LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Simas Stankevičius
Veršelių sergamumo analizė ir ligų prevencija
pramoniniame pienininkystės ūkyje
Analysis of calf morbidity and prevention of diseases in
the industrial dairy farm
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDARBAS ATLIKTAS LSMU VA VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Veršelių sergamumo analizė ir ligų prevencija pramoniniame pienininkystės ūkyje“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11 1.1. Veršelių mirtingumas ... 111.2. Veršelių enterito sukėlėjai rota- ir koronavirusai ... 11
1.3. Galvijų virusinės diarėjos duomenų apžvalga ... 14
1.4. Virusinių kvėpavimo takų sukelėjų apžvalga ... 15
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 18
2.1. Ūkio bendra apžvalga ... 18
2.2. Veršelių fekalijų tyrimas dėl viduriavimą sukeliančių patogenų ... 20
2.2.1. Bovid-5 ekspres testo naudojimo eiga ... 20
2.3. Modifikuotas MakMasterio (McMaster) metodas ... 21
2.3.1. McMaster metodo metu naudotos priemonės ... 21
2.2.2. Modifikuoto MakMasterio (McMaster) metodo darbo eiga... 22
2.4. Imunoglobulinų nustatymo metodas ... 22
2.5. Statistiniai skaičiavimo metodai ... 23
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 24
3.1. Gaištamumo ir gimstamumo analizė ūkio fermose ... 24
3.2. Epidemiologinių tyrimų rezultatai ... 25
VERŠELIŲ SERGAMUMO ANALIZĖ IR LIGŲ PREVENCIJA PRAMONINIAME PIENININKYSTĖS ŪKYJE
Simas Stankevičius
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Darbo tikslas – atlikti veršelių sergamumo ir ligų analizę pramoniniame pienininkystės ūkyje bei rekomenduoti rizikos veiksnių mažinimo programą ir prevencijos priemones. Darbo apimtis – 42 lapai, juose 4 lentelės, 13 paveikslų, 3 priedai, darbe panaudoti 46 literatūros šaltiniai.
Literatūros apžvalgoje aprašyta tiriamajame ūkyje aptiktų veršelių virškinamojo trakto patogenų (rota-, koronavirusai, kokcidijos), kvėpavimo takų ligų sukelėjų (PG-3, RSV, Adeno virusų) bei virusinės diarėjos virusų paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje, rizikos veiksniai, kurie lemia patogenų pasiskirstymą ir bendri veršelių mirtingumo faktoriai.
Tiriamas darbas buvo atliktas X pieninkystės bendrovėje Lietuvoje 2017-2018 metų laikotarpiu, LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje, mėginiai serologiniams tyrimams atlikti buvo siunčiami į Nacionalinį maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutą. Tyrimui buvo surinkta 80 fekalijų mėginių ir 67 kraujo mėginiai iš vieno ūkio A ir B fermų.
Eimeria oocistų 1-3 mėnesių amžiaus veršelių apsikrėtimas A fermoje 0 proc. (0/20), B fermoje apsikrėtimas 55 proc. (11/20), statistiškai reikšminga lygininant (P=0,0004). B fermoje mediana buvo 419 oocistų 1g išmatų, o tarp užsikrėtusiųjų buvo 762 oocista 1g išmatų.
A ir B fermose, kur A ferma nevakcinuota nuo virškinamojo trakto patogenų, o B vakcinuota, tyrimai parodė 3 savaičių amžiaus grupėje vakcinacija labai veiksminga (P=0,0007). A fermoje galvijų bendras užsikrėtimas rota-, koronavirusais buvo net 90 proc. (18/20), B fermoje buvo nustatytas rotavirusinis enteritas (40 proc.; 8/20).
GVDV antikūnų tyrimai parodė 12 ir daugiau mėn. galvijų grupėje buvo 100 proc. (10/10). 8-10 mėnesių amžiaus grupėje, seroteigiamų 80 proc. (4/5), 5-6 mėn. amžiaus grupėje 40 proc. (2/5). Bendras seroteigiamų santykis visose grupėse buvo 81,81 proc. (18/22), lyginant su 2017 duomenimis statistiškai reikšmingi (P<0,05).
PG-3, RSV ir GAV tyrimų rezultatai parodė 12 ir daugiau mėnesių amžiaus grupėje PG-3 antikūnų randama 100 proc.(10/10). RSV užsikrėtimas nuo 2017 metų 40 proc. (2/5) sumažėjo iki 0 proc. (0/10) 2018 metais. Statistiškai reikšmingas PG-3 užsikrėtimas (P<0,05).
ANALYSIS OF CALF MORBIDITY AND PREVENTION OF DISEASES IN THE INDUSTRIAL DAIRY FARM
Simas Stankevičius Master‘s Thesis
SUMMARY
The purpose of the thesis is to analyse calf morbidity and diseases prevalence in the industrial dairy farm and recommend risk reduction program and prevention measures. The scope of work is 42 pages, including 4 tables, 13 figures, 3 addenda and 46 references.
The literature review describes the prevalence of gastrointestinal pathogens (rota-, coronaviruses, coccidia), respiratory tract infections (PI-3, RSV, Adeno viruses) and bovine viral diarrhea viruses found in the test farm, review status in Lithuania and in the world, and the risk factors that determine the distribution of pathogens and other common calf mortality factors.
The research work was carried out at the X dairy farm in Lithuania during 2017-2018, at the Department of Veterinary Pathobiology of the LUHS VA. Samples for serological testing were sent to the National Institute for Food and Veterinary Risk Assessment. Totally 80 faecal samples and 67 blood samples from A and B farms were collected for the study.
Eimeria oocysts in 1-3 months old calves‘ were detected. Eimeria infestation on farm A was 0% (0/20) and 55% on farm B (11/20). The differences in Eimeria prevalence were statistically significant (P = 0.0004). In the B farm, the median number was 419 oocysts per 1g of faeces, and among the infected animals the median infestation was 762 oocysts per 1g of faeces.
On farm B, where the vaccination program against gastrointestinal pathogens was implemented, studies showed a high rate of vaccination effectiveness (P = 0.0007). In contrast, in unvaccinated animal group, the total number of cattle infected with rota-, coronaviruses was as high as 90%.
The evaluation of passive maternal immunity revealed that in 71.42% of A farm calves the amount of Ig was inadequate (< 15 g/l). In the vaccinated animal group the most of calves (66,66%) had a normal Ig level (P<0.02).
BVDV was 40 percent. The total seroprevalence to BVDV was 81.81% in 2018 and was significantly higher than in 2017 (P <0.05).
The prevalence of antibodies to PI-3, RSV, and BAdV was 100%, 0% and 0% respectively. RSV antibodies carriers dropped from 40% in 2017 to 0% in 2018 (P <0.05).
SANTRUMPOS
GVD – galvijų virusinė diarėja,
GVDV – galvijų virusinės diarėjos virusas, PG-3 – galvijų paragripas 3,
PGR – polimerazės grandininė reakcija, GIR – galvijų infekcinis rinotracheitas, GHV-1 – 1 tipo galvijų herpes virusas,
BRSV – galvijų respiracinis sincitinis virusas, BCoV – galvijų koronavirusas,
BRCoV – galvijų kvėpavimo takų koronavirusai,
BCoV-WD – galvijų koronaviruso sukelta žiemos dizenterija, BRV – galvijų rotavirusas,
GAV – galvijų adeno virusas, IgG – imunoglobulinai, ak+ – teigiami antikūnai, PI – nuolatinai infekuoti, Ekspres – greitieji testai, RV – rotavirusas,
ĮVADAS
Veršelių viduriavimo prevencija ir kontrolė turėtų būti pagrįsta gerai suprantamu ligų kompleksijos sudėtingumu, tokių kaip keletas veikiančių patogenų, bendra ko-infekcija, aplinkos veiksniai ir šėrimas bei bendras bandos valdymas vėlyvuoju laikotarpiu prieš ligos protrūkius. Tokiam tikslui būtina identifikuoti infekcinius agentus, dalyvaujančius veršelių viduriavimo patogenezėje, tinkamai taikyti diagnostinius metodus. Laiku atliktas patogenų identifikavimas padėtų tinkamai parinkti intervencijos strategijas, skirtas veršelių viduriavimui ir kitoms ligoms gydyti, ir jų mirtingumui pirmaisiai mėnesiais sumažinti (16). Jaunų veršelių mirtingumo sumažinimas yra aktualus ūkiams, siekiantiems ekonominės naudos ir didesnio efektyvumo. Komerciniai pienininkystės ūkiai dažnai taiko klinikinius ir epidemiologinius tyrimus, siekdami užtikrinti bendrą bandos sveikatingumą, tačiau tokių tyrimų gali nepakakti ir gali tekti atlikti serologinius ir kitus papildomus tyrimus patogenams identifikuoti. Pastarieji tyrimai yra komerciniai, atliekami sertifikuotose laboratorijose, ir dėl sąlyginio brangumo ūkiuose atliekami retokai.
Paskutiniu metu virusinėms galvijų ligoms diagnozuoti gali būti pasitelkti greitieji (ekspres) testai, kurie greitai ir efektyviai gali identifikuoti įvairių patogenų paplitimą bandoje ir protrūkių metu padeda diagnozuoti ligas, tačiau problema išlieka dėl to, jog virusinės ligos įvairiose amžiaus grupėse pasireiškia gana skirtingais sindromais, o jų kontrolė, ypač mišrių infekcijų atvejais, yra labai sudėtinga. Lietuvos galvijininkystės ūkiuose pasireiškiančios ligos ar jų protrūkiai dažniausiai diagnozuojamos pagal klinikinius požymius, infekcinės kilmės etiologija lieka nenustatyta ir gydoma tik simptomatiškai, nesigilinant į tikruosius užkrato patekimo kelius (35). Pagrindiniai infekcinių ligų kontolės principai remiasi dvejomis filosofijomis: eliminuoti patogeno nešiotoją ir užkirsti kelią arba bent jau limituoti patogenų transmisiją nuo seroteigiamų individų ant patogenams jautrių gyvūnų. Norint pritaikyti vakcinacijos programą, reikia patvirtinti atliktų tyrimų diagnozę, tačiau dažniausiai, jai nepasitvirtinus, programos galvijų ūkiuose būna netaikytinos (34).
kompleksiniai sveikatos būklės įvertinimo, laboratoriniai diagnostiniai tyrimai, todėl nepavyksta laiku parinkti tinkamų priemonių ligų prevencijai ir kontrolei.
Ūkyje, kuriame mes atlikome tyrimus, buvo pastebėtas dažnas veršelių sergamumas ir didelis mirtingumas, todėl, siekdami nustatyti galimas ligų ir mirtingumo priežastis, siekėme atlikti pakankamai išsamią analizę.
Darbo tikslas: atlikti veršelių sergamumo ir ligų analizę pramoniniame pienininkystės ūkyje, bei rekomenduoti rizikos veiksnių mažinimo programą bei prevencijos priemones.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti palyginamąją gaištamumo ir sergamumo analizę dvejose tiriamojo ūkio fermose. 2. Atlikti pasyvaus imuniteto kokybės tyrimus, nustatant IgG kiekį veršelių kraujo serume. 3. Identifikuoti veršelių virškinamojo trakto patogenus, sukeliančių viduriavimą, ištiriant
fekalijų mėginius, palyginti vakcinacijos nuo virškinamojo trakto ligų vakcinacijos efektyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Veršelių mirtingumas
Tinkamas veršelių auginimas yra esminė bandų valdymo dalis ir sąlyga produktyviam pieno ūkio gyvavimui (13). Veršelių mirtingumas yra vienas iš parametrų, kuris parodo bendrą ūkio kokybę veršelių auginime, jų gerovėje ir yra labai svarbus faktorius, patiriant ekonominius nuostolius pienininkystės ūkio produkcijoje. Didesnis mirtingumo pasireiškimas veršelių tarpe gali pastūmėti reikalingumą pirkti telyčias, todėl gali padidėti bendros išlaidos ir naujų infekcinių ligų pasireiškimas visos bandos mastu (14). Jaunų veršelių mirtingumui visiškai užkirsti kelią nėra galimybių, tačiau tai turi būti vienas iš tikslų kaip jį sumažinti kiek įmanoma labiau. Kitose Europos šalyse yra išstudijuota ir parašyta daug straipsnių apie veršelių mirtingumą, varijuojantį pagal jų amžių. Tyrimų metu nustatyta, jog veršelių mirtingumas varijuoja nuo 2 proc. iki 8 proc., pagal amžių – nuo pirmųjų keturių mėnesių iki pirmųjų šešių mėnesių amžiaus (15). Deja, veršelių mirtingumo rodikliai skirtingais tyrimais yra sunkiai palyginami, nes pranešimai apie tikslų mirtingumą ir tikslus mirtingumas bei padėtis ūkiuose gali skirtis. Nors ir palyginti situaciją dabartinio mirtingumo globaliai yra labai sunku, yra atlikta keletas studijų, kuomet veršelių mirtingumas buvo padidėjęs tarp 2002 ir 2007 metų (12). Vakcinų naudojimas yra veiksminga ir palyginti nebrangi infekcinių ligų kontrolės priemonė, dėl kurių būna patiriami dideli ekonominiai nuostoliai, mažas produktyvumas, gydymo išlaidos ir sumažina skerdenos kokybę. Daugeliu atžvilgių, kai kurios įprastinėmis priemonėmis pagamintos vakcinos yra netobulos, įskaitant virulentiškumą, saugumą ir veiksmingumą. Be to, kai kurioms gyvūnų ligoms nėra vakcinų. Nors genų inžinerija suteikė naujų veiksmingų vakcinų gamybos būdų, veterinarinių vaistų gamyboje išlaidos yra kritinis kriterijaus, pasirenkant vakcinų gamybą ir jų panaudojimą (11).
1.2. Veršelių enterito sukėlėjai rota- ir koronavirusai
kriptosporidijos ir enterotoksigeninės ar enteropatogenininės E. coli rūšys yra dažnos ir jos padidina bendrą sergamumą ir viduriavimo dažnumą (18).
1 pav. Korona viruso struktūra schematiškai.
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/coronavirus.jpg
Galvijų korona virusas yra labai paplitęs galvijų populiacijose ir daro didelę įtaką pienininkystės ūkiams, sukeldamas ekonominius nuostolius visame pasaulyje. Virusas aptinkamas visuose žemynuose ir jo serologinis paplitimas (> 90 proc.) rodo, kad dauguma galvijų per savo gyvenimą yra patyrę BCoV infekciją. Neseniai atlikto tyrimo duomenimis, BCoV plaučių infekcija buvo antra pagal dažnį po galvijų herpeso viruso infekcijos. (17) Tiek mėsinių, tiek ir pieninių galvijų bandose BCoV gali būti susijęs su veršelių viduriavimu, veršelių kvėpavimo takų ligomis, žiemos dizenterija bei kvėpavimo ligomis suaugusiems galvijams. Šie virusai gali sukelti ir kombinuotus susirgimus, tokius kaip plaučių uždegimas ir viduriavimas veršeliams bei suaugusiems galvijams vienu metu (18,19). Koronaviruso padermės, išskirtos iš nugaišusių galvijų nosies sekretų ir plaučių audinių, buvo klasifikuojamos kaip galvijų kvėpavimo koronavirusai (BRCoV). Koronaviruso padermės, išskirtos iš viduriuojančių naujagimių veršelių ar suaugusių galvijų, vadinamos galvijų žarnyno ar enteropatogeniniais koronavirusais (BECoV, 20). Be to, klinikiniais tikslais BECoV gali būti toliau suskirstyti į BCoV veršelių diarėją (BCoV-CD) ir žiemos dizenteriją (BCoV-WD). Ligos sindromų klinikinis pasireiškimas yra ne tik susijęs su pačiu viruso savybėmis, bet ir su padermės ir aplinkos veiksniais, pavyzdžiui, su gyvūno imunologine būkle, aplinkos temperatūra ir antrinė infekcija kitais patogenais (21). Veršeliams koronaviruso sukeltas viduriavimas yra dažnai sezoniškas, pasireiškiantis žiemos periodu dėl padidėjusio viruso stabilumo šaltoje aplinkos temperatūroje (19).
pasireiškia anksti, pirmąją gyvenimo savaitę, o korona viruso infekcija paprastai pasireiškia 2 arba 3 gyvavimo savaitę. Daugeliu atvejų abu viruso tipai dalyvauja ligos procese (38). Galvijų koronavirusai sukelia ir nežymų kvėpavimo takų pažeidimą (pasireiškia kosėjimas ir rinitas) arba plaučių uždegimą, pasireiškiantį 2-6 mėnesių amžiaus veršelių tarpe. Veršeliai nuolat skleidžia virusą į aplinką su kvėpavimo sekretu. Tokiems veršeliams gali būti arba nebūti ligos požymių. Vadinasi, koronavirusai geba sklisti visų amžiaus grupių galvijų rate, nepriklausomai nuo jų imunologinio stovio. Virusų transmisija gali būti per kvėpavimo sekreto aerozolius, per fekalinį-oralinį būdą arba mechaniniu būdu (37).
Kadangi koronavirusų sukeltas viduriavimas dažniausiai pasireiškia jaunų veršelių tarpe, rekomenduotina veršingų galvijų vakcinacija, kai imunitetas būtų perduodamas su krekenimis. Pasyvaus imuniteto kokybė tiesiogiai koreliuoja su imunoglobulinų antikūnų kiekiu krekenyse ir tai lemia susirgimų virusinėmis ligomis dažnį. Atrajotojams būdinga tai, kad į krekenis ir pieną antikūnai selektyviai transportuojami iš kraujo serumo ir dominuoja būtent IgG klasė (32). Daugelis suaugusių galvijų yra seroteigiami dėl antikūnų prieš galvijų koronavirusus, to pasekoje, atliekant veršingų karvių vakcinacija inaktyvuotomis vakcinomis, efektyviai padidina imunoglobulinų antikūnų titrus serume ir krekenyse, taip padidindama pasyvaus imuniteto kokybę veršeliams (33).
Rotavirusas priklauso Reoviridae šeimos Rotavirus genčiai (2 pav.). Rotavirusas yra neapsaugotas virionas, turintis 11 dvipusių RNR segmentų (16 ~ 21 kb) ir yra labai stabilus plačiu pH intervalu su šilumos labilumu (38). Yra rotavirusų septynios serotropinės grupės (A iki G), pagrįstos tarpiniu kapiliarų baltymu (VP6) antigeniniu ir genetiniu panašumu.
2 pav. Rotaviruso struktūra schematiškai.
http://www.onlinebiologynotes.com/wp-content/uploads/2017/05/rota-virus2-1024x934.jpg
Rotavirusinės infekcijos, sukeliančios viduriavimą, yra dažnos fermose auginamų gyvūnų populiacijose. Dažniausiai liga pasireiškia jauniems, 1-8 savaičių amžiaus, gyvūnams, tačiau dažniausiai liga pasireiškia jau pirmąją gyvenimo savaitę. Inkubacinis ligos periodas yra labai trumpas - nuo 14 iki 24 valandų. Iškart po užsikrėtimo daugelis gyvūnų neparodo jokių klinikinių požymių, jie toliau normaliai maitinasi ir būna pastebima tik nežymi apatija (20). Viduriuojančių veršelių fekalijos būna labai skystos konsistensijos, randama daug gleivių. Jauni gyvūnai dažniausiai gaišta dėl progresuojančios dehidratacijos. Rotavirusų infekcijos klinikinei eigai didelę įtaką daro ir aplinkos veiksniai: prasta higiena, skersvėjai, šaltas oras, drėgmė, per didelis veršelių skaičius viename garde ir kitų patogenų tokių kaip E.coli bakterijų poveikis. Mirtis galima dėl antrinės bakterinės infekcijos, tačiau daugelis veršelių geba rodyti sveikesnius požymius po 3-4 dienų Galvijų rotavirusas yra pagrindinis etiologinis veršelių viduriavimo veiksnys.
Lietuvos galvijų fermose RV ir KV infekcijos yra diagnozuojamos, 2005 metų tyrimų duomenis ištyrus antikūnų rotavirusams nešiotojų dinamiką seroteigiamų gyvulių – buvo 66,7 proc. jaunesnių kaip 3 mėnesiai prieauglio grupėse iki 92,3 proc. karvių grupėse (2). Deja, paskutiniu metu šia tema nėra paskelbta jokių mokslinių publikacijų.
1.3. Galvijų virusinės diarėjos duomenų apžvalga
Galvijų virusinės diarėjos virusas (GVDV) yra vienos grandinės RNR virusas, priklausantis
Flaviridae šeimai, kuris sukelia nuolatinę infekciją. Jei vaisius yra apkrečiamas gimdoje per
pirmąsias 120 nėštumo dienas, atvestas veršelis bus imunotolerantiškas jo organizme esančiai viruso padermei ir liks viruso nešiotoju visą likusį gyvenimą. Šie gyvūnai epidemiologiškai labai svarbūs, kaip pagrindinis virusų rezervuaras bandose, ir tokių galvijų identifikavimas bei likvidavimas yra vienas iš kertinių GVD kontrolės priemonių ūkiuose (4).
Galvijų virusinės diarėjos virusas turi savybę daugintis imunokompetentinėse ląstelėse, tokiu būdu sukelia prisitaikančio imuninio atsako pažeidimą, o imuninio atsako slopinimo lygis priklauso nuo viruso padermės savybių (3).
Lietuvoje ūkių, kur buvo nustatytas bent vienas IGR ir GVD seroteigiamas galvijas, atitinkamai buvo 84,2 ir 85 proc. Tuose ūkiuose IGR ir GVD seroteigiamų galvijų paplitimas atitinkamai buvo 30,5 proc. ir 43,4 proc.(2).
nuolatinę infekciją (8). Šie du biotipai skiriasi virulentiškumu, bet antigeniškai jie yra giminingi. Citogeninis biotipas sukelia apoptozę ląstelių kultūrose (22), o necitogeninis yra ūminių infekcinių procesų priežastis, kurios gali būti plačiai perduodamos su kūno skysčiais: seilėmis, taip pat išskyromis iš nosies, šlapimu ar sperma (23).
GVDV sukelta liga padaro didelius ekonominius nuostolius pieno pramonėje, daugiausia dėl sumažėjusios pieno gamybos, sumažėjusios reprodukcijos, lėto galvijų augimo, padidėjusio imlumo kitoms ligoms, ankstyvo brokavimo ir padidėjusio jaunų gyvulių gaištamumo (30). Po dviejų ar trijų savaičių po infekcijos kraujyje susidaro neutralizuojantys antikūnai (31). Tačiau, kai infekuojama imli seroneigiama veršinga karvė, virusai pereina placentos barjerą ir užkrečiamas vaisius. Fetalinės infekcijos pasekmės priklauso nuo vaisiaus vystymosi stadijos ir užsikrėtimo laiko. Taigi, kai vaisius užkrečiamas pirmuoju nėštumo trimestru, dėl specifinio imunotoksiškumo GVDV gali sukelti embriono žūtį, abortus, įgimtus vaisiaus apsigimimus, gali gimti negyvi veršeliai arba, jei vaisius išgyvena infekciją, gimsta nuolatinai infekuoti (PI) veršeliai. Šie viruso nešiotojai per visą savo gyvenimo laiką išskiria į aplinką daug virusų, todėl jie yra pagrindinis viruso šaltinis bandose (7).
Ligai kontroliuoti naudojamos dvi pagrindinės strategijos. Tai PI galvijų identifikavimas ir pašalinimas iš bandos (39). Kitas būdas būtų vakcininė profilaktika. Šiuo metu yra naudojamos modifikuotos nusilpnintų virusų ir inaktyvuotos vakcinos nuo GVDV. Be GVDV komponento šiose vakcinose, yra ir kiti virusiniai ar bakteriniai antigenai. Inaktyvuotos ar modifikuotos gyvų virusų vakcinos teikia gyvulių augintojams ir veterinarijos gydytojams saugias ir veiksmingas bandos imunizacijos galimybes, siekiant sumažinti infekcinių ligų pasireiškimus, susijusius su GVDV infekcija. Jaunų galvijų skiepijimas nuo GVDV yra rekomenduotinas klinikinės ligos profilaktikai ir viruso plitimo ribojimui, apsaugant imlius galvijus (32). Reprodukcinio amžiaus galvijai skiepijami siekiant ne tik juos apsaugoti nuo galimos GVDV infekcijos klinikinio pasireiškimo, bet, kas ypač svarbu, užkertamas kelias fetalinei infekcijai ir PI galvijų atsiradimui bandoje.
Naujausi tyrimai rodo, kad veiksmingiausia GVDV infekcijos kontrolė bandose yra abiejų strategijų taikymas vienu metu. Tai reiškia, kad didžiausias efektyvumas pasiekiamas vakcinuojant imlius reprodukcinio amžiaus galvijus ir identifikuojant bei pašalinantis bandos PI individus (40). Nors GVDV prevencijos metodai yra efektyvūs ir taikomi dalyje Europos šalių. Lietuvoje, mūsų žiniomis, vakcinacija ir kitos GVDV kontrolės priemonės šiuo metu taikomos tik dviejuose ūkiuose (33).
1.4. Virusinių kvėpavimo takų sukelėjų apžvalga
įvairaus amžiaus galvijai, bet dažniausiai – prieauglis tuo metu, kai susilpnėja pasyvusis imunitetas ir dar nėra susidaręs aktyvusis imunitetas. Tokie veršelių susirgimai vadinami enzootine pneumonija arba bronchopneumonija (1). Lietuvoje atliktais tyrimais 2006 ir 2007 metais net 95 proc. tirtų ūkių buvo rasti galvijai, turintys antikūnų prieš PG-3 ir RS virusus. Vidutiniškai PG-3 buvo persirgę 72,2 proc., RS virusų infekcija – 54,5 proc. (2).
Galvijų respiratorinis sinticinis virusas (GRSV) yra Paramyxoviridae grupės virusas, kuris yra vienas pagrindinių kvėpavimo takų uždegimo sukelėjų veršeliams (9). Virusas genetiškai ir antigeniškai yra artimas žmonių respiratoriniam sinticiniam virusui, kuris mažiems kūdikiams yra pagrindinis kvėpavimo takų sukelėjas. Didėjant imunologinių reagentų prieinamumui, veršeliams gali būti nustatyta patogenezė ir mechanizmai imuniteto prieš GRSV infekciją, išanalizuoti būdai kaip viruso baltymai sąveikauja su įgimto atsako komponentais ir įvertintos GRSV vakcinacijos strategijos (6).
Galvijų adeno virusas (GAdV) priklauso Mastadenovirus genčiai, Adenoviridae šeimai ir gali sukelti kvėpavimo takų ir žarnyno infekcijas veršeliams. Šiuo metu yra nustatyta apie dešimt GAV serotipų. Šie serotipai yra suskirstyti į du pogrupius, atsižvelgiant į jų biologinius ir serologinius skirtumus. GAdV1, GAdV2, GAdV3 ir GAdV9 yra I pogrupio nariai, kurie plačiai auga nustatytose galvijų ląstelėse, sudėtyje yra bendrų komplementą fiksuojančių antigenų, kurie kompleksinio fiksavimo testuose kryžmiškai reaguoja su kitais adenovirusais. Pastaraisiais metais buvo fokusuotasi studijuoti GAdV3, dėl jo mažo virulentiškumo ir viruso savybės užaugti dideliais titrais ląstelių kultūroje. Be to, įvairūs antigenai ir citokinai buvo sėkmingai įnešti į tiriamų gyvūnų organizmą per GAdV3 (10).
Ekonomiškai efektyvi gamyba ir būdingas gebėjimas patekti į ląsteles padarė adenoviruso vektorius kaip labai veiksmingą vakcinų antigenų pristatymo priemonę. Be to, adenovirusai sukelia kartu ir humoralinius, ir ląstelinius imuninius atsakus į išreikštus vakcinos antigenus. Kadangi nežmogiškieji adenovirusai yra specifiniai rūšiai, yra vertinama gamyba vakcinos pernešimo vektorių gyvūnams specifinių adenovirusų (11).
1.5. Kiti veiksnių apžvalga
Eimeria zuernii yra vienas pagrindinių klinikinės kokcidiozės sukėlėjas veršeliams. Ši liga
siejama su didžiuliu viduriavimu ir sumažėjusiu svorio padidėjimu, todėl taip pat yra labai ekonomiškai svarbi. E. zuernii būdingas inkubacinis laikotarpis apie 16 -17 dienų. Po to seka laikotarpis su oocistų ekskrecija ir klinikiniais simptomais (24).
(Craig, 1986), bet ir virškinimo trakto nematodai (Taylor, 2009) ar netgi kiti patogeniniai veiksniai, tokie kaip virusai ar bakterijos (Wright ir Coop, 2007).
Galvijų kokcidiozė yra svarbi vienaląščių Eimeria genties liga, paveikianti veršelius visame pasaulyje, todėl kiekvienais metais didelius ekonominius nuostolius patiria mėsos ir pieno pramonė (25). Keletas Eimeria rūšių gali sukelti šią ligą, iš kurių E. bovis ir E. zuernii yra labiausiai patogeniškos ir pagrindiniai galvijų ligų kaltininkai (26,27). Sunkiais atvejais šie organizmai padaro didelę žalą žarnyne, sunaikindami epitelio ląsteles ir audinius, o tai trukdo gyvūno gebėjimui absorbuoti maistines medžiagas (28). To pasekoje, pasireiškia sumažėjęs pašarų įsisavinimas ir svorio kritimas. Kai liga progresuoja, pašarų ir vandens suvartojimas nuolat mažėja, todėl veršeliai dehidratuoja. Jei svorio kritimas ir dehidracija yra pakankamai dideli, galvijai gali mirti nuo kokcidiozės (29). Jauni veršeliai nesugeba išnaudoti savo potencialo svorio ir nepriauga tinkamo svorio pagal augimą. Daugeliu atvejų kokcidiozė mažina produktyvumą, bet niekada nepasireiškia pastebimi simptomai, nors labiausiai paplitęs yra viduriavimas su kraujo priemaišomis (26,27).
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Ūkio bendra apžvalga
Magistrinis darbas buvo atliktas X pieninkystės bendrovėje 2017-2018 metų laikotarpiu, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje, mėginiai serologiniams tyrimams atlikti buvo siunčiami į Nacionalinį maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutą. Darbas buvo atliktas ir susistemintas veterinarijos medicinos magistratūros vientisųjų studijų metais. Tyrimo planas buvo vykdomas pagal pateiktą schemą (3 pav.).
Magistrinio tyriamajam darbui buvo pasirinktas pienininkystės ūkis, turintis dvi fermas, tyriamajame darbe fermos įvardytos A ir B. Skirtingų fermų gyvuliai tarpusavyje nekontaktuoja, nėra transportuojami iš vienos fermos į kitą. Tyrimo metu fermoje A galvijų sergamumas buvo mažesnis nei B fermoje, laikymo sistemos abiejose fermose yra tvartinio tipo – galvijai yra laikomi ūkiniuose pastatuose ištisus metus. B fermoje melžiamoms karvėms yra įrengta skreperių sistema, A fermoje naudojamos guoliavietės su pakratais. Tiriamajame ūkyje, fermoje B, veršelių mirtingumas ir sergamumas pasireiškė panašiais simptomais. Veršeliai gimdavo skurdukais arba stipriai viduriavo nuo pirmos savaitės iki 4-5 mėnesių amžiaus, kuomet gaišo arba buvo eutanizuojami dėl lėto augimo ir silpnumo. Tyrimų palyginimui buvo imami kraujo serumo mėginiai iš abiejų fermų gyvulių, siekiant nustatyti bendrą sergamumo tendenciją. Užtrūkintos karvės A fermoje vasaros metu kartais išleidžiamos į ganyklas, B fermoje visus metus laikomos tvartuose. Galvijams fermose sudaromos šėrimo programos, pašarai auginami ir paruošiami ūkyje. Vyrauja kukurūzų silosas, šienainis, šienas, papildomai perkami kombinuotų pašarų priedai. Visos karvės sėklinamos seksuota sperma. Nuo 2006 iki 2008 ūkyje buvo taikyta vakcinacija nuo galvijų infekcinio rinotracheito, tačiau nuo 2008 metų pabaigos vakcinacija buvo sustabdyta. A fermoje yra laikomi apie 750 galvijų, o B fermoje – apie 800 galvijų. Sudarytas B fermos galvijų judėjimo ir laikymo planas (4 pav.).
Buvo atlikta nuodugni virusinių ir kitų ligų analizė pienininkystės ūkyje, analizuojami ankstesnių metų laboratorinių ir epidemiologinių tyrimų rezultatai, renkami kraujo, fekalijų mėginiai ir daromi ekspres testai. Kraujo serumo mėginiai Nacionaliniame Maisto ir Veterinarijos rizikos vertinimo institute tirti naudojant serologinius metodus.
amžiaus veršelių, taip pat buvo tiriama 40 fekalijų mėginių iš veršelių iki 3 savaičių amžiaus Bovid-5 ekpres testams. Iš trisdešimt 1-Bovid-5 dienų amžiaus veršelių imtas kraujas ir atskyrus serumą tirti imunoglobulinų kiekiai. Penki kraujo mėginiai iš B fermos 3-4 mėnesių veršelių tirti, siekiant nustatyti GVD antigeną. GVDV antikūnams nustatyti, B fermoje sudarytos amžiaus grupės: 5-6 mėnesių veršeliai, 8-10 mėn. ir 12 ir daugiau mėn., viso 22 mėginiai. GP3, RSV ir GAV antikūnams nustatyti imta 10 kraujo mėginių iš 12 ir daugiau mėn. amžiaus.
3 pav. Tyrimo schema.
Suformuluoti tikslai ir uždaviniai
Literatūros apžvalga ir analizė
Parengiama metodika
Sudaromos tiriamosios grupės
Fermoje A veršeliai Fermoje B veršeliai
4 pav. B fermos galvijų laikymo planas.
2.2. Veršelių fekalijų tyrimas dėl viduriavimą sukeliančių patogenų
Ekspes testai Witness Bovid-5 buvo naudojami nustatyti apsikrėtimą 5 skirtingais ligų sukėlėjais ir fekalijų mėginiuose buvo nustatomi galvijų rota-, koronavirusų, E.coli K99, Kriptosporidijomis ir Giardia antigenai.
2.2.1. Bovid-5 ekspres testo naudojimo eiga
1. Steriliu vatiniu tamponu tiesiogiai iš analinės angos arba iš šviežių išmatų paimamas mėginys.
2. Tamponas su paimtu fekalijų mėginių dedamas į mėgintuvėlį su tyrimui skirtu skiedikliu, maišoma, kol mėginys susimaišo su skiedikliu, tamponas nuspaudžiamas per mėgintuvėlio sienelę ir išmetamas.
3. Palaukiama 30 sekundžių, kol įvyks sedimentacija, paimama vienkartinė sterili pipetė ir pritraukiama mėginio su skiedikliu turinio.
5 pav. Teigiamų, neigiamų ir blogai paimtų mėginių vertinimas.
2.3. Modifikuotas MakMasterio (McMaster) metodas
Daugelis žinomų helmintų geba į aplinką kartu su galvijų išmatomis išskirti helmintų kiaušinėlius. Pagal kiaušinėlių kiekį išmatose, galime nustatyti užsikrėtimo intensyvumą ir invazijos dydį. Tyrimams buvo naudojama MakMasterio kamera (sudaryta iš stiklelio su dvejais atskirais langeliais), flotacijos metodu nustatomas kiaušinėlių kiekis 1 g.
Tyrimo metodo nustatytas jautrumas yra dauginamas iš koeficiento 20, veršeliai yra laikyti apkrėstais, jeigu jų 1 g išmatų yra aptiktas nors 1 kiaušinėlis. Tyrimo metu nustatomas bendras bandos užsikrėtimas fermoje.
2.3.1. McMaster metodo metu naudotos priemonės • Mikroskopas (50x didinimo);
• McMaster kamera;
• Plastmasiniai indeliai (250ml talpos); • Marlės gabalėliai;
• Pipetės;
• Flotacinis tirpalas;
• Stikliniai mėgintuvėliai pritaikyti centrifūgai;
2.3.2. Modifikuoto MakMasterio (McMaster) metodo darbo eiga
1. Į plastmasinius indelius pasveriama po 4,0 gramus išmatų (0,1 gramo tikslumas). 2. Pagal proporciją 1g:14ml, užpilama ant išmatų 56 ml vandens.
3. Vanduo su išmatomis gerai išmaišomi mentele ir paliekami nusistovėti apie 30 min. 4. Pakartotinai išmaišius, visas mišinys perpilamas per marlę į kitą plastmasinį indelį. 5. Dar kartą išmaišius filtratą, atmatavus 10 ml supilama į mėgintuvėlį.
6. Dedama į centrifūgą ir centrifuguojama 1200 aps/min. greičiu apie 7-8 minutes.
7. Po centrifugavimo, su pipete paimamas paviršinis skystis, stengiantis nepajudinti nuosėdų.
8. Mėgintuvėlis su nuosėdomis yra pripildomas 4 ml flotacinio tirpalo.
9. Pipete gerai išmaišius (apie 10 kartų pritraukiant ir išpučiant be burbulų), užpildomos abi McMasterio kameros pusės.
10. Praėjus 4 minutėms, MakMasterio kamera mikroskopuojama 50x padidinimu.
11. Skaičiuojami ir identifikuojami kiaušinėliai. Helmintų rastas kiaušinėlių kiekis abiejose Mcmaster kamerų pusėse yra dauginamas iš koeficiento 20 ir taip nustatomas kiaušinėlių kiekis viename grame išmatų.
Tyrimo rezultatai priklauso nuo griežtų nurodymų laikymosi. McMaster kamera neturi turėti burbuliukų, reikia gerai išmaišyti flotacinį tirpalą kartu su nucentrifuguotu mėgintuvėlio turiniu. Tikslesniems skaičiavimams gali būti daromi pakartotiniai skaičiavimai, vėliau išvedant skaičiavimų vidurkį (Roepstorff, Nansen, 1998).
2.4. Imunoglobulinų nustatymo metodas
Norint patikrinti, ar fermos darbuotojai tinkamai sugirdo veršeliams krekenis, buvo renkamas veršelių nuo 1 iki 5 dienų amžiaus kraujas, siekiant serume nustatyti imunoglobulinų kiekį. Minėtojo imunoglobulinų kiekio nustatymas atliktas reagentų pagalba. Kraujas iš veršelių buvo imamas iš jungo venos į sterilius mėgintuvėlius, vakutainerius. Transportuojamas šaldytuve +2-4 °C ir per 24 valandas tiriamas pagal šią metodiką:
• Sukrešėjęs kraujas 10-15 min. yra centrifuguojamas 2000 aps./min greičiu.
• Viršutinis skaidrus serumo sluoksnis atsargiai nutraukiamas ir perpilamas į kitą mėgintuvėlį.
• Paruošiama 14, 16 ir 18 proc. natrio sulfito tirpalo koncentracija.
• Mėgintuvėliai pastatomi 1 val. kambario temperatūroje iki visiškos tiriamųjų mėginių precipitacijos pasireiškimo.
• Reakcijos rezultatai vertinami, atsižvelgiant į natrio sulfito koncentraciją, kurioje serumas precipitavo pagal 1 lentelę:
1 lentelė. Imunoglobulinų koncentracija 1-5 dienų veršelių kraujo serume. IgG koncentracija
mg/ml kraujo serume
Natrio sulfito 14 proc. tirpalas
Natrio sulfito 16 proc. tirpalas
Natrio sulfito 18 proc. tirpalas
Mažiau nei 5 - - +
Nuo 5 iki 15 - + ++
Daugiau nei 15 +++ +++ +++
Jeigu imunoglobulinų koncentracija normali, kraujo serumas gerai precipituoja (+++) visuose tirpaluose, jei 18 proc. ir 16 proc. tirpaluose įvyko, o 14 proc. skaidrus – tai bendra imunoglobulinų koncentracija kraujo serume gali būti apytikriai 5 mg/ml. Mažesnė nei 5mg/ml Ig koncentracija rodo, jog gauna labai mažai krekenų.
2.5. Statistiniai skaičiavimo metodai
Tyrimo rezultatai buvo apdoroti naudojantis Microsoft Office paketo Excel programa kartu su SPSS statistikos programa.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Gaištamumo ir gimstamumo analizė ūkio fermose
Išsami analizė, remiantis ūkio duomenimis, atlikta nuo 2011 iki 2018 metų. Fermoje A gimstamumas visais metais, išskyrus 2013 ir 2018 buvo didesnis, tai galima paaiškinti, jog skiriasi zoohigieninės sąlygos: ūkis A yra nežymiai didesnis, negu ūkis B, taip pat skiriasi laikymo tipas. Didžiausias gimstamumas užfiksuotas 2016 metais, jis 6,7 proc. didesnis negu visų kitų metų mediana. Fermos A ir B gimstamumo duomenys palyginami 6 paveiksle:
6 pav. A ir B fermų gimstamumo kreivės.
Nuo 2016 metų veršelių gaišimai pradėjo didėti abejose fermose. Visa tai galima susieti su 2015 metais labai karštu metų sezonu, taip pat ūkio darbuotojų kaita. Didžiausi gaišimai buvo 2012 metais B fermoje. Gaišimai B fermoje visais metais, išskyrus 2014 metus, buvo didesni (7 pav.).
Analizuojant 2018 metų duomenis, jaučiamas žymus veršelių gaišimų sumažėjimas po įvestos vakcinacijos. Nuo 9 mėnesio gaišimų procentas sumažėjo 21,2 proc., lyginant su visų prieš tai mėnesių mediana. Fermoje A tuo pačiu metu, kurioje vakcinacija nebuvo įvesta, gaišimo procentas sumažėjo 3,4 proc., lyginant su visų kitų mėnesių mediana. 2018 metų duomenų analizė atvaizduota 8 paveiksle:
8 pav. A ir B fermų 2018 metų išsami gaišimų,gimimų analizė
3.2. Epidemiologinių tyrimų rezultatai
9 pav. Teigiamų pirmuonių Eimeria užsikrėtimo procentas.
2018 metais atlikti pakartotiniai tyrimai dėl užsikrėtimo pirmuonimis. A fermoje apsikrėtimas pirmuonimis nenustatytas (0 proc. 0/20), B fermoje apsikrėtimas pirmuonimis Eimeria buvo daugiau negu pusė tiriamųjų (55 proc. 11/20), užsikrėtimas B fermoje didelis ir reikia imtis profilaktinių priemonių, statistiškai reikšminga (P=0,0004). Eimerijų užsikrėtimo B fermoje mediana buvo 419 oocistų 1g išmatų, o tarp užsikrėtusiųjų buvo 762 oocista 1g išmatų. Duomenys pateikti 10 paveiksle:
10 pav. Palyginimas A ir B fermos medianų oocistų 1g išmatų bendrai ir tarp užsikrėtusiųjų.
mėnesių galvijų grupėje buvo 20 proc., o 5-6 metų amžiaus 40 proc. (11 pav.), statistiškai lyginant duomenys reikšmingi (p<0,05).
11 pav. Palyginamieji GVD serologinių tyrimų rezultatai ūkio fermose.
Pakartotiniai GVDV infekcijos tyrimai, atlikti 2018 metais įvairiose amžiaus grupėse. Šiuo atveju tyrimo grupės buvo sudarytos pagal pagal tokią schemą: 5-6 mėnesių veršeliai, 8-10 mėn. ir 12 ir daugiau mėn. amžiaus grupė. Vyriausiųjų amžiaus grupėje buvo nustatytas 90 proc. (9/10) GVD viruso antikūnų nešiotojų. Siekiant nustatyti, ar vienintelis seroneigiamas mėginys buvo gautas ne iš PI galvijos, šio galvijo mėginys buvo pakartotinai ištirtas dėl antikūnų ir tyrimo rezultatas jau buvo teigiamas. Vadinasi, galime teigti, kad užsikrėtimas šioje 12+ mėn. galvijų grupėje buvo 100 proc. (10/10). Jaunesnių, 8-10 mėnesių amžiaus grupėje, seroteigiamų galvijų buvo 80 proc. (4/5), 5-6 mėn. amžiaus grupėje apsikrėtimas buvo 40 proc. (2/5). Bendras seroteigiamų santykis visose grupėse buvo 81,81 proc. (18/22), kas buvo statistiškai ženkliai daugiau, nei 2017 metais (P<0,05).
2017 metais atliktais tyrimais PG-3 apsikrėtimas B fermoje buvo 100 proc. (5/5), sekančiais metais pakartotinai daromi tyrimai kitose amžiaus grupėse parodė jog PG-3 antikūnų randama 100 proc. (10/10). Tuo pačiu metu taip pat atlikti pakartotiniai tyrimai dėl RSV ir GAV bei nustatyta, jog RSV užsikrėtimas nuo 2017 metų 40 proc. (2/5) sumažėjo iki 0 proc. (0/10) 2018 metais. Statistiškai GP3 užsikrėtimas labai reikšmingas (P<0,05).
2018 metais paimti 5 kraujo mėginiai iš B fermos 3-4 mėnesių veršelių, siekiant nustatyti GVD antigeną, tyrimai atlikti Nacionaliniame Maisto ir Veterinarijos rizikos vertinimo instituto laboratorijoje ELISA metodu, tačiau visi 5 mėginiai buvo neigiami.
Ištyrus 14 mėginių A fermoje, 10 mėginių iš 14 (71,42 proc.) buvo nustatytas sumažėjęs bendras Ig kiekis ir tik 4 iš 14 mėginių buvo su normaliu Ig kiekiu (28,58 proc.; 4/14). B fermoje – 5 iš 15 mėginių buvo su sumažėjusiu Ig kiekiu (33,33 proc.; 5/15), o 10 iš 15 mėginių buvo su normaliu Ig kiekiu (66,66 proc. 10/15). ). Vertinant statistiškai, šie skirtumai yra patikimi (P=0,02), duomenys pavaizduoti 12 paveiksle:
12 pav. Imunoglobulinų kiekio 1-5 dienų veršelių serume A ir B fermų palyginimas.
Imunoglobulinų kraujo serumo tyrimas parodė, jog skirtumų duomenys statistiškai yra reikšmingi ir yra matoma ryški tendencija, rodanti geresnį IgG įsisavinimą B fermoje, todėl to reiškinio priežastims nustatyti reikėtų atlikti platesnius tyrimus.
3.3. Veršelių sergamumo virškinamojo trakto ligomis ir vakcinacijos efektyvumo
palyginamais tyrimas
2018 metų vasaros metu padidėjus veršelių mirtingumui buvo nuspręsta atlikti Bovid-5 ekspres testus, siekiant nustatyti užsikrėtimą galvijų rota-, koronavirusų, E.coli K99, Kriptosporidijomis ir
Giardia antigenais. Buvo paimta 10 fekalijų mėginių, iš kurių 70 proc. buvo teigiami rotavirusiniam
aktyvaus imuniteto susidarymą, kuris po to jaunikliams užtikrina pasyvų imunitetą. Pasyvusis imunitetas visiems patogenams įgyjamas, veršeliams pradėjus gerti krekenas. Įgytas imunitetas saugo veršelius tol, kol jie yra girdomi surinktomis krekenomis dirbtiniu būdu. Natūraliai žindomų veršelių įgytas imunitetas rotavirusams išlieka ne mažiau kaip 7 d., o koronavirusams – mažiausiai 14 d..
Vakcinacijos nuo veršelių viduriavimo ligų efektyvumas buvo vertinamas pakartotinai Bovid-5 ekspres testais, ištyrus veršelių fekalijas po 5 mėnesių nuo vakcinacijos pradžios. Tyrimo metu B fermoje buvo suvakcinuota 70 užtrūkusių karvių. Išviso abejose fermose buvo ištirta 40 veršelių, gimusių iš vakcinuotų ir nevakcinuotų karvių mėginių. Bovid-5 ekspres testai (13 pav.) vertinami ir tyrimo rezultatai pateikti 2 lentelėje.
13 pav. Bovid-5 ekspres testo vertinimas, teigiamas rotavirusų Ag.
2 Lentelė. A ir B fermų tyrimo ekspres testais rezultatai po vakcinacijos
Tyrimo rezultatai A ferma (kontrolinė) B ferma (vakcinuota)
Teigiamų mėginių Teigiamų mėginių
n Proc. n proc. Galvijų rotavirusai 19 95 8 40 Koronavirusai 18 90 0 0 E.coli K99 0 0 0 0 Kriptosporidijos 0 0 1 5 Giardia antigenas 0 0 0 0 Patogenų nerasta 1 5 11 55
Mišri rota- korona virusų
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Nuo 2016 metų veršelių gaišimai pradėjo didėti abejose fermose, tai galima būtų susieti su 2015 metais labai karštu metų sezonu, taip pat ūkio darbuotojų kaita. Didžiausi gaišimai buvo 2012 metais B fermoje ir siekė net 15,1 proc. Tikslus veršelių sergamumo procentas tiriamajame ūkyje 1-3 mėn. grupėse nebuvo nustatytas, nes ūkyje dirbantys veterinarijos gydytojai ir felčeriai nefiksuoja visų sergančiųjų žurnaluose, tačiau lyginant su kitų šalių tyrimų duomenimis, kur veršelių sergamumas 1-3 mėn. grupėse buvo 4 proc., o 5 mėn. ir daugiau grupėse 3 proc. (45), yra matoma tendencija, jog mūsų tirtame ūkyje gaištamumas buvo daug didesnis, ypač atsižvelgiant į kritusių veršelių skaičių pirmosiomis gyvenimo savaitėmis. 2018 metų duomenimis, gimusių negyvų arba kritusių pirmąją savaitę, veršelių skaičius tiriamajame ūkyje tyrimo metu A fermoje buvo 10,9 proc., o B fermoje – 12,7 proc. ir 2015 metais atliktų tyrimų duomenimis buvo ženkliai didesnis nei Lietuvoje kritusių veršelių vidutinis skaičius – 5,3 proc. (46).
Mūsų tyrimas parodė, kad vakcinacija reikšmingai sumažino rota-, koronavirusų užsikrėtimą B fermoje, nes virusais infekuotų veršelių skaičius šioje fermoje buvo net 2,4 karto mažesnis negu nevakcinuotų kontrolinių gyvulių grupėje A fermoje. Kitų tyrimų duomenimis, darytais Jungtinėse Amerikos Valstijose 2007 metais, vakcinacija nuo žarnyno patogenų sumažina sergamumą ir virusų išskyrimą ir net 69,4 proc. ūkių vakcinuoja suaugusius galvijus arba veršelius (41).
Tačiau, nerimą kelia parazitinių pirmuonių aptinkamumas vakcinuotų veršelių grupės fekalijose. Būtent kriptosporidijos, kitų tyrėjų duomenimis, yra pavojingi jaunų veršelių žarnyno patogenai, galintįs sukelti ne tik viduriavimą, bet ir veršelių gaišimus (42). Todėl, mūsų nuomone, šioje fermoje vertėtų taikyti ir prevencinį gydymą nuo kriptosporidijų infekcijos bei kruopščiai taikyti ir vykdyti laikymo, dezinfekcijos ir kitas veršelių priežiūros priemones.
Naujai gimę veršeliai dažniausiai viduriuoja pirmomis gyvenimo savaitėmis. Bakteriniai, virusiniai ir parazitiniai faktoriai padidina viduriavimų intensyvumą. Tai yra vienas iš didžiausių faktorių galvijų fermose, nes taip paveikti veršeliai negali įsisavinti jiems skirtų pašarų ir tai veda link to, kad jie nesugeba priaugti svorio, net mažėja kūno masė, nuo ko veršeliai gaišta arba brokuojami. Veršeliams viduriuojant, turi būti suteikta skubi pagalba, skysčių terapija ir tiksli diagnozė, siekant nustatyti viduriavimų sukelėjus. Bovid-5 Ag testais gebama nustatyti pastaruosius greitai bei efektyviai ir tai vienas iš greičiausių diagnostinių sprendimų.
vakcinacijos planus. Šių testų privalumas yra tas, kad nėra kryžminės reakcijos su kitais veršelių viduriavimo sukelėjais. Jautrumas ir specifiškumas yra palyginamas su kitais metodais (polimerazės grandininės reakcijos ir ELISA), nurodomas 3 lentelėje.
3 lentelė. Sukelėjų jautrumas ir specifiškumas palyginus su PGR ir ELISA metodais.
Sukelėjas Jautrumas Specifiškumas Lyginimas su
Cryptosporidium 98.2% 99.0% PGR
Rotavirus 99.0% 98.0% PGR
Coronavirus 98.4% 98.0% PGR
E.coli K99 97.8% 99.0% PGR
Giardia 92.1% 99.1% ELISA
Pasyvaus imuniteto tyrimas parodė, kad abiejose fermose daliai veršelių buvo nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas. Vertinant statistiškai, šie duomenys buvo reikšmingi, todėl, siekiant geriausių rezultatų, reikėtų atkreipti dėmesį į veršelių krekenų sugirdymo laiką ir papildomai pravesti kursus ūkio darbuotojams. Pagrinde veršelių apsauga labai priklauso nuo krekenų antikūnų (kuriuos turi vakcinuotos karvės) per pirmas tris gyvenimo savaites, kol veršeliai patys įgys imunitetą. Vakcinacijos poveikis bus didžiausias, jeigu per šį laikotarpį krekenos bus girdomos tinkamai ir metodiškai. Visi veršeliai turi gauti pakankamai krekenų iš juos atsivedusių karvių per 6 val. nuo gimimo, o dar geriau - per pirmąsias 2 val. (44). Žindantįs veršeliai, girdomi iš vakcinuotų karvių, toliau gaus pakankamai krekenų. Karvių krekenys yra labai vertingas maisto ir imunoglobulinų šaltinis, todėl rekomenduotina rinkti vakcinuotų karvių krekenas. Mūsų atveju, B fermoje veršeliai yra girdomi tik iš vakcinuotų karvių gautomis krekenimis, kas labai sumažino sergamumą virusiniais enteritais. Krekenos gali būti laikomos 20 °C temperatūroje, tačiau jas būtina kuo greičiau sunaudoti. Jei įmanoma, krekenis rekomenduojama laikyti 4 °C temperatūroje arba užšaldytas (Godden, 2008). Mūsų tyrimas parodė, kad vakcinacija buvo efektyvi enteritų prevencijos priemonė B fermoje, tačiau A fermoje virusinis enteritas buvo labai dažnas. Vadinasi, optimalius veršelių sveikatingumo rezultatus galima pasiekti vakcinavimą taikant visoms ūkio karvėms. Tai padėtų iki minimumo sumažinti veršelių užsikrėtimo lygį ir vėlesnį virusų išskyrimą į aplinką.
IŠVADOS
1.
Lyginant gaištamumą ir sergamumą fermose A ir B, didžiausias gimstamumas užfiksuotas 2016 metais, jis 6,7 proc. didesnis negu visų kitų metų mediana. Didžiausi gaišimai buvo 2012 metais B fermoje. B fermoje 2018 metų 9 mėnesio gaišimų procentas sumažėjo 21,2 proc., lyginant su visų prieš tai mėnesių mediana. Fermoje A tuo pačiu metu, kurioje vakcinacija nebuvo įvesta, gaišimo procentas sumažėjo 3,4 proc. lyginant su visų kitų mėnesių mediana.2.
Pasyvaus imuniteto tyrimas parodė, kad abiejose fermose daliai veršelių buvo nustatytas nepakankamas pasyvus imunitetas. A fermoje nepakankamas Ig kiekis buvo nustatytas 71,42 proc., o B fermoje tokių veršelių buvo ženkliai mažiau – 28,58 proc. (P=0,002).3.
Fekalijų tyrimai dėl virusinių ligų sukelėjų rodo, jog A fermoje apsikrėtimas rota-, korona virusais buvo didesnis, negu B fermoje. E.coli K99, Kriptosporidijų ir Giardia antigenų nerasta nei A, nei B fermoje. Pirmuonių eimerijų apsikrėtimas A fermoje yra nulinis, palyginus su B fermoje, kur užsikrėtimo lygis buvo didelis ir statistiškai reikšmingas (P=0,0004). Vakcinacija B fermoje buvo efektyvi, nes reikšmingai sumažino virusinės kilmės enteritų pasireiškimą (P=0,0007).PRAKTINIAI PASIŪLYMAI
4 lentelė. Galvijų sergamumo mažinimo ir sveikatingumo priemonių planas.
Amžius Prevencijos priemonės
1 d. Krekenys ne mažiau 2 l, bambagyslės apdorojimas, draksinas Probiotikai (su krekenimis)
2-3 d. Krekenys, probiotikai, preparatai prieš kriptosporidijas B fermoje Vitaminizacija (vit. E ir selenas, pageidautina vit. A ir D)
4-5 d. Pergrupavimas
Antikokcidiniai preparatai
10 d. Vakcinacija nuo PG-3
1-1,5 mėn. Nuraginimas, draksinas Revakcinacija nuo PG-3
3 mėn. Vakcinacija nuo PG-3 ir GVD virusų gyvų nusilpnintų ar inaktyvuotų sukėlėjų vakcina
10 mėn. Revakcinacija nuo PG-3 ir GVD virusų. Gyvų nusilpnintų ar inaktyvuotų sukėlėjų vakcina
13-14 mėn. Telyčių vakcinacija prieš sėklinimą nuo GVD virusų infekcijos 14-15 mėn. Telyčių revakcinacija prieš sėklinimą nuo GVD virusų infekcijos.
15-16 mėn. Sėklinimas
23 mėn. (2 mėn iki veršiavimosi)
Vakcinacija nuo rota-, koronavirusų ir E. coli infekcijų sukeliamo veršelių enterito
Vitaminas E ir selenas 24 mėn (3 sav. iki
veršiavimosi)
Revakcinacija nuo rota-, koronavirusų ir E. coli infekcijų sukeliamo veršelių enterito (priklausomai nuo vakcinos rūšies, revakcinacija gali būti neatliekama)
25 mėn. Veršiavimasis
27 mėn. Karvių revakcinacija prieš sėklinimą nuo GVD virusų infekcijos Visos sekančios vakcinacijos nuo GVD kas 12 ar 24 mėn., priklausomai nuo naudojamos vakcinos
PADĖKA
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Kęstaitienė K, Šalomskas A, Jacevičius E, Petkevičius S, Lelešius R, Mockeliūnas R, Liutkevičienė V. Galvijų paragripo 3 ir respiratorinių sincitinių virusų paplitimo serologiniai tyrimai. Veterinarija ir zootechnika. 2009;47(69):2-4.
2. Šalomskas A, Jacevičius E, Kęstaitienė K, Petkevičius S, Lukauskas K, Liutkevičienė V, Milius J, Venskutonis D, Mockeliūnas R, Jokimas J. Ekonomiškai svarbių virusinių ligų paplitimas galvijų bandose. Veterinarija ir zootechnika. 2008;41(63):14-15.
3. Chase C. The impact of BVDV infection on adaptive immunity. Biologicals. 2013;41:52-60. 4. Chernick A, Ambagala A, Orsel K, Wasmuth JD., van Marle G, van der Meer F. Bovine viral diarrhea virus genomic variation within persistently infected cattle. Infection, Genetics and Evolution. 2018;58:218–223.
5. Ridpath JF. Bovine Viral Diarrhea Virus: Global Status. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2010;26(1):105–121.
6. Guzman E, Taylor G. Immunology of bovine respiratory syncytial virus in calves. Molecular Immunology. 2015;66(1):48–56.
7. Diéguez FJ, Yus E, Vilar MJ, Sanjuán ML, Arnaiz I. Effect of the bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection on dairy calf rearing. Research in Veterinary Science. 2009;87(1):39–40.
8. Walz PH, Grooms DL, Passler T, Ridpath JF, Tremblay R, Step DL, Givens MD. Control of Bovine Viral Diarrhea Virus in Ruminants. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2010;24(3):476–486.
9. Ellis JA. How efficacious are vaccines against bovine respiratory syncytial virus in cattle? Veterinary Microbiology. 2017;206:59–68.
10. Ren J, Zhang L, Cheng P, Zhang F, Liu Z, Tikoo SK, Du E. Generation of infectious clone of bovine adenovirus type I expressing a visible marker gene. Journal of Virological Methods.2018;15:15-18.
11. Ayalew LE, Kumar P, Gaba A, Makadiya N, Tikoo SK. Bovine adenovirus-3 as a vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2015;33(4);493–499.
12. Santman-Berends IM, Buddiger M, Smolenaars AJG, Steuten CDM, Roos CAJ, Van Erp AJM, Van Schaik G. A multidisciplinary approach to determine factors associated with calf rearing practices and calf mortality in dairy herds. Preventive Veterinary Medicine. 2014;117(2):375–387.
14. Rincke LE, VandeHaar MJ, Wolf CA, Liesman JS, Chapin LT, Weber Nielsen MS. Effect of intensified feeding of heifer calves on growth, pubertal age, calving age, milk yield, and economics. Journal of Dairy Science. 2011;94(7):3554–3567.
15. Raboisson D, Maigne E, Sans P, Allaire G, Cahuzac E. Factors influencing dairy calf and replacement heifer mortality in France. Journal of Dairy Science. 2014;97(1):202–211.
16. Cho Y, Yoon KJ. An overview of calf diarrhea - infectious etiology, diagnosis, and intervention. Journal of Veterinary Science. 2014;15(1):1.
17. Kapil S, Lamm CG, McVey DS, Detection of bovine respiratory coronavirus in beef cattle. In: Proceedings of the 27th annual meeting of the American Society of Virologists. Cornell University, Ithaca, NY. 2008;27:9–1.
18. Carman PS, Hazlett MJ. Bovine coronavirus infection in Ontario. Can Vet J 1992;33(12):812–4.
19. Storz J. Respiratory disease of cattle associated with coronavirus infections. Current veterinary therapy: food animal practice 4.1998;4:291–3.
20. Lin XQ, O’Reilly KL, Storz J. Antibody responses of cattle with respiratory coronavirus infections during pathogenesis of shipping fever pneumonia are lower with antigens of enteric strains than with those of a respiratory strain. Clin Diagn Lab Immunol 2002;9(5):1010–3.
21. Tsunemitsu H, Saif LJ. Antigenic and biologic comparisons of bovine coronavirus derived from neonatal calf diarrhea and winter dysentery of adult cattle. Arch Virol. 1995;14(7):1303–11.
22. Gamlen T., Richards KH., Mankouri J, Hudson L, McCauley J, Harris M, Macdonald A. Expression of the NS3 protease of cytopathogenic bovine viral diarrhea virus results in the induction of apoptosis but does not block activation of the beta interferon promoter. J Gen Virol. 2010;91:133-44.
23. Meyling A, Houe H, Jensen MA. Epidemiology of bovine virus diarrhoea virus. Scientifique et Technique.1990;11:75–93.
24. Mundt HC, Bangoura B, Rinke M, Rosenbruch M, Daugschies A. Pathology and treatment of Eimeria zuernii coccidiosis in calves: Investigations in an infection model. Parasitology International. 2005;54(4):223–230.
25. Daugschies A, Najdrowski M. Eimeriosis in cattle: current understanding. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 2005;52:417-427.
27. Radostits OM, Gay CC, Hinchcliff KW, Constable PD. Veterinary Medicine: A Textbook of the Diseases of Cattle, Horses, Sheep, Pigs and Goats, 10th ed. Elsevier Health Sciences. 2010;10:1498-1506.
28. Taylor MA, Catchpole J. Coccidiosis of domestic ruminants. Appl. Parasitol. 1994;35:73-86.
29. Rahmeto A, Abebe W, Bersissa K. Epidemiology of Eimeria Infections in Calves in Addis Ababa and Debre Zeit Dairy farms, Ethiopia. Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 2008;6:24-30.
30. Mockeliunienė V, Šalomskas A, Mockeliunas R, Petkevicius S. Prevalence and epidemiological features of bovine viral diarrhoea virus infection in Lithuania. Veterinary Microbiology. 2003;99:51–57.
31. Howard CJ. Immunological responses to bovine virus diarrhoea virus infections. Houe H1. Vet Microbiol. 1990;64(2-3):89-107.
32. Boileau MJ, Kapil S. Bovine Coronavirus Associated Syndromes. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2010;26(1):123–146.
33. Okba NM, Raj VS, Haagmans BL. Middle East respiratory syndrome coronavirus vaccines: current status and novel approaches. Current Opinion in Virology. 2017;23:49-58.
34. Newcomer BW, Chamorro MF, Walz PH. Vaccination of cattle against bovine viral diarrhea virus. Veterinary Microbiology. 2017;206:78–83.
35. Šalomskas A., Mockeliūnienė V., Jacevičius E., Lelešius R., Mockeliūnas R., Kliučinskas R., Petkevičius S. Galvijų infekcinio rinotracheito ir virusinės diarėjos diagnostikos ir prevencijos problemos. Veterinarija ir zootechnika. 2006;1:1–5.
36. Šalomskas A., Mockeliūnienė V., Mockeliūnas R. Galvijų virusinės diarėjos ir rotavirusinės infekcijos epizootologinių ypatumų palyginimasis tyrimas. Veterinarija ir zootechnika. 2005;1:2-4.
37. Bazeley M, Langoni O. Detection of Rota and Corona viral antigens in diarrheic newly born calves. Benha Veterinary Medical Journal. 2003;29(1):9-16.
38. Maclachlan N, Dubovi EJ. Fenner's Veterinary Virology 5th Edition. 2016;5:484-485. 39. Van Duijn L, Veldhuis AMB, Mars MH, Root B, Lam JGM. Efficacy of a voluntary BVDV control programme: Experiences from the Netherlands. The Veterinary Journal. 2017;7:40-44.
40. Janeway CA, Travers P, Walport M, Ellis JA, Belden EL. Effective Use of Vaccinations on Calf Operations to Reduce Incidence of Bovine Respiratory. WSU Animal Science and Veterinary Medicine. 2013;34:5-14.
https://www.aphis.usda.gov/animal_health/nahms/beefcowcalf/downloads/beef0708/Beef0708_is_ GenVacc.pdf.
42. Delafosse A, Chartier C, Dupuy MC, Dumoulin M, Pors I, Paraud C. Cryptosporidium parvum infection and associated risk factors in dairy calves in western France. Preventive Veterinary Medicine. 2015;118(4):406–412.
43. Cornelissen AWCA, Verstegen R, van den Brand H, Perie NM, Eysker M, Lam TJGM, Pijpers A. An observational study of Eimeria species in housed cattle on Dutch dairy farms. Veterinary Parasitology. 1995;56(1-3):7–16.
44. Uruakpa F, Ismond MA, Akobundu EN. Colostrum and its benefits: a review. Nutrition Research. 2002;22(6):755–767.
45. Gitau GK, McDermott JJ, Waltner-Toews D, Lissemore KD, Osumo JM, Muriuki D. Factors influencing calf morbidity and mortality in smallholder dairy farms in Kiambu District of Kenya. Preventive Veterinary Medicine. 1994;21(2):167–177.
PRIEDAI
1 priedas. Imunoglobulinų rezultatai A ir B fermose.
Imunoglobulinų kiekis fermoje Imunoglobulinų kiekis fermoje
A B
1 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 1 15+ Ig normalus
2 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 2 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 3 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 3 15+ Ig normalus
4 15+ Ig normalus 4 15+ Ig normalus 5 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 5 15+ Ig normalus
6 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 6 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 7 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 7 15+ Ig normalus
8 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 8 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 9 15+ Ig normalus 9 15+ Ig normalus
10 15+ Ig normalus 10 15+ Ig normalus
11 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 11 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 12 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 12 15+ Ig normalus
13 15+ Ig normalus 13 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 14 5-15 sumažėjęs Ig kiekis 14 15+ Ig normalus
15 15+ Ig normalus
