1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA VETERINARIJOS FAKULTETAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKA
Jonas Stonkus
Lietuvos genofondinių juodgalvių avių kraujo rodiklių
veislėje įvertinimas
Determination of hematological reference values in
lithuanian blackheaded sheep
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: Lekt. dr. Zoja Miknienė
2
DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Lietuvos genofondinių juodgalvių avių kraujo rodiklių veislėje įvertinimas“
1. Yra atliktas mano pačio.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltiniu, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visa naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
Turinys
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 91.1 Kraujo hematologinių rodiklių nustatymo svarba ... 9
1.2 Kraujo morfologiniai rodikliai ... 9
1.2.1 Raudonieji kraujo kūneliai ... 10
1.2.2 Baltųjų kraujo kūnelių pokyčiai ir morfologija ... 11
1..2.3 Kraujo plokštelių pokyčiai ... 15
1.3. Lietuvos juodgalvės avys ... 15
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 17
3. TYRIMO REZULTATAI ... 19
3.1. Referenciniai intervalai Lietuvos juodgalvėms avims ... 19
3.2 Referenciniai intervalai Lietuvos juoglavių ėriavedžių lyginant su kitų veislių avimis ... 20
3.3 Statistinių duomenų analizė ... 28
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 30
5. IŠVADOS ... 32
6. PADĖKA ... 33
4
SANTRAUKA
Lietuvos genofondinių juodgalvių avių kraujo rodiklių veislėje įvertinimas Jonas Stonkus
Magistro baigiamasis darbas
Tyrimas atliktas 2016 m. X ūkyje, kur laikomos į Lietuvos genofondą įtrauktos Lietuvos juodgalvės avys.
Darbo tikslas: išanalizuoti Lietuvos juodgalvių avių kraujo morfologinius rodiklius ir nustatyti jų referencines normas, lyginant su kitų veislių avių.
Buvo tirta 40 sveikų Lietuvos juodgalvių ėriavedžių avių. Paimti jų kraujo mėginiai ir ištirti kraujo morfologijos rodikliai, nustatyta leukoformulė.
Išanalizavus kraujo morfologijos parametrus, ir palyginus juos su kitų veislių avių pastebėta, kad kraujo morfologiniai rodikliai atitinka referencinių intervalų ribas pateiktuose šaltiniuose. Nedidelė variacija matoma tarp MCV ir PLT.
5
SUMMARY
Determination of hematological reference values in lithuanian blackheaded sheep Jonas Stonkus
Master thesis
The study was performed in 2016 year in Lithuania X farm where blackheaded ewes are being held.
The aim of the work was to investigate reference values for lithuanian blacheaded ewes, and compare values with the reference values of different breed sheeps.
40 clinically healthy 3 years old ewes were examined. Their blood morphology results were inspected and reference values created. Therefore it was compared with reference values results stated in textbooks Kaneko (2000) and Kramer (2008) in publications by Lepherd et al (2009) merino sheep, Šimpraga et al. (2013) Lika paramenka indigenous sheep and Churra-da-Terra-Quente sheeps by Dias et al. (2010).
Results of blood morphology showed that there was no significant difference between lithuanian blackheaded ewes compared with others results, only mild variations in MCV (26,2 – 28,0, fL) which was lower than results in other studies and PLT (114 – 446, 10^9/L) which was also lower with shift to the left.
6
ĮVADAS
Avių auginimas yra viena iš labiausiai plėtojamų žemės ūkio veiklų Lietuvoje. Avių ekonominis naudingumas susijęs su avių sveikatingumu, kuris priklauso ir nuo kraujo parametrų, kad būtų galimą nustatyti sveikatos statusą (1). Hematologiniai parametrai gali būti naudojami prognozuojant ir diagnozuojant daugelį ligų, kurios gali sukelti ekonominių nuostolių dėl sumažėjusio gyvūnų sveikatingumo, reprodukcijos (2). Hematologiniai parametrai yra naudingi nustatant konkrečias ligas, kurių negalėtume aptikti apžiūros metu (3).
Gebėjimas aiškintis laboratorinius duomenis yra pagrįstas remiantis žiniomis apie normalius fiziologinius mechanizmus, kurie yra kiekvieno laboratorinio tyrimo pagrindas, taip pat galima atpažinti pakitimus, kurie yra ligų padariniai ir iš testų rezultatų tinkamai atlikus laboratorinius tyrimus ir jų analizę, jie gali suteikti reikšmingų įžvalgų susijusių su liga ir jos gydymui (4).
Pilno kraujo tyrimo (CBC) vertinimas paprastai yra pirmoji papildoma pagalba praktikuojančiam veterinarijos gydytojui atlikus klinikinę apžiūrą, nustatant diagnozę arba įvertinant paciento būklę (5).
Norint nustatyti, parametras ar profilis yra labai vertingas, reikia juos palyginti su lygiaverčiais kliniškai sveikų individų populiacijų pamatiniais intervalais (PI). Todėl PI turėtų būti nustatytas atsižvelgiant į genotipo, amžiaus, lyties, valdymo ir, žinoma, analitinių procedūrų skirtumus (6).
Retkarčiais atskira pamatinė vertė reikalinga analizei konkretaus amžiaus ar gyvūno veislei. Daugelis reikšmių skiriasi priklausomai nuo amžiaus, kai gyvūną veikia augimo pokyčiai, prasidėję iki brendimo. Taigi, kai kurioms analizėms reikia skirtingų pamatinių intervalų skirtingo amžiaus grupėms (7).
Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti pamatinius verčių intervalus pasirinktiems hematologiniams kraujo kintamiesiems sveikoms Lietuvos juodgalvėms avims, taikant klasikinius ir pažangius statistinius metodus rekomenduojamus Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI).
7 Darbo tikslas: Nustatyti Lietuvos juodgalvių avių kraujo morfologinius ir biocheminius rodiklius
Darbo uždaviniai:
1. Surinkti tiriamąją medžiagą iš X ūkio, kur auginamos grynaveislės Lietuvos juodgalvės avys; 2. Atlikti surinktų avių kraujo morfologinius tyrimus ir pateikti referentinius intervalus;
3. Išanalizuoti Lietuvos juodgalvių avių kraujo morfologinius rodiklius ir palyginti juos su kitų veislių kraujo morfologiniais rodikliais;
4. Palyginti Lietuvos juodgalvių avių kraujo morfologinių rodiklių tik vidutinę vertę su kitų šalių rezultatais.
8 SANTRUMPOS IR PAAIŠKINIMAI
WBC – Leukocitai
LYM – limfocitai – leukocitų rūšis.
MID – vidutinio dydžio ląstelių skaičiaus kiekis kraujyje GRA – granuliocitai
LY% - limfocitai procentais kraujo tūryje
MI% - vidutinio dydžio ląstelių skaičiaus procentinis kiekis kraujo tūryje. GR% - granuliocitų procentinis kiekis kraujyje.
RBC – Eritrocitai HGB – Hemaglobinas
MCV – Vidutinis eritrocito tūris
MCH – Vidutinis hemaglobino kiekis eritrocite
MCHC – Vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite RDWc – Makrocitų ir mikrocitų santykis (anizocitozė) PLT – Trombocitai
PCT – trombokritas, procentinė kraujo tūrio, trombocitų užimama dalis. MPV – Vidutinis trombocitų tūris
PDWc – trombocitų išsidėstymas kraujo tūryje. HCT – Hematokritas
CLSI - Clinical & Laboratory Standards Institute PI – pamatiniai intervalai
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Kraujo hematologinių rodiklių nustatymo svarba
Referenciniai kraujo intervalai naminiam gyvūnams buvo nustatyti ir pateikti prieš daugelį metų (8,9,10,11) Tačiau reikia pažymėti, kad šie pamatiniai intervalai buvo sukurti bendrai avių rūšiai, buvo rinkti per ilgą ir nežinomą laiko intervalą, ir anksčiau nebuvo priimtinas vietiniam naudojimui. Patvirtinant pamatinius kraujo rodiklius reikia remtis 1) tinkama atranka pamatinio intervalo nustatymo metodu ir 2) atitinkamo pasirinkimo etaloninio gyvūnų mėginiu. Metodo vertinimo metodai yra gana paprasti, jei naudojami taip pat kaip ir pradiniame tyrime. Taip pat svarbu naudoti tas pačias analizės sistemas, kad būtų užtikrinama kokybė ir tikslumas, kuris taip pat yra retai įmanomas visų pirma dėl to, kaip sparčiai vystėsi ir keitėsi metodai per pastaruosius 50 metų (12).
Pastaruoju metu daugelis autorių (13,14) nurodė, kad hematologiniai ir biocheminiai kraujo rodikliai neeksponuoja tik mažu laipsniu veislės specifiškumo. Jie taip pat yra statistiškai reikšmingai priklausomi nuo gyvenimo sąlygų, regiono, augimo ir auginimo vietos, ypač mitybos (6,11). Šis faktas yra ypač svarbus ekologiniame ūkyje (11). Taip pat nustatyta reikšmingų skirtumų dėl lyties, reprodukcinės būklės (14,15) ir gyvulių amžiaus (4). Friedrichas su bendraautoriais (12) savo darbuose padarė išvadą, kad šių gairių priėmimas visai veterinarijos bendruomenei palengvintų bendradarbiavimą ir informacijos skleidimą. Tai ypač svarbu bandos sveikatingumo stebėjimui, kadangi auginimo ir maitinimo sąlygos dažnai sukelia daugelio serumo ir (arba) plazmos metabolitų koncentracijų pokyčius/ lyginant su literatūroje pateiktomis normomis (15).
1.2 Kraujo morfologiniai rodikliai
Kraujo morfologija organizme nėra statiška ir greitai kinta streso metu dėl fiksacijos ar kitų stresorių, nes padidėja kraujospūdis (galima neutrofilija) ir susitraukia blužnis (padidėja hematokritas) (28). Taip pat kraujo morfologija kinta neteisingai imant kraują – naudojant per mažą adatą, kraują į tyrimo mėgintuvėlį leidžiant per lėtai ar per greitai, per stipriai kraują traukiant švirkštu ir/ar netinkamai jį suleidžiant į tyrimo mėgintuvėlį, paimant per mažai ar per daug kraujo (netinkamas kraujo ir antikoagulianto santykis), tinkamai nesumaišius kraujo su antikoaguliantu (geriausiai morfologiniam tyrimui tinka EDTA) (29).
Svarbu paimtą tyrimui kraują kaip įmanoma greičiau ištirti, nes laikant kraują jo morfologija kinta. Kraują laikant kambario temperatūroje patariama jį ištirti per 4 val., nes po 6 val., prasideda eritrocitų
10 pabrinkimas (didėja PCV/HCT ir mažėja MCHC). Laikant kraują šaldytuve (4ºC temp.) iki 24 val., galima gauti pakankamai tikslius morfologinio tyrimo rezultatus, išskyrus trombocitų – juos įvertinti reikėtų per 4 val., nuo kraujo paėmimo (9,30). Tyrimui paimto kraujo laikymas kambario temperatūroje ar šaldytuve 4 valandas gali daryti įtakos trombocitų pabrinkimui, dėl ko padidėja MPV. Laikant kraują ilgiau nei 24 val., trombocitai gali fragmentuotis (31).
1.2.1 Raudonieji kraujo kūneliai
Avių eritrocitai yra vieni mažiausių žinduolių tarpe ir jiems nebūdinga agregacija ir deformacija, kaip kitoms rūšims. Daugumos avių veislių eritrocitai yra disko formos, išskyrus Angoros veislės avis (jų eritrocitai dviejų formų: disko ir fuziforminiai) (9).
Į RBC vertinimą įtraukti parametrai yra PCV arba hematokritas (HCT), RBC kiekis, hemoglobinas, MCV ir MCHC. Kaip minėta anksčiau, norint aptikti morfologinius pokyčius ir parazitus, svarbu ištirti ir dažytą kraujo tepinėlį. Smulkiųjų atrajotojų RBC yra santykinai nedideli, palyginti su kitomis rūšimis, taigi jie dažnai klaidingai aiškinami naudojant hematologinius instrumentus, kalibruotus naudoti kitose rūšyse. Tai ypač pasakytina apie impedanso analizatorius, kur RBC dažnai priskiriami trombocitams ir klaidingai mažėjančioms PCV vertėms (16). Panašios klaidos gali atsirasti ir in vitro hemolizės atveju, dažnai kyla problema, susijusi su avių kraujo mėginiais. Mikrohematokritas yra lengviausias būdas apskaičiuoti PCV ir įvertinti RBC kiekį rankiniu būdu ir visada turėtų būti atliekamas, net jei yra ir automatinių priemonių. Esminis PCV ir mikrohematokrito vertės skirtumas yra netikslaus analizatoriaus nustatymo požymis.
RBC indeksai, MCV, MCH ir MCHC, pateikia informaciją apie vidutinį ląstelių dydį, hemoglobino kiekį ir hemoglobino koncentraciją atitinkamai. Padidėjęs MCV (makrocitozė) yra regeneracinio atsako požymis, o mikrocitozė (sumažėjusi MCV) dažnai būna pastebėta metabolinių sutrikimų, tokių kaip geležies trūkumas. Padidėjęs MCH gali reikšti retikulocitų buvimą arba hemolizę, tuo tarpu sumažėjęs MCH pridedamas prie geležies trūkumo. MCHC laikomas labiausiai tiksliu iš eritrocitų rodiklių, gali padidėti esant hemolizei arba sumažėja retikulocitozės ir geležies stokos, anemijos atveju. Dėl to, kad hemoglobino koncentracija ir PCV yra glaudžiai susiję (pirmasis turi maždaug vieną trečdalį PCV vertės), MCHC padidėjimas paprastai rodo analitinę paklaidą (9,17,18).
Avims vertinant anemiją, kai PCV vertės sumažėja žemiau nei 24 %; jo diferencinė diagnozė yra pagrįsta klinikinių tyrimų rezultatais ir kuo labiau atskiria patologinius procesus, galinčius jį sukurti.
11 Pagrindiniai anemijos subklasifikacijos yra regeneraciniai ir neatsikuriantys tipai, pagrįsti retikulocitų skaičiumi ir RBC morfologija. (6).
Kraujo tepinėlių vertinimas gali atskleisti RBC morfologinius pakitimus, kurie gali padėti diagnozuoti ligas. Autoagliutinacijos buvimas (RBC agregacija) yra imuninių vaistų simptomas - pirminė (imuninės medijinės hemolizinės anemijos, IMHA) arba antrinė (hemoparazitinė) - ir turi būti patikrinta fiziologinio agliutinacijos testu. Pirmuoju atveju eritrocitų agregatai išlieka, kai nedidelis kraujo kiekis sumaišomas su druskos tirpalu ant objektinio stiklelio. Nors silpnas anizocitozė (RBC dydžio skirtumas) yra normalus avims, tai visada yra patologinis simptomas, pasireiškiantis kitais pokyčiais, tokiais kaip polichromazija (spalvos pasikeitimas), hipochromazija ir poikilocitozė (neįprasti RBC formos). Nukleino RBC, Howell-Jolly ląstelių ir bazofilinių granulių aptikimas yra regeneracijos (ir, dažniau, apsinuodijimo švinu) simptomas, o Heinzo kūnelių buvimas yra susijęs su oksidaciniais stresais dėl eritrocitų, kuriuos sukelia įvairios sąlygos, pavyzdžiui: mitybos sutrikimai, pievagrybių, svogūnų, ir nuodingų augalų ar kitos medžiagos (varis) nuryjimas. Kraujo tyrimas taip pat gali atskleisti keletą hemoparazitų (Anaplasma spp., Mycoplasma spp., Babesia spp.), todėl jas galima nedelsiant diagnozuoti. Tačiau kai kuriuos iš šių organizmų gali būti sunku atskirti nuo morfologinių pokyčių, tokių kaip Howell-Jolly kūnelių buvimas (19).
Policitemija ar padidėjęs PCV dažniau yra antrinis ir atsiranda dėl sunkios dehidracijos dėl įvairių sisteminių ligų. Tikroji policitemija yra retai pastebėta avyse nors gali atsirasti dideliuose aukščiuose gyvenančiuose gyvūnuose, taip pat sergant plaučių ligomis, inkstų ar kraujagyslių neoplazija (18,20).
1.2.2 Baltųjų kraujo kūnelių pokyčiai ir morfologija
Išskyrus limfocitus, visi kiti leukocitų tipai gaminami ir brandinami kaulų čiulpuose. Daugelis automatinių hematologinių analizatorių aptinka skirtingą WBC skaičių, tačiau geriau juos patvirtinti, rankiniu būdu skaičiuojant mažiausiai 100 ląstelių dažytuose kraujo tepinėliuose. Avių leukocitai dažnai skiriasi nuo tų, kurie yra užregistruoti kitose rūšyse ir retai būdingi konkrečiai ligai. Atrodo, kad tam tikromis sąlygomis (t.y bakterinė infekcija) avys gali neparodyti greito leukocitinio atsako, palyginti su kitomis rūšimis, todėl ūminės fazės baltymų pokyčiai gali būti labiau jautrūs uždegimo rodikliams (9,14). Jaunieji neutrofilai yra vyraujantys leukocitai, o suaugusiesiems dominuoja limfocitai, kur neutrofilų: limfocitų santykis yra 1: 2. Ūmaus ar didžiojo uždegimo dažnai lydėti toksiniai leukocitų pokyčiai 1 pav., tokie kaip citoplazminė basofilija 2 pav., vakuolizacija 3 pav., ar putojantis, azurofilinių granulių 4 pav., ir Doehle kūnelių buvimas 5 pav., ir branduolinė dismutacija (9,21,22). Tačiau reikia pastebėti, kad kai
12 kurie WBC morfologiniai pokyčiai, tokie kaip branduolinė hipersegmentacija 6 pav., ir citoplazminis putojimas, gali būti panašūs į patologinius pokyčius ir todėl turi būti aiškinami atsargiai (9,15,17). Be uždegiminės leukogramos, neutrofilija gali būti normalus atsakas į aplinkos stresą ir nerimą, skatinantį epinefrino išsiskyrimą, dažnai kartu su limfopenija, eozinopenija ir monocitozė (9). Sunkus uždegimas ar sepsis taip pat gali sukelti neutropeniją.
Limfocitų populiacijos suskirstomos į B arba T ląsteles, gaminami antikūnai arba dalyvauja imunoreguliacijoje ir citotoksiškai veikiant imunitetą. Avys turi tik mažus ir vidutinius limfocitus. Limfocitozė yra nedažna ir gali pasireikšti lėtinėmis virusinėmis infekcijomis ir autoimuniniais sutrikimais, tuo tarpu limfopenija paprastai būdinga endogeniniams arba egzogeniniams kortikosteroidams, ūminėms infekcijoms ir endoteksemijai. Dažniausiai pasikeitimas eozinofilams yra eozinofilija, apibūdinanti parazitines ir autoimunines ligas (9).
13
2 pav. Citoplazminė basofilija (33)
14
4 pav. Azurofilinės granulės su geležies intarpais limfocite (35)
5 pav. Dohle kūnelis eozinofilo citoplazmos periferijoje (36)
15 1..2.3 Kraujo plokštelių pokyčiai
Trombocitai yra kaip megakariocitiniai fragmentai ir dalyvauja pirminėje hemostazėje. Jie yra mažiau stabilūs bet gali būti tiksliai skaičiuojami kraujo mėginiuose 6 val. po surinkimo. Besitęsianti hemoragija ir petechijos yra dažniausiai pasitaikantys požymiai, rodantys trombocitopeniją ar trombocitų disfunkcija. Trombocitopenijos mechanizmai (trombocitų skaičius mažesnis nei 100 000 ląstelių/l) sumažėjo gamyba, padidėjo vartojimas ar sekvestracija, endotoksemija ir nuostoliai su plačiu kraujavimu. Vertinant trombocitus reikia atsargiai skaičiuoti, nes ląstelių susitraukimas senėjant mėginiam arba kai heparinas naudojamas kaip antikoaguliantas, sumažina trombocitų skaičių klaidingai. Klaidingą trombocitopeniją galima diferencijuoti, nes nėra suderintų klinikinių požymių (kraujavimo tendencijos, splenomegalijos) ir kraujo tepinėlio tyrimas. Krešėjimo faktoriaus trūkumai pasireiškia dėl spontaniško kraujavimo (melena, kraujavimas iš nosies, hematurija) (30).
1.3. Lietuvos juodgalvės avys
Nuo 1930m. įvežtinės Šropšyrų ir Vokietijos juodgalvės avys buvo bendrai vadinamos juodgalvėmis avimis. Jas intensyviai kryžminant su vietinėmis šiurkščiavilnėmis buvo sukurta mėsinių Lietuvos juodgalvių avių veislė (23) 1950 m. Veislinių avių surašymo duomenimis Lietuvos juodgalvės avys sudarė apie 21 %, o 1955 m. –apie 37 % visų avių. Lietuvos juodgalvių veislė oficialiai patvirtinta 1961 m. 1996 – 2000 m. laikotarpiu buvo gerinamas avių mėsingumas ir vislumas. Todėl Lietuvos juodgalvės avys gana mėsingos, vilningos, vislios ir pieningos, o atvesti ėriukai greitai auga ir bręsta. Jos priklauso pusiau plonavilnių mėsinių trumpavilnių avių grupei ir labai tinka vietos rinkai (23).
Lietuvos juodgalvės gana mėsingos, greitai bręsta ir jau pirmaisiais metais jas galima parduoti mėsai. Skerdenos išeiga sudaro apie 50 %. Suaugusios avys sveria 50 – 60 kg, avinai – 80 – 90 kg. Nuo jų prikerpama po 3 – 4 kg 8 – 10 cm ilgio ir 30 – 40 mikrometrų storio baltos vilnos. Plautos vilnos išeiga – 48 – 66 %.
Taigi dabartinės Lietuvos juodgalvės avys yra mažesnio produktyvumo negu Estijos ir Latvijos tamsiagalvės, ypač Vokietijos juodgalvės, Sufolkai, Šropšyrai, Tekseliai ir kitų mėsinių veislių avys. O kaip žinia, šiuo metu pačios perspektyviausios yra mėsinės, greitai bręstančios, vislios, riebalų nekaupiančios avys. Todėl Lietuvos juodgalves būtina kergti su Vokietijos juodgalviais, Sufolkais ar kitais mėsingais avinais ir tokiu būdu pradėti kurti perspektyvų mėsinės avies modelį. (24)
16 Lietuvos juodgalvių avių veislė yra gana perspektyvi, nes priklauso sunkiasvorių avių kategorijai. Įvertinus avių amžiaus bei ėriavimosi sezono įtaką vislumui ir prieauglio svoriui, nustatyta, kad Lietuvos juodgalves avis tikslingiausia kergti vasaros pabaigoje ir bandoje laikyti kuo daugiau 4-6 metų amžiaus ėriavedžių (24). Įvertinus Lietuvos vietinių avių veislių genetinę įvairovę mikrosatelitinių žymeklių ir mitochondrinės DNR sekos palyginimo pagalba, nustatyta, kad Lietuvos vietinių šiurkščiavilnių ir Lietuvos juodgalvių avių populiacijos pasižymi didele viduveisline įvairove, o Lietuvos vietinės šiurkščiavilnės avys sudaro genetiškai vientisą populiaciją.
17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2016m. Spalio mėn. Kraujo mėginiai buvo surinkti iš sertifikuotame ekologiniame ūkyje augančių genofondinių Lietuvos Juodgalvių avių. Kraujas buvo paimtas iš 40 vienodo amžiaus, kliniškai sveikų, ėriavedžių, vieną kartą ryte nuo 9 iki 12 val. Be išankstinio alkinimo. Dūrio vieta (v. Jugularis) buvo nuskusta ir paruošta pagal geros praktikos taisykles. Imant krauja gyvūnai buvo laikomi stovimoje pozicijoje, tarp asistento kojų, ištempiant kaklą ir galvą. Hematologiniam tyrimui kraujas (5ml) buvo surinktas į vakuuminius mėgintuvėlius su etilen diaminotetra acto rūgštimi (EDTA). Mėgintuvėliai su EDTA buvo naudoti kraujo morfologiniams tyrimams. Mėgintuvėliai su kraujo krešėjimą stabdančiais priedais paėmus kraują lengvai vartomi rankoje, kad kraujas susimaišytų, tačiau nepurtomi, kad neįvyktų hemolizės.
Surinkti kraujo mėgintuvėliai buvo sunumeruoti, sudėti į transportavimui skirtą šaldytuvą (0–4 °C), gabenami į LSMU VA tyrimų bazes. Tinkamai atšaldyti mėginiai gali būti tiriami iki 24 val. Po surinkimo, išskyrus trombocitų kiekį, kuris turi būti atliktas per 6 val. po mėginių paėmimo.
Kraujo morfologiniai parametrai vertinti automatiniu morfologiniu analizatoriumi „Abacus Junior Vet“ (Diatron Messtechnik GmbH, Austrija, 2006) LSMU VA Stambiųjų gyvulių klinikos Klinikinėje laboratorijoje. Nustatyti bendri eritrocitų (RBC) ir leukocitų (WBC), limfocitų (LYM) bei trombocitų (PLT) kiekiai, hemoglobino (Hb) koncentracija, hematokritas (HCT) bei apskaičiuoti vidutinis eritrocito tūris (MCV), vidutinis hemoglobino tūris (MCH) ir vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (MCHC).
Taip pat buvo atlikti ir kraujo forminių elementų tepinėliai. Diferencijuotos leukocitų grupės: neurtofilai (jauni, segmentiniai, lazdeliniai), eozinofilai, bazofilai, monocitai ir limfocitai. Kraujo tepinėlis daromas imant kraujo lašą stikline lazdele iš morfologinio mėgintuvėlio, prieš imant kraujas atsargiai sumaišomas megintuvėlį apverčiant keletą kartų. Kraujo lašas stikline lazdele dėtas ant objektinio stiklelio, kito objektinio stiklelio briauna, pakreipta 45 laipsniu kampu kraujas paskirstytas po objektinio stiklelio paviršių plonu sluoksniu. Kraujo tepinėliui leista nudžiūti. Nudžiūvęs tepinėlis dažytas May Grunvaldo – Gimzos - Romanovskio metodu ir vertintas skaičiuojant 100 leukocitinių ląstelių.
Tyrimų duomenys apdoroti SPSS statistiniu paketu (SPSS for Windows 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA, 2006) ir Microsoft Office Excel (2007) programa.
18
7 pav. Automatinis morfologinis analizatorius „Abacus Junior Vet“ (Z. Miknienės nuotrauka)
19
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Referenciniai intervalai Lietuvos juodgalvėms avims
Buvo tirta 40 Lietuvos juodgalvių ėriavedžių avių hematologiniai kraujo rodikliai, po vizualinio mėgintuvėlių apžiūrėjimo 5 vnt. dėl sukrešėjusio kraujo nebuvo įtraukti į tolimesnę analizę. Panaikinus netinkamus mėgintuvėlius, 35 mėginiai buvo įtraukti į tyrimą.
1 lentelė. Statistiniai rezultatai pasirinktiems hematologiniams rodikliams 3 metų amžiaus Lietuvos
Juodgalvių veislės ėriavedžių
Rodikliai Vienetai N Min Max SD Mean/MED
Apatinė riba (95% pasikliautinio intervalo) Viršutinė riba (95% pasikliautinio intervalo) WBC 109 /L 35 3,92 8,20 1,46 6,34±0,423 5,41 7,27 Lazdeliniai (proc.) 35 1 4 1,03 1,83±0,297 1,18 2,49 Segmentiniai (proc.) 35 21 40 5,74 29,92±1,658 26,27 33,57 Eozinofilai (proc.) 35 2 17 4,99 8,58±1,443 5,41 11,76 Monocitai (proc.) 35 1 5 1,42 2,75±0,411 1,85 3,65 Limfocitai (proc.) 35 49 70 6,47 57,83±1,870 53,72 61,95 RBC 1012/L) 35 10,04 13,93 1,04 12,53±0,301 11,867 13,194 HGB (g/L) 35 89 124 9,10 115,17±2,625 109,39 120,94 HCT (proc.) 35 28,12 36,51 2,13 33,9158±0,616 32,559 35,27 MCV (fL) 35 26 30 1,90 27,08±0,39 26,21 27,96 MCH (pg/L) 35 9,0 10,5 0,41 9,633±0,119 9,37 9,896 MCHC (g/L) 35 341 379 10,80 355,25±3,119 348,38 362,12 PLT 109/L 35 66 867 260,78 280,0±75,281 114,31 445,69
N - avių mėginių skaičius; Min - minimali reikšmė; Max- maksimali reikšmė; Mean/MED - Aritmetinis vidurkis; SD- Vidutinis kvadratinis nuokrypis; WBC – bendrųjų leukocitų kiekis,RBC – bendrųjų eritrocitų kiekis,Hb – hemoglobino koncentracija, HCT – hematokritas, MCV – vidutinis eritrocito tūris,MCH – vidutinis hemoglobino tūris, MCHC – vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite, PLT – trombocitų kiekis.
20 Referenciniai limitai buvo skaičiuojami su pasikliautiniu 95 % intervalu. Visi gauti duomenys pateikti kaip vidutinės paklaidos (±ER), minimali vertė, maksimali vertė, ir pasikliautinio intervalo 95 % apatine ir viršutine reikšmėmis. Parametrai kuriuos tyrėme buvo WBC, RBC, HGB, HCT, MCH, MCHC, WBC, PLT. Tyrimo duomenys pateikti 1 lentelėje.
Apibendrinta kraujo hematologinė analizė pateikta 2 Lentelėje. Gauti rezultatai yra lyginami su publikuotais duomenimis pateiktais knygose Kramer (2000) ir Kaneko (2008), Lepherd ir kitų bendraautorių publikacijoje tiriant merino avis (2009), Šimparga ir kt. bendraautorių Lika paramenka avis (2013), Dias ir kt. bendraautorių nustatant Churra-da-Terra-Quente avių referencius intervalus (2010) publikacijose.
3.2 Referenciniai intervalai Lietuvos juoglavių ėriavedžių lyginant su kitų
veislių avimis
Baltųjų kraujo kūnelių (WBC ) 5,41 – 7,27 x 109 rodikliai morfologinio kraujo tyrime atitiko literatūroje pateiktus Kaneko 2008 ir Kraner 2000, taip pat Lepherd, Šimpraga, ir Dias pateiktas referencinių intervalų ribas. Atsirado tokių mėginių kur leukocitų kiekis sumažėjo iki 3,92 , 109g/l ar
pakilo iki 8,2x109 g/l. Limfocitai (LYM ,%) (53,72 – 61,95) taip pat atitiko referenciniu normų ribas pateiktuose šaltiniuose. Segmentiniu neutrofilų skaičius (26,27 – 33,57 proc.) pateko į nurodytų šaltinių referencinius intervalus, kaip ir monocitų (1,85 – 3,65 proc.), eozinofilų (5,41 – 11,76 proc.) atitiko Churra-da-Terra-Quente avių referencinius intervalus, skirtumas matomas su knygose pateiktu intervalu taip pat keleto mėginių eozinofilų skaičius buvo virš 17 proc., kas buvo virš referencinių normos ribų. Lazdelinių neutrofilų procentinis skaičius yra (11,8 – 2,49 proc.), kas neatitiko pateiktų šaltinių informacijos, kurioje lazdelinių neutrofilų aptinkama retai..
Kraujo plokštelių PLT x 109L referencinis intervalas nustatytas 114 – 446 x 109/L atitinka
Šimpragos 2013 ir Dias 2010 studijas. Mūsų gauto referencinio intervalo aukštesnioji vertė 446 x 109/L
patenka ir į Lepherd 2009 nustatytas referencinio intervalo ribas, ko negalime pasakyti, apie knygose Kramer ir Kaneko pateiktas PLT ribas.
21
2 lentelė. Referenciniai intervalai pasirinktiems hematologiniams rodikliams Lietuvos
juodgalvių ėriavedžių ir avių iš literatūros šaltinių Rodikliai Vienetai Lietuvos
juodgalvių (tyrimo metu nustatyti) Knygos * Lepherd et al.,(2009) Šimpraga et al., (2013) Churra-da- Terra-Quente Dias et al. (2010) WBC 109/L 5,41-7,27 4,0-8,0 5,1-15,9 3,02-15,64 1,9 - 9,8
Lazdeliniai proc. 1,18 – 2,49 reti reti - reti
Segmentiniai proc. 26,27- 33,57 7,0 - 60,0 8,0 - 63,0 - 12 - 61 Eozinofilai proc. 5,41 – 11,76 0 - 10 0 - 2 - 0 - 13 Monocitai proc. 1,85 – 3,65 0 – 7,5 1 - 8 - 0 -7 Limfocitai proc. 53,72- 61,95 20,00 – 90,00 20 – 95 - 35 - 80 RBC (1012/L) 11,87-13,0 9,00-15,00 9,20-13,00 7,81-12,77 5,40 - 12,30 HGB (g/L) 109,40-120,90 90-150 105-137 78,1-134,70 79 - 150 HCT (proc.) 32,60-35,30 27-45 28-39 24-41 23,50 - 53,00 MCV (fL) 26,20-28,00 28-40 28,00-35,00 28,60-34,80 32,40 - 46,40 MCH (pg/L) 9,40-9,90 8,00-12,00 10,00-13,00 9,54-11,0 10,50 – 14,00 MCHC (g/L) 348,40-362,10 310-340 332-392 284-362 250 - 344 PLT (109/L 114-446 800-1100 426-1142 0-731 121 - 967
*Knygos - KRAMER (2000) ir KANEKO ir kt. (2008)
N - avių mėginių skaičius; Min - minimali reikšmė; Max- maksimali reikšmė; Mean/MED - Aritmetinis vidurkis; SD- Vidutinis kvadratinis nuokrypis; WBC – bendrųjų leukocitų kiekis,RBC – bendrųjų eritrocitų kiekis,Hb – hemoglobino koncentracija, HCT – hematokritas, MCV – vidutinis eritrocito tūris,MCH – vidutinis hemoglobino tūris, MCHC – vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite, PLT – trombocitų kiekis.
22 Lietuvos juodgalvių avių raudonųjų kraujo kūnelių koncentracija (RBC x 1012L) (11,87 – 13,00)
atitinka knygose Kramer ir k. (2000) ir Kaneko ir kt. (2008 ir Lepherd 2009 pateiktas vertes, vertinant Šimpraga 2013 ir Dias 2010 pateiktes vertes mūsų gautų referencinių intervalų aukštesnės ribos yra virš autorių pateiktų intervalų viršutinių ribų 2 Lentelė taip pat vidutinė vertė raudonųjų kraujo kūnelių (12,53 x 1012L) yra aukštesnė nei pateiktos vertės Dias, Šimpraga ir Lepherd. Keletas mėginių viršija fiziologinę normą, vienas iš jų 14,83 x 1012L. Hemoglobino (HGB, g/L) (109,40 – 120,90 g/L)
koncentracija kraujyje atitiko normos ribas kaip ir hematokrito (HCT, proc.) 32,60 – 35,30 proc. lyginant su pateiktais šaltiniais. Žemesnioji HGB intervalo reikšmė buvo aukštesnė, kaip ir HCT (2 lentelė)
10 pav. Leukocitas (autoriaus nuotrauka)
23
12 pav. Monocitas (autoriaus nuotrauka)
24
14 pav. Lazdeliniai neutrofilai (autoriaus nuotrauka)
25
16 pav. Trombocitai (autoriaus nuotrauka)
3 lentelė. Procentinis skaičius (proc.) sveikų Lietuvos juodgalvių avių, kurių pasirinkti
hematologiniai kraujo rodikliai yra už referencinių intervalų ribų pagal pateiktus literatūros šaltinius
Rodikliai Vienetai
Bendras avių mėgnių skaičius (pašalinus ekstremalias vertes)
proc. mėginių, kurie yra už referencinių
intervalų ribų pagal Šimpraga ir kt., (2013)
proc. mėginių, kurie yra už referencinių intervalų ribų pagal Lepherd
ir kt., 2009
proc. mėginių, kurie yra už referencinių intervalų ribų pagal literatūros šaltinius WBC 109/L 32 0 31,25 28 RBC 1012/L) 29 62 48 0 HGB (g/L) 26 11,50 26,90 3,80 HCT (proc.) 25 8 12 0 MCV (fL) 29 76 75,90 75,90 MCH (pg/L) 32 25 9,4 0 MCHC (g/L) 34 17,7 9 79 PLT 109/L 33 12 85 97
26 Vidutinio hemoglobino kiekio eritrocite (MCH, pg) referencinis intervalas varijuoja tarp 9,40 – 9,90 pg, kas atitiko normų ribas, vidutine reikšmė 9,63, pg yra kiek žemesnė nei pateiktose studijose Dias ir kt.(2010) Šimpraga ir kt. (2013) ir Lepherd ir kt. (2009) 4 Lentelė. Vidutinio eritrocitų tūrio (MCV , ft) lygio sumažėjimas 26,20 – 28,00 ft lyginant su pateiktų šaltinių normomis yra labiausiai pakitęs, 76 % procentai tirtų mėginių nepateko į referencinių intervalų ribas 3 Lentelė, šis intervalas atitinka knygose Kramer (2000) ir Kaneko (2008) pateiktas reikšmes, ir skiriasi nuo Dias (2010) ir Lepherd (2009) tyrimuose darbuose, nepatekdamas į jų pateiktų intervalų ribas. Vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (MCHC,g/l) 348,40 – 362,10 g/L gauti referencinės intervalai atitinka Lepher ir kt. (2009) ir Šimpraga ir kt. (2013) tyrimų darbuose gautomis vertėmis, lyginant su knygose aprašytomis normomis žemesnė intervalo riba atitiko pateikta aukštesniąją ribą 2 Lentelė.
17 pav. Grafikas vaizduojantis mėginių skaičių proc., kurie yra už referencinių intervalų ribų pagal
duomenis pateiktus 3 lentelėje
Mėginių skaičius, kurie nepateko į referencinių intervalų ribas pagal RBC rodiklį lyginant su Šimpraga ir kt. (2013) ir Lepherd ir kt. (2009) atitinkamai 62 % ir 48 %. Lyginant mėginių MCV rodiklį matome, kad pagal pateiktą literatūrą 76 % mūsų tirtų mėginių nepateko į pateiktus intervalus. Taip pat kraujo plokštelių skaičius mūsų tirtuose mėginiuose yra mažesnis, 97 % mėginių neatitiko pagal literatūros šaltinius ir 85 % su Lepherd ir t. (2009) pateiktais rezultatais.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT p ro c. rodikliai
% mėginių, kurie yra už referencinių intervalų ribų pagal Šimpraga et al. (2013)
% mėginių, kurie yra už referencinių intervalų ribų pagal literatūros šaltinius
% mėginių, kurie yra už referencinių intervalų ribų pagal Lepherd et al., 2009
27
4 lentelė. Vidutinė vertė (Mean) kraujo rodiklių Lietuvos Juodgalvių ėriavedžių
lyginant su kai kuriais literatūros šaltiniais
Rodikliai Vienetai Lietuvos juodgalvės avys (tyrimo rezultatas) Churra-da- Terra-Quente Dias et al. (2010) Lika pramenka sheep Šimpraga et al., (2013) Merino sheep Lepherd et al., (2009) WBC 109/L 6,34 5,70 9,80 9,00 RBC 1012/L) 12,53 9,80 8,30 10,00 HGB (g/L) 115,17 118,10 89,60 121 HCT (proc.) 33,92 40,80 27 33,00 MCV (fL) 27,08 41,60 32,30 32,00 MCH (pg/L) 9,63 12,20 10,90 11,00 MCHC (g/L) 355,25 292 336,70 362,00 PLT 109L 280 544,30 380,60 784,00
Lyginant vidutines vertes WBC, 109/L Lietuvos juodgalvių avių (65,34 x 109/L) yra žemesnė už
Šimpraga (2013) ir Lepherd (2009), bet aukštesnė už Dias (2010) pateiktą vidutinę vertę Churra-da- terra-Quente avims. RBC, 1012/L (12,53 x 1012/L) vidutinė vertė mūsų tyrime yra aukštesnė nei pateiktuose šaltiniuose. Gauta HGB (g/L) vidutinė vertė (115,17 g/L) yra aukštesnė už Šimpargos (2013) pateiktąją, bet žemesnė už Lepherd (2009) ir Dias (2010). Hematokrito vidutinė vertė (HCT, proc.) yra aukštesnė nei Šimpraga ir kt. (2013) ir Lepherd ir kt.(2009), bet žemesnė už Dias ir kt.(2010) pateiktą vidurkį. MCV (fL) ir MCH (g/L) vidutinės vertės yra žemesnės už pateiktas vertes šaltiniuose. MCHC (g/L) vidutinė vertė mūsų tyrime 355,25 g/L yra aukštesnė už Dias ir kt. (2010) ir Šimpraga ir kt. (2013), bet žemesnė už Lepherd ir kt.(2009) pateiktą vertę. Kraujo plokštelių (PLT 109/L) vidutinė vertė 280 109/L buvo žemesnė lyginant su pateiktais šaltiniais.
28
3.3 Statistinių duomenų analizė
Tirti duomenys apskaičiuoti naudojant „Mixrosoft Excel 2007“ statistinių duomenų paketu. Apskaičiuoma Mean/Moda, SD,standartinis nuokrypis ir tt. Koreliacijos koeficientui Leukoformulei ir kraujo morfologijai apskaičiuoti buvo naudojama „R-project“ paketas (5 Lentelė).
5 lentelė. Koreliacijos reikšmės
Neigiamos reikšmės Aprašymas Teigiamos reikšmės 0,00 "Nėra" 0,00 -0,19 -0,01 "Labai silpnas" 0,01-0,19 -0,39--0,20 "Silpnas" 0,20-0,39 -0,69--0,40 "Vidutinis" 0,40-0,69 -0,89--0,70 Stiprus" 0,70-0,89 -0,99--0,90 "Labai stiprus" 0,90-0,99 -1,00 "Visiškai tikslus" 1,00
Atlikus kraujo formulės koreliacinę analizę nustatėme, kad Stiprų neigiamą ryšį sudarė limfocitai su segmentiniais neutrofilais (-0,782) p < 0,05, o stiprų teigiamą ryšį sudarė monocitai su lazdeliniais neutrofilais(0,564) p < 0,01
6 lentelė. Leukoformulės koreliacinė analizė paskaičiuojant Pirsono koreliacijos koeficientą
Lazdeliniai Segmentiniai Eozinofilai Monocitai Limfocitai
Lazdeliniai 1 0,276 -0,323 ,564* -0,315 Segmentiniai 1 -0,31 -0,044 -,782** Eozinofilai 1 -0,172 -0,245 Monocitai 1 -0,13 Limfocitai 1 * - p<0.05; ** - p<0.01; *** - p<0.001
29
7 llentelė. Kraujo morfologijos koreliacinė analizė paskaičiuojant Pirsono koreliacijos koeficientą
Rodiklia
i WBC LYM MID GRA LY% GR% RBC HGB HCT MCV MCH
MCH C PLT WBC 109g/l 1 ,508 ** ,954** ,730** -0,088 0,088 0,102 0,082 0,037 -0,121 -0,102 0,083 -0,244 LYM 109g/l 1 ,411 ** -0,218 ,789** -,789** 0,152 -0,017 0,033 -0,199 -,318* -0,109 -0,156 MID 109g/l 1 ,755 ** -0,16 0,16 0,132 0,156 0,077 -0,13 -0,047 0,165 -0,144 GRA 109g/l 1 -,725 ** ,726** -0,005 0,106 0,016 0,02 0,137 0,181 -0,159 LY% 1 -1,000* * 0,055 -0,104 0,021 -0,05 -0,242 -0,259 -0,043 GR% 1 -0,055 0,104 -0,021 0,05 0,242 0,259 0,043 RBC 1012/L 1 ,845 ** ,806** -,601** -,544** 0,212 0,077 HGB (g/L) 1 ,882 ** -0,277 -0,015 ,387* -0,028 HCT (L/L) 1 -0,029 -0,103 -0,092 0,017 MCV( fL) 1 ,733 ** -,538** -0,089 MCH (pg/L) 1 0,158 -0,2 MCHC (g/L) 1 -0,082 PLT 109g/l 1 * - p<0.05; ** - p<0.01; *** - p<0.001
Atlikus koreliacinę analize nustatyta, kad GR % su LY % (-1,000) susiję labai stipriais neigiamais, statistiškai reikšmingais koreliaciniais ryšiais p < 0,01, stiprus neigiamas ryšys nustatytas tarp LY% ir GRA (-0,725), GR % su LYM (-0,789). Stipri, statistiškai reikšminga, teigiama koreliacija yra tarp GRA su WBC (0,730) ir MID (0,755), taip pat stipri, statistiškai reikšminga koreliacija tarp LY % su LYM (0,789), GR % su GRA (0,726); HGB su RBC (0,845), HCT su RBC (0,806) ir HGB (0,882), MCH su MCV (0,733)
30
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Lyginant referencinius intervalus kurių vertės pateiktos knygose Kramer (2000) ir Kaneko (2008), referenciniai intervalai suskaičiuoti šiame tyrime atitinka autorių pateiktas referencines normas, išskyrus MCV ir PLT kurių referencinės normos gautos mūsų tyrime yra žemesnės. Taip pat žemesniosios referencinių normų ribos rodiklių WBC, RBC, HGB, HCT, MCH ir MCHC mūsų gautame tyrime yra aukštesnės nei knygose Kramer (2000) ir Kaneko (2008) pateiktos apatinės referencinio intervalo vertės išskyrus MCV ir PLT rodiklių vertes. Pagal pateiktus duomenis Lepherd ir kt. (2009), kuris atliko merino avių hematologinius tyrimus mūsų suskaičiuotų kraujo rodiklių MCV, MCH, PLT vertės yra žemiau referencinių intervalų ribos su poslinkiu į kairę pusę. Lyginant su Šimpraga ir kt., (2013) tirtų Likos paramenka avių referenciniais intervalais (žr. 2 lentelę) mūsų tyrime nustatytų kraujo morfologinių rodiklių aukštesnės vertes yra su poslinkiu į kairę pusę.
Remiantis šio tyrimo rezultatais ir 1 ir 2 lentelėse pateiktais pamatiniais intervalais, buvo įrodyta, kad hematologinių kontrolinių intervalų kraujo kintamieji Lietuvos juodgalvių avių kraujo morfologiniai rodikliai iš tiesų skiriasi nuo to, kas matoma atitinkamoje literatūroje 3 Lentelė. Lyginant atrinktų gyvūnų kraujo vertę su rekomenduojamais intervalais iš atitinkamų vadovėlių, tokių kaip Kramer (2000) ir Kaneko (2008) pateiktomis hematologinėmis reikšmėmis rezultatai rodo, kad, nors jie buvo surinkti iš sveikų gyvūnų, didelė kraujo verčių dalis yra už etaloninių intervalų ribų. Standartinės vertės turėtų apimti 95% sveikų gyvūnų (CLSI, 2008 m.), Todėl maždaug 5% sveikų gyvūnų gali būti už rekomenduojamų intervalų ribų. Taip pat akivaizdu, kad šis procentas yra mažesnis, kai duomenys lyginami su referenciniais intervalais, pateiktais tyrimuose, atliktuose naudojant naujus, griežtesnius pamatinio intervalo nustatymo kriterijus, pvz., Lepherd ir kt. (2009) arba panašias etalonines populiacijas kaip ir Vojta ir kt. (2011) ir Šimpraga ir kt. (2013 m.). Nors mažesni, mėginių, kurių vertės yra didesnės ar mažesnės už nurodytas referencines ribas, procentinė dalis vis dar yra daugiau kaip 5 % (žr. 3 lentelę). Kai kurie aplinkos faktoriai, kaip fizinis stresas, vietovės aukštis. Kraujo mėginiai imti apie 1,0 m aukštyje, bet tai neturėtų būti reikšminga RBC koncentracijai. Dėl skysčių kiekio trūkumo eritrocitų kiekis didėja, taip pat didėja kraujo klampumas. Organizmą aprūpinus pakankamai skysčių kraujo klampumas atsistato ir eritrocitų kiekis normalizuojasi. Fizinis stresas gaudant avis galėtų daryti įtakos aptariamoms reikšmėms. Stresas gali sukelia adrenalino išsiskyrimą taip pat blužnies susitrakimus kas skatina raudonųjų kraujo ląstelių paleidimą į kraujo periferiją, ko pasėkoje išauga hematokrito rodiklis. Sumažėjimas HCT, HGB ir RBC gali būti siejamas su kaulų čiulpų hyperaktyvumu, kas skatina
31 raudonųjų kraujo ląstelių sutrikusią vientisumo produkciją, kuri buvo lengvai sunaikinta retikulo endotelio cirkuliacijos sistemos (9).
Ėriavedžių, kaip referencinės populiacijos, pasirinkimas nustato gautų pamatinių intervalų naudojimą. Reikia atkreipti dėmesį į rezultatus taikant patinams, nes jie nebuvo įtraukti į referencinę populiaciją. Taip pat sezoniniai pokyčiai gali paveikti analitės vertes (13), o tai reiškia, kad apskaičiuoti pamatiniai intervalai yra patikimiausi tuo metu kai buvo renkama etaloninė populiacija rugsėjo mėn.
Kitų autorių šaltiniuose randama, kad avių hematologines vertes gali veikti įvairūs vidiniai tiek išoriniai faktoriai, kaip amžius (3,8,13), lytis (13), sezoniškumas (11), vilnos kirpimas (25), veislė (13) laktacija (6) pašaras (26), ir auginimo modelis (15). nepaisant faktorių , kurie daro įtaką hematologinėms avių kraujo vertėms, gautos vertės yra gana arti įvairiuose šaltiniuose pateiktų referencinių intervalų (22,27).
Avių, kraujo morfologijos ir referencinių intervalų interpretacija kartu su klinikiniais duomenimis ir kitų diagnostinių tyrimų pagalba suteikia veterinarijos gydytojai vertingos informacijos, kad pasiektų galutinę diagnozę. Tačiau reikėtų atkreipti dėmesį į tai, kad gyvūnai, gyvenantys panašiomis aplinkos sąlygomis, sezonais ir esant tam pačiam fiziologiniam būklės lygiui su tyrimo populiacija, turėtų naudoti referencinius intervalus pateiktus atitinkamos vietovės avims. Kraujo tepinėlio analizavimas yra esminė avių hematologinio tyrimo dalis, kurioje pateikiama informacija apie ląstelių morfologiją, kraujo parazitų buvimą ir automatizuotų ląstelių skaičiaus tikslumą.
32
5. IŠVADOS
1. 2016 m. surinkti kraujo mėginiai iš X ūkyje laikomų sveikų Lietuvos juodgalvių avių.
2. Išanalizuoti kraujo morfologiniai rodikliai, sudaryti jų referenciniai intervalai WBC 5,41 – 7,27 109/L, RBC 11,87-13,00 1012/L, HGB 109,40 – 120,90 g/l, HCT 32,60 – 35,30 proc., MCV 26,2-28,0 fL, MCH 9,40 – 9,90 pg/L, MCHC 348,40 – 362,10 g/L, PLT 114,00 – 446,00 109/L.
3. Gautas referencines vertes palyginome su kitų veislių avimis, Lepherd ir kt. (2009) tirtomis merino, Šimpraga ir kt. (2013) Lika pramenka, Dias ir kt. (2010) Churra-da-Terra-Quente avimis.
4. Šio tyrimo rezultatai sutampa su kitų šaltinių rezultatais jei palyginame tik vidutinę vertę, gaunamą taikant aprašomąją statistiką. Tiesioginiam palyginimui reikia išsamios pradinių duomenų ir papildomos informacijos apie išankstinius analizės ir analizės veiksnius bei statistinių skaičiavimo metodų suderinimo.
33
6. PADĖKA
34
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Al-samarai FR, Al-jbory WAH. Effect of some environmental factors on hematological parameters in apparently healthy Iraqi Awassi sheep. 2017;5(3):1668-1671.
2. Journal K, Veterinary F, Sciences M. The hematological parameters in clinically normal lactating and ewes affected with mastitis Harith Abdul-Hadi AL- Hadithy * Jassim Mohamed Suleiman ** لا ض رع بلأ ت ها ب ولا مص ا بة سر ير يا لا طب ي ع ية لا ن عاج ف ي لا دم ية لا ق ي م ** سل ي ما ن محمد جاس م * لا حدي ث ي ع بدلاهاد ي ر ث. 2014;(5).
3. Badawi NM, Al-hadithy HA. EBSCOhost: Complexity theory applied to itself. 2014;4(1):1-5. http://web.ebscohost.com/ehost/pdf?vid=2&hid=107&sid=83493674-310f-4a64-b6fb-c308a1b3b750%40sessionmgr111.
4. Piccione G, Casella S, Giannetto C, Vazzana I, Niutta PP, Giudice E. Influence of age on profile of serum proteins in the calf. Acta Vet Brno. 2009;59(4):413-422. doi:10.2298/AVB0904413P
5. Callan RJ, Jones ML, Allison RW, Russell KE, Roussel AJ, Maas J. Preface Problems in Cattle. Analysis. 2007;23(3).
6. Shek Vugrovečki A, Vojta A, Šimpraga M. Establishing reference intervals for haematological and biochemical blood variables in Lika pramenka sheep. Vet Arh. 2017;87(4):487-499. doi:10.24099/vet.arhiv.160314
7. Dias IR, Viegas CA, Silva AM, et al. Haematological and biochemical parameters in Churra-da-Terra-Quente ewes from the northeast of Portugal. [Parâmetros hematológicos e bioquímicos de ovelhas da raça Churra da Terra Quente do nordeste de Portugal]. Arq Bras Med
Veterinária e Zootec. 2010;62(2):265-272. doi:10.1590/S0102-09352010000200004
8. Egbe-Nwiyi TN, Nwaosu SC, Salami HA. Haematological Values of Appararently Healthy Sheep and Goats as Influenced by Age and Sex in Arid Zone of Nigeria.
African J Biomed Res. 2000;3:109-115.
https://www.ajol.info/index.php/ajbr/article/view/140739.
9. Polizopoulou ZS. Haematological tests in sheep health management. Small Rumin
Res. 2010;92(1-3):88-91. doi:10.1016/j.smallrumres.2010.04.015
10. Borjesson DL, Christopher MM, Boyce WM. Biochemical and Hematologic Reference Intervals for Free-Ranging Desert Bighorn Sheep. J Wildl Dis. 2000;36(2):294-300.
35 doi:10.7589/0090-3558-36.2.294
11. Vojta A, Shek-Vugrovecki A, Radin L, Efendic M, Pejakovic J, Simpraga M. Hematological and biochemical reference intervals in Dalmatian pramenka sheep estimated from reduced sample size by bootstrap resampling. Vet Arh. 2011;81(1):25-33.
12. Friedrichs KR, Harr KE, Freeman KP, et al. ASVCP reference interval guidelines: Determination of de novo reference intervals in veterinary species and other related topics. Vet
Clin Pathol. 2012;41(4):441-453. doi:10.1111/vcp.12006
13. Oramari RAS, Bamerny AO, Zebari HMH. Factors Affecting Some Hematology and Serum Biochemical Parameters in Three Indigenous Sheep Breeds. 2013;7181(January 2014):56-63.
14. Lepherd ML, Canfield PJ, Hunt GB, Bosward KL. Haematological, biochemical and selected acute phase protein reference intervals for weaned female Merino lambs. Aust Vet J. 2009;87(1-2):5-11. doi:10.1111/j.1751-0813.2008.00382.x
15. Shek Vugrovečki A, Vojta A, Šimpraga M. Establishing reference intervals for haematological and biochemical blood variables in Lika pramenka sheep. Vet Arh. 2017;87(4):487-499. doi:10.24099/vet.arhiv.160314
16. Belotta AF, Santarosa BP, Ferreira DOL, et al. Portal Vein Dopplerflowmetry in healthy sheep according to age. Pesqui Vet Bras. 2017;37(10):1172-1176. doi:10.1590/S0100-736X2017001000021
17. Hale BM. Managing Internal Parasites ATTRA in Sheep and Goats. Parasite. 2006:1-8.
18. Jones ML, Allison RW. Evaluation of the Ruminant Complete Blood Cell Count.
Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2007;23(3):377-402. doi:10.1016/J.CVFA.2007.07.002
19. Braun JP, Trumel C, Bézille P. Clinical biochemistry in sheep: A selected review.
Small Rumin Res. 2010;92(1-3):10-18. doi:10.1016/j.smallrumres.2010.04.002
20. Adili N, Melizi M. Preliminary study of the influence of red blood cells morphometry on the species determinism of domestic animals. Vet World. 2014;7(4):219-223. doi:10.14202/vetworld.2014.219-223
22. Musk GC, James A, Kemp MW, Ritchie S, Ritchie A, Laurence M. Pregnant sheep in a farm environment did not develop anaemia. Animals. 2017;7(5):1-9. doi:10.3390/ani7050034
36 24. Zapasnikienė B. Lietuviškos Avių Veislės, LSMU Gyvulininkystės Institutas,
Baisogala, 2015me.
25. Carcangiu, Vincenzo & M Vacca, G & Parmeggiani, Albamaria & Mura, Consuelo & Pazzola, M & Dettori, Maria Luisa & P Bini P (2008). The effect of shearing procedures on blood levels of growth hormone, cortisol and other stress haematochemical parameters in Sarda sheep. Animal : an international journal of animal bioscience. 2. 606-12. 10.1017/S1751731108001651.
26. Al-Jbory WAH, Al-Samarai FR. Some hematological reference values estimated by the reference values advisor in the Iraqi Awassi sheep. Comp Clin Path. 2016;25(6):1155-1162. doi:10.1007/s00580-016-2320-3
27. KRAMER JW (2000): Normal Hematology of Cattle, Sheep, and Goats In:
Schalm’s Veterinary Hematology (Kramer, B. F., J. G, Zinkl, N. C. Jain, Eds.), 5th Ed., Baltimore, Lippincot Williams & Wilkins, Pp. 1057-1084.
28. Chase Ch., Lutz K., McKenzie E., Tibary A. Blackwell's Five-Minute Veterinary Consult: Ruminant. (2017)
29. Ježek J., Nemec M., Starič J., Klinkon M. (2011) Age related changes and reference intervals of haematological variables in dairy calves. Bull. Vet. Inst. Pulawy 55, 471-478.
30. Jones, M. L., & Allison, R. W. (2007). Evaluation of the Ruminant Complete Blood Cell Count. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 23(3), 377–402.
31. Roland L., Drillich M., Iwersen M. (2014). Hematology as a diagnostic tool in bovine medicine. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Vol.26(5) 592-598
32. https://allaboutblood.com/2013/03/23/toxic-granules-in-neutrophils/ 33. https://www.sciencedirect.com/topics/veterinary-science-and-veterinary-medicine/basophilia 34. https://www.labce.com/spg28972_toxic_granulation_and_vacuolation.aspx 35. https://imagebank.hematology.org/image/3781/large-granular-lymphocyte--1?type=upload 36. https://imagebank.hematology.org/image/1070/doumlhle-bodies--2?type=upload 37. https://imagebank.hematology.org/image/60400/hypersegmented-neutrophil?type=upload
