LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
NEUŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA
Akvil÷ Baranauskait÷
KLINIŠKAI SVEIKŲ KALIŲ MAKŠTIES CITOLOGINIAI POKYČIAI RUJOS
METU
Veterinarin÷s medicinos magistrinis baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Dr. Vytuolis Žilaitis
Magistro baigiamasis darbas rengtas 2011 02 – 2013 02 Lietuvos sveikatos mokslių universiteto Veterinarijos akademijoje, Neužkrečiamųjų ligų katedroje
.
Mokslinio darbo vadovas:
Prof. Dr. Vytuolis Žilaitis (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademija, veterinarin÷ medicina – 02 A)
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kliniškai sveikų kalių makšties citologiniai pokyčiai rujos metu“:
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. Akvil÷ Baranauskait÷
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Akvil÷ Baranauskait÷
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros ved÷jo vardas, pavard÷) (parašas Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s (– riaus) parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (parašas) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SUMMARY ... 6
ĮVADAS ... 7
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Makšties histologija ir citologija ... 9
1.2. Kalių reprodukcin÷ sistema ... 9
1.2.1 Priešrujis (proestrus) ... 10
1.2.2 Ruja (estrus) ... 11
1.2.3 Porujis (metestrus)... 12
1.2.4 Ramyb÷s periodas (anestrus)... 12
1.3 Endokrinin÷ lytinio ciklo reguliacija ... 12
1.4 Reprodukcin÷s sistemos sutrikimai ... 14
2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 16
3. TYRIMŲ REZULTATAI... 20
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 26
IŠVADOS... 27
SANTRUMPOS
SCI – makšties paviršinių epitelinių ląstelių indeksas
KPI – makšties paviršinių surag÷jusių epitelinių ląstelių indeksas LH – liuteinizuojantis hormonas
FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas
GnRH
–
gonadotropino atpalaiduojantis hormonas proc. – procentair – koreliacija p – patikimumas
VAGINAL CYTOLOGY CHANGES DURING ESTRUS PERIOD OF THE CLINICAL HEALTHY BITCHES
Student Akvil÷ Baranauskait÷/supervisor prof. dr. V. Žilaitis
Department of Noninfectious Diseases, Veterinary Academy, Lithuanian University of Health Sciences, 2013
SUMMARY
In particular periods of the year the bitches exhibit 1 – 2 estruses. This frequency depends on specific factors like breed, management conditions ant etc. The sexual cycle of bitches composed of proestrus, estrus, metestrus and anestrus stages. The increased concentration of estrogen during the proestrus period causes the vaginal epithelium proliferation and cornification. Vaginal cytology changes are very useful to determine canine estrus cycle stages and ovulation time. Vaginal cytology is a simple and inexpensive procedure that allows us to determine the stage of the reproductive cycle and ovulation time in bitches.
Investigations were carried out 2011 – 2012 years. The aim of this study was to determine vaginal cytology changes during different stages of the sexual cycle of the clinical healthy bitches. A total of 15 (5 small breeds, 5 medium breeds and 5 large breeds) clinical healthy bitches, belonging to different breeders and owners, have been examined. Only sexual mature bitches were used in this study. The samples were begin collected at the time of appearance of vulvar bloody discharge (it was considered as the first day of proestrus) in series 25 days. The samples were collected using cotton swab technique. The cotton was moistened with 1 – 2 drops of the sterile NaCl saline (0.9%). The moistened swab was introduced at the most dorsal point of the vulvar cleft and angled upward at a 45–degree angle. The swab was rolled between fingers in the deepness of the vagina and pulled straight out. The swab was rolled several times over a clean glass slide. The prepared smears were air–dried and stained with May Grunwald – Giemsa stain. The vaginal smear samples were evaluated using light microscope. Neutrophils, erythrocytes and all of the vaginal epithelium cells (parabasal, intermediate and superficial) were counted. The statistical analysis of the data shows that breed of the bitches has not influence on vaginal cytology changes (p<0.05). The time of the reproductive cycle has the most influence on number of parabasal, superficial epithelium cells and erithrocytes (p<0.001). The most vaginal cytology changes were determined on proestrus and metestrus. Whan cornified cells index reaches more than 80 percents it is optimal time for breeding.
ĮVADAS
Šiuolaikiniame pasaulyje yra daugiau nei 400 įvairiausių šunų veislių. Veis÷jų didžiausia užduotis yra išsaugoti ir gerinti veisl÷s savybes, bei gauti kuo daugiau palikuonių. Labai opi problema yra tikslus kergimo laiko nustatymas, nes, pavyzdžiui, besendžių ir Tibeto mastifų veislių kal÷s rujoja tik kartą metuose (Beijerink, 2007). Lytinio ciklo stadijos nustatymas yra vienas svarbiausių aspektų kalių reprodukcijoje. Tai gali būti nustatoma stebint klinikinius, endoskopinius, ultrasonografinius, endokrinologinius bei citologinius pokyčius (Aydin et al., 2011).
Kal÷s paprastai rujoja 1—2 kartus metuose. Laikas nuo vienos rujos iki kitos (interestrus) trunka nuo 4 – 13 m÷nesių (vidutiniškai 7). Kai kurių mažųjų veislių kal÷s rujoja 3 – 4 kartus per metus, kai tuo tarpu didžiųjų veislių tik vieną. Ruja gali pasitaikyti bet kuriuo metų laiku, tačiau pasteb÷ta, kad kal÷s dažniausiai rujoja pavasarį ir rudenį. Kalių lytinis ciklas skirstomas į šias stadijas: priešrujis (proestrus), ruja (estrus), porujis (metestrus) ir ramyb÷s laikotarpis (anestrus). Lyginant su kitų naminių gyvulių patel÷mis, kalių lytinis ciklas trunka labai ilgai. (Johnston et al., 2001, Davidson, 2010, Ajala et al., 2012).
Ovuliacijos laiko nustatymas padeda pasirinkti tinkamą kergimo laiką, tai turi didel÷s įtakos kal÷s apvaisinimui, bei vados dydžiui, taip pat ovuliacijos laiko žinojimas leidžia nustatyti tikslų šuningumo periodą, kuris yra labai svarbus veisimo valdymui (Davidson, 2010;Marti, 2008; Carreira et al., 2011 ). Kal÷ms ovuliacija įvyksta vidutiniškai 12 parą nuo priešrujo pradžios, tod÷l plačiai paplitusi tendencija, kad būtent ši diena yra optimaliausia kergimui, tačiau kai kurioms kal÷ms ovuliacija įvyksta daug anksčiau –8, 6 ar netgi 4 parą nuo priešrujo pradžios, o kitoms v÷lai – 17 ar net 24 parą. Tod÷l negalima teigti, kad kalei ovuliacija įvyks 12 ciklo parą, kol tai n÷ra įrodyta (Romagnoli, 2008).
Vienas iš optimalaus kergimo laiko nustatymo metodų yra makšties citologinis tyrimas. Šis metodas yra naudojamas praktikoje, tod÷l, kad yra paprastas, pigus ir pakankamai patikimas. Makšties epitelio audinys yra kaip taikinys kiaušidžių hormonams. Padid÷jusi estrogenų koncentracija priešrujo metu sukelia makšties epitelio ląstelių pokyčius, kurie stebimi kaip progresuojantis epitelio ląstelių rag÷jimas. Pilnas epitelio ląstelių rag÷jimas stebimas nuo priešrujo pabaigos iki porujo pradžios, kuris prasideda 7 –10 dieną po LH piko (Davidson, 2010).
Lytin÷s dominant÷s eigą galima vertinti pagal paviršinių epitelinių ląstelių (SCI) ir ląstelių surag÷jimo indeksus (KPI). SCI parodo santykį išreikštą procentais tarp paviršinių ir visų epitelinių ląstelių, o KPI tarp surag÷jusių ir visų paviršinių ląstelių. Kai SCI priart÷ja prie 100 proc. vert÷s, tai žymi priešrujo pabaigą ir rujos pradžią, toks lygis išlieka beveik iki pat porujo. KPI priart÷jimas prie 80
proc. žymi rujos pradžią, o tolesnis reikšm÷s did÷jimas ir art÷jimas link 100proc. rodo ovuliaciją (Post, 1985).
Darbo tikslas.
Įvertinti kliniškai sveikų kalių makšties citologinius pokyčius prieš lytinę dominantę ir po jos.
Darbo uždaviniai.
1. Apibendrinti literatūrinius duomenis apie kalių makšties citologinius pokyčius ir jų sąsają su lytinio ciklo stadija ir optimalaus kergimo laiku.
2. Įvertinti makšties citologinius pokyčius priklausomai nuo rujos stadijos.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Makšties histologija ir citologija
Makštis tai raumeninis vamzdinis organas, besitęsiantis nuo gimdos kaklelio iki makšties prieangio. Per visą makšties ilgį yra išsid÷stę išilgin÷s gleivin÷s raukšl÷s. Priklausomai nuo lytinio ciklo stadijos kinta makšties epitelio aukštis ir struktūra. Rujos metu padid÷ja išskiriamų gleivių kiekis, bei įvyksta epitelinių ląstelių rag÷jimas. Šis reiškinys ryškiausiai matomas m÷s÷džiams ir graužikams, o atrajotojams ne toks žymus, d÷l nedidelio išskiriamo estrogenų kiekio. Makšties sieną sudaro trys sluoksniai: gleivin÷, raumeninis ir serozinis (vietomis adventicija) sluoksniai. Gleivin÷ yra sudaryta iš daugiasluoksnio plokščiojo nerag÷jančio epitelio, kuris sustor÷ja priešrujo ir rujos metu (Dellmann ir Brown, 1976).
Makšties epitelio citologinis tyrimas yra paprasta, greita, neinvazyvi ir nebrangi procedūra, leidžianti nustatyti reprodukcinio ciklo laiką kal÷ms, bei kai kurias genitalinio trakto patologijas (hormoninius sutrikimus, uždegiminius ar neoplastinius susirgimus). Atliekant makšties citologinį tyrimą vertinamas eritrocitų, neutrofilų ir predominuojančių epitelinių ląstelių kiekis. Neutrofilų buvimas folikulin÷s faz÷s metu sukelia prieštaringą nuomonę, nes vieni mokslininkai teigia, kad neutrofilai charakterizuojami tik priešrujo metu, o rujos periodu jų neturi būti, o kiti laikosi nuomon÷s, kad neutrofilai gali pasitaikyti visos folikulin÷s faz÷s metu. Paprastai eozinofilai randami retai. Sveikoms kal÷ms makšties citologiniame tepin÷lyje dažnai aptinkamos bakterijos, tod÷l galima teigti, kad makšties gleivin÷ fiziologiškai n÷ra sterili. Aerobinių ir anaerobinių mikroorganizmų mišri populiacija makštyje aptinkama 60 proc. sveikų kalių (Groppetti ir kt., 2012).
1.2. Kalių reprodukcin÷ sistema
Kalių lytinis ciklas yra unikalus lyginant su dauguma kitų naminių gyvūnų patelių, d÷l priešovuliacinio progesterono koncentracijos kilimo, oocitų subrendimo tik įvykus ovuliacijai, bei d÷l to, kad kalių oocitai išlieka gyvybingi net iki 5 parų (Concannon et Verstegen, 2005).
Per metus kal÷s vidutiniškai rujoja 1 – 2 kartus. Šis dažnumas priklauso nuo veisl÷s, geografin÷s pad÷ties ir priežiūros sąlygų, kurios yra vienos svarbiausių (Turmalaj et al., 2011). Didžioji dauguma kalių lytiškai subręsta 6 – 18 m÷nesių amžiaus, tačiau kai kurioms didžiųjų veislių kal÷ms lytin÷ branda prasideda tik 24 m÷nesių amžiaus. Pirmą kartą kal÷s surujoja po kelių m÷nesių, kuomet pasiekia veislei
būdingą aukštį ir svorį. Dažniausiai pirma ruja būna „tyli“, be ryškių požymių, tod÷l labai sunku nusp÷ti tikslų pirmos rujos laiką (Johnston et al.,2001). Intervalas tarp dviejų rujų (laikas nuo vieno priešrujo pradžios iki kito priešrujo) kal÷ms priklauso nuo veisl÷s, bei individualių savybių. (Beijerink, 2007). Kalių, vyresnių nei 8 metai amžiaus, lytinio ciklo trukm÷ ir dažnumas tampa nereguliarūs, bei pailg÷ja tarprujo laikotarpis (Ettinger et Feldman, 2005). Taip pat didel÷s reikšm÷s turi aplinkos faktoriai, pavyzdžiui, kalę, kuri yra ramyb÷s periode, laikant kartu su rujojančia kale, ji gali surujoti po kelių savaičių. Pasteb÷ta, kad kal÷s, laikomos namuose kartu, rujoja panašiu metu. (Beijerink, 2007).
Rujos ciklas skirstomas į keturias fazes: priešrujis (5 – 20 dienų), ruja (5 – 15 dienų), porujis (50 – 80 dienų) ir ramyb÷s periodas (80 – 240 dienų) (Concannon, 2011). Taip pat egzistuoja skirstymas pagal kiaušid÷s funkcionavimą į folikulinę (jos metu įvyksta ovuliacija), liuteininę, bei ramyb÷s (anestrus) fazes (žr. Pav.1).
1.2.1 Priešrujis (proestrus)
Priešrujis, tai laikas kuomet kal÷ traukia patinus, tačiau nesileidžia kergiama. Vidutiniškai tai trunka 9 dienas, tačiau svyruoja nuo 3 – 17 dienų. Ankstyvieji kal÷s lytinio elgesio pokyčiai dažniausiai
lieka nepasteb÷ti, tod÷l priešrujo pirmoji diena skaičiuojama nuo kraujingų išskyrų pasirodymo iš makšties (Ettinger and Feldman, 2005).
Augantys kalių kiaušidžių folikulai produkuoja estradiolį, tod÷l priešrujo pabaigoje pasiekiamas estradiolio plazmos koncentracijos pikas. D÷l padid÷jusios estradiolio plazmos koncentracijos matomi tokie išoriniai priešrujo požymiai kaip vulvos hiperemija ir edema. Taip pat padid÷jusi estradiolio koncentracija sukelia gimdos ragų hiperemiją, gimdos kaklelio padid÷jimą bei makšties sienos sustor÷jimą (Beijerink, 2007).
Gerai žinomas fenomenas kal÷ms yra endometrinis kraujavimas priešrujo metu, tod÷l šiuo laikotarpiu būdingas didelis eritrocitų skaičius makšties išskyrose (tačiau kai kuriais atvejais eritrocitų aptinkama rujos ir porujo metu) (Walter et al., 2011).
Priešrujo metu galima aptikti visas makšties epitelio ląsteles nuo parabazinių iki paviršinių surag÷jusių ląstelių. D÷l vykstančios makšties epitelio proliferacijos ir rag÷jimo, makšties epitelinių ląstelių profilis keičiasi iš dominuojančių parabazinių į pirmiausia mažas, v÷liau dideles tarpines ir galiausiai surag÷jusias paviršines epitelines ląsteles, taip pat sumaž÷ja neutrofilų kiekis, nes sustor÷jus epiteliui, užkertamas kelias jų per÷jimui (Concannon, 2011, Davidson, 2010). Makšties epitelinių ląstelių tipai klasifikuojami pagal tai, kurį paviršinio epitelio sluoksnį sudaro (žr. Pav.4):
• Parabazin÷s (parabazale) ląstel÷s –tai mažiausios epitelin÷s ląstel÷s matomos tepin÷lyje, nes pamatin÷s ląstel÷s sudaro pamatinę membraną ir fiziologiškai neatsiskiria. Parabazin÷s ląstel÷s yra apvalios–ovalios formos, turinčios apvalų branduolį ir nedidelį kiekį tamsiai m÷lynos citoplazmos. Visos parabazin÷s ląstel÷s atrodo vienodos formos. • Tarpin÷s ląstel÷s (intermediate) –jos paprastai yra dvigubai didesn÷s nei parabazin÷s
ląstel÷s, turi daugiau citoplazmos. Tarpinių epitelinių ląstelių dydis ir citoplazmos kiekis kinta priklausomai nuo rujos laiko.
• Paviršin÷s (superficiate) ląstel÷s –tai pačios didžiausios epitelin÷s ląstel÷s matomos tepin÷lyje. Jos turi daug šviesios citoplazmos, kampuotos netaisyklingos formos. V÷liau, prasid÷jus ląstelių rag÷jimui, jų branduolys pamažu nyksta, pasidaro piknotiškas, kol galiausiai ląstelei pilnai surag÷jus branduolys išnyksta visiškai (Teske, 2009).
1.2.2 Ruja (estrus)
Ruja trunka nuo 3 parų iki 3 savaičių, šiuo metu kal÷ patinui rodo d÷mesį ir norą poruotis, ji meilinasi jam, bei bando imituoti patino vaidmenį šokin÷dama ir jodama ant jo. Taip pat vaisingo
periodo metu esant patinui, kal÷ refleksiškai pakelia pasturgalį išlenkia nugarą ir kelia uodegą (Ford et Mazzaferro, 2012). Rujos pradžia siejama su LH banga, po kurios pra÷jus 2 – 3 paroms įvyksta ovuliacija. Makšties išskyrų kiekis paprastai sumaž÷ja ir jos tampa rusvos spalvos, o vulva išlieka padid÷jusi, tačiau šiek tiek sumaž÷ja turgoras. Makšties išskyrose dominuoja paviršin÷s epitelin÷s ląstel÷s, kurių skaičius siekia 80 – 100 proc., neutrofilų paprastai n÷ra, gali pasitaikyti keli eritrocitai (Marti, 2008).
Kalių vaisingas periodas būna tuomet, kai gimdos raguose subręsta gyvybingi oocitai. Dvi paros prieš ovuliaciją ir keturios po jos (LH piko diena ir 6 paros po jos) laikoma optimaliu kergimo laiku, kuomet taikomas natūralus kergimas arba s÷klinimas šviežia sperma (Concannon, 2011).
1.2.3 Porujis (metestrus)
Porujis vidutiniškai trunka 2 –3 m÷nesius tuo atveju, jei kal÷ nebuvo apvaisinta ir 65 +/– 2 paras nuo LH piko, jei kal÷ buvo šuninga. Šiuo periodu kal÷ nustoja traukti patinus, ir nebesileidžia kergiama. Sumaž÷ja išskyrų kiekis, bei vulvos edema (Marti, 2008).
Porujo pradžią žymi neutrofilų antplūdis, bei staigus epitelinių ląstelių pokytis iš paviršinių į tarpines ir parabazines ląsteles (Post K., 1985). Šiuo periodo metu šuningoms kal÷ms išsivysto pieno liaukos, tačiau d÷l didelio progesterono kiekio, tai gali įvykti ir neapvaisintoms kal÷ms (tariamas n÷štumas) (Marti, 2008).
1.2.4 Ramyb÷s periodas (anestrus)
Ramyb÷s periodas vidutiniškai trunka nuo 1 – 6 m÷nesių, jo metu vyksta gimdos ir endometriumo atsistatymas, o kiaušid÷s paprastai būna neaktyvios. Sveikos kal÷s šiuo laikotarpiu patinų netraukia, ir jų neprisileidžia, makšties gleivin÷ lygi, plona, rausvos spalvos, išskyrų kiekis labai nedidelis, citologiškai jose dominuoja parabazin÷s ląstel÷s, randami pavieniai neutrofilai ir nedidelis kiekis mišrios bakterin÷s mikrofloros. Sezoniškumas per÷jimui iš ramyb÷s faz÷s į folikulinę neturi didel÷s įtakos, tod÷l tai gali įvykti bet kuriuo metu (Davidson, 2010; Blendinger, 2007).
1.3 Endokrinin÷ lytinio ciklo reguliacija
Kalių rujos ciklas yra žymiai ilgesnis nei daugumos kitų patelių. Folikulin÷ faz÷ ir spontanin÷ ovuliacija įvyksta po liuteinin÷s faz÷s, kuri vidutiniškai trunka 2 m÷nesius, nepriklausomai patel÷ buvo apvaisinta ar ne. Nesezoniškas ramyb÷s periodas gali trukti nuo 2–10 m÷nesių po kiekvieno rujos ciklo.
Hipotalamusas, hipofiz÷ ir kiaušid÷s patel÷ms vaidina svarbiausią vaidmenį reprodukcijos reguliavime. Priešrujo metu GnRh poveikyje priekin÷ hipofiz÷s dalis išskiria LH ir FSH, kurie stimuliuoja folikulų vystymąsi (Beijerink N.J., 2007).
Padid÷jęs plazmos estradiolio kiekis, d÷l padid÷jusio kiaušid÷s folikulo aktyvumo priešrujo metu, įtakoja tokius kalių elgesio pokyčius kaip žym÷jimą, nerimastingumą, nepaklusnumą, bei patinų trauką. Estradiolis skatina įvairius reprodukcin÷s sistemos procesus, jis stimuliuoja liaukinio epitelio augimą ir aktyvumą, skatina gleivin÷s vaskuliariškumą bei edemą, ko pas÷koje v÷liau gleivin÷s kapiliarai tampa silpni ir pro pralaidžias epitelio jungtis kraujo plazma ir ląstel÷s patenka į gimdos spindį, kas v÷liau matoma kaip kraujingos išskyros iš makšties. Reprodukcinio trakto edema stebima ultrasonografinio echogeniškumo sumaž÷jimu. Taip pat po estradiolio stimuliacijos stebima ryški epitelio proliferacija makšties išskyrose. Makšties paviršinio epitelio ląstelių vertinimas suteikia daug informacijos apie rujos ciklo stadiją (Simpson et al., 1998). Estrogenų kiekio kilimas priešrujo metu įtakoja padid÷jusį
makšties epitelio ląstelių subrendimo greitį, kas pasireiškia ląstelių keratinizacija ir rag÷jimu. Pilnas surag÷jimas tęsiasi visą rujos laiką iki pat porujo, kuris įvyksta vidutiniškai 7 – 10 parą po LH piko. Per 24 – 36 valandas nuo porujo pradžios, vyravęs paviršinių ląstelių vaizdas keičiasi į 50 proc. nesubrendulių ląstelių (parabazinių ir tarpinių) profilį (Ettinger and Feldman, 2005).
Kal÷ms, kaip ir kitiems naminiams gyvūnams, pra÷jus dienai ar dviem po estradiolio plazmos koncentracijos piko, seka LH pikas. LH pikas įvyksta automatiškai, kai pasiekiamas tam tikras folikulo aktyvumo lygis, bei estradiolio gamyba. Žymus LH koncentracijos kilimas nuo bazin÷s vert÷s įvyksta
per 24 – 48 valandas, o po jo seka staigus maž÷jimas. LH pikas iššaukia ovuliaciją, kuri įvyksta spontaniškai priešingai nei katinių ar kiaunių šeimos patelių, kurioms LH paleidimą ir ovuliaciją sukelia kopuliacija. FSH taip pat reikalingas stimuliuojant folikulų vystymąsi bei estradiolio sekreciją, bet cirkuliuojantis FSH neveikia taip ženkliai kaip LH, nes folikulai išskiria inhibiną, kuris slopina FSH sekreciją. Nepaisant to, FSH vaidina svarbų vaidmenį folikulų subrendime ir paruošia folikulo ląsteles virtimui į geltonąjį kūną po ovuliacijos. Priešovuliacinio folikulo sekretuojamo progesterono koncentracijos kilimas vaidina svarbią rolę sukeliant ovuliaciją. Padid÷jusi plazmos progesterono koncentracija prieš ovuliaciją yra neįprasta lyginant su kitų naminių gyvūnų patel÷mis, ypatingai atrajotojų, kurioms progesterono koncentracija turi būti minimali, kad įvyktų ovuliacija (Simpson et al., 1998).
Progesterono lygio kilimas prasideda praktiškai nuo LH piko. Did÷jant progesterono koncentracijai, maž÷ja estrogenų kiekis, bei vulvos ir makšties edema. Kiti klinikiniai požymiai minimalūs. Nagrin÷jant progesterono kiekį patel÷ms reprodukcinio ciklo metu tapo aišku, kad n÷ra absoliučios progesterono koncentracijos vert÷s, kuri nurodytų tiklslią ciklo stadiją. Progesterono kiekis LH piko metu varijuoja 0.8 – 3 ng/ml, ovuliacijos metu nuo 1 – 8 ng/ml, o vaisingu periodu nuo 4 – >20 ng/ml (Davidson A.P, 2010). Norint gauti tikslesnius rezultatus ovuliacijos ir veisimo laikui nustatyti, siūloma atlikti makšties citologinį tyrimą kartu su plazmos progesterono koncentracijos nustatymu. Idealiausias laikas kergimui būna tada, kai kylantis progesterono lygis koreliuoja su surag÷jusių epitelinių ląstelių skaičiumi (Meuten et al., 2005; Carreira et al., 2011).
1.4 Reprodukcin÷s sistemos sutrikimai
Kai kuriais atvejais pasteb÷jus kraujingas išskyras iš makšties daromos klaidingos išvados, kad kal÷ prad÷jo rujoti, nes tokios pat išskyros gali būti vaginito, metrito, makšties pašalinių kūnų, traumos ar navikų požymis, taip pat kraujavimas pasitaiko hemofilijos, hemolitinių nuodų apsinuodijimo, babezioz÷s atvejais. Diferencijuoti sutrikimus nuo priešrujo padeda makšties epitelio citologijos analizavimas (Simpson et al., 1998; Kustritz, 2006).
Lytinių organų bakterin÷s infekcijos nevaisingoms kal÷ms paprastai būna subklinikin÷s formos, tačiau retais atvejais pasireiškia akivaizdžiai pastebimu vaginitu, metritu, piometra ar sistemine infekcija. Kliniškai sveikų kalių makšties prieangyje ir makštyje vyrauja mišri bakterin÷ flora, kurią sudaro aerobin÷s ir anaerobin÷s bakterijos, tod÷l esant pirminei infekcijai labai sunku atskirti patogenines bakterijas nuo normalios makšties floros. Kal÷s vaginitu serga nepriklausomai nuo
amžiaus, veisl÷s ar lytinio ciklo stadijos. Dažniausi makšties uždegimo požymiai yra pūlingos išskyros, dažnas šlapinimasis, bei dažnas vulvos laižymas. Vaginito atveju tepin÷lyje matyti nesurag÷ję epitelin÷s ląstel÷s ir gausyb÷ degeneruotų ir nedegeneruotų neutrofilų (John et al., 2011). Piometros atveju klinikiniai požymiai koreliuoja su degeneruotų neutrofilų ir bakterijų buvimu makšties išskyrose. Poliuriją sukelia E.coli endotoksinai, kurie veikia antagonistiškai antidiuretiniui hormonui (Meuten et al., 2005).
Užsitęsusi ruja arba ramyb÷s periodas paprastai nustatomas vyresnio amžiaus kal÷ms, o dažnas rujojimas (3–4 ciklai per metus) įvairaus amžiaus kal÷ms ir dažnai siejamas su nevaisingumu, tačiau šis mechanizmas dar n÷ra iki galo aiškus. Ovuliacijos nebuvimas ciklo metu pasitaiko gana dažnai tiek lytiškai nesubrendusioms, tiek ir subrendusioms kal÷ms. Nors ciklo metu neįvyksta ovuliacija, tačiau kal÷s lytinis elgesys būna visiškai normalus – ji traukia patinus, pastebimos būdingos išskyros iš makšties, kal÷ leidžiasi kergiama. Neįvykusi ovuliacija gali būti diagnozuojama nustatant žemą progesterono lygį po veisimo (Romagnoli, 2008).
Užsitęsęs priešrujis ir (ar) ruja nustatomi, kai kraujavimas iš makšties tęsiasi daugiau nei 28 paras iš eil÷s ir visą šį laiką kal÷ traukia patinus. Makšties citologija rodo 80 – 90 proc. paviršinių epitelinių ląstelių. Manoma, kad šį sutrikimą sukelia persistentin÷ estrogenų sekrecija arba per mažas progesterono lygis. Užsitęsusį estrogenų išskyrimą gali sukelti folikulų cistos ar navikai (Ettinger ir Feldman, 2005).
Kai kurių makšties ir vulvos navikų ląstel÷s lengvai atsiskiria ir gali būti diagnozuojamos atliekant citologinį tyrimą. Lytiškai plintančių navikų ląstel÷s būna apvalios su bespalve ar blyškiai m÷lyna citoplazma, kurioje matyti mažų intracitoplazminių vakuolių, bei įvairių mitotinių figūrų (Kustritz, 2006).
Pav. 3 Makšties tepin÷lio pa÷mimas ir perk÷limas ant objektinio stiklelio. (Nuotrauka daryta A. Baranauskait÷s, 2012)
2. MEDŽIAGOS IR METODAI
Tyrimai buvo vykdomi 2011 – 2012 metais Neužkrečiamųjų ligų katedroje. Tyrimai atlikti laikantis gyvūnų, skirtų eksperimentams ir kitiems mokslo tikslams, laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų, patvirtintų Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2008 12 18 įsakymu Nr. B1–639 (Žin., 2009, Nr. 287).
Tyrimo objektas. Tyrimui imti tepin÷liai buvo iš privačių augintojų ir laikytojų bei iš vieno veislyno auginamų kalių. M÷giniai imti iš 15 kliniškai sveikų, vidutinio įmitimo kalių, kurioms pasireišk÷ ruja. Pasirinktų tyrimui kalių amžius buvo 2 – 7 metai, visos tur÷ję bent po vieną vadą šuniukų, nei viena iš kalių tyrimo laikotarpiu nebuvo kergiama. Norint įvertinti citologinių pokyčių ir ciklo trukm÷s priklausomybę nuo kal÷s dydžio visos tiriamosios kal÷s buvo suskirstytos į tris grupes: mažųjų (<10kg), vidutinių (10–20kg) ir didžiųjų (>20kg) veislių.
Tyrimo eiga. Tinkama atlikimo technika yra labai svarbi, tam, kad tepin÷lyje esančios ląstel÷s atspind÷tų tikrąjį hormonin÷s stadijos vaizdą, tod÷l tepin÷liai buvo imami ne iš klitorin÷s duob÷s, makšties prieangio ar kaudalin÷s makšties dalies, bet iš kranialin÷s makšties dalies, tam, kad gauti rezultatai būtų tikslūs ir reprezentatyvūs. Tepin÷liai kiekvienai kalei buvo imami nuo pirmos priešrujo dienos (kai buvo pasteb÷tos pirmosios kraujingos išskyros iš makšties) 25 dienas iš eil÷s. Tyrimui buvo naudojami 10 cm ilgio mediniai vatos tampon÷liai (priklausomai nuo kal÷s dydžio) paimti m÷giniui, objektiniai stikliukai, dažai (May – Grunvald ir Giemsa), sterilus NaCl 0,9 proc. tirpalas, distiliuotas vanduo.
Tampon÷lis sudr÷kinamas 1–2 lašais sterilaus NaCl 0,9 proc. tirpalo, tuomet praskleidus lytines lūpas įvedamas dorsaliai vulvos kol atsiremia į dubens briauną (žr. pav.3 A), tada pasukamas 45° kampu ir pastumiamas tolyn (žr. pav.3 B) (jeigu tampon÷lis bus nepakankamai įvestas, tai rezultatai bus netikslūs), tuomet švelniai pasukamas ir atsargiai ištraukiamas (Johnston et al., 2001; Kustritz, 2006).
Paimtas m÷ginys perkeliamas ant objektinio stikliuko atsargiai kelis kartus ridenant paviršiumi, svarbu padengti plonu sluoksniu, kad nepersidengtų ląstel÷s vienos kitomis (žr. pav.3 C). Labai svarbu nespausti, kad nesusitraiškytų ląstel÷s, nes tyrimas bus neinformatyvus. Stiklelis džiovinamas kambario temperatūroje apie 10 minučių ir dažomas:
1) padengiamas May–Grunwald dažų tirpalu ir laikomas 10 minučių (3–15min.); 2) nupilami dažai ir plaunama distiliuotu vandeniu;
3) Giemsa dažai 10 minučių (6–15min.);
4) dažai nupilami ir plaunama distiliuotu vandeniu; 5) leidžiama stikleliui išdžiūti kambario temperatūroje.
Paruošti tepin÷liai buvo mikroskopuojami šviesiniu binokuliariniu mikroskopu (OPTIKA B–352 PL, 2011 metai), kiekviename tepin÷lyje buvo skaičiuojama penkiuose atsitiktinai pasirinktuose matymo laukuose esančios ląstel÷s (žr. Pav. 4) (parabazin÷s, tarpin÷s, paviršin÷s, surag÷jusios (bebranduol÷s) epitelin÷s ląstel÷s, eritrocitai ir neutrofilai), naudojamas 400 kartų padidinimas. Ląstelių tipai buvo nustatomi remiantis E. Teske, 2009; K. Post, 1985 aprašymu.
Pav. 4 Makšties citologija priešrujo metu ( pirma priešrujo diena, 400x didinimas) ( Nuotrauka daryta A. Baranauskait÷s, 2012 )
Gauti duomenys buvo vedami į „Microsoft Exel 2003“ programą, o statistiškai apdoroti su SPSS statistiniu paketu (IBM SPSS for Windows 20,0 SPSS Inc.,Chicago, IL, USA, 2011) apskaičiuojant koreliaciją tarp lytinio ciklo laiko ir citologinių pokyčių, taip pat buvo apskaičiuoti ląstelių vidurkiai atskiroms kalių grup÷ms pagal dydį, atlikta ir įvertinta daugiafaktorin÷ statistin÷ duomenų analiz÷. Duomenys laikyti statistiškai patikimais, kai p<0,05. Pagal K. Post (1985) metodiką buvo apskaičiuojami makšties paviršinių epitelinių ląstelių (SCI) ir surag÷jusių (bebranduolių) ląstelių (KPI) indeksai pagal formules:
KPI pradedamas skaičiuoti nuo tos paros, kai visų paviršinių epitelinių ląstelių būna ne mažiau 100. Abiejų indeksų reikšm÷ išreiškiama procentais. SCI reikšm÷s priart÷jimas prie 100 proc., reiškia per÷jimą iš priešrujo į rują, o KPI rujos pradžią rodo, kai vert÷ pasiekia 80 proc., ir tolimesnis jos did÷jimas žymi ovuliacijos laiką. Pagal W. Concannon et al., 2002, kergimui tinkamas laikas yra tuomet kai surag÷jimo indeksas pasiekia 80 proc. ir daugiau. Kai SCI reikšm÷ staigiai krenta, tai rodo porujo pradžią (žr. Pav. 5)
Pav. 5 Ruja, paviršinių ląstelių indeksas 100 proc. (A); Paviršinių ląstelių indekso reikšm÷s staigus kritimas, pirma porujo diena (B), naudotas 400x didinimas. Nuotraukos darytos A. Baranauskait÷s, 2012)
3. TYRIMŲ REZULTATAI
Paveiksle (žr. pav. 4) pateikiami makšties citologiniai pokyčiai priklausomai nuo lytinio ciklo laiko. Ryškiausi pokyčiai pasteb÷ti 4 – 5 parą nuo priešrujo pradžios, šiuo ciklo metu prad÷jo sparčiai augti surag÷jusių ląstelių skaičius, o eritrocitų, neutrofilų ir parabazinių ląstelių skaičius ženkliai maž÷jo. 18 – 19 parą įvyko staigus parabazinių ląstelių bei neutrofilų skaičiaus augimas, o surag÷jusių ląstelių skaičiaus staigus maž÷jimas, kuris iki 24 dienos priart÷jo prie nulio. Eritrocitų skaičius palaipsniui maž÷jo ir nuo 15 dienos jų visai neaptikta. Paviršinių ląstelių skaičius augo iki 5 dienos, tačiau prasid÷jus ryškiam surag÷jusių ląstelių skaičiaus augimui, prad÷jo maž÷ti ir 23 dieną nebuvo aptiktos. -10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Diena nuo priešrujo pradžios
L ą s te li ų k ie k is Parabazin÷s ląst. Tarpin÷s ląst. Paviršin÷s ląst. Surag÷jusios ląst. Neutrofilai Eritrocitai
Pav. 6 Makšties citologiniai pokyčiai priklausomai nuo rujos dienos
Didžiausia koreliacija lyginant ląstelių skaičių su rujos diena nuo priešrujo pradžios nustatyta paviršin÷ms ląstel÷ms ir eritrocitams. Paviršinių ląstelių ir eitrocitų kiekis maž÷ja, o parabazinių, tarpinių ląstelių ir neutrofilų kiekis priklausomai nuo dienos did÷ja, tačiau šių ląstelių koreliacija su rujos diena n÷ra tokia stipri kaip paviršinių ląstelių ir eritrocitų.
lentel÷ Nr. 1 Ląstelių kiekio koreliacija su rojos diena nuo priešrujo pradžios (Pearson)
Nustačius vidutinius ląstelių skaičius atskiroms kalių grup÷ms pagal veisles (p<0,05), matoma tendencija, kad šiam požymiui kal÷s dydis neturi ryškios įtakos, nes stebimi tik nežymūs skirtumai (žr. Pav. 5). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 L ą s te li ų s k a ič iu s Parab azin÷ s ląs t. Tarpi n÷s l ąst. Pavir šin÷s ląst. Surag ÷jusio s ląs t. Neutr ofilai Eritro citai Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didžiųjų veislių
Pav. 7 Vidutinis ląstelių kiekis tarp skirtingų dydžių kalių makšties citologinio tyrimo rezultatų
Įvertinus atskirais intervalais po penkias paras pradedant pirmąja priešrujo diena stebima tendencija, kad pirmų penkių parų parabazinių ląstelių kiekis mažųjų veislių kal÷ms yra didesnis 15,16 proc. nei vidutinių veislių (p<0,05), o kiti skirtumai labai nežymūs ir statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
Parabazin÷s ląst. Intermedialin÷s ląst. Superficialin÷s ląst. Kornifikuotos ląst. Neutrofilai Eritrocitai r 0,334 0,382 –0,648 –0,046 0,253 –0,767 p <0,001 <0,001 <0,001 0,375 <0,001 <0,001
1-5 dienų vidurkis - priešrujis 0 10 20 30 40 50 60 70 Para bazi n÷s l. Tar pin÷ s l. Pavi ršin ÷s l. Sura g÷ju sios l. Eritr ocita i Neu trofil ai L ą s te lių s k a ič iu s Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didžiųjų veislių
Pav. 8 Ankstyvojo priešrujo citologija skirtingo dydžio kal÷ms
Vertinant 6 – 10 dienų ląstelių vidurkį, mažųjų veislių kalių paviršinių ląstelių kiekis 21 proc. didesnis nei vidutinių veislių kalių ir 32 proc. didesnis nei didžiųjų veislių, taip pat šiuo laikotarpiu visoms kalių grup÷ms sutinkama tik pavieniai eritrocitai ir parabazin÷s epitelin÷s ląstel÷s (p<0,05).
6-10 dienų vidurkis - priešrujis
0 20 40 60 80 100 120 Para bazin ÷s l. Tarp in÷s l. Pavi ršin ÷s l. Sura g÷ju sios l. Eritr ocita i Neu trofil ai L ą s te li ų s k a ič iu s Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didžiųjų veislių
Pav. 9 V÷lyvojo priešrujo citologija skirtingo dydžio kal÷ms
Stebint 11 –15 dienų makšties ląstelių skaičių matyti, kad didžiųjų veislių kalių surag÷jusių ląstelių kiekis 4 proc. didesnis nei vidutinių veislių kalių. Parabazinių, tarpinių ląstelių ir neutrofilų šiuo laikotarpiu nebuvo aptikta, ir pasitaik÷ tik pavieniai eritrocitai (p<0,05).
11-15 dienų vidurkis - ruja 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Para bazi n÷s l. Tarp in÷s l. Pavi ršin ÷s l. Sura g÷ju sios l. Eritr ocita i Neu trofil ai L ą s te li ų s k a ič iu s Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didžiųjų veislių
Pav. 10 Rujos citologija skirtingo dydžio kal÷ms
V÷lyvuoju rujos laikotarpiu (16–20 dienų intervale) stebima tendencija, kad ląstelių skaičiaus skirtumai visose trijose grup÷se labai nežymūs, o eritrocitų nebuvo aptikta visoms kalių grup÷ms. Šiuo laikotarpiu kelioms kal÷ms jau buvo stebimi pirmieji porujo požymiai, tod÷l atsiranda nedidelis kiekis parabazinių, tarpinių ląstelių bei neutrofilų kiekis (p<0,05).
16-20 dienų vidurkis - ruja
0 20 40 60 80 100 120 140 Para bazin ÷s l. Tarp in÷s l. Pavi ršin ÷s l. Sura g÷ju sios l. Eritr ocita i Neu trofil ai L ą s te lių s k a ič iu s Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didžiųjų veislių
V÷lesniu laikotarpiu (21 – 25 parą) porujis įvyksta visoms kal÷ms. Šiuo periodu dramatiškai padid÷ja parabazinių ląstelių kiekis, kuris mažųjų veislių kal÷ms buvo 14,53 proc. mažesnis nei vidutinių ir didžiųjų veislių kal÷ms, labai ženkliai sumaž÷jo paviršinių ir surag÷jusių ląstelių kiekis, tačiau skirtumai tarp skirtingų kalių grupių labai nedideli (p<0,05).
21-25 dienų vidurkis - porujis
0 20 40 60 80 100 120 140 Para bazin ÷s l. Tarp in÷s l. Pavi ršin ÷s l. Sura g÷ju sios l. Eritr ocita i Neu trofil ai L ą s te li ų s k a ič iu s Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didžiųjų veislių
Pav. 12 Priešrujo citologija skirtingo dydžio kal÷ms
Paviršinių ląstelių (SCI) ir surag÷jusių bebranduolių ląstelių (KPI) indeksų kreiv÷s rodo, kad ryškių skirtumų tarp skirtingų veislių kalių n÷ra, tačiau stebima tendencija, kad didžiųjų veislių kal÷ms epitelinių ląstelių rag÷jimas (žr. į KPI kreivę) prasideda anksčiau ir vyksta greičiau lyginant su mažųjų veislių (žr. Pav. 6), nes aštuntą ciklo parą nuo priešrujo pradžios mažųjų veislių kal÷ms KPI buvo 62 proc., o didžiųjų kalių 10 proc. daugiau, tačiau v÷liau (10 – 11 ciklo parą) susilygina ir netgi beveik visą steb÷jimo laikotarpį ląstelių surag÷jimo indeksas išlieka šiek tiek aukštesnis. Pagal K. Post (1985) epitelinių ląstelių surag÷jimo indekso vertinimo sistemą matyti, kad tiriamoms kal÷ms ruja prasid÷jo 9– 10 dieną, nes SCI indekso reikšm÷ pasiek÷ 100 proc., ovuliacija įvyko apie 12 – 15 dieną nuo priešrujo pradžios, nes šiuo laiku matyti ryškesnis ląstelių surag÷jimo indekso vert÷s kilimas virš 80 proc., 18 – 20 dieną SCI indekso kritimas parod÷ porujo pradžią.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
diena nuo priešrujo pradžios
in d e k s o v e rt ÷ ( % )
Mažųjų veislių SCI
Mažųjų veislių KPI
Vidutinių veislių SCI
Vidutinių veislių KPI
Didžiųjų veislių SCI
Didžiųjų veislių KPI
Pav. 13 Superficialinio epitelinių ląst. indekso (SCI) ir ląstelių kornifikacijos indekso (KPI) kreiv÷s pagal kalių dydį.
Nors matomas ženklus ląstelių kitimas priklausomai nuo rujos laiko, tačiau statistin÷ rujos dienos įtaka ląstel÷ms labai nedidel÷, didžiausia yra eritrocitams ir parabazin÷ms ląstel÷ms, o neutrofilų skaičiui rujos diena beveik visai neturi įtakos, tod÷l galima teigti, kad priklausomai nuo laiko labiausiai kinta eritrocitų ir parabazinių ląstelių skaičius.
lentel÷ Nr. 2 Daugiafaktorin÷ statistin÷ analiz÷. Rujos laiko įtaka ląstelių pokyčiams
Ląstelių rūšis Įtaka, proc. p
Parabazin÷s epitelin÷s ląstel÷s 26 <0,001
Tarpin÷s epitelin÷s ląstel÷s 16 <0,001
Paviršin÷s epitelin÷s ląstel÷s 23 <0,001
Surag÷jusios bebranduol÷s ląstel÷s 20 <0,001
Neutrofilai 3 <0,001
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Makšties epitelio citologinis tyrimas yra vertingas nustatant rujos ciklą. Tyrimo metu dažniausiai vertinamas makšties epitelinių ląstelių rag÷jimo laipsnis, kuris parodo rujos ciklo laiką. Ląstelių rag÷jimo laipsnis kinta priklausomai nuo ciklo laiko ir dažniausiai nustatomi šie keturi epitelinių ląstelių tipai: parabazin÷s, tarpin÷s, paviršin÷s ir surag÷jusios bebranduol÷s paviršin÷s ląstel÷s. Priešrujo staidijai charakteringas požymis yra did÷jantis surag÷jusių ląstelių skaičius, bei maž÷jantis polimorfonuklearinių ląstelių (neutrofilų) kiekis. Rujos metu paviršinių ląstelių kiekis siekia 100 proc. ir daugiau nei pusę jų sudaro surag÷jusios bebranduol÷s ląstel÷s. Porujo pirmomis dienomis užplūsta neutrofilai, bei ženkliai krenta surag÷jusių ląstelių laipsnis (Kustritz, 2006). Mūsų atlikto tyrimo metu pasteb÷ta analogiška ląstelių kitimo tendencija.
Priešrujo pradžią žymintis reiškinys yra kraujingų išskyrų pasirodymas iš makšties, tod÷l šiuo metu nustatoma didelis eritrocitų kiekis išskyrose. Eritrocitai dažniausiai aptinkami priešrujo metu, tačiau pavieniai gali pasitaikyti rujos ir porujo periodais (Walter et al., 2011). Eritrocitų kiekis labai svarbu diferencijuojant priešrujį nuo porujo ir ramyb÷s laikotarpio (Aydin et al., 2011).Mūsų tyrimo metu rujos laikotarpiu pasitaik÷ tik pavieniai eritrocitai, o porujo metu eritrocitų nebuvo rasta, tačiau kaip ir anksčiau min÷ti mokslininkai teigia, priešrujo metu eritrocitų kiekis buvo didžiausias. Kaip teigia I. Aydin et al. (2011), taip pat be eritrocitų priešrujo metu aptikome visus epitelinių ląstelių tipus: parabazines, tarpines, paviršines ir paviršines surag÷jusias bebranduoles, tačiau didžiausias kiekis parabazinių ir tarpinių epitelinių ląstelių, taip pat pasitaik÷ neutrofilų, jų kiekis ženkliai sumaž÷jo per pirmąsias priešrujo dienas.
Priešrujis kal÷ms trunka vidutiniškai 9 paras, tačiau gali svyruoti nuo 3 parų iki 3 savaičių (Blendinger, 2007; Wheeler, 2011; Davidson, 2010). Kai paviršinių ląstelių indeksas pasiekia 100 proc., tuomet prasideda ruja ir tęsiasi iki tol kol pirmą kartą nustatomas staigus paviršinių ląstelių indekso reikšm÷s maž÷jimas (Post, 1985). Tyrimo rezultatai rodo, kad ruja kal÷ms prasid÷jo vidutiniškai 10 – 11 parą ir truko 9 paras (+/–2). A.P. Davidson (2010), K.Blendinger (2007) taip pat teigia, kad ruja trunka 9 paras, tačiau gali svyruoti nuo 3 dienų iki 3 savaičių. Rujos metu nustatomos paviršin÷s ir paviršin÷s bebranduol÷s ląstel÷s, kurių skaičius gali svyruoti nuo 80 – 100 proc., neutrofilų paprastai neaptinkama, tačiau gali pasitaikyti eritrocitų (Marti, 2008; Ajala et al., 2012). S. Laurusevičiaus (2009) tyrimas rodo, kad 11 ciklo dieną paviršin÷s ląstel÷s vidutiniškai siek÷ 84 proc.
Citologinio porujo nustatymas labai vertingas planuojant šiuniukų atvedimo laiką, nes nustatyta, kad skaičiuojant nuo pirmos citologinio porujo dienos, kal÷ šuniuojasi 56 – 58 parą (Feldman and Nelson, 2004). Kliniškai porujis nustatomas tuomet, kai kal÷ nebetraukia patinų ir nesileidžia kergiama,
vulvos dydis ir išskyrų kiekis sumaž÷ja, jos tampa šviesios (Marti, 2008; Davidson, 2010). Mūsų tyrimo metu tirtoms kal÷ms porujis prasid÷jo tuomet, kai makšties citologijoje įvyko staigūs pokyčiai, 100 proc. siekęs paviršinių ląstelių profilis staiga sumaž÷jo beveik per pus, didžiąją dalį sudar÷ parabazin÷s ir tarpin÷s epitelin÷s ląstel÷s, bei ryškus įvykęs pokytis – neutrofilų antplūdis, tačiau kaip teigia G. England et P.W. Concannon (2002), pastarasis požymis n÷ra patognominis, bet tik charakteringas šiai stadijai.
Kal÷s rujoja 1–2 kartus per metus ir šis patirtų lytinių ciklų skaičius priklauso nuo veisl÷s, nes pasteb÷ta, kad mažųjų veislių kal÷s rujoja dažniau lyginant su didžiųjų veislių kal÷mis, tačiau lytinio ciklo ir jo atskirų stadijų trukm÷ varijuoja ne tik tarp veislių, bet ir tarp atskirų individų (Aydin et al., 2011; Ajala et al., 2012) Stebint skirtingų dydžių kalių citologinius pokyčius, pasteb÷jome, kad n÷ra ryškaus aptiktų ląstelių kiekio ir ciklo fazių trukm÷s skirtumo tarp mažųjų, vidutinių ir didžiųjų veislių kalių. Didesn÷ skirtumų tendencija pasteb÷ta tik individualioms kal÷ms, nepriklausomai nuo jų dydžio.
IŠVADOS
1. Priklausomai nuo rujos stadijos kinta makšties epitelio surag÷jimo laipsnis. Priešrujo metu kyla surag÷jimo laipsnis ir rujos pradžioje pasiekia 80 proc., o porujo pradžia nustatoma tuomet kai įvyksta staigus surag÷jimo laipsnio kritimas. Kai surag÷jimo laipsnis siekia 80 proc. ir daugiau, tai laikoma optimaliu kergimo laiku.
2. Ryškiausiai citologiniai pokyčiai vyksta priešrujo ir porujo metu, o rujos metu citologinis vaizdas išlieka pastovus. Lytinio ciklo laikas daugiausiai įtakos turi parabazin÷ms (26 proc.), paviršin÷ms epiletin÷ms ląstel÷ms (23 proc.) ir eritrocitams (26 proc.) (p<0,001).
3. Kalių dydis neturi įtakos makšties citologiniams pokyčiams, nes stebimi nedideli ląstelių kiekio skirtumai priklausomai nuo rujos ciklo laiko (p<0,05).
REKOMENDACIJA PRAKTIKAMS
Makšties citologinį tyrimą galima naudoti kaip alternatyvą kitiems optimalaus kergimo laiko nustatymo metodams (arba kitų tyrimų patvirtinimui), kergti rekomenduojama kergti, kai makšties tepin÷lyje surag÷jusių ląstelių yra daugiau nei 80 proc., taip pat citologinių pokyčių vertinimas padeda nustatyti būsimo atsivedimo laiką ir atskirti patologinius pokyčius (neoplazijas, vaginitą) nuo
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Aydin I., Sur E., Ozyadin T., Dinc D. A. Determination of the Cycle of the Bitch by Direct Examination. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2011. Vol. 10 (15). P. 1962 ‒1967. 2. Ajala O., Fayemi O. E., Oyeyemi M. O. The Oestrus Cycle of the Nigerian Local Bitch. Global
veterinaria. Ibadan, Nigeria. 2012. Vol. 8 (6). P. 574 –582.
3. Beijerink N. J. Endocrinology of physiological and progestin induced canine anoestrus. http://igitur–archive.library.uu.nl/dissertations/2007–0614–202116/full.pdf. Prieiga per internetą 2012 05 04.
4. Beimborn V. R., Tarpley H. L., Bain P. J., Latimer K. S. The canine estronus cycle: Staging
using vaginal cytological examination.
http://www.redmondvetclinic.com/Animal_Care/Dog_and_Cat_Library/Small_Animal_Reprod uction/179096.aspx. Prieiga per internetą 2012 05 06.
5. Carreira R. P., Miranda S., Nizanski W. Artificial insemination in dogs. 2011. http://www.intechopen.com/books/artificial–insemination–in–farm–animals/artificial–
insemination–in–dogs. Prieiga per internetą 2012 04 23.
6. Concannon P. W, Verstegen J. Some unique aspects of canine and feline female reproduction important in veterinary practice. Proccedings of WHSAVA congress. Mexico. 2005.
7. Concannon P. W. Reproductive cycle of the domestic bitch. Animal reproductive science. 2011. Vol. 124. P. 200 – 210.
8. Davidson A. P. Reproduction. Proccedings of the Southern European Veterinary Conference & Congreso Nacional AVEPA. Barcelona. 2010.
9. Dellmann H. D., Brown E.M. Textbook of veterinary histology. USA. Lea & Febiger. 1976. 513 p.
10. England G., Concannon W., Verstegen J., Linde–Forsberg C. Determination of the optimal
breeding time in the bitch: basic conciderations.
http://www.ivis.org/advances/concannon/england2/ivis.pdf. Prieiga per internetą 2012 07 16. 11. Ettinger S. J., Feldman E. C. Textbook of Veterinary Internal Medicine. St. Louis. Saunders
2005. Vol 2 (6). 1148 p.
12. Feldman E. C., Nelson R. W. Canine and feline endocrinology and reproduction. Missouri. USA. Saunders. 2004. 1089 p.
13. Fontbonne A. Hormones and antibiotics in canine and feline reproduction. Proceedings of the WSAVA Congress. Sydney. 2007.
14. Ford R. B., Mazzaferro E. Kirk and Birstner’s handbook of veterinary procedures and emergency treatment. 9 ed. Saunders. 2011. 784 p.
15. Groppetti D., Pecile A., Barbero C., Martino P. A. Vaginal bacterial flora and cytology in proestrous bitches: Role on fertility. Theriogenology. 2012. Vol. 77. P. 1549 – 1556.
16. Houpt K. A. Domestic animal behavior for veterinarians and animal scientists. Iowa. 2011. 393 p.
17. John A., Nair D. R., Sreejith J. R, Deepthi L., Praseeda R., Ajitkumar G. Vaginal microflora and its antibiogram in infertile bitches. http://www.vetscan.co.in/v6n1/79–Vaginal–Microflora– Antibiogram–Infertile–Bitches.htm. Prieiga per internetą 2012 06 12.
18. Johnston S. D., Kustritz M. V., Olson P. N. S. Canine and feline theriogenology. Philadelphia. Saunders. 2001. 592 p.
19. Kustritz M. V. R. Collection of tissue and culture samples from the canine reproductive tract. Theriogenology. 2006. Vol. 66 (3). P. 567 – 574.
20. Marti S. Clinical aspects of normal female fertility. Proccedings of the Southern European Veterinary Conference & Congreso Nacional AVEPA. Barcelona. 2008.
21. Meuten D. J., Raskin R. E., Rebar A. H. Cytology of internal organs. Proceedings ot the North American veterinary conference. Florida. 2005.
22. Post K. Canine vaginal cytology during the estrous cycle. Can Vet J. 1985. Vol. 26 (3). P. 101– 104.
23. Romagnoli S. Infertility in the Bitch. Proccedings of the Southern European Veterinary Conference & Congreso Nacional AVEPA. Barcelona. 2008
24. S. A. Laurusevičius. Kalių reprodukciniai parametrai ir makšties mikrofloros tyrimas skirtingomis lytinio ciklo faz÷mis. Daktaro disertacija. Biomedicinos mokslai, veterinarin÷ medicina (12B). Kaunas. 2009. 122p.
25. Simpson G., England G. C. W., Harvey M. BSAVA Manual of Small Animal Reproduction and Neonatology. United Kingdom. British Small Animal Veterinary Assosiation1998. 113 p. 26. Teske E. Urogenital cytology. Part II – vaginal cytology. Proceedings of the 34th World Small
Animals Veterinary Congress WHSAVA. Brazil. 2009.
27. Turmalaj L., Duro S., Lika E., Ceroni V. The Hormonal Control of Estrous in Bitches. Journal of animal and veterinary advances. 2011. Vol. 10 (18). P. 2447 – 2449.
28. Walter I., Galabova G., Dimov G., Helmreich M. The morphological basis of proestrus endometrial bleeding in canines. Theriogenology. 2011. Vol 75 (3). P. 411 –420.
29. Wheeler R. Canine estrous cycle and estrous monitoring. Proceedings of the European Veterinary Conference Voorjaarsdagen. Amsterdam. 2011.
