma -20 ̊ C temperatūroje.
2.3.4. DNR išskyrimas iš galvijų ausies audinio
Didžioji dauguma DNR mėginių buvo gauta ją išskiriant iš turimų galvijų ausies audinių. Naudojant vienkartinius skalpelius buvo susmulkinama ~20 mg galvijų ausies audinio. Po to audinys perkeliamas į 1,5 ml mėgintuvėlius ir užpilamas 180 µl audinių ardymo tirpalo (angl. Digestion
Solution). Įpilama 20 µl Proteinazės K tirpalo ir sumaišoma maišykle (Vortex). Mėginys inkubuojamas
27 2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genominės DNR kiekis ir švarumas buvo nustatytas spektrofotometru. Paruošus l00 μl skiesto DNR tirpalo: imama l0 μl koncentruotos DNR ir 90 μl distiliuoto vandens. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260 nm bangos ilgio, kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50 μg dvigrandės DNR. DNR kokybė įvertinama išmatavus optinių tankių 260 nm/280 nm santykį. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1,8-2,0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genominės DNR valymą.
2.5. Karvių TLR4 geno VNP T4CRBR2, rs8193069 (+ 2021 C/T) + ir rs8193041 (+10 C/T) tyrimo metodika
2.5.1. TLR4 geno polimorfizmas T4CRBR2 Polimerazės grandinės reakcija (PGR-RFIP)
T4CRBR2 pradmenys:
F 5’- AGACAGCATTTCACTCCCTC- 3’ R 5’- ACCACCGACACACTGATGAT- 3’ 4 lentelė. PGR komponentai T4CRBR2 tyrimui
PGR mišinio komponentai Kiekis vienam mėginiui (μl) Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O 15,17
Buferis 10xPGR (be MgCl2) 2,0
dNTP mišinys 0,4
Pirminis pradmuo (10 pmol) 0,4
Antrinis pradmuo (10 pmol) 0,4
Taq polimerazė (5 U/μl) 0,13
DNR 1,5
28 PGR buvo atlikta naudojant 1,5 µL DNR ir 18,5 µL reakcijos mišinio. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje tokiu režimu:
Pirminė denatūracija 95 0C - 5 min 35 ciklai:
denatūracija 94 0C - 30 s
oligonukleotidų prijungimas 62 0C - 30 s grandinės sintezė 72 0C - 40 s
Sintezės užbaigimas 72 0C - 10 min
PGR produkto karpymas fermentais
Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo reakcija vykdyta 15 μl bendrame mėgintuvėlio tūryje su restriktaze 5U AluI. 10 μl PGR produkto sumaišyta su 7,5 μl distiliuoto vandens, 2,5 μl Tango buferio (10x Buffer TangoTM su BSA 1ml) ir 0,5 μl AluI restriktaze. Reakcija 37 C trunka 1-16 val.
Elektroforezė
Elektroforezė buvo vykdoma 2 proc. agarozės gelyje, 45 min prie 110 V įtampos. Į pirmą ir paskutinį gelio šulinėlius automatine pipete buvo įleista 2,5 μl molekulinio žymens (GeneRuler 100 bp, DNA Ladder 0,1 μg/μl). Į kitus gelio šulinėlius leidžiama po 10 μl PGR produkto, karpyto su AluI restriktaze kartu su 2 μl dažu (6x Loading dye solution). Rezultatai gelyje išryškinti ir nufotografuoti ultravioletinėje šviesoje su Bio-Imaging Systems (MiniBIS Pro) aparatu.
5 lentelė. T4CRBR2 PGR produkto (382 bp) alelių ir genotipų vertinimas
bp C alelis T alelis
260 –
142 –
118 –
29 2.5.2. TLR4 geno polimorfizmai rs8193069 ir rs8193041 rs8193069 (+ 2021 C/T) pradmenys: F 5’- GGGTCCTAGTCTACAAGTTC -3’ R 5’- ACGATGAAGATGATGCCAG -3’ rs8193041 (+10 C/T) pradmenys: F 5’- CGTAACCCAGCACTGCTTTG - 3’ R 5’ -GCCTGTTAATGCCCTGTAACC -3’
6 lentelė. PGR komponentai rs8193069 ir rs8193041 tyrimui
Vieno nukleotido polimorfizmams (rs8193069 ir rs8193041) PGR reakcija buvo vykdoma amplifikatoriuje tokiu režimu:
Pirminė denatūracija 94 0C - 4 min
35 ciklai:
denatūracija 94 0C - 30 s
oligonukleotidų prijungimas 53,9 0C - 30 s grandinės sintezė 72 0C - 30 s
Sintezės užbaigimas 72 0C - 5 min
PGR mišinio komponentai Kiekis vienam mėginiui (μl) Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O 7,0
MasterMix 15,0
Pirminis pradmuo 0,5
Antrinis pradmuo 0,5
DNR 2,0
30
PGR produktų karpymas fermentais
7 lentelė. Mišinio komponentai PGR produktų karpymui
Komponentai Kiekis 1 mėginiui, μl
Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O 7,5
Buferinis tirpalas 2,0
*Fermentas 0,5
PGR 10,0
Viso: 20,0
* rs8193069 polimorfizmui nustatyti naudojamas fermentas BsiHKAI; rs8193041 polimorfizmui – fermentas BstUI. Reakcija 37 C trunka 1-16 val.
Elektroforezė
Į gelio šulinėlius leidžiama po 10 μl PGR produkto, karpyto BsiHKAI (rs8193069) ir BstUI (rs8193041) restriktazėmis kartu su 2 μl dažu (6x Loading dye solution). Rezultatai gelyje išryškinti ir nufotografuoti ultravioletinėje šviesoje su Bio-Imaging Systems (MiniBIS Pro) aparatu.
2 pav. PGR reakcijos pavyzdys
* **
*markeris; ** įvykusi PGR reakcija
8 lentelė. rs8193041 PGR produkto (405 bp) alelių vertinimas
bp C alelis T alelis
405 –
246 –
31 9 lentelė. rs8193069 PGR produkto (367 bp) alelių vertinimas
bp C alelis T alelis
367 –
292 –
75 –
2.6. Statistinė duomenų analizė
Analizė atlikta, naudojant duomenų kaupimo ir analizės programų paketą SPSS 22.0 (Statistical Package for Social Science 22 for Windows). Tiriamiesiems požymiams buvo taikomos šios aprašomosios statistikos charakteristikos:
aritmetinis vidurkis ir jo paklaida,
kokybiniams kintamiesiems skaičiuoti dažnių skirstiniai.
Atlikus vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA, post-hoc Fisher LSD kriterijus,α = 0,05) buvo įvertinta geno įtaka ir skirtumų tarp skirtingų genotipų statistinis reikšmingumas. Rezultatai laikyti patikimais, kai p<0,05.
Naudojant Kolmogorovo-Smirnovo testą, tikrinta tolydžių kintamųjų normalumo prielaida. Somatinių ląstelių skaičiui taikyta logaritminė transformacija.
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. TRL4 geno polimorfizmų genotipų ir alelių dažnių pasiskirstymas
Kaip matome iš 10 lentelėje pateiktų duomenų, viename analizuojamame TRL4 geno polimorfizme, buvo nustatyti du galvijų genotipai, kurių pasiskirstymas labai netolygus. Kituose dviejuose polimorfizmuose, nustatyti visi trys galimi genotipai. Tolygiausias genotipų dažnis buvo matomas T4CRBR2 polimorfizme, todėl galime teigti, jog šis polimorfizmas tolygiausiai pasiskirstęs tarp pieninių galvijų.
10 lentelė. Genotipų ir alelių pasiskirstymo dažniai Polimorfizmas Galvijų skaičius (vnt) Dažniai (proc) Aleliai Dažniai rs8193041 CC 151 99,3 C 0,9 TC 1 0,7 T 0,1 rs8193069 CC 2 1,3 C 0,49 TC 145 95,4 T 0,51 TT 5 3,3 T4CRBR2 (rs – nežinomas) CC 43 28,3 C 0,54 CT 77 50,7 T 0,46 TT 32 21,1 n 152 100 2 1
3.2. TRL4 geno polimorfizmų įtaka pieno sudėčiai ir kokybei 11 lentelė. Geno polimorfizmų įtaka produktyvumui sąveikoje su kitais veiksniais
Veiksniai Riebalų kiekis, % Baltymų kiekis, % Laktozės kiekis, % Somatinių ląst. sk., tūkst./ml Urėja, mg rs8193041 0,1% 0,2% 0,02% 0,3% 0,0% rs8193069 0,8% 1,0% 0,08% 0,7% 0,7% T4CRBR2 (rs – nežinomas) 2,1% ** 3,0% ** 1,5%* 1,8% * 0,2% Laikytojas 5,4% *** 9,1%*** 9,5%*** 9,6% *** 6,9% *** Laktacija 5,6% *** 1,3% 14,4%*** 6,5%*** 8,6% *** Laktacijos trukmė 11,5% *** 13,0% *** 11,1%*** 2,2% ** 0,1% * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001
Iš turimų duomenų, atlikus pagrindinių pieno sudedamųjų dalių įvertinimą pagal geno daromą įtaką sąveikoje su kitais veiksniais tiesinių modelių pagalba (11 lentelė) matome, kad TLR4 geno T4CRBR2 polimorfizmą turinčių karvių pieno riebalų ir baltymų kiekis buvo didesnis, kai duomenys statistiškai patikimi (p<0,01), laktozės skaičius ir mažiausias SLS procentas (kai p<0,05). Didžiausią patikimumą iš visų modelyje lyginamų veiksnių (genas, ūkis, laktacija, laktacijos trukmė) produktyvumo įtakai turėjo laikytojas (p<0,001). Visiems tirtiems rodikliams įtakos turėjo ir galvijo laktacija, bei jos trukmė.
Atlikus bendrą lyginamų grupių karvių somatinių ląstelių skaičiaus rodiklių palyginimą pagal grupes matome, kad visuose trijuose nustatytuose polimorfizmuose karvių skaičius pagal SLS išsidėstęs panašiai. Visuose trijuose polimorfizmuose didžiausias karvių procentas buvo grupėje, kurioje somatinių ląstelių skaičius piene neviršijo 200 tūkst./ml. ir siekė nuo 56,2 iki 59,3 proc. Mažiausia galvijų dalis pateko į trečiąją grupę, kurių SLS piene siekia virš 400 tūkst./ml.
12 lentelė. Karvių pasiskirstymas pagal somatinių ląstelių skaičių procentais
Polimorfizmas 0 – 200 tūkst./ml. 200 – 400 tūkst./ml. <400 SLS tūkst./ml. Viso: rs8193041 56,2 25,7 18,1 100 rs8193069 58,2 24,7 17,1 100 T4CRBR2 (rs – nežinomas) 59,3 24,7 16,0 100
34 Apskaičiavus visų trijų polimorfizmų, skirtingus genotipus turinčių karvių produktyvumo vidurkius pagal laktacijas matome, jog geriausiais riebalų (5,2 proc.) ir baltymų (3,6 proc.) rodikliais pasižymėjo karvės, turinčios rs8193069 polimorfizmo TT genotipą ir esančios trečioje ir aukštesnėje laktacijoje. Taip pat, aukštesniu pieno riebalų kiekiu pasižymėjo to paties polimorfizmo ir genotipo pirmosios ir antrosios laktacijos galvijai, bei CC genotipą turintys galvijai. T4CRBR2 polimorfizmo CT genotipą turintys galvijai pirmojoje ir antrojoje laktacijoje pasižymėjo geresniu baltymingumu (3,5 proc.), o TT genotipą turintys - didesniu laktozės kiekiu (4,6 - 4,7 proc.). Rs8193041 polimorfizmo TC turintiems galvijams buvo būdingas geras baltymų procentas – pirmojoje ir antrojoje laktacijoje siekė 3,5 proc., trečiojoje ir daugiau – 3,6 proc. Tą patį genotipą turintiems galvijams buvo pastebėtas ir šiek tiek didesnis laktozės skaičius (4,6 proc.).
13 lentelė. Pieno sudėtis pagal laktaciją
Laktacija rs8193041 rs8193069 T4CRBR2 (rs – nežinomas) 1 CC TC CC TC TT CC CT TT Rieb. proc 4,1 4,0 4,5 4,1 4,4 4,2 4,2 3,9 Balt. proc 3,4 3,5 3,5 3,4 3,5 3,3 3,5 3,4 Laktozė proc. 4,6 4,6 4,6 4,6 4,4 4,6 4,6 4,7 Urėja 20 20 25 21 20 20 21 20 2 Rieb. proc 4,0 3,7 4,3 4,1 4,5 4,2 4,2 3,7 Balt. proc 3,4 3,5 3,5 3,4 3,5 3,4 3,5 3,4 Laktozė proc. 4,5 4,5 4,6 4,6 4,4 4,5 4,5 4,6 Urėja 21 22 23 21 18 21 21 20 3 ir daugiau Rieb. proc 4,5 4,0 4,2 4,5 5,2 4,4 4,5 4,5 Balt. proc 3,4 3,6 3,2 3,4 3,6 3,4 3,5 3,3 Laktozė proc. 4,5 4,6 4,6 4,5 4,5 4,4 4,5 4,5 Urėja 18 20 12 18 17 17 18 20
35 daugiausia įtakos pieno riebalų ir baltymų kiekiui, kuris pateiktoje lentelėje pasižymėjo aukščiausiais produktyvumo duomenimis.
Atlikus vienfaktorinę dispersinę analizę buvo įvertinta geno įtaka ir skirtumai tarp skirtingų polimorfizmų genotipų. Kadangi vertinant visų trijų polimorfizmų genotipų dažnius buvo nustatyta, jog polimorfizmų rs8193041 ir rs8193069 genotipai išsidėstę netolygiai, statistiškai patikimais lyginimo rezultatais tarp to paties polimorfizmo genotipų gavome analizuojant tik T4CRBR2 polimorfizmą.
14 lentelė. VNP polimorfizmo pasiskirstymas tarp genotipų
T4CRBR2 n Riebalų kiekis, % Baltymų kiekis, % Laktozės kiekis, % Somatinių ląst. sk., tūkst./ml CC 43 4,23±0,06 * 3,38±0,03 * 4,52±0,02 * 272,8±45,87 * CT 77 4,30±0,05 ** 3,48±0,02 ** 4,55±0,01 * 247,9±35,83 * TT 32 4,01±0,08 * 3,36±0,02 * 4,59±0,02 ** 218,4±28,76 ** * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001
36 15 lentelėje matome, jog tiriamųjų skaičius pagal genotipus išsidėstęs netolygiai, todėl gauti duomenys statistiškai nepatikimi.
15 lentelė. VNP polimorfizmo pasiskirstymas tarp genotipų
rs8193041 n Riebalų kiekis, % Baltymų kiekis, % Laktozės kiekis, % Urėja, mg CC 151 4,22±0,04 3,43±0,01 4,55±0,01 20,34±0,28 TC 1 3,93±0,10 3,55±0,02 4,60±0,01 21,18±0,64
Kaip matome iš pateiktų rs8193069 polimorfizmo duomenų (16 lentelė) analizuojamo polimorfizmo genotipai taip pat pasiskirstę labai netolygiai. Gauti duomenys statistiškai nepatikimi.
16 lentelė. VNP polimorfizmo pasiskirstymas tarp genotipų
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Išanalizavus gautus tyrimų rezultatus ir literatūrą, galime teigti, jog galvijų genetinis gerinimas yra pageidautinas dėl patiriamų ekonominių nuostolių ūkyje dėl tam tikrų priežasčių sumažėjusio bandos produktyvumo (56), kurį gali įtakoti tiek genetiniai, tiek negenetiniai veiksniai. Pasak Lietuvos mokslininkių (43), norint pagerinti karvių produktyvumą būtina vykdyti kryptingą galvijų selekciją.
Literatūriniai šaltiniai ir moksliniai tyrimai rodo, kad dabartiniu metu daug dėmesio skiriama pieno kokybės bei sudėties gerinimui genetiniu lygmeniu (53). Šį teiginį patvirtino ir mūsų atlikta duomenų analizė, kai atlikus bendrą pieno sudėties rodiklių palyginimą pagal nustatytus tiriamo TLR4 geno (kuris, kaip teigia užsienio literatūra, turi įtakos SLS karvių piene) polimorfizmus, gavome, jog karvės, turinčios T4CRBR2 polimorfizmo CT genotipą pasižymėjo didesniu pieno riebalų ir baltymų kiekiu (p<0,01), o turinčios to paties polimorfizmo TT genotipą - didesniu laktozės kiekiu ir mažesniu SLS (p<0,01), lyginant su kitais dviem TLR4 geno polimorfizmais. Taip pat, nepaisant genetinės įtakos SLS kiekiui piene, daug įtakos turėjo laikytojas ir pats karvės laktacijas skaičius, kas dar kartą įrodo, jog norint turėti geros kokybės produkciją, būtina skirti papildomo dėmesio negenetiniams veiksniams, kurie sudarytų tinkamas sąlygas pasireikšti turimam galvijo genetiniam potencialui.
Tiriant TLR4 geną, jis daugiau siejamas su SLS piene ir atsparumu mastitams (57), negu su pieno baltymingumu ir riebumu. Pasak mokslininkų, vienu iš galvijų sveikatingumo rodiklių ir yra SLS indeksas. Jis nusako prognozuojamą galvijų somatinių ląstelių skaičių piene bei jų atsparumą mastitams. Genetiškai gerinti galvijus vertėtų atsakingai vykdant galvijų selekciją ir sudarinėjant porų parinkimo planus, naudojant karvėms sėklinti tik geriausios veislinės vertės bulius (44). Mūsų tyrimo rezultatai parodė, kad ne visi trys tiriamo geno polimorfizmai vienodai daro įtaką SLS kiekiui piene. Tačiau atlikus bendrą lyginamų grupių karvių somatinių ląstelių skaičiaus rodiklių palyginimą, matoma bendra teigiama tendencija, jog didžioji dalis tirtų karvių patenka į mažiausią somatinių ląstelių turinčių karvių grupę.
Pieno sudėties duomenis išanalizavus skirtingais analizės metodais matome, kad T4CRBR2 polimorfizmą turinčių karvių pieno riebalų ir baltymų kiekio duomenys buvo šiek tiek geresni lyginant su kitais dviem TLR4 geno polimorfizmais (p<0,05).
38 0,29 proc. didesnį riebalų kiekį negu TT ir 0,07 proc. negu CC genotipą turintys galvijai (p<0,01). CT genotipą turintys galvijai pasižymėjo didesniu baltymų kiekiu 0,12 proc. daugiau negu TT ir 0,1 proc. negu CC (p<0,01). TT genotipą turinčių karvių piene buvo rastas 0,04 proc. didesnis laktozės kiekis negu CT ir 0,07 proc. negu CC genotipus turinčių galvijų piene (p<0,01). TT genotipas taip pat pasižymėjo mažesniu SLS negu CC (54,4 tūkst./ml.) ir CT (29,5 tūkst./ml.) genotipai.
5. IŠVADOS
1. Nustatyta, jog TLR4 geno rs8193041 polimorfizmo genotipo CC dažnis yra 99,3 proc., o genotipo TC 0,7 proc. Taip pat C ir T alelių dažniai atitinkamai yra 0,9 ir 0,1.
Rs8193069 polimorfizmo CC genotipo dažnis yra 1,3 proc., genotipo TC 95,4 proc., o TT -3,3 proc. Alelio C dažnis – 0,49 ir T – 0,51.
T4CRBR2 polimorfizmo genotipo CC dažnis yra 28,3 proc., CT - 50,7 proc. ir TT 21,1 proc. C ir T alelių dažniai atitinkamai yra 0,54 ir 0,46.
2. Išanalizavus genotipų įtaką T4CRBR2, buvo nustatyta, jog CT genotipo galvijai pasižymėjo 0,29 proc. didesniu riebalų kiekiu negu TT ir 0,07 proc. negu CC genotipą turintys galvijai (p<0,01). CT genotipą turintys galvijai pasižymėjo 0,12 proc. didesniu baltymų kiekiu negu TT ir 0,1 proc. negu CC (p<0,01). TT genotipą turinčių karvių piene buvo rastas 0,04 proc. didesnis laktozės kiekis negu CT ir 0,07 proc. negu CC genotipus turinčių galvijų piene (p<0,01). TT (54,4 tūkst./ml) ir CT (24,9 tūkst./ml.) genotipai taip pat pasižymėjo mažesniu SLS negu CC (p<0,05).
40
Literatūra
1. Tänavots A., Kiiman H.,Baltosaar E., Kaart T, Viinalass H. Milk leakage from the udder of cows on dairy farms with automatic and conventional milking system. Veterinarija ir zootechnika. 2015; T. 69 (91), P. 7.
2. Klaas I. C., Enevoldsen C., Ersboll A. K., Tölle U. Cow-related risk factors for milk leakage.. Journal of Dairy Science.. 2005.; Vol. 88. P. 128.
3. Jaakson H., Ling K., Samarütel J., Ilves A., Kaart T., Kärt O., Ots M. Kraujo gliukozės ir insulino reakcijų priklausomybė nuo pieninių karvių kūno riebalų kiekio ir pieningumo,nustatyta gliukozės tolerancijos testu. Veterinarija ir zootechnika. 2013; T. 62. P.84.
4. Gupta P. H., Patel N. A., Rank D. N., Joshi C. G. Genetic polymorphism of toll-like receptors 4 gene by polymerase chain restriction fragment length polymorphisms, polymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism to correlate with mastitic cows. Veterinary World. 2015; P. 615-619.
5. Wang X. P., Xu S.Z., Gao X., Ly J.Y., Ren H.Y., Luoren Z. Cloning Of TLR4 Gene And It's Signal Transduction Gene, SNPs Detection And Association Analysis Of TLR4 Gene With Mastitis In Dairy Cattle. South African Journal of Animal Science. 2008; P. 101-108.
6. Mijić P., Knežević I., Baban M., Domaćinović M., Rimac D. Investigation of correlations and milking parameter distribution on cattle farms in eastern croatia. Acta Agronomica Hungarica. 2003; 51( Number 2. P. 191–198.
7. Bagnato A., Rossoni A., Maltecca C., Vigo D., Ghiroldi S. Milk emission curves in different parities in Italian Brown Swiss cattle Ital. J. Anim. Sci. 2003; Vol. 2 (Suppl. 1) 47. P. 46–48.
8. Garcia – Peniche T. B., Cassell B. G., Pearson R. E. and Misztal I. Comparisons of Holsteins with Brown Swiss and Jersey Cows on the Same Farm for Age at First Calving and First Calving interval. J. Dairy Sci. 2005; T. 88. P. 790 – 796.
9. Skimundris V. Pieninkystė. Vilnius.1993. P. 26;
10. Gudonis A. Pieno kokybė. Kaunas. Technologija. 2007. P.55-57.
11. Šernienė L. Žalio pieno kokybės užtikrinimas. Ferma. 2008/4 (12) P. 36 – 37. .
12. Kenedy B. W., Sethar M. S., Moxley J. E. and Downey B. R. Heritability of somatic cell count and its relationship with milk yield and composition in Holsteins. J. Dairy Sci 65. 1982; P. 843.
13. Juozaitienė V., Kučinskienė J., Juozaitis A., Malevičiūtė J. Lietuvoje veisiamų juodmargių galvijų veislių įtakos somatinių ląstelių kiekiui piene įvertinimas. Veterinarija ir zootechnika. 2004; T. 28 (50). P. 83 – 87.
41 15. Stankūnienė V.. Pieno mikroflora. Ferma. 2008/3 (11). P. 38.
16. Urbšienė D. Gyvulininkystės žinynas. LSMU Gyvulininkystės institutas: 2013. P. 6.
17. UAB gyvulių produktyvumo kontrolė. Kontroliuojamų bandų produktyvumo analizės sistema. [Online].; 2018 [cited 2018 01 05. Available from: http://www.gpk.lt/kontroliuojamu-bandu-produktyvumo-analizes-sistema/.
18. Šernienė L., Sekmokienė D. Pieno higiena. Kaunas. 2013. P. 9, 16, 106.
19. Greičiuvienė A., Jukna Č., Malakauskas M., Markevičiūtė D., Minkevičius V., Rudejevienė J. Semokienė D.,Šernienė L. "Pieno ūkis".2009. P.115-127.
20. Japertas S., Minkevičius V. Pienas ir jo kokybė. Kaunas. 2002. P. 56;
21. Juškienė V., Tarvydas V., Uchockis V., Nainienė R., Zapasnikienė B., Juška R. Gyvulininkystės žinynas. Kaunas. „Aušra“. 2007. P. 98 - 102, 128.
22. Žilaitis V., Antanaitis R., Rudejevienė J., Juozaitienė V., Žiogas V. Karvių pieno sudėties ir tešmens mikrofloros pokyčiai veikiant vaistui „Ergogen Complex“.. Veterinarija ir Zootechnika.. 2008. T. 43 (65).P. 96 – 99.
23. Spurgeon P., Burke R.J., Cooper C.L. The innovation imperative in health care organisation.2012.P.13
24. Persaud, P., Simm, G., Hill W.G. Genetic and phenotypic parameters for yield, food intake and efficiency of dairy cows fed ad libitum. Animal Production. 1991; 52.P. 435-444.
25. Nir O. What are production diseases and how we manage them? Acta vet. Suppl. 2003.; Vol.98. P. 21 – 32.
26. Japertas S. Mastitas: gydymas ir kontrolė. Veterinarijos informacija. Kaunas. 2001. 1. P - 7.
27. Hamann J., Kromker V. Potenial of specific milk composition variables for cow health management. Livest. Prod. Sci.1997.; P. 21.
28. Bendikas P., Bliznikas S., Jatkauskas J., Mankevičius R., Marčiauskas., Strolys K.. Tarvydas V., Uchoskis V., Urbšienė D., Zakas F. Galvijų ūkis. Kaunas. „Aušra“. 2001. P. 85 – 86.
29. Urbienė S. Pieno sudėtis ir savybės. Žaliava produktų gamybai. Akademija.2005. P. 88, 91-93.
42 31. Juozaitienė V., Japertienė R. Karvių melžimo savybių, pieno kiekio, sudėties ir kokybės tarpusavio
ryšių fenotipis įvertinimas. Veterinarija ir zootechnika. 2005. T. 32 P.54.
32. Zootechnikos žinynas [interaktyvus]. prieiga per internetą: http://www.lgi.lt/files/info/Zootechniko_zinynas.pdf. [Online].; 2012 [cited 2017 11 12.
33. Gerspach C., Ruetten M., Riond B. Investigation of coagulation and serum biochemistry profiles in dairy cattle with different degrees of fatty liver. 2016, P. 811–818.
34. Baranauskas S., Juknevičius S., Stankevičiūtė J. Pašarai ir galvijų šėrimas.LŽŪ.2009.P.15-25.
35. Drochner W., Mikulionienė S., Kulpys J. Kiaulių šėrimas. Kaunas.; 2000.P.1-8.
36. Z. B. Krakmolas pieningų karvių racionuose. Mano ūkis.2005. Nr. 12. P.46-47.
37. M. H. The cows are always right!: Evaluting rations. Preceedings of the 6 th Western dairy management conference.2003. P. 35-42.
38. Bendikas P. TV,UV. Veislinių telyčių auginimas. Baisiogala. 2004. P.9-21.
39. Jukna Č. Galvijininkystė. Vilnius.1998. P. 5-14.
40. Gaidžiūnienė N.. Pieno ūkio tvarkymas. Dotnuva; 2000.P.12-18.
41. Bartkevičiūtė Z., Černauskienė J.. Startinio kombinuotojo pašaro poveikis veršelių augimo spartai pirmaisiais gyvenimo mėnesiais. LVA mokslo darbai. Veterinarija ir zootechnika. 2003.T. 21 (43).P. 59–61.
42. Cobanoglu O., Gurcan E. K., Cankaya S., Kul E., Abaci H. S. Association between STAT1 gene polymorphism and milk production traits in Holstein, Jersey and Turkish native cattle breeds. International Conference on Tropical Animal Science and Production. 2016 July 26-29. P.35-38.
43. Gaidžiūnienė N., Meškauskienė S. Pieninių galvijų selekcija. Vilnius.: Lietuvos Respublikos Žemės ūkio ministerijos programos LEADER ir žemdirbių mokymo metodikos centras. 2007.P.21-25.
