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3. Materiali e Metodi
3.1 Sostanze impiegate
I composti utilizzati per la valutazione dell’attività cardioprotettiva anti-ischemica possono essere suddivisi per provenienza in sostanze originali di nuova sintesi e sostanze di origine commerciale.
I composti originali disegnati e sintetizzati allo scopo di ottenere nuovi attivatori del canale mito-KATP provengono dal Dipartimento di
Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa (Supervisione del Professor Aldo Balsamo e Dottoressa Simona Rapposelli), tale serie è costituita da derivati spirociclici del nucleo benzopiranico recanti un anello morfolonico, morfolinico o ossazolidinico variamente sostituiti: F 163 (morfolonico), MM 107 (morfolinico), F 276, F 278, F 279, F 246, F 245, F 247 (ossazolidinico).
I composti originali disegnati e sintetizzati allo scopo di ottenere nuovi ligandi in grado di attivare il recettore β-estrogenico provengono dal Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa (Supervisione del Professor Filippo Minutolo), tale serie è costituita da derivati salicilaldossimici monoaril sostituiti: TM 33, TM 34, TM 18, TM 20, FS 95.
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Le sostanze di origine commerciale impiegate nella valutazione della attività cardioprotettiva anti-ischemica sono NaHS (Sigma-Aldrich) quale donatore di solfuro d’idrogeno e potenziale attivatore dei canali mito-KATP, il Diazoxide (Sigma-Aldrich) quale mito-KATP attivatore di
riferimento e il sale sodico dell’Acido 5-idrossidecanoico (5-HD) (Sigma-Aldrich) quale bloccante selettivo dei canali mito-KATP.
Le soluzioni delle sostanze utilizzate sono state ottenute come segue: Diazoxide, NaHS e derivati salicilaldossimici monoaril sostituiti: madre in dimetilsolfossido (DMSO) 200mM e successiva preparazione di un mezzo di coltura medicato composto da DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) contenete una concentrazione di Diazoxide, NaHS e derivati salicilaldossimici monoaril sostituiti pari a 100M.
Derivati spirociclici del nucleo benzopiranico: madre in dimetilsolfossido (DMSO) 20mM e successiva preparazione di un mezzo di coltura medicato composto da DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) contenete una concentrazione di composto pari a 10M.
Derivati salicilaldossimici monoaril sostituiti: madre in dimetilsolfossido (DMSO) 2mM e successiva preparazione di un mezzo di coltura medicato composto da DMEM (Dulbecco’s
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Modified Eagle’s Medium) contenete una concentrazione di composto pari a 1M oppure madre in dimetilsolfossido (DMSO) 20M e successiva preparazione di un mezzo di coltura medicato composto da DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) contenete una concentrazione di composto pari a 10nM.
Sale sodico dell’ Acido 5-idrossidecanoico: madre in PBS (Phosphate Buffer Salt) 10mM ulteriore diluizione 1:10 per la concentrazione 10-3 M da somministrare nel pozzetto al fine di ottenere la concentrazione finale di 5-HD pari a 100M.
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3.2 Linea cellulare
La linea di cardiomioblasti di ratto, H9c2 (American Type Culture Collection, Rockville, MA, USA) è caratterizzata da cellule che crescono adese alla superficie della fiasca assumendo un aspetto allungato (vedi Figura 26) e con un tempo di duplicazione di circa 24-36 ore. Tali cellule sono mantenute in coltura con un terreno caratterizzato da DMEM ad alta concentrazione di glucosio, contenente L-Glutamina (2mM), siero fetale bovino (FBS) al 10 %, penicillina (50UI/ml) e streptomicina (50g/ml) (tutti di provenienza Sigma-Aldrich). Il mezzo utilizzato invece durante la procedura di insulto anossico risulta invece composto da DMEM a bassa concentrazione di glucosio, contenente L-Glutamina (2mM), penicillina (50UI/ml) e streptomicina (50g/ml) (tutti di provenienza Sigma-Aldrich) ma deprivato del componente FBS.
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3.3 Protocollo sperimentale
I composti descritti sopra, sciolti nel mezzo medicato sono stati incubati per 1 ora in condizioni di normossia, al termine di tale trattamento, il protocollo sviluppato prevede che le cellule H9c2, (8.000 cellule per pozzetto), siano sottoposte ad ischemia sotto flusso di diazocarb (miscela al 95% di N2 e 5% di O2) in mezzo di coltura
contenente basse concentrazioni di glucosio e deprivato del siero fetale bovino, per 16 ore, al termine delle quali si procede alla riossigenazione (riperfusione), ottenuta ripristinando le condizioni di coltura pre-anossiche, per un periodo di 2 ore. La valutazione del danno ischemico viene effettuata al termine delle 2 ore di riossigenazione attraverso un saggio colorimetrico impiegato comunemente per la misurazione della vitalità cellulare: il test, denominato Cell Proliferation Reagent WST-1 (Water Soluble Tetrazolium; Roche, Mannheim, Germany) è costituito da un reagente principale, il WST-1 che è un sale di tetrazolio color rosso pallido e che, nelle cellule vitali, viene convertito da enzimi mitocondriali in un sale di formazano solubile colorato di rosso intenso (vedi Figura 27). Al termine della riossigenazione pertanto, il WST-1 è stato aggiunto ad ogni pozzetto in rapporto volumetrico 1:10 e dopo 1 ora d’incubazione a 37°C in atmosfera normossica, è stata misurata
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l’assorbanza ad una lunghezza d’onda di 450nm mediante lettore di micropiastre (Wallac3, PerkinElmer, Wellesley, USA). La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale di assorbanza esibita dalle cellule trattate sottoposte ad anossia rispetto alle cellule di controllo (solo veicolo) mantenute in condizioni di normossia. Ogni esperimento è stato replicato almeno 10 volte e i valori sono stati espressi come medie ± errore standard (GraphPad Prism 4.0, San Diego, CA, USA).
