MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
LAIMA STONKUTĖ
CIRSIUM ARVENSE (L.) SCOP. LAPŲ, ŽIEDŲ, STIEBŲ IR ŠAKNŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc., dr. Lina Raudonė
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:
CIRSIUM ARVENSE (L.) SCOP. LAPŲ, ŽIEDŲ, STIEBŲ IR ŠAKNŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Data
Darbo vadovas
Doc., dr. Lina Raudonė Data
Darbą atliko Magistrantė Laima Stonkutė
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Dirvinės usnies (Cirsium arvense (L.) Scop.) apibūdinimas, sistematika ir paplitimas ... 11
1.2. Dirvinės usnies (Cirsium arvense (L.) Scop.) morfologiniai požymiai ... 11
1.3. Dirvinių usnių augalinės žaliavos fitocheminė sudėtis ... 12
1.4. Dirvinių usnių augalinės žaliavos panaudojimas ... 12
1.5. Fenoliniai junginiai, jų struktūros ypatumai ir biologinis poveikis ... 14
1.6. Laisvieji radikalai, antioksidantai, antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 17
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Naudotos medžiagos ... 21
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės ... 21
2.4. Tyrimo metodai ... 21
2.4.1. Tiriamųjų ekstraktų paruošimas ... 21
2.4.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 22
2.4.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 23
2.4.4. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas ABTS metodu ... 23
2.4.5. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 24
2.4.6. Cirsium arvense (L.) Scop. lapų, žiedų, stiebų ir šaknų analizė ESC metodu ... 25
2.5. Duomenų apdorojimas ir statistinis įvertinimas ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas Cirsium arvense (L.) Scop. žaliavų analizei ... 27
3.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas dirvinių usnių lapų, žiedų, stiebų ir šaknų ekstraktuose. ... 29
3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas dirvinių usnių lapų, žiedų, stiebų ir šaknų ekstraktuose. 33 3.4. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas dirvinių usnių lapų, žiedų, stiebų ir šaknų ekstraktuose
ABTS metodu ... 36
3.6. Redukcinio aktyvumo nustatymas dirvinių usnių lapų, žiedų, stiebų ir šaknų ekstraktuose FRAP metodu ... 39
3.7. Cirsium arvense (L.) Scop. lapų, žiedų, stiebų ir šaknų analizė ESC metodu ... 41
4. IŠVADOS ... 45
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47
SANTRAUKA
L. Stonkutė. Magistro baigiamasis darbas. Mokslinis vadovas doc. dr. Lina Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Kaunas.
Pavadinimas: Cirsium arvense (L.) Scop. lapų, žiedų, stiebų ir šaknų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai.
Raktiniai žodžiai: Cirsium arvense, dirvinė usnis, Folin-Ciocalteu, fenoliniai junginiai, antioksidantinis aktyvumas, ABTS, FRAP.
Tyrimo tikslas: Ištirti Lietuvoje natūraliai augančių dirvinių usnių (Cirsium arvense (L.) Scop.) žiedų, lapų, stiebų ir šaknų ekstraktų fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą augalų vegetacijos metu natūraliose augavietėse.
Tyrimo objektas ir metodika: Tyrimo objektas – natūraliai augančių dirvinių usnių lapai, žiedai, stiebai ir šaknys. Bendras fenolinių junginių kiekis augalinėje žaliavoje nustatytas taikant spektrofotometrinį Folin-Ciocalteu metodą. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas UV-VIS spektrofotometriniu metodu. Laisvųjų radikalų surišimas įvertintas ABTS metodu, o redukcinis aktyvumas nustatytas FRAP metodu. Taikant ESC metodą nustatyta kokybinė ir kiekybinė augalinės žaliavos analizė.
Rezultatai: Nustatyta, kad dirvinių usnių organuose bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis priklauso nuo fenologinio tarpsnio. Didžiausias fenolinių junginių kiekis lapuose (56,97 ± 0,28 mg/g) nustatytas butonizacijos tarpsnyje, žieduose (27,61 ± 0,26 mg/g)- žydėjimo pradžioje, stiebuose (17,17 ± 0,21 mg/g) - masinio atžėlimo metu, šaknyse - butonizacijos tarpsnyje (18,43 ± 0,39 mg/g)(p<0,05). Didžiausias flavonoidų kiekis lapuose (11,65 ± 0,49 mg/g) nustatytas butonizacijos tarpsnyje, žieduose (15,29 ± 0,34 mg/g) – masinio žydėjimo metu, stiebuose ir šaknyse - butonizacijos tarpsnyje, atitinkamai 4,93 ± 0,12 mg/g ir 2,41 ± 0,35 mg/g (p<0,05). Didžiausias antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas dirvinių usnių lapuose nustatytas butonizacijos tarpsnyje, atitinkamai 183,92 ± 2,51 µmol/g ir 303,89 ± 5,41 µmol/g, žieduose – žydėjimo pradžioje, atitinkamai 119,21 ± 3,52 µmol/g µmol/g ir 149,79 ± 2,27 µmol/g. Stiebuose didžiausias antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas žydėjimo pradžioje, atitinkamai 43,69 ± 4,03 µmol/g ir 85,18 ± 2,35 µmol/g, šaknyse - butonizacijos metu, atitinkamai 60,70 ± 4,01 µmol/g ir 106,19 ± 2,17 µmol/g (p<0,05). Nustatytos statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp dirvinių usnių lapų, žiedų, šaknų ir bendro fenolinio junginių kiekio. ESC metodu nustatyta, kad dirvinių usnių lapuose ir stiebuose dominuojantis junginys yra chlorogeno rūgštis, atitinkamai 6242,95 ± 2271,11 µg/g ir 683,60 ± 506,67 µg/g, žieduose - liuteolino-4-gliukozidas (7619,22 ±348,93 µg/g). Šaknyse didžiausias kiekis nustatytas 3,5-dikafeoilchino rūgšties (1018,55 ± 882,94 µg/g).
SUMMARY
L. Stonkutė final master‘s thesis/research supervisor assoc. prof. dr. L. Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis. Kaunas.
Title: Research of phenolic compounds and antioxidant activity in leaves, flowers, stems and roots of Cirsium arvense (L.) Scop.
Key words: Cirsium arvense, creeping thistle, Folin-Ciocalteu, phenolic compounds, antioxidant activity, ABTS, FRAP.
The aim of the research: to investigate total content of phenolic compounds and antioxidant activity during the vegetative season from naturally growing Cirsium arvense (L.) Scop. flowers, leaves, stems ant roots.
The object and methods of the research: Research object – leaves, flowers, stems and roots of naturally growing creeping thistle. The total phenolic content of the plant material was determined by the Folin-Ciocalteu spectrophotometric method. The total content of flavonoids was determined by the UV-VIS spectrophotometric method. Radical scavenging determined using ABTS method and reducing antioxidant potential was determined by FRAP. The qualitative and quantative analysis of plant material was determined by HPLC method.
Results: It has been determined that the total phenolic and flavonoid content depend on the phenological phase. The highest amount of phenolic compounds was determined in leaves (56,97 ± 0,28 mg/g) – in pre-flowering period, in flowers (27,61 ± 0,26 mg/g) – in the beginning of flowering, in stems (17,17 ± 0,21 mg/g)- in period of intense growth, in roots – in pre-flowering period (18,43 ± 0,39 mg/g) (p<0,05). The highest amount of flavonoids in leaves was determined in the beginning of vegetation: in leaves in pre-flowering period (11,65 ± 0,49 mg/g), in flowers in period of massive flowering (15,29 ± 0,34 mg/g). The highest amount on flavonoids in stems and roots was determined in pre-flowering period, respectively, 4,93 ± 0,12 mg/g ir 2,41 ± 0,35 mg/g (p<0,05). The highest antiradical and reducting activity was determined in leaves in pre-flowering period, respectively, ,92 ± 2,51 µmol/g ir 303,89 ± 5,41 µmol/g, in flowers – in the beginning of flowering and period of massive flowering, respectively, 119,21 ± 3,52 µmol/g, 149,79 ± 2,27 µmol/g and 113,93 ± 3,59 µmol/g, 149,35 ± 2,06 µmol/g. The highest radical scavenging and reducing activity in stems was determined in the beginning of flowering (43,69 ± 4,03 µmol/g and 85,18 ± 2,35 µmol/g) and in roots – in pre-flowering period, respectively, 60,70 ± 4,01 µmol/g and 106,19 ± 2,17 µmol/g (p<0,05). Significant correlations have been found between the creeping thistle leaves, flowers, roots and total phenolic compounds. The dominant compound in the creeping thistle leaves and stems is chlorogenic acid, respectively, 6242,95 ± 2271,11 μg / g and 683,60 ± 506,67 μg / g, in flowers - luteolin-4-glucoside
(7619,22 ± 348,93 μg / g), and in the roots the maximum content was determined for 3,5- dicaffeoyl quinic acid (1018,55 ± 882,94 μg / g).
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
ABTS – 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) CGA – chlorogeno rūgštis (angl. Chlorogenic acid)
CUPRAC – (angl. CUPric Reducing Antioxidant Capacity)
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
ESC – efektyviosi skysčių chromatografija
FRAP – (ang. Ferric reducing antioxidant power)
GAE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic Acid Aquivalent) M – aritmetinis vidurkis
Maks. – maksimali reikšmė Min. – minimali reikšmė
ORAC – deguonies radikalų absorbcinė geba (angl. Oxygen Radical Absorbance Capacity) proc. – procentai
RNS – reaktyviosios azoto rūšys (ang. Reactive nitrogen species) ROS – reaktyviosios deguonies rūšys (angl. Reactive oxygen species) Sd – standartinis nuokrypis
TE – trolokso ekvivalentas (angl. Trolox equivalent)
USE – ultragarsu skatinama ekstrakcija
ĮVADAS
Moksliniai tyrimai patvirtina, kad laisvųjų radikalų susiformavimas dalyvauja daugelio lėtinių ligų etiopatogenezėje. Reaktyvūs laisvieji radikalai sukelia įvairių ląstelių komponentų pokyčius, skatina lipidų peroksidaciją. Su oksidaciniu stresu susijusių ligų gydymui ir profilaktikai aktualūs tampa natūralių antioksidantų poveikio tyrimai bei jų natūralių šaltinių paieška. Vaistiniai augalai yra natūralus įvairių antioksidantų šaltinis naudojamas ligų gydymui visame pasaulyje [1]. Vieni iš antioksidantiniu poveikiu pasižyminčių augalinių junginių grupių yra fenoliniai junginiai.
Nustatyta, kad augaliniai fenoliniai junginiai turi reikšmingą poveikį su oksidaciniu stresu susijusių ligų, tokių kaip vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto, osteoporozės ir neurodegeneracinių ligų profilaktikai [2,3]. Per pastaruosius kelerius metus fenolinių junginių nustatymas iš skirtingų augalų ekstraktų ir perspektyvių augalinių žaliavų, kaupiančių daug fenolinių junginių nustatymas tapo viena iš pagrindinių mokslininkų tyrimų sričių [2].
Dirvinė usnis (lot. Cirsium arvense) – žolinis daugiametis augalas priklausantis astrinių šeimai (lot. Asteraceae), natūraliai paplitęs šiaurės rytų Europoje ir Azijoje. Šis augalas pasižymi antioksidantiniu ir antimikrobiniu poveikiu bei yra naudojamas liaudies medicinoje dėl diuretinių, hemostazinių, priešuždegiminių ir kitų savybių. Dirvinės usnies organuose nustatytos veikliosios medžiagos – flavonoidai, fenolinės rūgštys, taninai, kumarinai, steroliai ir triterpenai [4]. Nustatyta, kad augalas pasižymi diuretiniu, sutraukiančiu, hepatoprotekciniu ir kitais poveikiais daugiausia dėl savo sudėtyje esančių fenolinių junginių [5]. C. arvense taip pat laikoma viena iš agresyviausių piktžolių, ypač vidutinio klimato zonose [6,7]. Nors šie augalai yra laikomi kenksmingais dėl žalos padarytos ūkininkų laukams, vis daugiau rezultatų parodo, kad šios genties atstovai pasižymi svarbiomis antioksidantinėmis savybėmis.
Nors visame pasaulyje dirvinė usnis tyrinėta nemažai, trūksta duomenų apie šių augalų fitocheminės sudėties kitimus vegetaciniais tarpsniais. Tikslinga įvertinti C. arvense augalo organų fenolinių junginių įvairavimą esant skirtingiems vegetacijos tarpsniams siekiant nustatyti optimalų žaliavų rinkimo laiką, kada augalas pasižymi didžiausiomis antioksidantinėmis savybėmis.
Mokslinio darbo naujumas. Pirmą kartą nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis, įvertintas antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas Lietuvoje natūraliai augančių dirvinių usnių organuose vegetacijos metu trijose augavietėse.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių dirvinių usnių (Cirsium arvense (L.) Scop.) žiedų, lapų, stiebų ir šaknų ekstraktų fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą augalų vegetacijos metu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį dirvinių usnių (Cirsium arvense (L.) Scop.) žiedų, lapų, stiebų, šaknų ekstraktuose.
2. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį dirvinių usnių žolės, žiedų, lapų, stiebų ir šaknų ekstraktuose.
3. ESC metodu nustatyti fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį dirvinių usnių (Cirsium arvense (L.) Scop.) žiedų, lapų, stiebų ir šaknų ekstraktuose.
4. Nustatyti dirvinių usnių (Cirsium arvense (L.) Scop.) žiedų, lapų, stiebų ir šaknų ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą ABTS ir FRAP metodais.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Dirvinės usnies (Cirsium arvense (L.) Scop.) apibūdinimas, sistematika ir
paplitimas
Dirvinė usnis (Cirsium arvense (L.) Scop.) – tai astrinių (Asteraceae Bercht. & J. Presl) šeimos augalų rūšis, priklausanti usnies (Cirsium) genčiai. Šis daugiametis žolinis augalas natūraliai auga šiaurės rytų dalyje Europoje ir Azijoje. [4,8]. Anglų kalboje dažniausiai nurodomi dirvinės usnies pavadinimai: Californian thistle, Canada thistle, Canadian thistle, creeping thistle ir field thistle. [7,9,10].
Sistematika:
Karalystė: Augalai (Plantae)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Astražiedžiai (Asteridae) Eilė: Astriečiai (Asterales)
Šeima: Astriniai (Asteraceae) Gentis: Usnis (Cirsium)
Rūšis: Dirvinė usnis (Cirsium arvense (L.) Scop.) [9].
Tai itin plačiai paplitusi piktžolė, dažniausiai aptinkama kultivuojamuose laukuose, pievose, ganyklose, atliekų laikymo vietose, pakelėse, gyvatvorėse ir apleistose vietose [11,12,13,14]. Dirvinė usnis labiausiai paplitusi žemesnėse aukštumose, vidutinio klimato zonose kur vyrauja vidutinė vasaros temperatūra [10,11]. Dirvinė usnis yra aptinkama įvairiuose dirvožemio tipuose. Augalui būdingos gilios šaknys nereikalauja pastovaus aprūpinimo vandeniu ir labiausiai aptinkamos maistinių medžiagų pilname substrate arba substrate su susikaupusiomis organinėmis liekanomis. Dirvinės usnys geriausiai auga derlinguose dirvožemiuose, mėšlo krūvose ir daržuose. Taip pat tokiame dirvožemyje, kuris yra tręšiamas trąšomis. Šie augalai neauga labai rūgščiuose dirvožemiuose, o geriausiai auga esant beveik neutraliam dirvos pH [11].
1.2. Dirvinės usnies (Cirsium arvense (L.) Scop.) morfologiniai požymiai
Dirvinės usnies stiebas stačias, šviesiai gelsvai žalios, kartais rusvai violetinės spalvos, briaunotas, nemažai išsišakojęs. Jaunas stiebas yra beveik lygus arba šiek tiek plaukuotas, o su amžiumi stiebo plaukuotumas didėja. Stiebo aukštis gali siekti 30–150 cm. Ant stiebo gali būti nuo 10 iki 20 lapų. Lapai 2–5 cm ilgio, nuo pilkšvai gelsvai žalios iki tamsiai žalios spalvos su blyškia
vidurine gysla. Apatinė lapo dalis blyškesnė, retai – balkšva. Lapai pailgos ar lancetiškos formos, klostytais kraštais, dygliuoti. Dygliai – 1–10 mm ilgio. Horizontalios šaknys gali siekti iki 5 m, o vertikalios šaknys 2–5 m ilgio. Žiedynas 13–18 mm skersmens, dvinamis, rožinės arba šviesiai violetinės spalvos, kartais – baltas. Būdingas stiprus medaus kvapas. Lukštavaisiai pailgi, lygiu, blizgiu paviršiumi, išilgai gofruoti su plokščia viršūne ir būdingu kūgio formos tašku centre. Lukštavaisiai 2,5–4 mm ilgio, nuo šviesiai iki tamsiai rudos spalvos. Pūkai yra nuo baltai pilkšvos iki rusvos spalvos sudaryti iš daugybės 2–3 mm ilgio plaukelių [11].
1.3. Dirvinių usnių augalinės žaliavos fitocheminė sudėtis
Dirvinių usnių žolėje yra glikozido knicino, dervų, inulino, eterinio aliejaus, flavonoidų, karotino, askorbinės rūgšties, mineralinių medžiagų: makroelementų (Ca, K, S) ir mikroelementų (Fe, Zn, Mn, Cu, Co) [11,15]. Sėklose yra 22-27 proc. riebalinio aliejaus [15].
Cirsium arvense (L.) Scop. žolės ekstraktuose nustatyti flavonoidai (apigeninas, apigenino-O-7-gliukozidas, luteolinas, luteolino-7-O-gliukozidas, narirutinas, kvercetinas, rutinas) ir fenolinės rūgštys (protokatecho rūgštis, chlorogeno rūgštis, vanilino rūgštis, kavos rūgštis, 3-kumaro rūgštis, 4-kumaro rūgštis, ferulino rūgštis, galo rūgštis, chino rūgštis) [16].
Dirvinių usnių lapų ekstraktuose nustatytos fenolinės rūgštys: protokatecho rūgštis, chlorogeno rūgštis, vanilino rūgštis, kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis [17].
Atlikus viso C. arvense augalo ekstraktų tyrimą nustatyti junginiai: cirineolis C, skopoletinas, pektolinarigenino-7-O-gliukopiranozidas, akacetinas, 6,7-dimetoksikumarinas [5], α-tokoferolis, 9,12,15-oktadekatrieno rūgštis, tracinas, hispidulinas, luteolinas [18].
1.4.
Dirvinių usnių augalinės žaliavos panaudojimas
Cirsium genties augalai nuo seno yra populiarūs liaudies medicinoje. Šios genties augalai buvo naudojami gydant pepsinę opą, leukemiją, metroragiją, sifilį, akių infekcijas, gonorėją bei hemorojų. Taip pat buvo pastebėtas Cirsium genties augalų veiksmingumas kovojant su diabetu. Amerikos indėnai Cirsium arvense (L.) Scop. šaknų infuzijas naudojo burnos ligoms, kirminams, apsinuodijus nuodinguoju raugmedžiu (Toxicodendron radicans) bei tuberkuliozės gydymui [5].
C. arvense žolė pasižymi diuretiniu, hemostatiniu, priešuždegiminiu ir sutraukiančiu poveikiu [19]. Šis augalas naudojamas kaip prakaitavimą skatinantį, vėmimą sukelianti ir tonizuojanti priemonė. Sėklos pasižymi kraujotaka skatinančiu poveikiu dubens srityje ir gimdoje, o aliejus pasižymi antiseptiniu poveikiu [20].
Įvairiose pasaulio dalyse šio augalo organų dalys yra naudojamos įvairiems negalavimams: dirvinių usnių šaknys naudojamos odos infekcijos gydymui ir apetitui skatinti [21], lapų ir stiebų pasta naudojama nuo skorbuto [22], dirvinių usnių jauni žiedai sutrinti vandenyje naudojami vėmimui sukelti [23], lapų sultys ir antžeminė dalis vietiškai naudojama žaizdoms gydyti [8,24,25], dirvinių usnių žolė ir šaknys naudojama skrandžio ligoms ir karščiavimui gydyti [26,27]. Šio augalo žali žiedynai vartojami nuo žarnyno kirminų [28]. Šaknys ir lapai naudojami uždegimui gydyti. Šaknys taip pat naudojamos kaip diuretinė ir hepatoprotekcinė priemonė [16].
Yra žinoma, kad dirvinių usnių žaliavos ir preparatai pasižymi diuretiniu, sutraukiančiu, priešuždegiminiu ir kepenis veikiančiu poveikiu daugiausia dėl sudėtyje esančių įvairių flavonoidų ir kumarinų [5].
Kadangi virusinių, bakterinių ir fungicidinių ligų gydymui natūralūs junginiai yra pageidaujami dėl savo netoksiškumo ir lengvo biologinio skaidymo, lyginant su sintetiniais junginiais buvo atlikti tyrimai in vitro, kurių metu ištirtas dirvinės usnies antibakterinis ir priešgrybelinis poveikiai [7,29]. Taikant chromatografinius metodus iš šios rūšies augalų buvo išskirti 5 junginiai: cirineolis C, skopoletinas, pektolinarigenino-7-O-gliukopiranozidas, akacetinas ir 6,7-dimetoksikumarinas. Buvo patikrintas šių junginių antibakterinis aktyvumas prieš B. subtillis, E. coli, S. flexenari, S. aureus, S. typhi ir P. aeruginosa. Cirineolis C, pektolinarigenino-7-O-gliukopiranozidas ir akacetinas pasižymi dideliu aktyvumu prieš Bacillus subtilis ir Shigella flexenari. Taip pat akacetinas pasižymi dideliu aktyvumu prieš Staphylococcus aureus ir Salmonella typhi. Fungicidinis šių junginių aktyvumas buvo atliktas prieš šešis patogeniškus grybus: Trichophyton longifusus, Candida albicans, Aspergillus flavus, Microsporum canis, Candida glaberata ir Fusarium solani. Gauti rezultatai parodė, kad skopoletinas ir pektolinarigenino-7-O-gliukopiranozidas pasižymi vidutinišku aktyvumu prieš Trichophyton longifusus, Candida albicans, Microsporum canis ir Fusarium solani [5].
Buvo atliktas iš C. arvense išskirtų junginių (α-tokoferolis, 9, 12, 15-oktadekatrieno rūgštis, tracinas, hispidulinas ir liuteolinas) antibakterinis aktyvumas prieš Bacillus subtilius, Escherichia coli, Shigella flexenari, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi ir Pseudomonas aeruginosa. Tracino, hispidulino ir liuteolino inhibavimo zonos buvo beveik tokios pačios kaip imipinemo ir pasižymi dideliu aktyvumu, o α-tokoferolis – vidutinišku aktyvumu prieš B. subtilis, E. coli, S. flexenari, S. Aureus ir S. Typhi. Šių junginių priešgrybelinis aktyvumas buvo atliktas prieš šešis patogeniškus grybus: Trichophyton longifusus, Candida albicans, Aspergillus flavus, Microsporum canis, Candida glabrata ir Fusarium solani. Lyginant su amfotericinu B20, tracinas, hispidulinas ir liuteolinas pasižymi pakankamu priešgrybeliniu poveikiu, o α-tokoferolis vidutiniu aktyvumu [18].
1.5.
Fenoliniai junginiai, jų struktūros ypatumai ir biologinis poveikis
Fenoliniai junginiai yra didelė ir sudėtinga cheminių junginių grupė randama augaluose. Jie yra augalų antriniai metabolitai ir atlieka svarbų vaidmenį kaip apsauginiai junginiai [29]. Fenoliniai junginiai dažniausiai yra susiję su apsauga nuo ultravioletinių spindulių, patogenų, parazitų, plėšrūnų bei gali augalams suteikti spalvą [2]. Šių augalų pagamintų antrinių metabolitų funkcijos augimui, fotosintezei, reprodukcijai ir kitiems pirminiams procesams dar nėra žinomos [31]. Kai kurie fenoliniai junginiai yra labai plačiai paplitę, o kiti yra specifiniai, būdingi tam tikrai augalų šeimai ar randami tik tam tikruose augalų organuose, tam tikruose vystymosi etapuose [32].
Yra žinoma daugiau kaip 8000 fenolinių junginių struktūrinių variantų [33]. Pagrindinė fenolinių junginių struktūra yra sudaryta iš vieno ar daugiau aromatinių žiedų, turinčių vieną ar daugiau hidroksilo grupių [34,33].
Fenoliniai junginiai yra klasifikuojami į skirtingas grupes pagal jų pagrindinę C atomų grandinę (1 lentelė) [35].
1 lentelė Pagrindinės fenolinių junginių klasės augaluose [29]
Eil. Nr. Klasė Anglies atomų
skaičius Pagrindinė grandinė 1. Paprastieji fenoliai Benzochinonai 6 C6 2. Fenolinės rūgštys 7 C6-C1 3. Acetofenonai Tirozino dariniai 8 C6-C2 4. Hidroksicinamono rūgštys Kumarinai 9 C6-C3 5. Naftochinonai 10 C6-C4 6. Ksantonai 13 C6-C1-C6 7. Stilbenai 14 C6-C2-C6 8. Flavonoidai 15 C6-C3-C6 9. Lignanai 18 (C6-C3)2 10. Bioflavonoidai 30 (C6-C3-C6)2 11. Kondensuoti taninai N (C6-C3-C6)n
Flavonoidai yra viena iš labiausiai paplitusių fenolinių junginių grupių augaluose [36]. Flavonoidai yra mažos molekulinės masės antriniai metabolitai, kurie, skirtingai nuo pirminių
metabolitų, nėra būtini augalų išgyvenimui. Iki šiol nustatyta daugiau kaip 9000 flavonoidų struktūrinių variantų [37]. Flavonoidai randami kaip aglikonai, glikozidai ir metilinti dariniai. Augaluose flavonoidai aglikonai (t.y., flavonoidai be cukrinės dalies) būna įvairių struktūrinių formų [36]. Chemiškai flavonoidų pagrindas yra penkiolikos anglies atomų konfiguracija susidedanti iš dviejų benzeno žiedų (A ir B), sujungtų per heterociklinį pirano žiedą (C) (1 pav.) [38].
1 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas [38]
Flavonoidų biosintezės kelias prasideda nuo vienos p-kumaril-CoA molekulės kondensacijos su trimis malonil-CoA molekulėmis katalizuojant chalkono sintetazei (CHS). Gaunamas chalkonas (4',2',4',6'-tetrahidroksichalkonas). Kitas žingsnis yra chalkono izomerizavimas į flavononą veikiant chalkono izomerazei (CHI). Nuo šio žingsnio kelias gali šakotis į keletą skirtingų flavonoidų klasių, įskaitant auronus, dihidrochalkonus, flavanonolius (dihidroflavonolius), izoflavonus, flavonus, flavonolius, leukoantocianidinus, antocianinus ir proantocianidinus [39].
Flavonoidai skirstomi pagal C žiedo struktūros pokyčius į 6 pogrupius: flavonus, flavonolius, flavanolius, flavanonus, izoflavonus ir antocianinus. Jų struktūrinis pokytis kiekviename pogrupyje iš dalies priklauso nuo hidroksilinimo, metoksilinimo, prenilinimo ir glikozilinimo laipsnio [2].
Cheminė įvairovė, dydis, trimatės formos, fizinės ir biocheminės flavonoidų savybės leidžia jiems sąveikauti su tikslinėmis medžiagomis skirtingose tarpląstelinėse vietose, kad galėtų išreikšti biologinį poveikį augaluose, gyvūnuose ir mikrobuose [37].
Flavonoidai augalų žiedams, vaisiams ir lapams suteikia oranžinę, mėlyną ir violetinę spalvą [40]. Flavonoidai gali veikti kaip fermentai, mikrobų inhibitoriai, chelatuojančios medžiagos, apsauga nuo UV ir laisvųjų radikalų [35]. Taip pat nustatyta, kad jie pasižymi priešuždegiminėmis, antialerginėmis, hepatoproteksinėmis, antitrombozinėmis, antivirusinėmis ir priešvėžinėmis savybėmis [36,40]. Šios savybės daugiausia yra susijusios su jų antioksidantiniu aktyvumu ir priklauso nuo jų struktūros [35].
Fenolinės rūgštys svarbi fenolinių junginių klasė pasižyminti biologiškai aktyviomis funkcijomis, paprastai randama augaluose ir maisto produktuose [41]. Šie fenoliniai junginiai savo struktūroje turi vieną karboksirūgšties funkcinę grupę [29]. Pagal savo struktūrą fenolinės rūgštys gali
būti suskirstytos į du pogrupius: hidroksibenzenkarboksi rūgštys ir hidroksicinamono rūgštys (2 pav.) [41].
2 pav. Natūraliai randamų fenolinių rūgščių pavyzdžiai [41]
Daugiausia fenolinės rugštys tiriamos dėl savybių apsaugančių nuo oksidacinės žalos, kurią sukelia įvairios degeneracinės ligos tokios kaip širdies ir kraujagyslių ligos, uždegimas ir vėžys [29,42]. Nustatyta, kad fenolinės rūgštys didina tulžies sekreciją, mažina cholesterolio kiekį kraujyje bei pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš kai kurias bakterijas, pvz. auksinį stafilokoką (lot. Staphylococcus aureus). Taip pat nustatyta, kad fenolinės rūgštys pasižymi tokiais poveikiais kaip antiopiniu, priešuždegiminiu, antioksidantiniu, citotoksiniu, antinavikiniu, antispazminiu ir antidepresiniu [29].
Nustatyta, kad dirvinių usnių ekstraktuose gausiausiai randamas fenolinis junginys – chlorogeno rūgštis [16]. Chlorogeno rūgštis (CGA) yra kavos ir chino rūgščių esteris plačiai paplitęs augaluose ir didelės koncentracijos kavoje. Viename kavos puodelyje gali būti 70-350 mg chlorogeno rūgšties [43]. Klinikiniai tyrimai parodė, kad chlorogeno rūgšties vartojimas gali pasireikšti antihipertenziniu poveikiu. Mechaniškai CGA metabolitai sumažina oksidacinį stresą (reaktyvias deguonies rūšis) kas lemia kraujospūdžio sumažėjimą dėka geresnės endotelio funkcijos ir azoto oksido biopraeinamumo arterinėse kraujagyslėse [44]. Taip pat tyrimai parodė galimas
antioksidantines, antibakterines, hepatoprotekcines, antivirusines, hipoglikemines ir antikarcinogenines CGA savybes [45,46].
1.6. Laisvieji radikalai, antioksidantai, antioksidantinio aktyvumo nustatymo
metodai
Laisvieji radikalai dalyvauja įvairių ligų etiopatogenezėje: aterosklerozės, artrito, išemijos, centrinės nervų sistemos pažeidimo, gastrito ir vėžio. Dėl aplinkos teršalų, radiacijos, cheminių medžiagų, toksinų, kepto ir aštraus maisto bei fizinio krūvio, laisvieji radikalai sukelia imuninės sistemos antioksidantų išeikvojimą, genų ekspresijos pakitimą ir sukelia baltymų anomalijas. Oksidacijos procesas yra vienas iš svarbiausių būdų gamintis laisviesiems radikalams maisto produktuose, vaistuose ir net gyvose sistemose [47]. Reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) ir reaktyviosios azoto rūšys (RNS) yra šalutiniai produktai, gaunami ląstelinio redokso proceso metu[48]. Laisvieji radikalai apibrėžiami kaip molekulės ar molekulių fragmentai, kurių išorinėje orbitoje yra vienas ar daugiau nesuporuotų elektronų. Šie nesujungti elektronai yra nestabilūs ir paprastai laisviesiems radikalams suteikia didelį reaktyvumo laipsnį [48].
Reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) apima superoksido (O2• -), hidroksilo (•OH), peroksilo (ROO•), lipidperoksilo (LOO•) ir alkoksilo (RO•) radikalus. Reaktyviosios azoto rūšys apima azoto oksidą (NO•) ir azoto dioksidą (NO
2•). Deguonies ir azoto laisvieji radikalai gali būti lengvai konvertuojami į kitas neradikalines reaktyviąsias rūšis, kurios taip pat pavojingos sveikatai: vandenilio peroksidas (H2O2), ozonas (O3), viengubasis deguonis (1O2), hipochlorido rūgštis (HOCl), azoto rūgštis (HNO2), peroksinitritas (ONOO-), diazoliu trioksidas (N2O3), lipidų peroksidas (LOOH). Šios rūšys paprastais vadinamos oksidatoriais ir gali lengvai sukelti laisvųjų radikalų reakcijas gyvuose organizmuose [48].
Antioksidantai – tai medžiagos gebančios apsaugoti organizmus nuo žalos, kurią sukelia laisvųjų radikalų sukeltas oksidacinis stresas [47].
Antioksidantai yra klasifikuojami į natūralius ir sintetinius. Natūralūs antioksidantai skirstomi į:
1. Fermentai (pvz. superoksido dismutazė (SOD), katalazė ir glutationo peroksidazė) 2. Mažos molekulinės masės antioksidantai:
a) lipiduose tirpūs antioksidantai (tokoferolis, karotinoidai, chinonai, bilirubinas ir kai kurie polifenoliniai junginiai);
Sintetiniai antioksidantai gali būti BHA (butilintas hidroksi anizolas), BHT (butilintas hidroksi toluenas), TVHQ (tretinis butilintas hidroksichinonas) ir kt [49].
Antioksidantų veikimo mechanizmai:
1. Grandinės nutraukimo reakcija, pvz. α-tokoferolis, kuris veikia lipidų fazę siekiant sugauti laisvą radikalą.
2. Reaktyviųjų deguonies rūšių koncentracijos sumažinimas, pvz. glutationas.
3. Pradinių radikalų pašalinimas, pvz. superoksido dismutazė, kuri veikia lipidų fazę, kad sugautų superoksido laisvųjų radikalų.
4. Chelatuojant pereinamojo metalo katalizatorių [49].
Fenoliniai junginiai kaip antioksidantai gali veikti įvairiais būdais. Fenolinių junginių hidroksilo grupės yra geri vandenilio donorai: vandenilį atiduodantys antioksidantai gali reaguoti su reaktyviu deguonimi ir reaktyviomis azoto rūšimis nutraukimo reakcijoje, kurios metu nutraukiamas naujų radikalų susidarymo ciklas. Po sąveikos su pradinėmis reaktyviomis rūšimis susidaro antioksidanto radikalo forma, turinti daug didesnį cheminį stabilumą negu pradinis radikalas. Fenolinių junginių hidroksilo grupių sąveika su benzeno žiedo π-elektronais suteikia specifines savybes, kurių svarbiausia gebėjimas generuoti laisvuosius radikalus, kur radikalas stabilizuojamas delokalizacijos būdu [50].
Fenolinių junginių antioksidantinis pajėgumas taip pat priskiriamas jų gebėjimui chelatuoti metalų jonus, dalyvaujančius laisvųjų radikalų gamyboje [50].
Tačiau, fenoliniai junginiai gali veikti kaip prooksidantai, kurie chelatuoja metalus tokių būdu, kuris palaiko arba padidina jų katalizinį aktyvumą arba mažina metalus, taip padidindamas jų gebėjimą sudaryti laisvuosius radikalus [50].
Fenoliniai junginiai turi tinkamą cheminę struktūrą laisvųjų radikalų šalinimui nes jie turi: 1) Fenolines hidroksilo grupes, kurios linkusios atiduoti vandenilio atomą arba elektroną
laisviesiems radikalams;
2) Išplėstinę konjuguotą aromatinę sistemą skirtą delokalizuoti neskaidytą elektroną [50].
Atlikti tyrimai in vitro parodė, kad fenoliniai junginiai pasižymi stiprenėmis antioksidantinėmis savybėmis nei vitaminas C, E ir karotinoidai [2].
Dažniausiai antioksidantiniam aktyvumui nustatyti yra taikomi ABTS, ORAC, DPPH, FRAP ir CUPRAC metodai [51,52].
ABTS metodas yra vienas iš dažniausiai naudojamų antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodų [53]. Šis metodas yra pagrįstas mėginiuose esančių antioksidantų gebėjimu redukuoti ABTS·+ radikalą. ABTS·+ radikalas – melsvai žalios spalvos, kurio didžiausios absorbcijos vertės nustatomos esant 645 nm, 734 nm ir 815 nm bangos ilgiams. Reakcijos terpėje esantys antioksidantai redukuoja radikalą ir sumažina spalvos intensyvumą [54]. Dėl ABTS radikalo tirpumo vandenyje ir organiniuose
tirpikliuose šis kolorimetrinis tyrimas nustato bendrą antioksidantinį aktyvumą tiek lipofilinėse tiek hidrofilinėse medžiagose [55].
ORAC metodas pagrįstas antioksidanto gebėjimo slopinti oksidacijos procesus, sukeltus peroksilo radikalo, matavimu. Peroksilo radikalai reaguoja su fluorescuojančia medžiaga, vyksta oksidacija ir susidaro neflorescuojantis produktas, kuris kiekybiškai įvertinamas. Ši reakcija pagrįsta flurescencijos intensyvumo mažėjimu per tam tikrą laiką [56]. ORAC metodas populiarus vertinant įvairių medžiagų antioksidantinį aktyvumą, tačiau šio metodo trūkumas – ilgas matavimo laikas (2 val.) [57].
DPPH analizės metodas pagrįstas principu, kad DPPH radikalas priima vandenilio atomą iš antioksidanto ir redukuojasi iki DPPH2 – violetinė spalva pasikeičia į geltoną. Absorbcijos maksimumai yra prie 515 nm bangos ilgio [58]. Tai greitas, paprastas, nebrangus ir plačiai naudojamas metodas įvertinti junginių gebėjimą veikti kaip laisvųjų radikalų surišėjams ar vandenilio donorams ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą [59,60]. Šis metodas gali būti naudojamas kiekybiškai įvertinti antioksidantus sudėtingose biologinėse sistemose kietuose ir skystuose mėginiuose [59].
FRAP metodas paremtas (Fe(III)-TTPZ) komplekso redukcija į (Fe(II)-TPTZ) kompleksą esant žemam pH. Fe(II)-TPTZ intensyviai mėlyna spalva gali būti stebima 593 nm bangos ilgyje [61]. Literatūroje minima, kad šis redukcinio aktyvumo nustatymo metodas yra paprastas, greitas ir patikimas, be to nereikalaujantis specializuotos įrangos [62].
CUPRAC metodas yra pagrįstas Cu(I)–Nc chelato absorbcijos matavimu susidariusio dėl redokso reakcijos tarp antioksidanto ir Cu(II)–Nc komplekso. Absorbcijos maksimumai matuojami 450 nm šviesos sugerties bangos ilgyje [52]. Šio metodo trūkūmas yra tas, kad yra reikalingos sudėtingesnės ir brangesnės priemonės [62].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – dirvinių usnių (Cirsium arvense (L.) Scop.) priklausančių usnių (Cirsium) genčiai, astrinių (Asteraceae Bercht. & J. Presl) šeimai lapai, žiedai, stiebai ir šaknys. Visos augalinės žaliavos rinktos 2017 metais nuo birželio vidurio iki rugsėjo mėnesio pradžios iš trijų radaviečių: Tirkšlių miestelio (Mažeikių raj.) (56° 15' 35.81", 22° 19' 30.58" (WGS)), Viekšnių miestelio (Mažeikių raj.)( 56° 14' 25.22", 22° 31' 43.04" (WGS)) ir Bugenių kaimo (Mažeikių raj.) (56° 19' 7.79", 22° 11' 39.06" (WGS)). Visų trijų vietų augavietės – grūdinių kultūrų laukas, pakelė. Tyrimams naudojamos augalinės žaliavos ėminių duomenys pateikti 2 lentelėje. Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje ir gerai vėdinamoje patalpoje, vėliau fasuojama į popierinius maišelius ir laikoma tamsioje, sausoje vietoje.
2 lentelė. Augalinės žaliavos rinkimo data, fenologinis tarpsnis ir vieta
Žaliavos rinkimo data
Fenologinis tarpsnis
Žaliavos rinkimo vieta
Tirkšliai Viekšniai Bugeniai
2017-06-18 Masinis atžėlimas Lapai, stiebai, šaknys Lapai, stiebai, šaknys Lapai, stiebai, šaknys
2017-07-02 Butonizacija Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys 2017-07-16 Žydėjimo pradžia Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys 2017-07-31 Masinis žydėjimas Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys 2017-08-13 Masinis žydėjimas Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, žiedai, stiebai, šaknys 2017-08-29 Žydėjimo pabaiga Lapai, žiedai, stiebai, šaknys Lapai, stiebai, šaknys Lapai, stiebai, šaknys
2017-09-10 Sėklų branda Lapai, stiebai, šaknys
Lapai, stiebai, šaknys
Lapai, stiebai, šaknys
2.2. Naudotos medžiagos
Distiliuotas vanduo ruošiamas vandens distiliatoriumi „Milipore“, JAV; 96 proc. V/V etanolis (AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva), Folin – Ciocalteu reagentas („SigmaAldrich Chemie“, Šveicarija), natrio karbonatas (Na2CO3) („Roth“,Vokietija), galo rūgšties monohidratas („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija), ABTS (2,2´- azino–bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis) („Alfa Aesar“, Vokietija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) („Sigma-Aldriche Chemie“, Vokietija), natrio acetatas, 99,8-100,5 proc. acto rūgštis (CH3COOH) (,,Sigma–Aldrich“, St. Louis, JAV), 37 proc. vandenilio chlorido rūgštis (,,Sigma – Aldrich“, St. Louis, JAV), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) („Sigma-Aldriche Chemie“, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas, aliuminio chloridas („Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Steinheim, Vokietija), heksametilentetraminas („Sigma-Aldriche Chemie“, Vokietija).
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės
Elektroninės svarstyklės „Sartorius AG Gottingen CP64-OCE“ (Vokietija), ultragarsinė vonelė „Elmasonic P“ (Vokietija), spektrofotometras („Spectronic Camspec M550“, Barley Hill Road Garforth Leeds, Anglija), elektrinis malūnėlis („IKA A11 basic“, Vokietija), chromatografas „Waters 2695“ (Milford, USA), įvairių talpų mikropipetės (JAV), popieriniai filtrai (Vokietija).
2.4. Tyrimo metodai
2.4.1. Tiriamųjų ekstraktų paruošimas
Augalinė žaliava sumalama elektriniu malūnėliu ir atsveriama 0,25 g žaliavos (atsveriamas tikslus žaliavos svėrinys). Malta žaliava suberiama į tamsaus stiklo buteliuką, užpilama 25 ml 70 proc. V/V etanolio ir užsukama kamšteliu. Buteliukai ekstrahuojami ultragarso vonelėje: lapai, žiedai, stiebai – 15 minučių, šaknys – 60 minučių. Ekstrakcija pradedama esant kambario temperatūros vandeniui. Gauti ekstraktai filtruojami pro popierinius filtrus į tamsaus stiklo buteliukus, užsandarinami ir ženklinami.
2.4.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis spektrofotometriškai nustatomas Folin-Ciocalteu metodu. Tiriamųjų tirpalų paruošimas: ruošiant tiriamuosius tirpalus 1 ml ekstrakto sumaišoma su 5 ml Folin-Ciocalteu regaento (10 kartų skiesto su distiliuotu vandeniu) ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui.
Palyginamojo tirpalo paruošimas: palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip tiriamasis, tik vietoj ekstrakto naudojamas ekstrahentas: 1 ml ekstrahento (70 proc. V/V etanolio) sumaišoma su 5 ml Folin-Ciocalteu reagento (10 kartų skiesto su distiliuotu vandeniu) ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo.
Sudaryti kalibracinei kreivei buvo ruošiami etaloniniai galo rūgšties tirpalai. Šie tirpalai ruošiami tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai tik vietoj 1 ml ekstrakto naudojami 1 ml skirtingų koncentracijų (0,075 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,0125 mg/ml) galo rūgšties tirpalai.
Bendras fenolinių junginių kiekis išmatuojamas galo rūgšties ekvivalentais pagal formulę: 𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺 = 𝑐𝑐×𝑉𝑉𝑚𝑚 (mg/g)
c – galo rūgšties koncentracija iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V – ekstrakto tūris (ml);
m – augalinės žaliavos malinio svoris (g).
Galo rūgšties kalibracinė kreivė pavaizduota 3 paveiksle.
3 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 A bs o rbc ij a
Galo rūgšties koncentracija, mg/ml
y = 10,301x - 0,0804 R² = 0,9997
2.4.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas
Bendras flavonoidų kiekis nustatytas UV-VIS spektrofotometriniu metodu, veikiant tiriamąjį ekstraktą aliuminio chlorido tirpalu rūgštinėje terpėje.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: 5 ml tūrio matavimo kolboje 0,2 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,1 ml 30 proc. (V/V) acto rūgšties tirpalo ir 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 minučių įpilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės.
Palyginamojo tirpalo paruošimas: 5 ml tūrio matavimo kolboje 0,2 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,1 ml 30 proc. (V/V) acto rūgšties tirpalo ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės.
Matuojamas absorbcijos dydis esant 407 nm bangos ilgiui. Bendras flavonoidų kiekis tiriamuosiuose ėminiuose apskaičiuojamas pagal rutino kalibracinę kreivę ir išreiškiamas rutino ekvivalentu mg/g absoliučiai sausos žaliavos.
Rutino kalibracinė kreivė pavaizduota 4 paveiksle.
4 pav. Rutino kalibracinė kreivė
2.4.4. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas ABTS metodu
Motininio ABTS tirpalo paruošimas: tamsaus stiklo buteliuke 0,0548 g atsvertų ABTS miltelių ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens ir įdedama 0,0095 g kalio persulfato. Gautas mišinys sumaišomas ir 16 valandų laikomas tamsoje.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 A bs o rbc ij a Rutino koncentracija, mg/ml y = 1,3687x - 0,0058 R² = 0,9989
Darbinio ABTS tirpalo paruošimas: po 16 valandų motininis tirpalas praskiedžiamas iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 3 ml darbinio ABTS tirpalo pridedama 20 µl tiriamojo ekstrakto. Gautas mišinys laikomas kambario temperatūroje, tamsoje 1 valandą. Po valandos spektrofotometru išmatuojama tiriamojo tirpalo absorbcija esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.
Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:
TEABTS = 𝑐𝑐 × 𝑉𝑉/𝑚𝑚; µmol/g
c – trolokso koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
Trolokso kalibracinė kreivė pavaizduota 5 paveiksle.
5 pav. Trolokso kalibracinė kreivė
2.4.5. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
A, B ir C reagentų paruošimas:
A) 3,1 g natrio acetato suberiama į 1000 ml matavimo kolbą, įpilama 16ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės. Gauto tirpalo pH=3,6.
B) Į 50 ml distiliuoto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties ir gautame mišinyje tirpinama 0,1562 g TPTZ miltelių.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 200 400 600 800 1000 A b sor b ci jos p ok yt is
Trolokso koncentracija, µmol/L
y = 0,0002x + 0,0764 R² = 0,9994
C) 50 ml distiliuoto vandens ištirpinama 0,2703 g geležies (III) chlorido heksadidrato.
Darbinio FRAP reagento paruošimas: šis reagentas ruošiamas A, B ir C reagentus sumaišius santykiu 10:1:1.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 3 ml darbinio FRAP reagento įdedama 20 µl tiriamojo ekstrakto. Mišinys laikomas kambario temperatūroje, tamsoje 1 valandą. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 593 nm bangos ilgiui.
Palyginamojo tirpalo paruošimas: palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip tiriamasis tirpalas, tačiau vietoj ekstrakto dedama tirpiklio (70 proc. (V/V) etanolio).
Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:
TEFRAP= 𝑐𝑐 × 𝑉𝑉/𝑚𝑚; mg/g
c – trolokso koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml);
m- tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
Trolokso kalibracinė kreivė pavaizduota 6 paveiksle.
6 pav. Trolokso kalibracinė kreivė
2.4.6. Cirsium arvense (L.) Scop.
lapų, žiedų, stiebų ir šaknų analizė ESC metodu
Atliekant ESC analizę naudotas „Waters 2695“ chromatografas (Milford, USA) su diodų matricos detektoriumi „Waters 2998“ (Milford, USA). Chromatografiniam skirstymui naudota 5-µm ACE C18 analitinė kolonėlė (250 × 4,6 mm) su prieškolone 5-µm ACE C18 (20 × 4,0 mm) (Aberdeen, Scotland) esant 25 °C temperatūrai.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 A bs o rbc ij a
Trolokso koncentracija, µmol/L
y = 0,0003x - 0,0127 R² = 0,9998
Analizės metu naudota eliuentų sistema: 1 proc. (v/v) skruzdžių rūgštis (A) ir acetonitrilas (B). Eliucija: Eliucija: 10–15 proc. tirpiklis B 0–20 min, 15 proc. tirpiklis B 20–30 min, 15–30 proc. tirpiklis B 30–45 min, 30–40 proc. tirpiklis B 45–55 min. Tėkmės greitis 1 ml/min, o injekcijos tūris – 10 µl.
Analizės metu fenoliniai junginiai identifikuoti pagal smailių sulaikymo trukmę ir UV spektrą (λ = 200–600 nm) juos palyginant su etaloninėmus medžiagomis (standartais). Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas atliktas pagal standartų kalibracines kreives.
2.5. Duomenų apdorojimas ir statistinis įvertinimas
Visi gauti duomenys susisteminti ir apdoroti naudojantis „Microsoft Office Excel 2013“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 17.0“ (SPSS Inc., JAV) kompiuterinėmis programomis. Microsoft Office Excel 2013“ kompiuterine programa skaičiuoti gautų duomenų matematiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (SD). Taikant „SPSS Statistics 17.0“ kompiuterinę programą įvertintas statistinis patikimumas taikant vienfaktorinę dispersinę analizę (One-way ANOVA) pasirinkus Tukey post-hoc kriterijų. Spirmeno koreliacijos koefiecientu įvertintas koreliacinis ryšys. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo p=0,05.
3. R
EZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas Cirsium arvense (L.) Scop.
žaliavų analizei
Kokybiniai ir kiekybiniai augalinių medžiagų bioaktyvių junginių tyrimai daugiausia priklauso nuo tinkamo ekstrahavimo metodo parinkimo [63,64]. Ekstrahavimas yra svarbiausias pirmas žingsnis atliekant vaistinių augalinių žaliavų tyrimus bei turi reikšmingą įtaką galutiniams rezultatams. Bet kurio tradicinio ekstrahavimo metodo efektyvumas daugiausia priklauso nuo tirpiklių parinkimo [63]. Dažniausiai ekstrakcija atliekama įvairios koncentracijos etanolio–vandens mišiniais ar vandeniu, rečiau – kitais tirpikliais. Flavonoidams išskirti iš vaistinės augalinės žaliavos dažniausiai naudojamas etanolis ir jo koncentracijos įvairuoja 45-70 proc. Etanolio ir vandens mišiniai tinkami visoms ekstraktų formoms gaminti [65]. Siekiant parinkti tinkamiausią tirpiklį buvo pagaminti vandeninis ir įvairių etanolio koncentracijų (40 proc., 60 proc., 70 proc., 80 proc., 96 proc.) ekstraktai ir taikant Folin-Ciocalteu metodą, esant 765 nm bangos ilgiui išmatuotas bendras fenolinių junginių kiekis galo rūgšties ekvivalentais. Rezultatai pavaizduoti 7 paveiksle.
7 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) dirvinių usnių žolės ekstraktuose naudojant skirtingos koncentracijos etanolį.
Nustatyta, kad reikšmingai mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis išekstrahuotas kai tirpiklis yra vanduo (34,82 ± 0,61 mg/g) (p<0,05), o didžiausias naudojant 70 proc. etanolį (68,03 ± 0,51 mg/g) (p<0,05). Nenustatytas statistiškai patikimas skirtumas tarp 40 proc. ir 80 proc. etanolio ir vandens mišinių išekstrahuoto bendro fenolinių junginių kiekio. Atsižvelgiant į gautus rezultatus tolimesniems tyrimams kaip tirpiklis pasirinktas 70 proc. etanolis.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 Vanduo 40% etanolis 60% etanolis 70% etanolis 80% etanolis 96% etanolis B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is, m g/ g Tirpiklis
Ekstrakcijos laiko parinkimas taip pat vienas iš dažniausių veiksnių įtakojančių ekstrakcijos procesą [63]. Ultragarsu skatinama ekstrakcija (USE) pasižymi nemažai pranašumų: trumpesnis ekstrahavimo laikas, mažesnis energijos ir tirpiklių naudojimas, galimybė vienu metu ekstrahuoti daugybė ekstraktų [63,66]. Ultragarso energija garantuoja efektyvesnį maišymą, greitesnį energijos perdavimą, mažesnį šiluminį gradientą ir temperatūrą bei sumažina reikiamos įrangos dydį [63]. Ekstrahavimui atlikti buvo pasirinkti laiko intervalai: 5, 10, 15, 30, 45 ir 60 minučių. Po ekstrakcijos spektrofotometru buvo išmatuotas tiriamųjų ekstraktų bendras fenolinių junginių kiekis.
Nustatyta, kad vykdant ekstrakciją nuo 5 iki 15 minučių didėja išekstrahuotas bendras fenolinių junginių kiekis dirvinių usnių žolėjė nuo 30,78 ± 0,22 mg/g iki 38,95 ±1,02 mg/g. 15 minučių ekstrakcijos trukmė užtikrina didžiausią bendrą fenolinių junginių kiekį dirvinių usnių žolėjė (p<0,05). Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstrakciją vykdant 30 minučių – 25,14 ± 0,35 mg/g (p<0,05). Pritaikius vienfaktorinę dispersinę ANOVA analizę nustatyta, kad 5 ir 10 minučių bei 45 ir 60 minučių trukmės ekstrakcijos laikas vienodai darė įtaką fenolinių junginių ekstrakcijai – nenustatytas reikšmingas skirtumas (8 paveikslas).
8 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio dirvinių usnių žolėje įvairavimas ekstrahuojant ultragarso vonelėje skirtingais laiko intervalais.
Atliekant dirvinių usnių šaknų ekstrakcija ultragarso vonelėje nustatyta, kad fenolinių junginių kiekis nuo 5 minutės (8,56 ± 0,24 mg/g) didinant laiko intervalus didėjo iki kol 60 minutę buvo pasiektas didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (17,53 ± 0,44 mg/g)(p<0,05) (9 paveikslas). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5 10 15 30 45 60 B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is (m g/ g)
9 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio dirvinių usnių šaknyse įvairavimas ekstrahuojant ultragarso vonelėje skirtingais laiko intervalais.
Remiantis gautas rezultatais tolesniems tyrimams gaminant dirvinių usnių organų ekstraktus ultragarso vonelėje dirvinių usnių lapai, žiedai ir stiebai buvo ekstrahuojami 15 minučių, o šaknys – 60 minučių.
3.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas dirvinių usnių lapų, žiedų,
stiebų ir šaknų ekstraktuose.
Aplinkos veiksniai įtakoja antrinių metabolitų susikaupimo dėsningumus augaluose. Sezoniškumas, saulės šviesa, temperatūra, drėgmė, kenkėjai, trąšos yra bendrieji aplinkos veiksniai, kurie įtakoja augalų fenologinį vystymąsi [67]. Gauti rezultatai parodė, kad bendras fenolinių junginių kiekis dirvinių usnių organuose trijose augavietėse (Tirkšliai, Viekšniai, Bugeniai) įvairuoja.
Dirvinių usnių organuose bendras fenolinių junginių kiekis priklauso nuo fenologinio tarpsnio. Vegetacijos metu reikšmingai didžiausias fenolinių junginių kiekis lapuose (56,97 ± 0,28 mg/g) nustatytas butonizacijos tarpsnyje (07.02) (p<0,05), o mažiausias – (29,30 ± 0,33 mg/g) sėklų brandinimo metu (09.10) (p<0,05). Lyginant 06.18 su 07.31 ir 08.13 su 08.29 rinktų lapų ekstraktuose nustatytus bendrus fenolinių junginių kiekius nenustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (10 paveikslas). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 5 10 15 30 45 60 B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is (m g/ g)
10 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių lapuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
Žieduose didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas žydėjimo pradžioje (07.16) - 27,61 ± 0,26 mg/g (p<0,05). Mažiausias fenolinių junginių kiekis (22,21 ± 0,41 mg/g) dirvinių usnių žieduose nustatytas butonizacijos tarpsnyje (07.02) (p<0,05). Nenustatytas statistiškai reikšmingas bendras fenolinių junginių kiekio skirtumas tarp masinio žydėjimo tarpsnių (07.31 ir 08.13) ir tarp masinio žydėjimo (08.13) ir žydėjimo pabaigos (08.29) vegetacinių laikotarpių (11 paveikslas).
11 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių žieduose vegetacijos metu (liepos – rugpjūčio mėn.)
0 10 20 30 40 50 60 70 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is (m g/ g)
Žaliavos rinkimo data
0 5 10 15 20 25 30 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is (m g/ g)
Stiebuose didžiausias fenolinių junginių išeiga nustatyta masinio atžėlimo metu (06.18) – 17,17 ± 0,21 mg/g), o mažiausi kiekiai nustatyti masinio žydėjimo metu (08.13) ir sėklų brandinimo metu (09.10) (atitinkamai 12,96 ± 0,19 mg/g ir 12,48 ± 0,20 mg/g) (p<0,05) (12 paveikslas).
12 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių stiebuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
Šaknyse fenolinių junginių maksimumai nustatyti masinio atžėlimo (06.18) – 18,41 ± 0,36 mg/g) ir butonizacijos (07.02) – 18,43 ± 0,39 mg/g) fenologiniais tarpsniais (p<0,05). Fenolinių junginių minimumai nustatyti žydėjimo pradžioje (07.16) ir masinio žydėjimo metu (08.13) (atitinkamai 12,98 ± 0,29 mg/g ir 12,93 ± 0,28 mg/g) (p<0,05) (13 paveikslas).
13 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių šaknyse vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is (m g/ g)
Žaliavos rinkimo data
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 B endr as fe no lini ų jung ini ų ki ek is (m g/ g)
Lyginant visus dirvinių usnių organus maksimalios bendro fenolinių junginių reikšmės pasiekiamos skirtingais vegetaciniais tarpsniais. Didžiausias fenolinių junginių kiekis lapuose nustatytas butonizacijos metu (07.02) – 56,97 ± 0,28 mg/g. Žieduose didžiausias fenolinių junginių kiekis (27,61 ± 0,26 mg/g) nustatytas žydėjimo pradžioje (07.16). Tai beveik 2,06 kartus mažesnis fenolinių junginių kiekis lyginant su lapais. Šaknyse masinio atžėlimo ir butonizacijos tarpsniuose nustatyti fenolinių junginių kiekio maksimumai (atitinkamai 18,43 ± 0,39 mg/g ir 18,41 ± 0,36 mg/g) beveik 3 kartus mažesni lyginant su lapais ir beveik 1,5 kartus mažesnis lyginant su žiedais. Stiebuose bendras fenolinių junginių kiekio maksimumas nustatytas masinio atžėlimo vegetaciniame tarpsnyje – 17,17 ± 0,21 mg/g. Šis kiekis net 3,31 kartą mažesnis lyginant su lapais ir 1,6 kartus – su žiedais. Palyginus nustatytus bendrus fenolinių junginių kiekius tarp dirvinių usnių organų galima teigti, kad daugiausia fenolinių junginių kaupiama lapuose, o mažiausiai – stiebuose.
Mokslininkai 2008 metais tyrė 5 usnių rūšis. Buvo ištirtas dirvinių usnių lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų bendras fenolinių junginių kiekis taikant Folin-Ciocalteu metodą. Nustatyta, kad dirvinių usnių žieduose bendras fenolinių junginių kiekis siekė 192 mg/g, o lapuose – 52 mg/g [68]. Šio mokslinio tyrimo rezultatus lyginant su šiame tyrime gautais rezultatais lapuose gautas panašus fenolinių junginių kiekis, o žieduose beveik 7 kartus mažesnis kiekis.
Mokslininkai atliko tyrimą (2008 m.), kurio metu buvo ištirtas bendras fenolinių junginių kiekis 5 usnių rūšių lapų vandeniniuose ekstraktuose. Dirvinių usnių lapuose gautas bendras fenolinių junginių kiekis siekė 78 mg/g [17]. Lyginant su šiame tyrime gautais rezultatais, šiame tyrime gautas 1,37 karto mažesnis kiekis.
2015 metais mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu buvo ištirtos 61 vaistinių augalų rūšys surinktos skirtingose Pakistano vietovėse. Buvo pagaminti metanolio/chloroformo ir vandeniniai dirvinių usnių stiebų ekstraktai. Bendras fenolinių junginių kiekis ištirtas taikant Folin-Ciocalteu metodą. Metanolio/chloroformo dirvinių usnių stiebų ekstrakte nustatytas 20,8 ± 2,0 mg/g, o vandeniniame – 23,3 ± 2,1 mg/g bendras fenolinių junginių kiekis galo rūgšties ekvivalentais [69]. Lyginant abiejų tyrimų duomenis, šiame tyrime dirvinių usnių stiebuose nustatytas apytiksliai 1,28 kartus mažesnis bendras fenolinių junginių kiekis.
Atsižvelgiant į gautus rezultatus, galima teigti, kad vegetacijos tarpsniai turi įtakos fenolinių junginių kiekiui dirvinių usnių organuose. Lyginant dirvinių usnių organuose (lapuose, žieduose, stiebuose, šaknyse) nustatytą bendrą fenolinių junginių kiekį, nustatyta, kad daugiausia šių junginių sukaupiama lapuose. Lyginant su kitais moksliniais darbais, gauti skirtumai tarp gauto fenolinių junginių kiekio dirvinės usnies žaliavose gali būti siejami su skirtinga augalų geografine kilme, augavietės ypatumais, klimatinėmis sąlygomis, ekstrakcijos sąlygomis ir kitais veiksniais. Literatūroje
trūksta duomenų kokiais augalo vegetaciniais tarpsniais buvo rinkta tyrimams naudojama vaistinė augalinė žaliava.
3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas dirvinių usnių lapų, žiedų, stiebų ir
šaknų ekstraktuose.
Bendras flavonoidų kiekis dirvinių usnių organuose visose augavietėse įvairuoja, tačiau nenustatyti reikšmingi skirtumai tarp augaviečių. Vegetacijos tarpsniai ženkliai įtakoja bendrą flavonoidų kiekį dirvinių usnių lapuose, žieduose, stiebuose ir šaknyse.
Dirvinių usnių lapuose flavonoidų kiekio maksimumai nustatyti butonizacijos tarpsnyje (07.02) ir žydėjimo pabaigoje (08.29)( atitinkamai 11,65 ± 0,49 mg/g ir 10,83 ± 0,33 mg/g) (p<0,05). Mažiausias bendras flavonoidų kiekis lapuose nustatytas masinio atžėlimo (06.18) ir sėklų brandinimo metu (09.10) (atitinkamai 8,18 ± 0,31 mg/g ir 8,55 ± 0,21 mg/g) (p<0,05). Atlikus statistinę analizę žydėjimo pradžios ir masinio žydėjimo vegetacijos laikotarpiuose (07.16-08.13) nenustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp bendro flavonoidų kiekio dirvinių usnių lapuose (14 paveikslas).
14 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių lapuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
Žieduose reikšmingai didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas masinio žydėjimo metu (07.31) – 15,29 ± 0,34 mg/g, o mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas butonizacijos tarpsnyje (07.02) – 7,07 ± 0,21 mg/g (p<0,05). Statistiškai įvertinus nustatytos statistiškai reikšmingo skirtumo neturinčios reikšmės žydėjimo pradžioje (07.16) ir pabaigoje (08.29) (15 paveikslas).
0 2 4 6 8 10 12 14 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 B en dr as fl avon oi dų k ie ki s (m g/ g)
15 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių žieduose vegetacijos metu (liepos – rugpjūčio mėn.)
Stiebuose reikšmingai didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas butonizacijos metu (07.02), o mažiausias – sėklų brandos tarpsnyje (atitinkamai 4,93 ± 0,12 mg/g ir 2,06 ± 0,09 mg/g) (p<0,05) (16 paveikslas).
16 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių stiebuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
Šaknyse bendro flavonoidų kiekio maksimumai nustatyti butonizacijos (07.02), žydėjimo pradžios (07.16) ir masinio žydėjimo metu (07.31) (atitinkamai 2,41 ± 0,35 mg/g, 2,27 ± 0,26 mg/g ir 2,16 ± 0,12 mg/g) (p<0,05). Bendro flavonoidų kiekio minimumai nustatyti masinio atžėlimo (06.18), masinio žydėjimo (08.13) ir žydėjimo pabaigoje (08.29) (atitinkamai 1,76 ± 0,12 mg/g, 1,69 ± 0,14 mg/g ir 1,66 ± 0,09 mg/g) (p<0,05) (17 paveikslas). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 B en dr as fl avon oi dų k ie ki s (m g/ g)
Žaliavos rinkimo data
0 1 2 3 4 5 6 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 B en dr as fl avon oi dų k ie ki s (m g/ g)
17 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių usnių šaknyse vegetacijos metu (biržėlio – rugsėjo mėn.)
Palyginus visus dirvinių usnių organus didžiausias bendras flavonoidų kiekis žieduose nustatytas masinio žydėjimo metu (07.31) ir siekia 15,29 ± 0,34 mg/g. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis dirvinių usnių lapuose, stiebuose ir šaknyse nustatytas butonizacijos tarpsnyje. Dirvinių usnių lapuose didžiausias flavonoidų kiekis (11,65 ± 0,49 mg/g) beveik 1,3 kartus mažesnis už kiekį nustatytą žieduose. Stiebuose nustatytas didžiausias bendras flavonoidų kiekis yra 4,93 ± 0,12 mg/g ir tai yra 3,1 kartą ir 2,4 kartus mažesnis kiekis nei žieduose ir lapuose. Mažiausias flavonoidų kiekis sukauptas šaknyse – 2,41 ± 0,35 mg/g. Šis kiekis 6,3 kartus mažesnis nei žieduose, 4,8 kartus nei lapuose ir beveik dvigubai mažesnis nei flavonoidų kiekis stiebuose.
2015 metais mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu buvo ištirtos 61 vaistinių augalų rūšys surinktos skirtingose Pakistano vietovėse. Buvo pagaminti metanolio/chloroformo ir vandeniniai dirvinių usnių stiebų ekstraktai. Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatytas taikant kolorimetrinį aliuminio chlorido metodą. Atlikus tyrimą nustatytas bendras flavonoidų kiekis metanolio/chloroformo dirvinių usnių stiebų ekstrakte siekė 23,9 ± 2,6 mg/g, o vandeniniame – 7,9 ± 2,0 mg/g [69]. Lyginant gautus rezultatus, šiame tyrime nustatytas bendras flavonoidų kiekis dirvinių usnių stiebų etanoliniame ekstrakte lyginant su metanolio/chloroformo ekstraktu beveik 4,8 kartus, o su vandeniniu -1,6 kartus mažesnis.
Nustatyta, kad dirvinių usnių organuose rinktuose skirtingu laiku bendras flavonoidų kiekis skiriasi. Galima daryti išvada, kad vegetacijos tarpsniai turi įtakos šių junginių kiekiui. Lyginant su kitais moksliniais darbais, gauti skirtumai tarp gauto bendro flavonoidų kiekio dirvinės usnies žaliavose. Augalų geografinė kilmė, augavietės ypatumai, klimatinės sąlygos, fenologiniai tarpsniai, ekstrakcijos sąlygos ir kiti veiksniai lemia nustatytus šių junginių kiekius augalinėse žaliavose.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 B en dr as fl avon oi dų k ie ki s (m g/ g)
3.4. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas dirvinių usnių lapų, žiedų, stiebų ir
šaknų ekstraktuose ABTS metodu
Reikšmingai didžiausias antiradikalinis aktyvumas dirvinių usnių lapuose nustatytas butonizacijos tarpsnyje (07.02) ir siekia 183,92 ± 2,51 µmol/g (p<0,05). Mažiausia antiradikalinio aktyvumo reikšmė (97,11 ± 3,54 µmol/g) pasiekta sėklų brandinimo metu (09.10) (p<0,05). Statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas tarp 06.18–08.13 ir 07.16–07.31 lapų ėminiuose nustatyto antiradikalinio aktyvumo (18 paveikslas). Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys tarp lapuose nustatyto bendro fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo (R=0,929; p<0,05).
18 pav. Laisvųjų radikalų surišimo (TE, µmol/g) įvairavimas dirvinių usnių lapuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
Žieduose antiradikalinio aktyvumo maksimumai nustatyti žydėjimo pradžioje (07.16) – 119,21 ± 3,52 µmol/g. ir masinio žydėjimo metu (08.13) – 113,93 ± 3,59 µmol/g. Mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas butonizacijos tarpsnyje (07,02) ir siekia 89,76 ± 3,93 µmol/g (19 paveikslas). Nustatyta statistiškai reikšminga koreliacija tarp fenolinių junginių žieduose ir antiradikalinio aktyvumo (R=0,800, p<0,05). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 TE, µ m o l/ g
19 pav. Laisvųjų radikalų surišimo (TE, µmol/g) įvairavimas dirvinių usnių žieduose vegetacijos metu (liepos – rugpjūčio mėn.)
Nustatyti du antiradikalinio aktyvumo maksimumai dirvinių usnių stiebuose. Žydėjimo pradžioje (07.16) nustatyta 43,69 ± 4,03 µmol/g ir sėklų brandinimo tarpsnyje (09.10) nustatyta 42,08 ± 2,67 µmol/g (p<0,05). Mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu (07.31) – 21,89 ± 2,43 µmol/g (p<0,05). Nustatytas statistiškai reikšmingas antiradikalinio aktyvumo sumažėjimas tarp žydėjimo pradžios (07.16) ir masinio žydėjimo (07.31) tarpsnių. 43,69 ± 4,03 µmol/g (20 paveikslas).
20 pav. Laisvųjų radikalų surišimo (TE, µmol/g) įvairavimas dirvinių usnių stiebuose vegetacijos metu (birželio – rugsėjo mėn.)
Šaknų ekstraktuose didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas vegetacijos pradžioje: masinio atžėlimo metu (06.18)–60,07 ± 3,58 µmol/g ir butonizacijos metu (07.02) – 60,70 ± 4,01
0 20 40 60 80 100 120 140 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 TE, µ m o l/ g
Žaliavos rinkimo data
0 10 20 30 40 50 60 06-18 07-02 07-16 07-31 08-13 08-29 09-10 TE, µ m o l/ g
