Radiodažninės abliacijos poveikis eksperimentinių avių širdžių skilvelių epikardiniams nervams

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS ANATOMIJOS INSTITUTAS

Linvydas Ivaškevičius

Radiodažninės abliacijos poveikis eksperimentinių avių širdžių skilvelių

epikardiniams nervams

Medicinos vientisųjų studijų BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS

Darbo vadovė: dr. Kristina Rysevaitė-Kyguolienė

TURINYS

1.SANTRAUKA ... 3

SUMMARY ... 4

2. PADĖKA ... 5

3. INTERESŲ KONFLIKTAS... 5

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5

5. SANTRUMPOS ... 6

6. ĮVADAS ... 7

7. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8

8. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

8.1 Intrakardinė nervinė sistema ... 9

8.2 Avies intrakardinės nervinės sistemos anatomija ... 10

8.3 Maršalo vena ... 10

8.4 Radiodažninės abliacijos poveikis audiniams ... 11

9. TYRIMO METODIKA ... 13

9.1 Medžiaga ... 13

9.2 Imunohistocheminio tyrimo protokolas ... 13

9.3 Mikroskopinis ir kiekybinis nervinių struktūrų tyrimas ... 15

9.4 Statistinė duomenų analizė ... 16

10. REZULTATAI ... 17

10.1 Dorsalinio paviršiaus epikardiniai nervai ... 17

10.2 Ventralinio ir dorsalinio paviršiaus epikardiniai nervai ... 18

11. REZULTATŲ APTARIMAS ... 22

12. IŠVADOS... 24

13. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 25

1. SANTRAUKA

L.Ivaškevičius. Radiodažninės abliacijos poveikis eksperimentinių avių širdžių skilvelių epikardiniams nervams. Medicinos studijų programos baigiamasis mokslinis darbas / mokslinė vadovė dr. Kristina Rysevaitė–Kyguolienė, Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas, Medicinos akademija,

Anatomijos institutas. Kaunas, 2017.

Tyrimo tikslas. Imunohistochemiškai ištirti radiodažninės prieširdžių abliacijos poveikį avių širdies skilvelių epikardiniams nervams.

Uždaviniai. 1. Ištirti radiodažninės abliacijos poveikį dorsalinio paviršiaus epikardiniams nervams.

2. Ištirti radiodažninės abliacijos poveikį ventralinio paviršiaus epikardiniams nervams 3. Palyginti epikardinių nervų pažaidos dydį tolstant nuo abliacijos vietos. 4. Ištirti skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulų tankumą epikardiniuose nervuose, po atliktos prieširdžių abliacijos.

Tyrimo metodika. Ištirtos devynios juodgalvių avių širdys, šesioms iš jų buvo atlikta prieširdžių radiodažninė abliacija. Imunochistocheminiu metodu buvo išryškinamos skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulos, naudojant tris nervinių skaidulų žymenis (tirozino hidroksilazę (TH), cholino acetiltrasferazę (ChAT) ir baltymo geno produktą 9,5 (PGP9,5)). Panaudojant AxioVision 4.8.1 (Zeiss, Gottingen, Germany) programoje įdiegtus AutoMeasure matavimo modulius, apskaičiuotas nervinių skaidulų tankumas.

Tyrimo rezultatai. Po atliktos prieširdžių RA dorsaliniame skilvelių paviršiuje statistiškai patikimai

(p<0,001) sumažėjo TH, PGP 9,5, ChAT imunoreaktyvių (IR) skaidulų kiekis. TH–IR skaidulų sumažėjo 16,66, PGP 9,5–IR 15,98 ir ChAT skaidulų 0,411 santykiniais vienetais. Tolstant nuo abliacijos vietos skaidulų kiekio sumažėjimas išliko pastovus. Ventraliniame paviršiuje taip pat statistiškai patikimai (p<0,05) 7,9 santykiniais vienetais sumažėjo TH–IR skaidulų kiekis, 0,647 ChAT–IR skaidulų tankumas,

PGP 9,5–IR skaidulų sumažėjimas statistiškai nereikšmingas. Palyginus avių po atliktos prieširždių abliacijos nervinių skaidulų tankumus tarp kairiojo ir dešiniojo priekinių skilvelių paviršių, nustatytas statistiškai reikšmingas adrenerginių skaidulų tankumo sumažėjimas 11,68 santykiniais vienetais ir bendrų nervinių skaidulų 7,93 santykiniais vienetais kairiajame skilvelyje.

Išvados. 1. Radiodažninė prieširdžių abliacija pažeidžia dorsalinio skilvelių paviršiaus epikardinius nervus. 2. Radiodažninė prieširdžių abliacija pažeidžia ventralinio skilvelių paviršiaus epikardinius nervus. 3. Tolstant nuo abliacijos vietos, pažaidos dydis epikardiniuose nervuose nesumažėjo. 4. Po atliktos prieširdžių abliacijos, epikardiniuose nervuose sumažėjo TH–IR, ChAT–IR, PGP9,5–IR skaudulų tankumas.

SUMMARY

Effects of Radiofrequency Ablation on the Epicardial Nerves in Experimental Sheep Heart Ventricles. Final Paper in the Program of Study in Medicine/ Academic Advisor: Dr. Kristina Rysevaitė – Kyguolienė, Institute of Anatomy, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2017. The goal of the study is to investigate the effects of radiofrequency ablation on the epicardial nerves in experimental sheep heart ventricles by the use of immunohistochemical methods.

Research objectives: 1. To investigate the effects of radiofrequency ablation on the epicardial nerves of the dorsal surface of the heart. 2. To investigate the effects of radiofrequency ablation on the epicardial nerves of the ventral surface of the heart. 3. To compare the size of epicardial nerve lesions away from the ablation area. 4. To analyse the density of various neurochemical phenotype fibres in the epicardial nerves following atrial ablation.

Research methods: Nine hearts of the blackfaced sheep were examined, six of which had undergone radiofrequency ablation of the atria. The fibres of various neurochemical phenotypes were highlighted by means of the immunohistochemical method using three markers for nerve fibres: Tyrosine Hydroxylase (TH), Choline Acetyltransferase (ChAT), and Protein Gene Product 9.5 (PGP 9.5). The density of the nerve fibres was calculated using AutoMeasure modules installed in the programme AxioVision 4.8.1 (Zeiss, Gottingen, Germany).

Research results: Following a successful radiofrequency ablation of the atria, a statistically

significant (p < 0.001) decrease in TH, PGP 9.5 and ChAT immunoreactive (IR) fibers was found in the dorsal surface of the ventricles. TH, PGP 9.5, and ChAT IR fibres decreased by 16.66, 15.98, and 0.411 relative units, respectively. Away from the ablation area, the decrease in fibre counts remained consistent. A statistically significant (p < 0.05) decrease in the TH and ChAT IR fibres was also detected on the ventral surface of the hearts, i.e. by 7.9 and 0.647 relative units, respectively. No significant difference in PGP 9.5 fibre density was observed. After comparison of nerve fibre density between anterior surfaces of the left and the right ventricles in sheep following atrial ablation, a statistically significant decrease was found in adrenergic fibres (by 11.68 relative units) and overall nerve fibres (by 7.93 relative units) in the left ventricle.

Conclusions. 1) Radiofrequency ablation of the atria results in lesions in the epicardial nerves of the dorsal surface of the ventricles. 2) Atrial radiofrequency ablation affects the epicardial nerves of the ventral surface of the ventricles. 3) Away from the ablation area, the size of epicardial nerve lesion remained consistent. 4) The density of the TH, ChAT, and PGP 9.5 immunoreactive fibres decreased in the pericardial nerves following radiofrequency ablation of the atria.

2. PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju savo mokslinio darbo vadovei gerb. m. dr. K. Rysevaitei-Kyguolienei už konsultaciją bei patarimus rašant šį darbą.

3. INTERESŲ KONFLIKTAS

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Leidimą išdavė Valstybinė Maisto ir veterinarijos tarnyba. Leidimo numeris 33ĮV-62. Leidimo išdavimo data 2014 02 05.

5. SANTRUMPOS

ANS – autonominė nervų sistema; FFT – fosfatinis fiziologinis tirpalas; INS – intrakardinė nervų sistema; ChAT – cholino acetiltransferazė; PGP 9,5 – baltymo geno produktas 9,5; PV- prieširdžių virpėjimas;

RA – radiodažninė abliacija;

TEM – transmisinė elektroninė mikroskopija; TH – tirozino hidroksilazė;

6. ĮVADAS

Avių širdys plačiai naudojamos kardiovaskuliniuose tyrimuose, nes jos turi daug panašumų į žmogaus (taip pat ir elektrofiziologinėmis sąvybėmis) [1]. Siekiant sudaryti galimybes tobulinti esamas ir kurti naujas prieširdžių virpėjimo gydymo strategijas, pagrįstas širdies nervinių struktūrų išsaugojimu, reikalinga ištirti bei aprašyti širdies inervacijos pokyčius po atliktos prieširdžių abliacijos. Atliktas išsamus širdies inervacijos tyrimas padėtų atskleisti abliacijos sukeltus pakitimus ir pažeidimus, bei sudarytų sąlygas atlikti itin lokalizuotas širdies chirurgines manipuliacijas, reikalui esant, atlikti selektyvias specifinių intrakardinių nervinių struktūrų stimuliacijas. Daugelyje tyrimų vertinti ir nagrinėti lokalūs prieširdžių audinių, nervinių struktūrų pažeidimai po atliktos prieširdių abliacijos ir dažniausiai tik abliacijos atlikimo vietoje [2,3,4]. Mūsų žiniomis, publikuotas tik vienas tyrimas, kuriame aprašyta širdies skilvelių nervinių struktūrų topografijos ir kiekio skirtumai, po atliktos prieširdžių abliacijos [5]. Abliacija pažeidžia nervus, nervines skaidulas, neuronus, kurie priklauso intrakardinei nervinei sistemai (INS) [6]. Ši sistema atlieka atlieka svarbų vaidmenį reguliuodama širdies ritmą, skilvelių bei prieširdžių refrakteriją, kontraktiliškumą [7], vainikinių kraujagyslių kraujotaką [8], koordinuoja parasimpatinių ir simpatinių eferentinių nervinių signalų patekimą į širdį [9]. Nustatyta, jog autonominė nervų sistema yra įvairių širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimų priežastis: širdies nepakankamumo, išeminių širdies ligų, aritmijų ar net staigios širdies mirties priežastis [10, 11, 12].

Taigi, imunochistocheminis autonominių skaidulų, lokalizuotų ant avių širdies skilvelių paviršiaus tyrimas tampa itin aktualus atskleidžiant galimus inervacijos pokyčius, po atliktos prieširdžių abliacijos. Mūsų darbe atlikta kairiosios lykinės venos srities radiodažninė abliacija, pažeistas kairysis nugarinis širdies subrezginys, iš kurio išeinantys nervai plinta į skilvelius. Skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulos skilveliuose pažymėtos imunochistocheminiu metodu ir skaičiuojamas jų tankis epikardiniuose nervuose.

Šio darbo tikslas – imunohistochemiškai ištirti radiodažninės prieširdžių abliacijos poveikį avių širdies skilvelių epikardiniams nervams.

7. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: imunohistochemiškai ištirti radiodažninės prieširdžių abliacijos poveikį avių širdies skilvelių epikardiniams nervams;

Uždaviniai:

1) Ištirti radiodažninės abliacijos poveikį dorsalinio paviršiaus epikardiniams nervams; 2) Ištirti radiodažninės abliacijos poveikį ventralinio paviršiaus epikardiniams nervams; 3) Palyginti epikardinių nervų pažaidos dydį tolstant nuo abliacijos vietos;

4) Ištirti skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulų tankumo pokyčius epikardiniuose nervuose, po atliktos radiodažninės abliacijos;

8. LITERATŪROS APŽVALGA

Nervų sistemos sritis susijusias su širdies nervine reguliacija morfologiškai galima suskirstyti į ekstrakardinę ir intrakardinę širdies inervaciją [13]. Smegenų žievės bei požievio sritis, dalyvaujančias adaptuojant širdies veiklą prie kintančių aplinkos sąlygų apjungia ekstrakardinė širdies inervacija [14]. Intrakardinė širdies inervacija apjungia kyliančiąsias ir nusileidžiančiąsias nervines skaidulas bei autonominius nervinius mazgus, kurie išsidėsto širdies paviršiuje ir kartu su nervinėmis skaidulomis suformuoja širdies sienos nervinį rezginį, kuris vadinamas intrakardine nervų sistema (INS) [15].

Intrakardinė nervų sistema svarbi reguliuojant širdies ritmą [7], kontraktiliškumą ir kraujo tekėjimą vainikinėmis kraujagyslėmis [8]. INS taip pat reguliuoja kardiovaskulinius refleksus, koordinuoja parasimtpatinių ir simpatinių eferentinių postganglinių skaidulų patekimą į širdį [9]. Anatomiškai INS iš nervinių mazgų formuoja rezginius, kurie pasiskirsto epikarde, miokarde ir endokarde. Epikarde yra daugiausia mazgų ir storiausi nervai [16]. Nustatyta, kad širdies nerviniai mazgai daugiausia pasiskirstę tam tikrose prieširdžių dalyse apie sinusinį prieširdžio mazgą (n.sinuatrialis) , ties v.cava ir plautinių venų įėjimo vieta ir šalia n.atrioventricularis [17]. Ant atskirų riebalinių sričių, esančių širdies paviršiuje, pasiskirsto postgangliniai neuronai [17]. Jie reguliuoja tam tikras širdies funkcijas. Epikardo riebalinėse srityse ties vv. pulmonales dex. išsidėsto mazginės ląstelės, kurios sukelia neigiamą chronotropinį poveikį [18], mazginės ląstelės, esančios riebalinėse srityse tarp dešiniojo prieširdžio apatinės dalies ir vena cava inferior, slopina

AV mazgo laidumą [18]. Riebalinėse srityse, kurios randamos ventralinėje kairiojo skilvelio bazinėje dalyje (netoli jungties su dešiniuoju skilveliu), taip pat yra mazginių ląstelių. Jos sukelia neigiamą inotropinį n.vagus poveikį kairiajame skilvelyje [18]. Tačiau šios ląstelės neveikia nei chronotropinės, nei dromotropinės širdies funkcijos. INS atlieka svarbiausią vaidmenį sukeliant prieširdžių virpėjimą ir jį palaikant [19]. Tai vyksta dėl simpatinės sistemos ir n.vagus aktyvacijos, kuri sutrumpina veikimo potencialo trukmę ir efektyvųjį refrakterijos periodą prieširdžiuose [20]. Atlikti tyrimai, kuriuose gilinamasi į širdies n.vagus denervaciją naudojant radiodažninę abliaciją. Manoma, kad nors ir po atliktos abliacijos nustatomas mazgų ląstelių bei nervinių skaidulų netekimas, tačiau su laiku prieširdžių virpėjimai vėl atsiranda, grižtama į būklę prieš abliaciją. Tai, manoma, įvyksta dėl reinervacijos [21].

8.2 Avies intrakardinės nervinės sistemos anatomija

Kadangi mes tyrėme avis, todėl svarbu įsigilinti į šių gyvūnų intrakardinę nervų sistemą, kuri išsamiausiai ištirta LSMU Anatomijos instituto publikuotame, I. Saburkinos ir kitų autorių straipsnyje [22]. Remiantis straipsnio duomenimis avių ekstrakardiniai nervai, pasiekę avies skilvelių epikardą ties arterine širdies vartų dalimi, t.y. tarp plautinio kamieno ir kylančiosios aortos žiočių, išsišakoja arterinio kūgio nervinių mazgų lauke ir išplinta abiejų skilvelių ventraliniame paviršiuje iki pat viršūnės, sudarydami retus nervinius rezginius vainikinių arterijų adventicijoje. Veninės širdies vartų dalies epikardiniai nervai, kurie, prasiskverbę ties kairiosios lykinės ir kairiosios plautinės venų žiotimis, driekiasi prieširdžių paviršiumi ir kirtę vainikinę vagą, pasiekia avies skilvelių dorsalinį ir ventralinį paviršius [22]. Taigi nervai patekę į širdį, šakodamiesi suformuoja epikardinį nervinį rezginį, kuris yra pagrindinis širdies vidinės inervacijos šaltinis [23]. Avies širdies rezginys yra skirstomas į penkis subrezginius [22]. Mums svarbus kairysis užpakalinis subrezginys, nes būtent jo projekcijoje buvo atlikta abliacija ir audinių pažaida.

Kairiojo užpakalinio subrezginio ikimazginiai neuronai į epikardą patenka per kairiojo skilvelio raukšlę, kuri išsidėsto priekyje kairiosios viršutinės plautinės venos [22]. Dalis šių nervų tiesiogiai plinta į kairiosios ausytės sritis. Jose aptikta maža dalis epikardinių mazgų. Įprastai šis subrezginys turi apie 39% visų širdyje esančių mazgų. Didžioji dalis subrezginio užmazginių neuronų praeina per kairiąją užpakalinę vainikinę vagą ir išplinta kairiojo ir dešiniojo skilvelio užpakaliniame paviršiuje. Mažiau skaidulų plinta į priekinį kairiojo skilvelio paviršių [22].

8.3 Maršalo vena

Prieširdžių virpėjimo gydymas radiodažnine abliacija (RA) yra pagrįstas aritmogeninio židinio sunaikinimu [24]. Šešioms Juodgalvėms avims RA buvo atlikta Maršalo venos srityje. Todėl svarbu išsiaiškinti kokią įtaką ritmo sutrikimams atsirasti turi ši struktūra. 1850 metais John Marshall apibūdino ir aprašė

„vestigial fold of the pericardium” , „rudimentinę perikardo raukšlę“, embrioniniu vystymosi laikotarpiu

buvusią kairiojo prieširdžio įstrižinę veną. Ši raukšlė nuo tada žinoma kaip Maršalo raištis žmogaus širdyje. Maršalo raištis mokslinėje literatūroje neretai vadinamas ir Maršalo vena, nes kai kuriuose keturkojuose gyvūnuose (avyse, šunyse) yra išlikęs venos spindis, nors dažniausiai vena tampa skaiduliniu ruoželiu [25]. Maršalo raištyje yra smulkių kraujagyslių, jungiamojo skaidulinio audinio, raumeninių pluoštelių (Maršalo pluoštelių) ir nervinių skaidulų [26]. Eksperimentiniuose bandymuose įrodyta, kad Maršalo raukšlė gali būti paroksizminio prieširdžių virpėjimo šaltinis [27]. Taip pat yra užfiksuota, kad

ilgalaikio prieširdžių virpėjimo metu iš Maršalo raukšlės srities kyla greiti impulsai [28]. Dėl sudėtingų raumenų skaidulų jungčių su šalia esančiu prieširdžio miokardu [27], Maršalo raukšlė taip pat gali turėti įtakos grįžtamojo rato sužadinimui [29]. Be to, Maršalo raukšlė, gali būti papildomo laidumo tako dalis pacientams, kuriems pasireiškia priešlaikinio sužadinimo sindromas [30]. Maršalo pluošteliai tiesiogiai susijungia su kairiojo prieširdžio laisvos sienelės miokardu. Anatomiškai Maršalo raukšlė dalinama į artimąją, vidurinę ir tolimąją dalis. Artimoji dalis tiesiogiai jungiasi su vainikinio ančio raumeninėmis skaidulomis. Vidurinė Maršalo pluoštelių dalis jungiasi su kairiosiomis plautinėmis venomis, o tolimoji dalis tęsiasi už kairiųjų plautinių venų [31]. Imunohistocheminiais tyrimais patvirtinta, jog, Maršalo raukšlėje yra simpatinių ir parasimpatinių nervinių skaidulų [32].

8.4 Radiodažninės abliacijos poveikis audiniams

Kokią vietinę pažaidą sukelia radiodažninė abliacija avių širdies audiniams atskleidžia histologinis tytimas. Mėginiai histologiniams tyrimams buvo paimti iš abliacijos zonos. Naudojant hematokslino – eozino dažymo būdą, preparatai analizuoti šviesiniu mikroskopu [33]. Abliuoti bandomieji mėginiai atitiko miocitų pažeidimo charakteristikas. Miokardo ląstelės buvo susitraukusios, degeneravusi jų citoplazma. Buvo stebimas padidėjęs atstumas tarp miocitų dėl intesticinės edemos [33]. Žymiausi morfologiniai pokyčiai: sarkoplazminio tinklo vakuolizacija, ląstelės suapvalėjusios, neaiškiomis membranomis, nenormalus arba sumažėjęs ruožuotumas. Gyvų miocitų abliacijos vietoje neaptikta, buvo nustatytas tolygus fibrozavusio audinio perėjimas į normalų prieširdžio miokradą [33]. Šie morfologiai pokyčiai matėsi ir makroskopiškai. RA metu buvo sukelti degeneraciniai nukleocitoplazminiai ląstelių pokyčiai, miocitų žūtis. Šie morfologiniai požymiai parodo, kad pokyčiai sukelti negrįžtamai ir ląstelės neišliko gyvos [33]. Kitame tyrime su avių širdimis po atliktos prieširdžių abliacijos buvo naudotas imunochistocheminis metodas, išryškinant nervines epikardo skaidulas prieširdyje [34]. Skaidulų tankis ištirtas 1cm2 plote apie abliacijos zoną. Naudoti antikūnai prieš tiroksilo hidroksilazę (TH) ir cholino acetiltrasferazę (ChAT), atitinkamai pažymintys simpatines ir parasimpatines skaidulas. Tarpusavyje lyginant kontrolinę grupę ir abliuotus preparatus, nustaytas reikšmingas adrenerginių ir cholinerginių skaidulų tankio sumažėjimas tiriamojoje grupėje [34].

Iki šiol tik viename publikuotame straipsnyje pateikiami duomenys apie distalinių nervų pažaidą po atliktos prieširdžių abliacijos [35].Visose abliuotose avyse, praėjus nuo dviejų iki trijų mėnesių po atliktos epikardo kairiosios ir viduriniosios plautinių (PV) venų šaknų srities RA, dauguma kairiojo dorsalinio nervinio subrezginio epikardinių nervų nesidažė acetilcholisteraze (AChE) ties RA vieta (pvz.

ties abliuota kairiąja ir viduriniąja PV šaknimi). Tačiau trijose (60%) tirtose širdyse histochemiškai nustatyta keletas plonų epikardinių nervų (RA vietoje), kurie dažniausiai randami griovelyje aplink kairiają kranialinę veną [35]. Žemiau abliacijos vietos, ties kairiuoju dorsaliniu subrezginiu gerai įvyko reakcijos ir gerai nusidažė su AchE. Taip pat nebuvo jokių struktūrinių pokyčių kairiajame vainikiniame antyje bei visame dorsaliniame kairiojo skilvelio paviršiuje. Panašiai buvo ir tiriant mikroskopu kontrolinius epikardinius nervus – abliuotų gyvūnų dešiniajame ventraliniame nerviniame subrezginyje nustatytos stipriai teigiamos AchE reakcijos ir jokių struktūriškai matomų pokyčių (palyginus su nepaliestu, sveiku subrezginiu kontrolinėje grupėje [35]. Nudažius kontrolinės grupės epikardo nervines skaidulas iš dešiniojo ventralinio ir kairiojo dorsalinio subrezginio buvo pastebėtos tankiai išsidėsčiusios adrenerginės ir cholinerginės nervinės skaidulos, kurios tolygiai pasiskirstė pjūvyje. Tačiau pašalinti vainikinio ančio sienelės ir dorsaliniai kairiojo skilvelio nervai turėjo pastebimai mažiau ir nevienodai nusidažiusių ChAT-IR ir TH-IR aksonų [35].

Visų kontrolinių grupių epikardinių nervų transmininės elektroninės mikroskopijos (TEM) analizė parodė, kad mielininės ir nemielininės skaidulos turėjo visiškai normalią aksonų struktūrą. Pvz. tolygiai pasiskirsčiusios neurotubulės, gerai įžiūrimos mitochindrijos bei lygiojo endoplazminio tinklo cisternos [35]. Priešingi pokyčiai buvo pastebėti distalinėje srityje nuo RA vietos: žymūs mielinizuotų ir nemielinizuotų nervinių skaidulų ultrastruktūrų pokyčiai vainikinio ančio srityje ir kairiojo skilvelio dorsalinėje pusėje [35]. Neįprastos nervinės skaidulos buvo išbrinkusiais aksonais, gausiomis vakuolėmis ir suirusiomis aksolemomis, neurotubulėmis ir mielininiais dangalais. Palyginus su kontrolinės grupės nervais, pažeistos nemielinizuotos nervinės skaidulos buvo paveiktos: susitraukusios, laisvu endoneuriumu [35]. Vis dėlto, epikardiniuose nervuose, kurie buvo distaliau nuo RA vietos, atsitiktinai buvo aptikti normalūs nemielinizuotų nervinių ksiadulų pluoštai. Kiekybinė TEM nuotraukų analizė parodė reikšmingą pokytį tarp nervinių skaidulų, esančių abliuotų bei kontrolinių avių prieširdžių ir skilvelių epikardiniuose nervuose [35].

9. TYRIMO METODIKA

Devynios, abiejų lyčių juodagalvės avys (34±5 kg) buvo gautos iš gyvūlininkystės ūkių, bendradarbiaujant su LSMU Veterinarijos akademijos Stambiųjų gyvulių klinika. Gyvūnai ir jų organų panaudojimas moksliniams tyrimams buvo atliekamas atsižvelgiant į Lietuvos Respublikos Maisto ir veterinarijos tarnybos nustatytas laboratorines praktikos taisykles. Šešioms avims buvo atlikta Maršalo raukšlės radiodažninė abliacija. Avims atlikta sedacija 0,1mg/kg ksilazinu, midazolamu 0.03 mg/kg ir nuskausminimas 2mg/kg ketaminu į raumenį. Gyvūnai intubuoti ir ventiliuoti. Taip pat sukelta bendra anestezija 5 μg/kg fentalinu, kuri buvo palaikoma halotano dujomis, naudojant ciklinį kvėpavimo aparatą. Anestezuotoms avims atlikta kairė šoninė torakotomija penktame tarpšonkauliniame tarpe. Identifikavus Maršalo raukšlę, atlikta radiodažninė abliacija, naudojant 20W galią 500 kHz dažniu, sukuriant muo 2 iki 2,5cm koaguliacinę liniją išilgai Maršalo raukšlės. Trys avių širdys buvo naudotos kaip kontrolė.

Po 4 – 5 mėnesių avims buvo atlikta eutanazija suleidžiant mirtiną natrio tiopentalio dozę į veną (100 mg/kg). Atvėrus krūtinę, širdis būdavo išimama bei per kylančiąją aortą švirštu perfuzuojama atšaldytu

0,01M fosfatiniu fiziologiniu tirpalu (FFT) su druska. Išplovus kraują iš širdies kamerų bei kraujagyslių, buvo perfuzuojama 4% paraformaldehido fiksatoriumi fosfatiniame buferyje, bei laikoma jame 2 val. kol audiniai užsifiksuos. Vėliau buvo plaunama 3x10 min. FFT, bei karpomi širdies gabaliukai pagal pateiktą schemą (9.2.1 pav.). Avių širdžių skilveliai buvo topografiskai padalinti ir supjaustyti į atskiras dalis, atsižvelgiant į avių širdies nervinų subrezginių ir jų skaudulų plitimo kelius. Iškirpti širdies gabaliukai buvo laikomi +4oC 25% sacharozės tirpale fosfatiniame buferyje 1-2 dienas, kol nugrims į dugną. Po to gabaliukai būdavo greitai užšaldomi panaudojant skystą azotą, bei laikomi -40oC šaldiklyje.

9.2 Imunohistocheminio tyrimo protokolas

Atskiri skilvelių gabalėliai, naudojant kriotomą CryoStar NX70 (Thermo Fisher Scientific, Vokietija) , buvo orientuojami ir pjaustomi taip, kad pjūvyje būtų matomi epikardinių nervų skersiniai pjūviai bei miokardiniai mervai ir skaidulos. 18µm storio šaldyti pjūviai, buvo perkeliami ant SuperFrost (Thermo Fisher Scientific, Vokietija) objektinių stiklelių, bei išdžiovinami kambario temperatūroje. Prieš atliekant reakciją su antikūnais, preparatai plaunami 3 kartus po 10 min FFT su 0,5% Triton X-100 (CarlRoth, Karlsruhe, Vokietija), vėliau 2 val. patalpinami blokuojančiame tirpale, turinčiame 5% normalaus asilo serumo (angl. normal donkey serum, NDS; CarlRoth, Vokietija), siekant sumažinti

nespecifinę imunohistocheminę reakciją į antikūnus. Vėliau preparatai buvo tris kartus po 10 minučių skalaujami tik su FFT ir inkubuojami tirpale su pirminiais antikūnais 24 valandoms 4°C temperatūroje. Įvykus pirminių antikūnų reakcijai su antigenais, preparatai tris kartus buvo plaunami su FFT ir 2 valandas inkubuojami antrinių antikunų mišinyje (9.2.2 lentelė). Paėjus 2 valandoms preparatai tris kartus po 10 minučių plaunami tik su FTT. Išimti iš fasfatinio fiziologinio tirpalo preparatai buvo užliejami Vectashield (Vector Laboratories, JAV) dengiamąją terpe, uždengti dengiamuoju stikleliu, o kraštai hermetiškai užsandarinami skaidriu nagų laku.

9.2.1 pav. Avies širdies paviršių sritys: a – ventralinis paviršius, b – dorsalinis paviršius 1. Didžiosios

širdies venos sritis 2. Nugarinio kairiojo skilvelio paviršiaus viršutinė šoninė sritis 3. Nugarinio kairiojo skilvelio paviršiaus viršutinė vidurinė srtitis 4. Nugarinio dešiniojo skilvelio paviršiaus viršutinė sritis 5. Nugarinio kairiojo skilvelio paviršiaus vidurinės dalies šoninė sritis 6. Nugarinio dešiniojo skilvelio paviršiaus vidurinė dalis 7. Nugarinio kairiojo skilvelio paviršiaus vidurinės dalies vidinė sritis 8. Nugarinio kairiojo skilvelio paviršiaus vidurinė dalis 9. Nugarinio kairiojo skilvelio paviršiaus apatinė dalis 10. Nugarinio dešiniojo skilvelio paviršiaus apatinė sritis 11. Priekinio kairiojo skilvelio paviršiaus vidurinė dalis 12. Priekinio dešiniojo skilvelio paviršiaus vidurinė dalis. (Modifikuota pagal Saburkina et al., 2010.)

9.2.2 lentelė Naudotų antikūnų sąrašas

Imunoglobulinai Kilmė Skiedimas Katalogo nr. Gamintojas

Pirminiai prieš: PGP 9,5 Pelė 1:1000 AB 8189 1 PGP 9,5 Triušis 1:2000 AB 1761 1 TH Triušis 1:1000 AB 152 1 TH Pelė 1:800 MAB 318 1 TH Ožka 1:500 AB 1542 2

ChAT Pekė 1:800 MAB 305 2

ChAT Ožka 1:500 AB 144P 1

Imunoglobulinai Kilmė Skiedimas Katalogo nr. Gamintojas

Antriniai prieš: Pelę Asilas 1:300 AB 96593 1 Pelę Asilas 1:500 AP 195F 1 Triušį Asilas 1:200 AP 180C 1 Triušį Asilas 1:500 AP 182C 2 Ožką Asilas 1:300 AP 184F 1

1 – Abcam, Cambridge, UK;

2 – Chemicon International, California, Temecula, USA;

9.3 Mikroskopinis ir kiekybinis nervinių struktūrų tyrimas

Naudojant fluorescencinį mikroskopą AxioImager Z1 su Apotomu, įdiegta AxioVision 4.8.1 programine įranga (Zeiss, Gottingen, Germany), Axiocam MRm monochromine skaitmenine fotokamera ir naudojant filtrus, kurie sužadina fluoresceino (FITC) ir cianino (Cy3) sujungto su antriniais antikūnais fluorescenciją, buvo forografuojamos išryškintos epikardinės nervinės strukturos. Pirmiausia 5x objektyvu fotografuojami pilni imunochistocheminiu metodu parengti preparatų vaizdai (pjūviai), naudojant AxioVision Mosaic modulį. Tuomet buvo nustatomos tiriamų nervinių strukūrų topografijos epikarde ir 40x objektyvu vizualizuojamos atskiros imunochistochemiškai išryškintos struktūros (epikardiniai nervai).

Panaudojant AxioVision 4.8.1 programoje įdiegtus AutoMeasure matavimo modulius, mikrofotografijose buvo apvedamas kiekvieno epikardinio nervo kontūras ir suskaičiuotas apvestame plote esančių nervinių skaidulų santykinis dydis (9.3.1 pav.).

9.3 pav. AxioVision 4.8.1 (Zeiss, Gottingen, Germany) programoje įdiegtas AutoMeasure matavimo modulis. Raudona linija apvestas epikardinis nervas.

9.4 Statistinė duomenų analizė

Kiekybiniai duomenys buvo statistiškai analizuojami, naudojant IBM SPSS v. 17.0 programinę įrangą. Pasiskirstymo normalumas duomenų imtyje buvo patikrinamas Levene‘s testu. Parametriniam dviejų nepriklausomų grupių duomenų vidurkių statistiniam skirtumų palyginimui buvo taikytas Student‘o t-testas, pasirinkus 95% pasikliovimo lygmenį (p < 0,05). Skilvelių epikardo nervinių skaidulų santykinis tankis buvo skaičiuojamas nervinių skaidulų plotą dalinant iš nervo ploto. Kiekybiniai duomenys pateikti aritmetiniu vidurkiu ± standartine vidurkio paklaida. Raide „n“ žymimas imties dydis.

10. REZULTATAI

Nustatyti kiekybiniai imunohistocheminiai nervinių skaidulų tankio epikardiniuose nervuose skirtumai tarp abliuotų ir kontrolinių avių skilvelių nugarinio paviršiaus, naudojant tris imunohistocheminius nervinių struktūrų žymenis. TH – andrenerginėms skaiduloms, ChAT – cholinerginėms skaiduloms ir PGP 9,5 – (nespecifinis markeris), pažymintis visas nervines struktūras (adrenerginias, cholinerginias, juntamąsias). Siekiant tiksliau ištirti distalinių epikardinių nervų pažaidą po atliktos prieširdžių abliacijos ir palyginti kaip kinta pažaidos dydis tolstant nuo abliaciacijos vietos, skilveliai buvo padalinti į tris zonas: pagrindą (1,2,3,4) vidurinę dalį ( 5,6,7,8) ir viršūnę (9,10), (9.2.1 pav.).

Gauti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp simpatinių skaidulų tankio abliuotų ir kontrolinių avių epikardiniuose nervuose, trijose skilvelių zonose (pagrinde, vidurinėje dalyje ir viršūnėje), po abliacijos, TH imunoreaktyvių (IR) skaidulų tankis sumažėjo, p<0,001 (10.1 lentelė) . Nustatyti statistiškai patikimi skirtumai trijose zonose tarp bendrą inervaciją žyminčio PGP 9,5 tankio. PGP 9,5–IR skaidulų kiekis sumažėjo po abliacijos, p<0,001 (10.1 lentelė). Cholino acetiltransferazei pozityvių skaidulų po abliacijos sumažėjo, tačiau statistiškai reikšmingi pokyčiai nustatyti tik skilvelio vidurinėje dalyje (p<0,001). Cholinerginės inervacijos šaltinių (skaidulų) skilvelių epikardiniuose nervuose yra labai mažai, todėl šiuo atveju sunku objektyviai vertinti tikruosius pokyčius, nors ChAT-IR skaidulų kiekis tendenciškai sumažėjęs visame nugariniame paviršiuje. Didžiausią kiekį visuose nervuose sudarė PGP 9,5 imunoreaktyvios skaidulos (10.1 lentelė).

Palyginus skilvelių pagrindo, vidurinės dalies ir viršūnės skaidulų tankį distalinuose nervuose, širdyse po atliktos prieširdžių abliacijos, skirtumų tarp TH–IR, ChAT–IR ir PGP 9,5–IR skaidulų tankio nenustatyta. Taigi pažaidos dydis distaliniams nervams plintant link širdies viršūnės ir tolstant nuo abliacijos zonos nesiskyrė.

10.2 Ventralinio ir dorsalinio paviršiaus epikardiniai nervai

Kiekybiniai imunohistocheminiai nervinių skaidulų tankio skirtumai epikardiniuose nervuose nustatyti lyginant abliuotos širdies dorsalinį ir ventralinį skilvelių paviršius. Nugariniame abliuotų širdžių paviršiuje TH imunoreaktyvių skaidulų santykinis dydis ištyrus 342 nervus buvo 37,60±0,85, priekiniame paviršiuje 45,40±2,26, n=62 (10.2.1 pav.). Vidurkių skirtumas statistiškai patikimas, p<0,05. Statistiškai reikšmingai sumažėjęs PGP 9,5 imunoreaktyvių skaidulų tankis dorsaliniame paviršiuje, p<0,02(10.2.1 pav.) Nugariniame paviršiuje 368 nervuose tankis yra 46.13±0.80, priekiniame paviršiuje tankis 56 nervuose 53.75±2,41. ChAT pozityvių skaidulų tankis statistiškai nesiskyrė (10.2.1 pav.)

N ervi ni ų s ka idu lų t anki s 60 50 40 30 20 10 0 53.75 44.4 46.13 37.6 0.467 0.593 TH PGP 9.5 ChAT Imunohistocheminis žymuo

Dorsalinis pav. Ventralinis pav.

10.2.1 pav. Nervinių skaidulų tankis dorsaliniame ir ventraliniame skilvelių paviršiuje, po atliktos prieširdžių abliacijos.

Bendras skaidulų kiekis (PGP 9,5) ir adrenerginių skaidulų tankis reikšmingai mažesnis nugariniame skilvelių paviršiuje, p<0,05. Cholinerginių skaidulų tankis mažesnis dorsaliniame paviršiuje, tačiau p>0,05 (10.2.1 pav.)

Abliuotų avių širdyse skirtumas tarp dešiniojo ir kairiojo skilvelių darsalinio paviršiaus nervinių skaidulų tankumo nedidelis ir statistiškai nereikšmingas (10.2.2 pav).

N ervi ni ų s ka idu lų t anki s 60 50 40 30 20 10 0 45.84 46.83 37.57 37.31 0.47 0.521 PGP 9,5 TH ChAT Imunohistocheminis žymuo

Kairys skilvelis Dešinys skilvelis.

10.2.2 pav. Nervinių skaidulų tankis kairiojo ir dešiniojo skilvelio dorsaliniame paviršiuje, po RA.

N ervi ni ų s ka idu lų t anki s 70 60 50 40 30 20 10 0 59.17 53.75 52.3 44.4 0.593 1.24 PGP 9,5 TH ChAT Imunohistocheminis žymuo Po abliacijos Kontrolė

10.2.3 pav. Tiriamųjų ir kontrolinių avių nervinių skaidulų tankis priekiniame viduriniame skilvelių paviršiuje.

Palyginome abliuotų avių širdžių ir kontrolinių avių širdžių priekinius vidurinius skilvelių paviršiaus nervus ir nustatėme bendrų nervinių skaidulų (PGP 9,5) tankio sumažėjimą, po atliktos RA prieširždių abliacijos. Taip pat, lyginant su kontrole, reikšmingai priekiniame paviršiuje sumažėjo adrenerginių ir cholinerginių skaidulų tankis p<0,05 (10.2.3 pav.)

Tanki s 70 60 50 40 30 49.13 55.39 _47.46 20 _37.45 10 0 TH PGP 9.5 Imunohitocheminis žymuo

Dešinys skilvelis Kairys skilvelis

10.2.4 pav. Avių po atliktos RA nervinių skaidulų tankis priekiniame viduriniame skilvelių paviršiuje.

Išmatuotuose priekinio vidurinio skilvelių epikardiniuose nervuose nustayti bendrų ir adrenerginių skaidulų tankio skirtumai tarp dešiniojo ir kairiojo skilvelių. Kairiajame skilvelyje statistiškai patikimai (p<0,05) 11,68 santykinio dydžio vienetais yra mažiau andrenerginių skaidulų ir 7,93% PGP 9,5 – IR skaidulų (10.2.4 pav.)

A

D

B

E

C

F

10.2.5 pav. Imunohistochemiškai išryškinti epikardiniai nervai. A,B,C – nugarinio paviršiaus nervai pažeisti abliacijos. D,E,F – sveiki nugarinio paviršiaus nervai avių širdyse, kurioms nebuvo atlikta RA.

11. REZULTATŲ APTARIMAS

Atlikus kairiosios lykinės venos abliaciją, pažeidus kairį dorsalinį subrezginį ir toje vietoje esančius ikimazginius nervus, distaliniuose epikardiniuose nervuose nustatėme skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulų tankio sumažėjimą. Palyginus su kontrolinėmis avių širdimis, visame dorsaliniame paviršiuje reiksmingai sumažėjo TH imunoreaktyvių, PGP 9,5 imunoreaktyvių skaidulų. ChAT imunoreaktyvių skaidulų statistiškai reikšmingai sumažėjo dorsalinio paviršiaus vidurinėje dalyje. Nors skilvelių pagrinde ir viršūnėje cholinerginių skaidulų skirtumas tarp abliuotų ir kontrolinių širdžių statistiškai nesiskyrė, tačiau abliuotose širdyse jų tankis buvo mažesnis. Svarbu tai, jog distalinių nervų pažaida atitinka 2010 metais publikuotame I. Saburkinos ir kitų autorių straipsnyje apibūdintą avies širdies INS ir nervinių skaidulų plitimo kelius [22]. Remiantis šiuo moksliniu darbu nervai, pasiekę epikardą tarp kairiosios lykines ir kairiosios plautinės venų žiočių (abliacijos vieta), plinta dorsaliniu kairiojo prieširdžio paviršiumi besišakodami nervinių mazgų lauke, esančiame kairiojo prieširdžio dorsaliniame paviršiuje, kerta vainikinę vagą ir pasiekia kairiojo ir dešiniojo skilvelių dorsalinį paviršių iki pat viršūnės. Ištirtuose epikardiniuose nervuose skaidulų tankis taip pat sumažėjo iki pat viršūnės. Tarp kairiojo ir dešiniojo skilvelio nervinių skaidulų tankio skirtumų nebuvo.

Nervinių skaidulų tankis sumažėjo ir ventraliniame viduriniame skilvelio paviršiuje. Tačiau atskirai palyginus nervinių skaidulų kiekį tarp kairiojo ir dešiniojo skilvelių priekinių paviršių, nustatyta, jog skaidulų tankis sumažėjo kairiojo skilvelio sąskaita. Dešiniojo skilvelio skaidulų tankis nervuose nesiskyrė nuo kontrolinės grupės. Kadangi dalis nervų iš kairiojo dorsalinio subrezginio išplinta tik į kairiojo skilvelio ventralinį paviršiųį dešinyjį neplinta) [22], tai tik patvirtina, jog pažeidus šį subrezginį, pažeiždiami ir iš jo plintantys nervai.

Iki šiol tik viename publikuotame straipsnyje pateikiami duomenys apie distalinių nervų pažaidą po atliktos prieširdžių abliacijos [33]. Šiame moksliniame darbe taip pat naudotos juodagalvės avys, abliacija atlikta ties kairiosios ir viduriniosios plautinių venų šaknimis ir pažeistas kairysis nugarinis subrezginys. Tačiau imunochistocheminis tyrimas neišsamus, nes ištirti buvo tik pavieniai, kelių sričių - vainikinio ančio ir distaliniai kairiojo skilvelio nugarinio paviršiaus sričių nervai. Kaip ir mūsų tyrime TH ir ChAT imunoreaktyvių skaidulų, lyginant su kontrole sumažėjo. Tačiau skirtumai buvo vertintinami tik mikroskopiškai, tai yra nebuvo tiksliai matuojamas nervinių skaidulų tankis nerve. Išsamiau epikardiniai nervai buvo vertinti naudojant acetilcholinesterazės dažymo metodą [35]. Šis metodas histocheminių pokyčių distaliniuose epikardiniuose nervuose neatskleidė. Kiekybinė TEM nuotraukų analizė parodė reikšmingą pokytį tarp nervinių skaidulų, esančių abliuotų bei kontrolinių avių prieširdžių ir skilvelių

epikardiniuose nervuose [35]. Palyginus su kontrolinės grupės nervais, pažeistos nemielinizuotos nervinės skaidulos buvo pažeistos: susitraukusios, laisvu endoneuriumu [35].

12. IŠVADOS

1) Radiodažninė prieširdžių abliacija pažeidžia dorsalinio skilvelių paviršiaus epikardinius nervus; 2) Radiodažninė prieširdžių abliacija pažeidžia ventralinio skilvelių paviršiaus epikardinius nervus; 3) Tolstant nuo abliacijos vietos, pažaidos dydis epikardiniuose nervuose nesumažėjo;

4) Po atliktos prieširdžių abliacijos, epikardiniuose nervuose sumažėjo TH–IR, ChAT–IR, PGP9,5– IR skaidulų tankumas;

13. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. McKibben JS, Getty R. A comparative study of the cardiac innervation in domestic animals: sheep. Acta Anat (Basel) 1969;74:228 –242

2. Manasse E, Colombo P, Roncalli M, Gallotti R. Myocardial acute and chronic histological modifications induced by cryoablation. 2000;17:339–40

3. Aupperle H, Doll N, Walther T, Ullmann C, Schoon H, Wilhelm F. Histological findings induced by different energy sources in experimental atrial ablation in sheep. 2005;4:450–5

4. Zhao Q, Huang H, Zhang S, Tang Y, Wang X, Zhang Y, et al. Atrial autonomic innervation remodelling and atrial fibrillation inducibility after epicardial ganglionic plexi ablation. 2010;805– 10

5. Puodziukynas A, Kazakevicius T, Vaitkevicius R, Rysevaite K, Jokubauskas M, Saburkina I, et al. Radiofrequency catheter ablation of pulmonary vein roots results in axonal degeneration of distal epicardial nerves. Auton Neurosci Basic Clin [Internet]. Elsevier B.V.; 2012;167(1–2):61–5. 6. Wongcharoen W, Lo L, Chen S. Collateral Damage from Catheter Ablation of Atrial Fibrillation :

Lessons Learnt in the Past Decade. 2013;5(6):84–92

7. Tsuboi M, Furukawa Y, Nakajima K, Kurogouchi F, Chiba S. Inotropic, chronotropic, and dromotropic effects mediated via parasympathetic ganglia in the dog heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;279:H1201–H1207.

8. Gorman MW, Tune JD, Richmond KN, Feigl EO. Quantitative analysis of feedforward sympathetic coronary vasodilation in exercising dogs. J ApplPhysiol 2000;89:1903–1911.

9. Armour JA, Kember GC. Cardiac sensory neurons. In: Armour JA, Ardell JL editors. Basic and Clinical Neurocardiology. New York: Oxford University Press, 2004:79 –117

10. Brugada, J. Psychosis, depression, and high risk for sudden cardiac death: Time for co-operation between psychiatrists and cardiologists. Eur. Heart J. 2012; 33, 687–688.

11. Kishi, T. Heart failure as an autonomic nervous system dysfunction. J. Cardiol. 59, 117–22. doi:10.1016/j.jjcc. 2012.12.006 68.

12. Schwartz, P.J. Vagal stimulation for heart diseases: from animals to men. - An example of translational cardiology.-. Circ. 2011; J. 75, 20–7

13. Penn, M., Bakken, E. Heart-brain medicine: where we go from here and why. Cleve. Clin. J. Med. 2007; 74.

14. Thayer, J.F., Lane, R.D. Claude Bernard and the heart-brain connection:further elaboration of a model of neurovisceral integration. Neurosci. Biobehav. Rev. 2009 33, 81–8.

15. Armour, J.A. The little brain on the heart. Cleve. Clin. J. Med. 74 Suppl 1, 2007; S48–51.

16. Marron K, Wharton J, Sheppard MN, et al. Distribution, morphology, and neurochemistry of endocardial and epicardial nerve terminal arborizations in the human heart. Circulation 1995;92:2343–2351

17. Batulevicius D, Skripka V, Pauziene N, Pauza DH. Topography of the porcine epicardial nerve plexus as revealed by histochemistry for acetylcholinesterase. Auton Neurosci 2008;138:64 –75. 18. Kamada S, Kawamura Y, Iida Y, Sato N, Hasebe N. An experimental study on the site dependency

and mechanism of vagal denervation following radiofrequency catheter ablation for supraventricular arrhythmias including atrial fibrillation. Int Heart J 2008;49:493–506.

19. Chen PS, Chen LS, Fishbein MC, Lin SF, Nattel S. Role of the autonomic nervous system in atrial fibrillation: Pathophysiology and therapy. Circ Res. 2014;114(9):1500–15

20. Brack KE, Winter J, Ng GA. Mechanisms underlying the autonomic modulation of ventricular fibrillation initiation - Tentative prophylactic properties of vagus nerve stimulation on malignant arrhythmias in heart failure. Heart Fail Rev. 2013;18(4):389–408.

21. Zhao Q, Huang H, Zhang S, Tang Y, Wang X, Zhang Y, et al. Atrial autonomic innervation remodelling and atrial fibrillation inducibility after epicardial ganglionic plexi ablation. 2010;805– 10.

22. Saburkina I, Rysevaite K, Pauziene N, Mischke K, Schauerte P, Jalife J, et al. Epicardial neural ganglionated plexus of ovine heart : Anatomic basis for experimental cardiac electrophysiology and nerve protective cardiac surgery. HRTHM [Internet]. Elsevier Inc.; 2010;7(7):942–50. Available 23. Newton, C.M., Stoyek, M.R., Croll, R.P., Smith, F.M. Regional innervation of the heart in the

goldfish, Carassius auratus: a confocal microscopy study. J. Comp. Neurol. 2014; 522, 456–78. doi:10.1002/cne.23421

24. Vaccari D, Giacopelli D, Rocchetto E, Vittadello S, Mantovan R, Neri G. Atrial Fibrillation

Radiofrequency Ablation : Safety Using Contact Force Catheter In A Low-Volume Centre. 2014;39(2):10–4.

25. Ho SY, Cabrera JA, Sanchez-Quintana D. Left atrial anatomy revisited. Circ Arrhythmia Electrophysiol. 2012;5(1):220–8.

26. Kim DT, Lai AC, Hwang C, Fan L, Karagueuzian HS, Chen P, et al. The Ligament of Marshall : A Structural Analysis in Human Hearts With Implications for Atrial Arrhythmias. 2010;36(4):2–5.

27. Tan AY, Chou CC, Zhou S, Nihei M, Hwang C, Peter CT, et al. Electrical connections between left superior pulmonary vein, left atrium, and ligament of Marshall: implications for mechanisms of atrial fibrillation. Am J Physiol Hear Circ Physiol [Internet]. 2009;290(1):H312-22.

28. Kamanu S, Tan AY, Peter CT, Hwang C, Chen PS. Vein of Marshall activity during sustained atrial fibrillation. J Cardiovasc Electrophysiol. 2006;17(8):839–46.

29. Hwang C, Karagueuzian HS, Chen P-S. Idiopathic paroxysmal atrial fibrillation induced by a focal discharge mechanism in the left superior pulmonary vein: possible roles of the ligament of Marshall. J Cardio- vasc Electrophysiol 1999;10:636–48

30. Jackman WM, Wang X, Friday KJ, et al. Catheter ablation of accessory atrioventricular pathways (Wolff-Parkinson-White syndrome) by radiofrequency current. N Engl J Med 1991;324:1605–11. 31. Báez-Escudero JL, Keida T, Dave AS, Okishige K, Valderrábano M. Ethanol infusion in the vein

of marshall leads to parasympathetic denervation of the human left atrium: Implications for atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol. 2014;63(18):1892–901.

32. Ulphani JS, Arora R, Cain JH, Villuendas R, Shen S, Gordon D, et al. The ligament of Marshall as a parasympathetic conduit. Am J Physiol Heart Circ Physiol [Internet]. 2007;293(3):H1629-35. 33. Aupperle H, Doll N, Walther T, Ullmann C, Schoon H, Wilhelm F. Histological findings induced

by different energy sources in experimental atrial ablation in sheep. 2005;4:450–5.

34. Linz D, Ukena C, Mahfoud F, Neuberger HR, Böhm M. Atrial autonomic innervation: A target for interventional antiarrhythmic therapy? J Am Coll Cardiol. 2014;63(3):215–24.

35. Puodziukynas A, Kazakevicius T, Vaitkevicius R, Rysevaite K, Jokubauskas M, Saburkina I, et al. Radiofrequency catheter ablation of pulmonary vein roots results in axonal degeneration of distal epicardial nerves. Auton Neurosci Basic Clin [Internet]. Elsevier B.V.; 2012;167(1–2):61–5.