LIETUVOS SVEIKATOS MOKSL

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

GRETA MORKŪNAITĖ

SIRT1 GENO POLIMORFIZMŲ IR KI-67 PROLIFERACIJOS INDEKSO SĄSAJOS SU HIPOFIZĖS ADENOMOS PASIREIŠKIMU

Magistro baigiamasis darbas

Magistrinio darbo vadovė: Doc. dr. Rasa Liutkevičienė

2

TURINYS

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6

6. SANTRUMPOS ... 7

7. SĄVOKOS ... 9

8. ĮVADAS ... 10

9. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11

10. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12

10.1. Hipofizės adenoma ... 12

10.2. Hipofizės adenomų klasifikacija ... 13

10.3. Etiologija ... 14

10.4. Sirtuinų vaidmuo ... 14

10.5. SIRT1 geno polimorfizmai... 16

11. TYRIMO METODIKA ... 18

11.1. Tyrimo planavimas ... 18

11.2. Tyrimo objektas ... 18

11.3. Tiriamųjų atranka ... 18

11.4. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas ir genų polimorfizmų tyrimas ... 19

11.4.1. DNR išskyrimo etapai ... 19

11.4.2. DNR gryninimo etapai ... 20

11.4.3. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru ... 20

11.5. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos ... 20

11.5.1. PGR principas ... 21

11.5.2. Metodas ... 22

11.5.3. Ki-67 nustatymas ... 22

11.6. Statistinė analizė ... 22

12. REZULTATAI ... 24

12.2. Rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse... ... 25

3 12.3. Rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių HA ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į

tiriamųjų lytį ... 26

12.4. Rs3740051 genotipų daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsiţvelgiant į ligos recidyvą ... 27

12.5. Rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į naviko invazyvumą ... 28

12.6. Rs3740051 genotipų daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsiţvelgiant į ligos aktyvumą ... 30

12.7. Ki-67 proliferacijos indekso ir SIRT1 rs3740051 genotipų sąsajos ... 31

13. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32

14. IŠVADOS ... 34

15. LITERATŪRA ... 35

4

1. SANTRAUKA

Magistro darbo autorė: Greta Morkūnaitė.

Darbo pavadinimas: SIRT1 geno polimorfizmų ir Ki-67 proliferacijos indekso sąsajos su hipofizės adenomos pasireiškimu.

Tyrimo tikslas: Įvertinti SIRT1 rs4746720 ir rs3740051 polimorfizmų ir Ki-67 proliferacijos indekso sąsajas su hipofizės adenomos pasireiškimu.

Uţdaviniai: 1. Nustatyti SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų genotipų daţnius sergantiems hipofizes adenoma ir sveikiems asmenims bei įvertinti jų įtaką hipofizės adenomos pasireiškimui. 2. Nustatyti SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su hipofizės adenomos pasireiškimu, atsiţvelgiant į lytį. 3. Nustatyti SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su hipofizės adenomos pasireiškimu, atsiţvelgiant į hipofizės adenomos recidyvą, invazyvumą ir hormoninį aktyvumą. 4. Nustatyti SIRT1 polimorfizmų ir Ki-67 proliferacijos indekso (PI) sąsajas.

Tyrimo metodai ir dalyviai: Tyrime dalyvavo 142 asmenys, kuriems buvo nustatyta hipofizės adenoma (HA) ir 826 sveiki tiriamieji. Iš tiriamųju buvo paimtas kraujas, išskirta DNR, naudojant DNR skyrimo rinkinius. Realaus laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu buvo atliktas genotipavimas. Rezultatai apskaičiuoti naudojant ,,IBM SPSS Statistics„„ programą.

Rezultatai: Atlikus SIRT1 rs4746720 genotipavimą, visiems tiriamiesiems buvo nustatytas laukinio tipo genotipas (A/A), todėl toliau į statistinę analizę šis polimorfizmas nebuvo įtrauktas.

Išanalizavus SIRT1 rs3740051 polimorfizmo daţnį, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, statistiškai reikšmingų skirtumų nustatyta nebuvo. Taip pat, statistiškai reikšmingų rezultatų negavome atlikę analizę pagal tiriamųjų lytį. SIRT1 rs3740051 G/A genotipas, lyginant su G/G genotipu galimybę susirgti neinvazyvia HA didina 2,6 kartus (p=0,003), o lyginant su G/G ir A/A genotipais kartu, šią galimybę didina 2,5 kartus (p=0,004). Taip pat, G/A ir A/A genotipai kartu, lyginant su G/G genotipu, susirgti neinvazyvia HA galimybę didina 2,7 kartus (p=0,001).

Išvados: Nustatėme, kad SIRT1 rs3740051 A/A genotipas maţina galimybę susirgti HA su recidyvu, o G/A ir G/G genotipai bei kiekvienas G alelis didina galimybę susirgti neinvazyvia HA. Vertinant SIRT1 rs3740051 polimorfizmo ir Ki-67 proliferacijos indekso sąsajas, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme.

5

2. SUMMARY

Author of Master Thesis: Greta Morkūnaitė

Full title of Master Thesis: SIRT1 gene polymorphisms and Ki-67 labelling index relations with manifestation of pituitary adenoma.

The Purpose of the Thesis: To evaluate the influence of SIRT1 rs4746720 and rs3740051 polymorphisms and Ki-67 labelling index manifestations of pituitary adenoma.

The Tasks: 1. To determine the frequencies of SIRT1 single nucleotide polymorphisms in patients with pituitary adenoma and for control group, also evaluate their influence on the manifestation of pituitary adenoma. 2. To determine the association between SIRT1 single nucleotide polymorphisms and manifestation of pituitary adenoma, based on gender. 3. To determine the association between SIRT1 single nucleotide polymorphisms andmanifestation of pituitary adenomain recurrence, invasiveness and hormonal activity. 4. To determine the association between SIRT1 single nucleotide polymorphisms and Ki-67 labelling index (LI).

Materials and methods: Study group included patients with 142 pituitary adenoma (PA) and 826 control group of healthy people. The DNA was isolated with DNA purification kit from blood. The genotyping was performed using the real-time polymerase chain reaction method (RT-PCR). The resultswere calculated using the statistical analysis method of “IBM SPSS Statistics“.

Results: Genotyping of SIRT1 rs4746720 revealed that onlywild-type genotype (A/A) was observed in allstudy subjects, therefore this polymorphism was not included in the further statistical analysis. Genotyping results of SIRT1 rs3740051 polymorphism did not show statistically significant differences between overall PA group and control had no relation to gender, as well. Further, analysis showed that SIRT1 rs3740051 G/A genotype increases odds of having non-invasive PA by 2.6-folds (p = 0.003), compared with G/G and A/A genotype andby 2.5-folds (p = 0.004), compared with G/G genotype and by 2.7-folds (p = 0.001), compared with the G/G genotype.

Conclusions: Study revealed that SIRT1 rs3740051 A/A genotype decreases odds of recurrence PA development. SIRT1 rs3740051 G/A and G/G genotypes and each G allele increase the odds of non-invasive PA development. No statistically significant results were found for SIRT1 rs3740051 polymorphism and PA activity. No statistically significant associations between SIRT1 rs3740051 and Ki-67 were found, as well.

6

3. PADĖKA

Nuoširdţiai dėkoju baigiamojo magistro darbo vadovei Doc. dr. Rasai Liutkevičienei uţ pagalbą, renkant tiriamųjų ir kontrolinę grupes, kantrybę, vertingas pastabas, patarimus rašant baigiamąjį darbą. Uţ pagalbą laboratorijoje, konsultacijas, bendradarbiavimą rašant baigiamąjį magistro darbą, dėkoju jaunesniajai mokslo darbuotojai Alvitai Vilkevičiūtei.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Kauno regioninis biomedicininių tyrimų etikos komitetas (Nr. P2-9/2003) ir Valstybinės duomenų apsaugos inspekcija (Nr. 2R-581).

7

6.SANTRUMPOS

AKTH – adrenokortikotropinis hormonas

CNC (angl. carney complex) – carney kompleksas CNS – centrinė nervų sistema

CPS1 (angl. carbamoil-phosphate synthase 1) – karbamoilfosfato sintazė 1 DNR – deoksiribonukleininė rūgštis

FXR – farnesoido X receptorius GDH – gliutamato dehidrogenazė HA – hipofizės adenoma

HIF1α– hipoksiją indukuojantis faktorius 1α

HMGKS2 – 3-hidroksi-3-metilgliutaril-KoA sintazė 2 H3 – histono H3 dimeras

H3K9– histonas H3 lizinas 9 IDH2 – izocitrato dehidrogenazė 2

IHC – imunochistocheminis tyrimo metodas Ki-67 – ląstelių dalijimosi indeksas

LCAD (angl. long-chain acyl-CoA dehydrogenase)- ilgų grandinių acil-KoA dehidrogenzė. LH/FSH –liutenizuojantis hormonas ir folikulus stimuliuojantis hormonas

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas LXR (angl. liver X receptor) – kepenų X receptorius

MEN (angl. multiple endocrine neoplasia)– dauginė endokrininė neoplazija NF-kB (angl. nuclear factor kappa B) – branduolio faktorius kapa B

OXPHOS (angl. oxidative phosphorylation) – oksidacinis fosforilinimas PAR3 – proteinazę aktyvuojantis receptorius 3

PEPKK – fosfoenolpiruvato karboksinazė PI – proliferacijos indeksas

PGR – polimerazės grandininė reakcija PSO– pasaulinė sveikatos organizacija PRL– prolaktinas

p53 - auglio supresoriaus baltymas, kurį koduoja TP53 genas. RNR – ribonukleininė rūgštis

SIRT1 (angl. silent mating-type information regulation 2 homologue 1) – sirtuinas 1 SOD2 – superoksido dismutazė 2

8 SREBP-1c (angl. sterol regulatory element-binding protein 1c) – sterolį reguliuojančio elemento surišantis baltymas 1c

STH – augimo hormonas somatropinas

TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija TTH/TSH – tirotropinis ir tirostimuliuojantis hormonai

9

7. SĄVOKOS

AMPK/LKB1 kelias (angl. activated protein kinase/liver kinase B1) – dalyvauja cheminėse reakcijose, kurio rezultatas – slopinamos vėţio ląsteles [1].

Bax (angl. bcl-2-associated X protein) – bcl-2 susijęs baltymas, cheminėse reakcijose reguliuojantis mitochondrijų membranos pralaidumą ir nuo mitochondrijų priklausomą apoptozę [1].

FAS indukcija (angl. member of the TNF receptor family) – antigenas, sąlygojantis ląstelės apoptozę [1].

PGC-1α transkripcijos faktorius (angl. peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)– dalyvauja cheminėse reakcijose, kurios didina mitochondrijų tūrį, kraujagyslių skaičių ir baltymų, atsakingų uţ riebalų oksidavimą, gamybą [2].

FOXO (angl. forkhead box protein O) – transkripcijos faktorius, dalyvaujantis reguliuojant lipidų ir gliukozės metabolizmą [3].

GADD45 (angl. growth arrest and DNA-damage-inducible protein) – augimą stabdantis ir DNR paţaidas sukeliantis baltymas [3]

Laukinio tipo genotipas – gamtinėse populiacijose daţniausiai sutinkamas genotipas [4]

Ku70 (kitaip ţinomas XRCC6, angl. X-Ray Repair Cross Complementing 6) – dalyvauja cheminėse reakcijose jungiant nehomologiškas DNR galus [3].

10

8. ĮVADAS

Hipofizės adenomos (HA) sudaro 15 proc. visų intrakranijinių navikų ir yra trečioje vietoje tarp daţniausių navikų formų po meningiomų ir gliomų [5]. Šiandieninėje medicinos praktikoje šie daţniausiai gerybiniai neuroendokrininiai navikai priklauso prie atsitiktinai turkiškojo balno srityje randamų darinių, kurie aptinkami atliekant galvos smegenų vaizdinius tyrimus dėl visai kitų prieţasčių. Jų atsitiktinis nustatymas padidėjo 10 proc. dėl vis daţniau atliekamų, labiau tobulėjančių vaizdinių tyrimų diferencinėje diagnostikoje. Apie trečdalį visų HA sudaro hormonaliai neaktyvios (negamina kliniškai nustatomų hormonų) gerybinai navikai ir nors klinika gan ryški (galvos skausmas, regėjimo sutrikimas, hipopituitarizmas), simptomai pasireiškia tik apie 30-60 metus [6]. Likusią dalį sudaro hormonaliai aktyvios HA, iš kurių iki 66 proc. yra prolaktinomos, apie 16 proc. somatotropinomos, 6 proc. kortikotropinomos ir kiti navikai [7]. Šių navikų klinika pasireiškia ţymiai anksčiau, simptomų raiška priklauso nuo išskiriamo hormono kiekio.

Viena iš prieţasčių, kodėl naviko klinika gali nepasireikšti arba atsirasti per vėlai, yra susiję su naviko dydţiu. Klinikinių atvejų tyrimuose buvo nustatyta, kad esant makroadenomoms (≥10 mm) simptomai pasireiškia ţymiai anksčiau (nuo 20 metų), taip pat jie yra labiau išreikšti dėl per didelio išskiriamo hormono kiekio [7, 8-11].

Kadangi daugumos HA patogeneziniai mechanizmai nėra aiškūs, vis daugiau dėmesio skiriama genetikos sričiai. Iki šių dienų yra nustatyta, kad 5 proc. HA atsiradimą lemia genetinės mutacijos [12]. Daugėja mokslinių tyrimų susijusių su genais, kurie nukreipti HA atsiradimo galimybei nustatyti, klinikinės naviko eigos sekimui.

Nemaţai tyrimų buvo atlikta ieškant naujų genetinių veiksnių tyrinėjant SIRT1 geną bei jo polimorfizmų sąsajas su kitais navikais [13-18]. Tačiau mokslinių tyrimų, tyrinėjančių sąsajas SIRT1 geno su HA buvo atliktas tik vienas. Tyrime tirtas vienas iš SIRT1 geno rs12778366 polimorfizmas ir buvo įrodyta, kad genas gali būti viena iš prieţasčių, lemiančių HA pasireiškimą [4].

Šiame darbe buvo tiriama SIRT1 geno polimorfizmų sąsajos su HA. Buvo pasirinkti SIRT1 geno rs3740051, kuris buvo tirtas ieškant sąsajos su krūties vėţiu ir rs4746720, kuris buvo tirtas ieškant sąsajos su plaučių vėţiu, polimorfizmai. Abu šie genai didino minėtų vėţių atsiradimo galimybę [19, 20].

11

9. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Tikslas: Įvertinti SIRT1 rs4746720 ir rs3740051 polimorfizmų ir Ki-67 proliferacijos indekso sąsajas su hipofizės adenomos pasireiškimu.

Uţdaviniai:

 Nustatyti SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų genotipų daţnius, sergantiems hipofizes adenoma ir sveikiems asmenims bei įvertinti jų įtaką hipofizės adenomos pasireiškimui.

 Nustatyti SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su hipofizės adenomos pasireiškimu, atsiţvelgiant į lytį.

 Nustatyti SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su hipofizės adenomos pasireiškimu, atsiţvelgiant į hipofizės adenomos recidyvą, invazyvumą ir hormoninį aktyvumą.

12

10. LITERATŪROS APŢVALGA

10.1. Hipofizės adenoma

Hipofizė yra išsidėsčiusi turkiabalnyje, pleištakaulio kūno įduboje, kur trumpu savo piltuvėliu jungiasi su pagumburiu (1 pav.). Sudaryta iš 80 proc. adenohipofizės, 20 proc. iš uţpakalinės skilties neurohipofizės. Liaukinė adenohipofizė sekretuoja: augimo hormoną somatotropiną (STH), augimo faktorių (IGF-1), prolaktiną (PRL), kortizolį (KOR), gonadotropinius hormonus (FSH, LH), tirotropiną (TTH/TSH), adrenokortikotropinį hormoną (AKTH), α-melanotropiną (α-MSH) ir β-endorfiną (END) [12]. Nervinė neurohipofizė gamina specifines glijos ląsteles, pituicitus. Jos negamina hormonų, bet kaupia pagumburio išskiriamus hormonus – antidiurezinį hormoną (ADH) ir oksitociną [21]. Hipofizės sritis apsupta svarbiomis nervinėmis, kraujagyslinėmis, endokrininėmis ir kaulinėmis struktūromis. Esant jų paţeidimui daţniausiai išsivysto HA. Ši nedidelė vidaus sekrecijos liauka (12-15 mm) reguliuoja kitų organizmo liaukų veiklą, todėl sergant HA sutrinka ir kitų hormonų veikiančių organų sistemas veikla [22]. Gerybinis navikas daţnai perauga aplinkinius audinius, sutrikdo jų funkciją. Kartais dėl metabolinės apykaitos sutrikimo ar per didelės hormonų sekrecijos gali išsivystyti ir piktybinis navikas [21].

13 10.2. Hipofizės adenomų klasifikacija

HA klasifikacija pagrįsta naviko dydţiu, invazija į gretimas struktūras, šeimynine anamneze, klinika, morfologinėmis savybėmis, reakcijomis į gydymą, recidyvais. Nors HA yra gerybinis navikas, tačiau kai kuriuos iš jų yra sunku gydyti dėl jų tendencijos atsinaujinti. Nauji ankstyviosios diagnostikos metodai ir skirtingos klasifikacijos perspektyvos gali padėti nustatyti pacientų grupes su panašiomis savybėmis ir pritaikyti kuo optimalesnį gydymą [12].

Pagal naujausius 2017 metų Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) duomenis HA yra skirstomos į: hormonaliai aktyvias, neaktyvias ir atipines. Pagal dydį: mikroadenomos (iki 10 mm), makroadenomos (daugiau kaip 10 mm) [24].

Pagrindinės sekretuojančių adenomų rūšys, kurios išskiria pagumburio kontroliuojamus hormonus: LH/FSH, TSH, STH, PRL, AKTH. Pagal tai, kokį hormoną išskiria adenoma, yra suformuojamas naviko pavadinimas ir suskirstoma į grupes [25].

Viena iš labiausiai paplitusių HA, sekretuojančių priekinės hipofizės liaukos laktotrofinių ląstelių, yra prolaktinoma. Šis navikas sudaro 50 proc. visų HA. Esant naviko hipersekrecijai vyraujantys simptomai: hipogonadizmas, nevaisingumas, amenorėja, galaktorėja, osteoporozė moterims, vyrams – impotencija. Didėjant navikui, spaudţiamos gretimos struktūros, dėl ko atsiranda galvos skausmas ir regos funkcijos sutrikimai [26].

Akromegalija yra reta, bet sunki liga, kurią 95 proc. atvejų suaugusiems sukelia STH sekretuojanti makroadenoma. Gerybinė priekinės hipofizės dalies adenoma dėl nekontroliuojamos STH sekrecijos vaikų amţiuje sukelia gigantizmą.

Tirotropinoma ir gonadotropinoma sudaro iki 1 proc. visų aktyviai sekretuojančių HA. Esant TSH hipersekrecijai vyrauja hipertiroidizmo simptomai. Bendrai TSH makroadenomai ir LH/FSH adenomoms galimi akipločio defektai ir hipopituitarizmas [12].

AKTH produkuojanti hipofizės adenoma 80 proc. atvejų sukelia Kušingo ligą. Dėl priekinės hipofizės dalyje adrenokotikotropinio hormono hipersekrecijos didėja kortizolio išsiskyrimas iš antinksčių, todėl pacientai skundţiasi aukštu spaudimu, menstruacijų sutrikimais, impotencija, greitai augančiu svoriu, veido raudoniu, padidėjusiu plaukuotumu, depresijomis. Reta liga greitina ir kitų ligų atsiradimą: cukrinį diabetą, osteopeniją ar osteoporozę, hiperpigmentaciją, dislipidemiją. Negydant ligos mirtingumas siekia iki 50 proc. [27].

Didelės nefunkcionuojančios adenomos daţnai spaudţia regos nervų kryţmę ir plečiantis lemia regos sutrikimą, net aklumą. Didėjant navikui, spaudţiama hipofizė, sutrikdoma jos endokrininė funkcija: maţėja LH/FSH, STH, TTH/TSH, AKTH sekrecija [28].

Atipinės HA buvo išskirtos klasifikacijoje remiantis jų imunohistocheminiais ţymenimis ir dėl netipinės klinikos. Šie reti piktybiniai navikai apibūdinami kaip turintys Ki-67 proliferacijos indeksą didesnį kaip 3 proc. ir diagnozuojant laboratorijoje stebimas ryškus p53 baltymo nusidaţymas

14 branduolyje. Tačiau vis dar vyksta klinikiniai tyrimai, kaip kuo greičiau ir efektyviau diagnozuoti bei gydyti naviką [29].

10.3. Etiologija

HA pasireiškimo prieţastys nėra ţinomos iki šiol. Manoma, kad jų atsiradimą lemiantys veiksniai yra genetiniai, hormoniniai, ţalingi įpročiai. Aplinkos veiksnių įtaka HA išsivystymui vis dar nėra pagrįsta moksliniais tyrimais [30, 31].

Vis daugiau dėmesio yra skiriama genetiniams tyrimams. Iš visų HA yra išskiriama paveldima, šeiminė, izoliuota HA, kuri yra siejama su: dauginės endokrininės neoplazijos sindromo 1, 4 tipais (MEN1, MEN4) ir Carney kompleksu (CNC). Dėl ligos retumo, literatūroje minimi pavieniai atvejai besimptominės, šeiminės, izoliuotos HA, kuriuos buvo aprašytos kartu su akromegalijos liga [32].

Šeiminė HA sudaro 5 proc. visų HA [33]. Esant MEN1 geno patologijai yra nustatomi keli endokrininiai organų navikai: prieskydinių, hipofizės, enteropankreatinių liaukų. Tyrimai rodo, kad baltymas meninas, kurį koduoja MEN1 genas, veikia kitus baltymus, dalyvaujančius transkripcijos reguliavime, genomo stabilume, DNR paţaidų taisyme ir ląstelių dalijimosi procesuose [34, 35]. Paciento giminaičiai turi padidintą riziką sirgti centrinės nervų sistemos (CNS), antinksčių, ţarnų navikais [36]. Apie 10 proc. pacientų, sergantys šeimine HA, gali turėti kartu ir MEN4 mutaciją, todėl vėliau gali susirgti inkstų, antinksčių, skydliaukės navikais [37,38].

Retos CNC komplekso mutacijos kaip ligos simptomai gali pasireikšti dar paauglystėje. Vystosi odos pigmentacijos sutrikimai, miksomos, pavieniais atvejais gali būti paţeidţiami antinksčiai - didėja naviko atsiradimo rizika [36].

10.4. Sirtuinų vaidmuo

Sirtuinai tai baltymų grupė, kuri veikia skirtingas ląstelių struktūras: branduolyje deacetilina histonus ir keletą kitų transkripcijos reguliatorių branduolyje, taip pat specifinius baltymus citozolyje ir mitochondrijoje, reguliuoja lipidų ir gliukozės metabolizmą bei atsaką į fiziologinius organizmo pokyčius pagal kintamą energijos lygį [39]. Jie tarsi operatorių tinklas, kuris apjungia ir kontroliuoja energijos homeostazę ir taip lemia ţmogaus ilgaamţiškumą, sveikatą [40].

Atliktuose tyrimuose su ţinduoliais, buvo išskirtos septynios sirtuinų grupės. Jie apibūdinami kaip nuo nikotinamido adenino dinukleotido (NAD) priklausoma, histono deacetilazės [41]. Sirtuinų lokalizacija ir funkcija apibūdinama 1 lentelėje. Kontroliuodami histonų dacetilizaciją, sirtuinai yra kaip „energijos jutikliai ir transkripcijos aktyvatoriai“ ląstelėje. Sirtuinai veikia mitochondirijų aktyvumą, baltymus, kurie atlieka pagrindinį vaidmenį su metabolizmu susijusiomis ligų

15 progresavimu: antro tipo cukrinis diabetas, metabolinis sindromas, neurodegeneracinės ligos (Parkinsono, Alzheimerio) [42].

Vienas iš labiausiai tirtų sirtuinų šeimos narių yra sirtuinas1 (SIRT1), kuris iš pradţių buvo aprašytas kaip deacetilintas histonas, tačiau atlikus klinikinius tyrimus, buvo įrodyta, kad SIRT1 turi ir kitų organų taikinių, kuriuos veikia [43] (1 lentelė). SIRT1 genas yra aptinkamas 10 chromosomomos ilgajame petyje 10q21.3 (2 pav). SIRT1 atsakingas uţ ląstelės ciklo reguliavimą, apoptozę, DNR paţaidų taisymą, ypač kai yra oksidacinis stresas. Silpnėjant transkripcijos faktoriaus funkcijai, nėra aktyvinami kiti genai, kurie galėtų sukelti ląstelės apoptozę. Pavyzdţiui, slopinant p53 baltymo, patekimo į chromatiną, keičiasi tolimesnė genų transkripcija ir ląstelė išgyvena DNR paţaidą. Genas taip pat apsaugo mitochondrijas nuo susinaikinimo deacetilindamas Ku70, kuris neleidţia Bax baltymui patekti į mitochondrijas. Panašiai SIRT1 kontroliuoja deacetilinimą FOXO transkripcijos faktoriaus, kuris yra svarbus reguliuojant lipidų ir gliukozės metabolizmą ir stresui atsparų geną – GADD45 [3].

SIRT1 neabejotinai slopina plačiai plintantį, stiprų uţdegimą, kai progresuoja vėţys. Ţinoma, kad lėtinis uţdegimas gali būti susijęs su laipsnišku naviko išsivystymu, ypač kai aktyviai dauginasi atipinės ląstelės. SIRT1 slopina tumoro nekrozės faktorių ɑ (TNF-ɑ), lipopolisacharidą (LPS), interleukinus, transkripcijos veiksnius, kurie yra susiję su uţdegimu [44]. Genas sukelia antivėţinį efektą per kelis mechanizmus. Pavyzdţiui, SIRT1 gali neutralizuoti įvairius genetinius paţeidimus, įskaitant oksidacinį DNR paţeidimą, taip blokuodamas kancerogenezės pradţią [45]. Tačiau atliktuose klinikiniuose tyrimuose stebimas SIRT1 raiškos padidėjimas vystantis: storosios ţarnos [46], prostatos [47], glioblastomos [48], kiaušidţių [49], skrandţio [50], krūties [51,49], skydliaukės [52], limfomos [53] vėţio atvejais.

1 lentelė. Sirtuinų charakteristika [42,43] Sirtuinas Klasė Lokalizacija Biocheminės

reakcijos Funkcija Taikiniai

SIRT1 I Branduolys, ląstelės citoplazminis matriksas Deacetilinimas Ląstelės metabolizmo ir išgyvenamumo reguliavimas, streso atsako

kontrolė PGC1α, FOXO1, FOXO3, p53, NF-kB, HIF1α, LXR, FXR, SREBP-1c ir kiti. SIRT2 Ląstelės citoplazminis matriksas Mikrovamzdelių stabilumo, ląstelės ciklo

reguliavimas, heterochromatino formavimasis Tubulinas, PEPKK, FOXO1, PAR3 SIRT3 Mitochondrija Mitochondrijos funkcijos LCAD,

16 aktyvavimas, termogenezės reguliavimas HMGKS2, SOD2, GDH, IDH2, OXPHOS kompleksai ir kiti SIRT4 II ADP-ribosilacija

Insulino sekrecijos atsako amino rūgštims

reguliavimas

GDH

SIRT5 III Deacetilinimas Neţinomas CPS1

SIRT6 IV Branduolys Deacetilinimas, ADP-ribosilacija DNR kontrolė/taisymas, ADP-ribosiltransferazės aktyvinimas H3K9, H3

SIRT7 Branduolėlis Neţinoma

rRNA sintezės ir ribosomos gamybos

reguliavimas

Neţinoma

2 Pav. Sirtuino 1 geno lokalizacija [23]

10.5. SIRT1 geno polimorfizmai

Kadangi SIRT1 genas yra labiausiai ištirtas iš savo grupės, didelis dėmesys buvo atkreiptas į kitas jo formas – polimorfizmus ir jų veikimą organizme.

SIRT1 kiekis yra susijęs su mityba. Kai yra badaujama arba gaunama per maţai kalorijų, jo kiekis didėja [39]. Vienas iš organų taikinių yra kepenų ląstelės, kuriose maţėjant energijos atsargoms,

17 aktyvuojama SIRT1 ir skatinama glukoneogenezė – slopinama glikolizė, deacetilinant transkripcijos kofaktorių PGC-1ɑ [2]. Nyderlanduose atliktame kohortiniame tyrime, kuriame dalyvavo daugiau kaip tūkstantis tiriamųjų, buvo nustatyta, kad būtent nutukę ţmonės, kuriems rastas SIRT1 rs12778366 atliekant gliukozės toleravimo testą turėjo geresnę gliukozės toleranciją, nes SIRT1 skatino insulino sekreciją kasos ląstelėse. Maţiau statistiškai reikšmingas rezultatas buvo pacientams su normaliu/maţu svoriu [54]. SIRT1 reguliuoja kepenyse lipidų metabolizmą aktyvuodamas AMPK/LKB1 kelią. Kai yra hiperglikemija SIRT1 aktyvina AMPK, kuris uţkerta kelią lipidų atsargoms susidaryti, stabdo FAS indukciją [1]. Tai buvo pastebėta atlikus tyrimus laboratorijoje su pelėmis, kurios buvo maitinamos riebalų turinčia dieta ir gydomos SIRT1 agonistu, kurio dėka buvo stebima pagerėjusi kepenų fiziologija ir medţiagų apykaita [55].

Yra hipotezė, kad antiapoptozinis SIRT1 poveikis, skatina vėţio-1 geno (HIC-1) aktyvavimą, kuris daugelyje neaktyvių navikų yra uţslopintas. Daugiausia mokslinių tyrimų yra atlikta tyrinėjant SIRT1 geno polimorfizmų sąsajas su krūties vėţiu, kuriose buvo aptikta didelė SIRT1 koncentracija vėţinių ląstelių linijose. Viename iš pirmųjų tyrimų buvo tirti kelių polimorfizmų sąsajos su krūties vėţiu. Rezultatai parodė, kad pacientams, sergantiems vėţiu, tiriant serumą SIRT1 raiška buvo gerokai didesnė ir atlikti tolimesni tyrimai tik patvirtina SIRT1 reikšmę krūties vėţio pasireiškimui [56]. Kitų sistemų navikams (storosios ţarnos, prostatos, glioblastomos, kiaušidţių, skrandţio, skydliaukės, limfomos) SIRT1 polimorfizmai gali lemti šių darinių kancerogenezę [46-53]. Maţiausiai tyrimų yra atlikta tiriant SIRT1 sąsajas su CNS navikais, ypač su HA [39].

18

11. TYRIMO METODIKA

11.1. Tyrimo planavimas

Tyrimas buvo atliktas LSMU Neuromokslų institute, Oftalmologijos laboratorijoje. Planuojant magistrinio darbo tyrimus, buvo išanalizuotas problemos aktualumas, ieškoma informacijos patikrintose duomenų bazėse apie atliktus SIRT1 geno polimorfizmų sąsajas su hipofizės adenomomis. Nagrinėjome anksčiau atliktus mokslinius darbus, tyrimus, kurie teigia, kad hipofizės adenomos išsivystymą lemia įvairūs genetiniai veiksniai. Antrame tyrimo etape buvo įvertintos laboratorijos techninės galimybės, uţsakyti reikalingi reagentai. Suplanavus tyrimą ir gavus reikiamus reagentus, buvo pradėti magistrinio baigiamojo darbo tyrimai.

11.2. Tyrimo objektas

Tyrimo metu buvo ištirti SIRT1 rs3740051 ir rs4746720 polimorfizmai, sergantiems hipofizės adenoma ir kontrolinės grupės asmenims.

11.3. Tiriamųjų atranka

Tyrimo metodai patvirtinti ir tyrimas pradėtas gavus Kauno regioninio biomedicinių tyrimų etikos komiteto leidimą (protokolo Nr. P2-9/2003). Visi į tyrimą įtraukti asmenys pasirašė informuoto asmens sutikimo formą. Tyrimo eigoje suformuotos dvi grupės:

 I grupė: pacientai, sergantys hipofizės adenoma (n=142). Tiriamųjų amţius 18-84 metai. Grupę sudarė 87 (61,3 proc.) moterys ir 55 (38,7 proc.) vyrai.

 II grupė: 826 sveiki pacientai, kurių amţius 19-94 metai. Grupę sudarė 506 (61,3 proc.) moterys ir 320 (38,7 proc.) vyrai.

HA grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai:

 Pacientams HA diagnozė patvirtinta magnetinio rezonanso tyrimu (MRT)

 Amţius ≥18 metų

 Neserga kitu galvos smegenų ar kitos lokalizacijos augliu

 Nenustatyta kitų akių ligų oftalmologinio patikrinimo metu

 Pasirašyta informuota asmens sutikimo anketa HA grupės neįtraukimo kriterijai:

 Gretutinės akių ligos (gliaukoma, intensyvios optinių terpių drumstys, didelio laipsnio refrakcijos ydos, regos nervų ligos)

 Sisteminės ligos (onkologinės ligos, lėtinės infekcinės ligos, būklės po audinių ar organų transplantacijos)

19 Kontrolinės grupės įtraukimo kriterijai:

 Oftalmologiškai sveiki

 Tiriamieji, nesergantys lėtiniais ir ūminiais infekciniais ir neinfekciniais susirgimais

 Pasirašyta informuoto asmens sutikimo forma

11.4. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas ir genų polimorfizmų tyrimas

Deoksiribonukleininė rūgštis (DNR) buvo išskirta iš periferinio veninio kraujo, kuris buvo surinktas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu), kuris apsaugo DNR nuo degradacijos ir nuo krešulių susidarymo. Genominė DNR buvo greitai ir kokybiškai efektyviai išskirta iš leukocitų, silikagelio kolonėlių pagalba, naudojant ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit‟‟ rinkinį.

11.4.1. DNR išskyrimo etapai:

 Ląstelių lizavimas: į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 400 µl lizavimo tirpalo, kuris suardo išorinę ląstelių membraną, ir 20 µl proteinazės K tirpalo, kuris suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvina nukleazes, kurios ardo DNR. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56 ºC temperatūroje.

 DNR nusodinimas naudojant silikagelių kolonėlių metodą: į lizatą įpilama 200 µl 96 proc. etanolio, išmaišoma. DNR lieka ant kolonėlės membranos, dėl sąveikos su etanoliu sukeltos precipitacijos. Turinys perkeliamas į surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifuguojamas 1 min. 6000 aps./min. greičiu. DNR prisitvirtina prie kolonėlės membranos.

 DNR išvalymas: į kolonėlę įpilama 500 µl plovimo buferio I, mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu. Tada pilama 500 µl buferio II, centrifuguojama 3 min. 12000 aps./min.greičiu. Taip nuo DNR yra pašalinamos baltyminės liekanos, druskos ir reagentai, panaudoti ląstelių lizavimui.

 DNR išplovimas iš filtro: įpilama 75 µl eliucijos buferio, inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojama 1 min. 8000 aps./min.greičiu. Dėl aukštos joninės jėgos choatropinių tirpalų lizuojamos ląstelės prisitvirtina ant filtrų, vyksta adsorbcija.

 DNR išskyrimas: rinkinio ,,Thermo Scientific GenJET Genomic DNA Purtification Kit’’ technologija pagrįsta magnetinėmis dalelėmis ant kuriosišskiriama aukštos kokybės DNR, tinkama naudoti tolimesniems molekuliniams tyrimams.

20 11.4.2. DNR gryninimo etapai:

 Ląstelių lizavimas: į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 400 µl lizavimo tirpalo, kuris suardo išorinę ląstelių membraną, ir 20 µl proteinazės K tirpalo, kuris suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvina nukleazes, kurios ardo DNR. Mėginys gerai išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56 ºC temperatūroje.

 RNR inaktyvacija naudojant RNazės A tirpalą: į lizatą įpilama 20 µl RNazės A, išmaišoma ir inkubuojama 10 min. kambario temperatūroje.

 DNR surišimas su magnetinėmis dalelėmis: į mėginį įpilama 300 µl lizės buferio, 400 µl 96 proc. etanolio ir 25 µl magnetinių dalelių. Sumaišoma ir įstatoma į magnetinį stovelį, ir laikoma 3 min., kad DNR su magnetinėmis dalelėmis prikimbtų prie mėgintuvėlio sienelės, esančios prie magneto.

 DNR išvalymas: į mėginį įpilama 800 µl plovimo buferio I, mėginys sumaišomas. Vėliau mėginys du kartus plaunamas naudojant 800 µl plovimo buferio II. Po kiekvieno plovimo mėginys įstatomas 2 – 3 min. į magnetinį stovelį. Taip nuo DNR yra pašalinamos baltyminės liekanos, druskos ir reagentai, panaudoti ląstelių lizavimui.

 DNR išgryninimas: į mėginį įpilama 75 µl eliucijos buferio, išmaišoma ir inkubuojama 72ºC temperatūroje 5 min.

11.4.3. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru

Prieš atliekant tikro laiko polimerazės grandininės reakcijas (TL – PGR), išmatuojama DNR koncentracija spektrofotometru ,,Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis„„. DNR, RNR, oligonukleotidų ir mononukleotidų kiekis nustatomas matuojant tirpalo absorbciją (optinį tankį) ultravioletinių bangų ilgyje vandeniniuose tirpaluose. Matuojant, pagrindinę funkciją atlieka absorbuojančios bangos ilgio spindulius purino bazės. Buferiniai tirpalaidaţnai naudojami vietoj gryno vandens. Naudojant 260 nm bangos ilgio spindulius, nustatomos nukleino rūgštys. Išmatavus santykį bangos ilgių prie 260 nm ir 280 nm, įvertinamos baltyminės tirpalo priemaišos. Jei DNR švari, santykis turi būti apie 1,8.

11.5. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu

Genų polimorfizmų tyrimas (rs3740051, rs4746720) buvo atliktas tikro laiko polimerazės grandies reakcijos (TL-PGR) metodu.

21 11.4.1. PGR etapai

PGR sudaro trys cikliškai pasikartojantys etapai:

 DNR denatūracija: vyksta 94 – 95ºC temperatūroje, kurio metu nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių ir DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.

 Pradmenų hibridizacija: 40 – 60ºC temperatūroje, pradmenys vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių dauginamų DNR sričių.

 Elongacija: 72ºC temperatūroje, reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė, kuri sintetina komplementarią matricinei DNR grandinę. Ji sintetinama iš mononukleotidų, kurie pridedami į terpę. Kartojant denatūraciją, hibridizaciją ir elongaciją DNR kiekis didėja eksponentiškai.

11.5.1. PGR principas

968 mėginių genotipavimas buvo atliktas tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q‘‘. Genotipavimui skirti pradmenys ir molekuliniai ţibukai sukurti kompanijos ,,Applied Biosystems‘‘. Kiekvienai reakcijai buvo naudojama 2 µl matricinės bandinių DNR (~10 ng) ir 10 µl PGR reakcijos mišiniai, kurių sudėtis nurodoma 2 lentelėje. PGR vykdyta pagal 3 lentelėje aprašytas sąlygas.

2 lentelė. Realaus laiko PGR mišinio paruošimas

Reagentai 1 pvz., µl 72 pvz., µl

TaqMan Universal Master Mix II

(,,Applied Biosystems„„, Lietuva) 5 µl 360 µl

Sterilus ddH2O

(,,Thermo Fisher Scientific‟‟, Lietuva) 4,5 µl 324 µl ,,Applied Biosystems„„ genotipavimo rinkinys(rs3740051,

rs4746720)

0,5 µl 36 µl

Viso (PGR mišinio) 10 µl 720 µl

DNR 2 µl

Viso 12 µl

3 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos nustatant rs3740051 ir rs4746720 genotipus tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q‘‘

Genotipavimo rinkinys PGR sąlygų protokolai

Produkto dydis rs3740051

“Applied Biosystem” patentas. 95ºC 10 min

45 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 90s

Nenurodyta rs4746720 “Applied Biosystem” patentas.

95ºC 10 min 45 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 90s Nenurodyta

22 11.5.2. Metodas

 Paruošiamas PGR mišinys 72 mėginiams.

 Mišinys išpilstomas po 10 µl į 0,2 ml tūrio mėgintuvėlius.

 Į 71 mėgintuvėlį įpilama po 2 µl DNR, o paskutiniame šulinėlyje, kaip neigiama kontrolė, įpilamas sterilus vanduo.

 Mėgintuvėliai sudedami į specialų, 72 mėgintuvėliams skirtą diską ir ant jo uţdedamas apsauginis ţiedas.

 Nustatoma programa vieno iš polimorfizmų nustatymui. Genotipuojant naudota ,,Alelių nustatymo‟‟ programa (angl. Allelic Discrimination’’).

 Po 2,5 val. programa baigia darbą. Pagal skirtingų detektorių fluorescensijos intensyvumo santykį, programa nustato individų genotipus.

11.5.3. Ki-67 nustatymas

Ki-67 PI nustatymas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, patologinės anatomijos klinikoje (atliko dr.B.Glebauskienė ir I.Gudinavičienė). IHC tyrimo metodu naudojant Ventana BenchMark XT daţymo automatą (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, JAV) tirta biologinių ţymenų baltymų raiška parafininiuose pjūviuose. Parafininiai pjūviai deparafinizuoti naudojant Ventana deparafinizavimo reagentą. Antigenų epitopai buvo atkurti naudotant Ventana ląstelių kondicionavimo tirpalą (pH 8,4) – 100˚C 60 min. Vėliau pjūviai inkubuoti monokloniniu antikūnu – 37˚C32 min. ir naudojant Ventana Iview DAB detektavimo sistemą identifikuoti. IHC reakcijos pabaigoje pjūviai buvo kontrastuoti Gillo hematoksilinu, vėliau melsvinti vandeninio buferinio ličio karbonato tirpalu ir uţdengti dengiamaisiais stikleliais.

11.6. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atliekama naudojant statistinės duomenų analizės paketą „IBM SPSS Statistics 20.0“. Kokybiniai tiriamųjų poţymiai išreiškiami absoliučiais skaičiais ir procentais skliausteliuose. Hipotezė, apie matuojamų poţymių reikšmių normalųjį skirtinį, tikrinta taikant Šapiro – Vilko testą. Tiriamiesiems poţymiams, kurie netenkino normaliojo skirstinio kriterijaus, buvo taikomos šios aprašomosios statistikos charakteristikos: mediana ir tarpkvartilinis plotis (IQR).

Vertinant tiriamųjų amţių ir tiriamosioms grupėms netenkinant normaliojo skirstinio kriterijaus, skirtumui tarp dviejų nepriklausomų grupių įvertinti buvo naudotas Mano-Vitnio U testas. SIRT1 rs4746720 ir rs3740051 polimorfizmų genotipų pasiskirstymas sergantiems hipofizės adenoma

23 ir kontrolinėje grupėse vertintas pagal Hardţio – Veinbergo pusiausvyros modelį (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml). Sergančiųjų hipofizes adenoma ir kontrolinės grupės SIRT1 geno polimorfizmų pasiskirstymo palyginimui taikytas χ² kriterijus.

Atliekant dvinarę logistinę regresiją buvo sukurti 5 genetiniai modeliai: kodominantinis (G/A vs. G/G; A/A vs. G/G); dominantinis (G/A + A/A vs. G/G); recesyvinis (A/A vs. G/A + G/G); viršdominantinis (G/A vs. G/G + A/A) ir adityvinis (2A/A + G/A vs. G/G), kuriuos naudojant buvo įvertinti genotipų ir alelių įtaka HA vystymuisi, nurodant GS su 95 proc. patikimumo intervalu (PI). Vertintas Akaike informacinis kriterijus (AIK) pasirenkant geriausią paveldėjimo modelį. Maţiausia AIK reikšmė nurodo tinkamiausią modelį. Skirtumai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

24

12. REZULTATAI

12.1. Tiriamųjų demografinės charakteristikos

Tyrimo metu buvo suformuota hipofizės adenoma sergančių asmenų grupė (n=142), kurią sudarė:55 vyrai (38,7 proc.) ir 87 moterys(61,3 proc.). Amţiaus mediana – 53,5 metai. Ir kontrolinė grupė (n=826), kurią sudarė: 320 vyrai (38,7 proc.), 506 moterys (61,3 proc.). Amţiaus mediana siekė 53 metus. Amţius, lyginant tiriamųjų grupes, statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p=0,764) (4 lentelė). Lyčių pasiskirstymas tiriamosiose grupėse taip pat nesiskyrė (p=0,998) (4 lentelė).

4 lentelė. Demografinė charakteristika

Charakteristika

Grupė

p reikšmė HA, N (proc.) (n=142) Kontrolinė grupė, N

(proc.) (n=826) Moterys 87 (61,3) 506 (61,3) 0,998* Vyrai 55 (38,7) 320 (38,7) Mediana (IQR) 53,5 (18;84) 53 (19;94) 0,764** Recidyvai: Taip Ne 30 (21,1) 112 (78,9) – – Invazyvumas: Taip Ne 84 (59,2) 58 (40,8) – – Aktyvumas: Taip Ne 80 (56,3) 62 (43,7) – – KI-67 PI: <1 proc. 1 proc. >1 proc. 41 (74,6) 8 (14,5) 6 (10,9) IQR – tarpkvartilinis plotis

*χ² kriterijaus testas **Mano-Vitnio U testas

25 12.2. Rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje

grupėse

SIRT1 rs4746720 į statistinę analizę nebuvo įtrauktas, nes genotipuojant buvo gautas laukinio tipo genotipas (A/A) visiems tiriamiesiems.

Buvo įvertintas SIRT1 geno rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse (5 lentelė). Abi grupės atitiko Hardţio – Veinbergo dėsnį (p>0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų, lyginant genotipų ir alelių pasiskirstymus sergančių HA ir kontrolinėje grupėse, nustatyta nebuvo (5 lentelė).

5 lentelė. rs3740051 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse Genotipas/alelis Daţnis (proc.) Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=826) HVE p reikšmė HA grupė, N (proc.) (n=142) HVE preikšmė preikšmė Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 8 (1,0) 103 (12,5) 715 (86,6) 826 (100) 119 (7,2) 1533 (92,8) 0,053 2 (1,4) 22 (15,5) 118 (83,1) 142 (100) 26 (9,2) 258 (90,8) 0,414 0,534 0,248

HA – hipofizės adenoma, p reikšmė – reikšmingumo lygmuo, HVE p reikšmė – reikšmingumo lygmuo pagal Hardţio – Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

Dvinarė logistinė regresija buvo atlikta tiriamųjų, sergančių HA ir kontrolinėje grupėse, norint įvertinti rs3740051 genotipų ir A alelio įtaką HA pasireiškimo galimybei, tačiau analizė statistiškai reikšmingų rezultatų neparodė. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.

6 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dvinarė logistinė regresijos analizė pacientų, sergančių hipofizės adenomair kontrolinėje grupėse

Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė AIK Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 1,307 (0,793;2,155) 1,347 (0,287;6,309) 0,294 0,706 810,021 Dominantinis G/A+ A/A vs. G/G 1,310 (0,809;2,122) 0,272 808,022 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 1,297 (0,277;6,065) 0,741 809,077 Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 1,301 (0,790;2,145) 0,301 808,155

Adityvinis A 1,261 (0,824;1,930) 0,285 808,090

GS-galimybių santykis, AIK-akaike, informacinis kriterijus, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

26 12.3. Rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių HA ir kontrolinėje grupėse,

atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį

Kitas darbo uţdavinys buvo įvertinti rs3740051 polimorfizmo daţnį, sergantiems HA ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį (7 lentelė). Statistiškai reikšmingų skirtumų rs3740051 tiriamiesiems nebuvo nustatyta.

7 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį

Genotipas/Alelis Vyrai p reikšmė Moterys p reikšmė HA grupė, N (proc.) (n=55) Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=320) HA grupė, N (proc.) (n=87) Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=506) Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 1 (1,8) 10 (18,2) 44 (80,0) 55 (100,0) 12 (10,9) 98 (89,1) 4 (1,2) 48 (15,0) 268 (83,8) 320 (100,0) 56 (8,8) 584 (91,2) 0,779 0,466 1 (1,1) 12 (13,8) 74 (85,1) 87 (100,0) 14 (8,1) 160 (91,9) 4 (0,8) 55 (10,9) 447 (88,3) 506 (100,0) 64 (6,3) 948 (93,7) 0,682 0,397 HA-hipofizės adenoma, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

Atlikus dvinarę logistinę regresiją tiriamųjų, sergančių HA ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į lytį, statistiškai reikšmingų rezultatų nenustatėme. Rezultatai pateikti 8 lentelėje.

8 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dvinarė logistinė regresijos analizė pacientų, sergančių hipofizės adenomair kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį

Moterys

Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė AIK Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 1,342 (0,685;2,629) 1,208 (0,139;10,487) 0,391 0,864 497,796 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 1,331 (0,696;2,547) 0,388 495,804 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 1,165 (0,134;10,095) 0,890 496,499 Overdominantinis G/A vs. G/G+A/A 1,339 (0,684;2,621) 0,394 495,824

Adityvinis A 1,266 (0,714;2,246) 0,420 495,898 Vyrai Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 1,269 (0,598;2,692) 1,523 (0,166;13,942) 0,535 0,710 316,185 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 1,288 (0,624;2,659) 0,493 314,208 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 1,463 (0,160;13,339) 0,736 314,557 Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 1,259 (0,594;2,668) 0,547 314,312

27

Adityvinis A 1,258 (0,665;2,382) 0,481 314,186

GS-galimybių santykis, AIK-akaike, informacinis kriterijus, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

12.4. Rs3740051 genotipų daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėje, atsiţvelgiant į ligos recidyvą

Pirmoji trečiojo uţdavinio dalis buvo įvertinti rs3740051 polimorfizmą, sergantiems HA ir kontrolinėje grupėje, atsiţvelgiant į ligos recidyvą (9 lentelė). Statistiškai reikšmingų skirtumų lyginant rs3740051 genotipų ir alelių daţnius HA grupėse pagal recidyvą su kontroline grupe nustatyta nebuvo (9 lentelė). Kita vertus, lyginant genotipų (G/G, G/A, A/A) daţnius HA be recidyvo ir su recidyvu grupėse, nustatėme, kad šie statistiškai reikšmingai skyrėsi: 0 proc., 17,9 proc., 82,1 proc. vs, 6,7 proc., 6,7 proc., 86,7 proc., p=0,009 (9 lentelė).

9 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma, ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į ligos recidyvą

HA – hipofizės adenoma, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

*G/G 0 proc., G/A 17,9 proc., A/A 82,1 proc. vs, G/G 6,7 proc., G/A 6,7 proc., A/A 86,7 proc., p=0,009.

Dvinarėje logistinės regresijoje įvertintos HA su ir be recidyvo ir kontrolinė grupės (10 lentelė). Analizė parodė, kad rs3740051 A/A genotipas galimybę susirgti HA su recidyvu maţina tiek lyginant su G/G genotipu (GS=6,111; 95 proc. PI: 1,257;29,709; p=0,025), tiek lyginant su G/A ir G/G genotipais kartu (GS=6,484; 95 proc. PI: 1,339;31,411; p=0,020) (10 lentelė).

Genotipas /alelis Daţnis (proc.) Kontrolinė grupė, N(proc.) (n=826) HA grupė be recidyvo*, N (proc.) (n=112) p reikšmė Kontrolinė grupė, N(proc.) (n=826) HA grupė su recidyvu*, N (proc.) (n=30) P reikšmė Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 9 (1,1) 102 (12,3) 715 (86,6) 826 (100) 120 (7,3) 1532 (92,7) 0 (0) 20 (17,9) 92 (82,1) 112 (100) 20 (8,9) 204 (91,1) 0,154 0,373 9 (1,1) 102 (12,3) 715 (86,6) 826 (100) 120 (7,3) 1532 (92,7) 2 (6,7) 2 (6,7) 26 (86,7) 30 (100) 6 (9,7) 56 (90,3) 0,204 0,475

28 10 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dvinarė logistinė regresijos analizė pacientų, sergančių

hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į ligos recidyvą HA grupė su recidyvu

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) P reikšmė AIK

Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 0,539 (0,126;2,306) 6,111 (1,257;29,709) 0,405 0,025 259,469 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 0,991 (0,339;2,893) 0,987 262,000 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 6,484 (1,339;31,411) 0,020 258,292 Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 0,507 (0,119;2,160) 0,358 260,980

Adityvinis A 1,366 (0,607;3,076) 0,451 261,483 HA grupė be recidyvo Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 1,524 (0,900;2,579) --- 0,117 --- 685,509 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 1,207 (0,830;2,363) 0,207 686,608

Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G --- --- ---

Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 1,543 (0,912;2,611) 0,106 685,675

Adityvinis A 1,235 (0,764;1,997) 0,388 687,406

GS-galimybių santykis, AIK-akaike, informacinis kriterijus, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

12.5.Rs3740051 polimorfizmo daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į naviko invazyvumą

Trečiojo darbo uţdavinio, antroji dalis buvo įvertinti rs3740051 polimorfizmo daţnį, sergantiems HA ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į naviko invazyvumą (11 lentelė). Nustatėme, kad genotipų (G/G, G/A, A/A) pasiskirstymai lyginant neinvazyvia HA sergančius asmenis su kontroline grupėmis, skyrėsi statistiškai reikšmingai: 3,4 proc., 25,9 proc., 70,7 proc., vs. 1,1 proc., 12,3 proc., 86,6 proc., atitinkamai, p<0,001 (11 lentelė). Taip pat nustatėme, kad G alelis buvo statistiškai reikšmingai daţnesnis neinvazyvia HA sergantiems nei kontrolinės grupės asmenims (16,4 proc. vs. 7,3 proc., atitinkamai, p<0,001 (11 lentelė). Lyginant neinvazyvia HA ir invazyvia HA sergančiųjų grupės, nustatėme, kad genotipų (G/G, A/G, A/A) pasiskirstymai taip pat statistiškai reikšmingai skyrėsi: 3,4 proc., 25,9 proc., 70,7 proc., vs. 0 proc., 8,3 proc., 91,7 proc., atitinkamai, p=0,003 (11 lentelė).

11 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į naviko invazyvumą

Genotipas /alelis Daţnis (proc.) Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=826) Neinvazyvi HA grupė*, N (proc.) (n=58) p reikšmė Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=826) Invazyvi HA grupė*, N (proc.) (n=84) p reikšmė

29 Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 9 (1,1) 102 (12,3) 715 (86,6) 826 (100) 120 (7,3) 1532 (92,7) 2 (3,4) 15 (25,9) 41 (70,7) 58 (100) 19 (16,4) 97 (83,6) <0,001 <0,001 9 (1,1) 102 (12,3) 715 (86,6) 826 (100) 120 (7,3) 1532 (92,7) 0 (0) 7 (8,3) 77 (91,7) 84 (100) 7 (4,2) 161 (95,8) 0,338 0,133

HA – hipofizės adenoma, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

*G/G 3,4 proc., G/A 25,9 proc. , A/A 70,7 proc. vs. G/G 0 proc., G/A 8,3 proc., A/A 91,7 proc., p=0,003

Dvinarė logistinė regresija buvo atlikta pacientų, sergančių invazyvia ir neinvazyvia HA ir kontrolinėje grupėse (12 lentelė). Analizė parodė, kad rs3740051 G/A genotipas, lyginant su G/G genotipu, galimybę susirgti neinvazyvia HA didina 2,6 karto (GS=2,565; 95 proc. PI: 1,370;4,800; p=0,003), o lyginant su G/G ir A/A genotipais, šią galimybę didina 2,5 karto (GS=2,476; 95 proc. PI: 1,328;4,618; p=0,004) (12 lentelė). Taip pat G/A ir A/A genotipai kartu, lyginant su G/G genotipu, neinvazyvios HA galimybę didina 2,7 karto (GS=2,671; 95 proc. PI: 91,466;4,865; p=0,001) (12 lentelė).

12 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dvinarė logistinė regresijos analizė pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į naviko invazyvumą

Invazyvi HA grupė

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p reikšmė AIK

Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 0,637 (0,286;1,420) --- 0,270 --- 561,172 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 0,586 (0,263;1,302) 0,189 560,318

Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G - 0,999 560,525

Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 0,645 (0,290;1,438) 0,284 561,002

Adityvinis A 0,575 (0,268;1,230) 0,154 559,867 Neinvazyvi HA grupė Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 2,565 (1,370;4,800) 3,875 (0,811;18,519) 0,003 0,090 422,765 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 2,671 (91,466;4,865) 0,001 420,996 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 3,242 (0,684;15,365) 0,138 428,377 Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 2,476 (1,328;4,618) 0,004 422,96

Adityvinis A 2,300 (1,392;3,801) 0,001 421,073

GS-galimybių santykis, AIK-akaike, informacinis kriterijus, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05

30 12.6. Rs3740051 genotipų daţnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje

grupėje, atsiţvelgiant į ligos aktyvumą

Trečiojo darbo uţdavinio, paskutinioji dalis buvo įvertinti rs3740051 polimorfizmo daţnį, sergantiems HA ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į ligos aktyvumą (13 lentelė). Statistiškai reikšmingų skirtumų lyginant tiriamųjų grupes nustatyta nebuvo.

13 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į ligos aktyvumą

Genotipas/ alelis Daţnis (proc.) Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=826) Aktyvi HA grupė, N (proc.) (n=80) p reikšmė Kontrolinė grupė, N (proc.) (n=826) Neaktyvi HA grupė, N (proc.) (n=62) p reikšmė Genotipas G/G G/A A/A Iš viso Alelis G A 9 (1,1) 102 (12,3) 715 (86,6) 826 (100) 120 (7,3) 1532 (92,7) 1 (1,2) 11 (13,8) 68 (85,0) 80 (100) 13 (8,1) 147 (91,9) 0,927 0,690 9 (1,1) 102 (12,3) 715 (86,6) 826 (100) 120 (7,3) 1532 (92,7) 1 (1,6) 11 (17,7) 50 (80,6) 62 (100) 13 (10,5) 111 (89,5) 0,429 0,189 HA – hipofizės adenoma, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

Taip pat, atlikta dvinarė logistinė regresija tiriamųjų, sergančių HA ir kontrolinėje grupėse, atsiţvelgiant į ligos aktyvumą, statistiškai reikšmingų rezultatųneatskleidė (14 lentelė).

14 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dvinarė logistinė regresijos analizė pacientų, sergančių hipofizės adenoma ir kontrolinėje grupėse, atsižvelgiant į ligos aktyvumą

Aktyvi HA grupė

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) P reikšmė AIK

Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 1,134 (0,580;2,216) 1,168 (0,146;9,360) 0,713 0,884 544,892 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 1,137 (0,596;2,168) 0,697 542,893 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 1,149 (0,144;9,187) 0,896 543,024 Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 1,132 (0,579;2,210) 0,717 542,912

Adityvinis A 1,118 (0,631;1,981) 0,702 542,898 Neaktyvi HA grupė Kodominantinis G/A vs. G/G A/A vs. G/G 1,542 (0,777;3,059) 1,589 (0,197;12,792) 0,215 0,663 452,087 Dominantinis G/A+A/A vs. G/G 1,546 (0,798;2,994) 0,196 450,088 Recesyvinis A/A vs. G/A+G/G 1,488

(0,185;11,939)

31 Viršdominantinis G/A vs. G/G+A/A 1,531 (0,773;3,033) 0,222 50,255

Adityvinis A 1,446 (0,813;2,574) 0,210 450,198

GS-galimybių santykis, AIK-akaike, informacinis kriterijus, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05

12.7. Ki-67 proliferacijos indekso ir SIRT1 rs3740051 genotipų sąsajos

Ki-67 proliferacijos indeksas buvo ištirtas 55 tiriamiesiems, sergantiems HA (15 lentelė). Buvo įvertinti SIRT1 rs3740051 genotipų daţniai pacientams, sergantiems HA, atsiţvelgiant į Ki-67 proliferacijos indeksą (15 lentelė). Palyginome rs3740051 genotipų pasiskirstymus skirtingose Ki-67 grupėse. Nė vienam pacientui, kuriam buvo ištirtas Ki-67, G/G genotipas nebuvo rastas. Palyginus genotipų A/A ir G/A pasiskirstymus Ki-67 grupėse, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme (p=0,534) (15 lentelė).

15 lentelė. Rs3740051 polimorfizmo dažnis pacientų,sergančių HA, atsižvelgiant į Ki-67 proliferacijos indeksą

Genotipas/alelis Ki-67 p reikšmė

<1 proc. 1 proc. >1 proc. G/G, n (proc.) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

0,534 G/A, n (proc.) 5 (12,2) 0 (0) 1 (16,7)

32

13. REZULTATŲ APTARIMAS

SIRT1 geno polimorfizmų sąsajos su įvairių navikų išsivystymu tirtos sergant kitų lokalizacijų vėţiui [46-53], tačiau atliktas tik vienas tyrimas, kuriame buvo analizuotos SIRT1 rs12778366 geno polimorfizmo sąsajos su hipofizės adenoma. Mokslinis tyrimas įrodė, kad SIRT1 rs12778366 polimorfizmas turi įtakos HA išsivystymui, tačiau iki šiol, mūsų ţiniomis, yra ištirtas tik vienas SIRT1 geno vieno nukleotido polimorfizmas [4].

Mūsų pasirinkti polimorfizmai yra maţai tirti, ieškant sąsajų su navikų pasireiškimais. SIRT1 rs4746720 polimorfizmas tirtas, tik viename moksliniame tyrime, ieškant sąsajų su plaučių vėţio pasireiškimu. Tačiau atliktame tyrime statistiškai reikšmingų rodmenų nebuvo nustatyta [20]. Kitas mūsų pasirinktas SIRT1 rs3740051 polimorfizmas tirtas, ieškant sąsajų su krūties vėţiu. Tyrime dalyvavo 541 egiptietės moterys, sergančios krūties vėţiu, ir 439 sveikos moterys. Amţiaus mediana buvo 52,3 (37;69). Statistiškai reikšmingų skirtumų, lyginant genotipų ir alelių pasiskirstymus, sergančių krūties vėţiu ir kontrolinėje grupėse nebuvo nustatyta. Mokslininkai atliko dvinarę logistinę regresiją bei įvertino sergančių krūties vėţiu ir kontrolinė grupės tiriamąsias. Statistinė analizė parodė, kad rs3740051 A/A lyginantsu G/G genotipu galimybę susirgti krūties vėţiu maţina 1,5 kartus (p=0,006), o lyginant su G/G ir A/G genotipais kartu – 1,4 kartus (p=0,002) [19].

Mūsų atliktame tyrėme ištyrėme SIRT1 rs4746720 ir rs3740051 vieno nukleotido polimorfizmus 142 HA ir 826 sveikiems tiriamiesiems. Atlikus SIRT1 rs4746720 genotipavimą laukinio tipo genotipas (A/A) buvo nustatytas visiems tiriamiesiems, todėl į tolimesnę statistinę analizę šis polimorfizmas nebuvo įtrauktas. Išanalizavus SIRT1 rs3740051 polimorfizmo daţnį, sergantiems HA ir kontrolinėje grupėse, statistiškai reikšmingų skirtumų nustatyta nebuvo. Tolimesnė analizė parodė, kad SIRT1 rs3740051 G/A genotipas, lyginant su G/G genotipu galimybę susirgti neinvazyvia HA didina 2,6 kartus (p=0,003), o lyginant su G/G ir A/A genotipais kartu, šią galimybę didina 2,5 kartus (p=0,004).Taip pat G/A ir A/A genotipai kartu, lyginant su G/G genotipu, susirgti neinvazyvia HA galimybę didina 2,7 kartus (p=0,001).

Kitų tyrėjų atliktame moksliniame tyrime, kuriame buvo ieškoma SIRT1 rs12778366 polimorfizmo sąsajų su HA, tiriamųjų grupę sudarė 143 sergantys HA pacientų (88 moterys ir 55 vyrai) ir 808 sveikų asmenų (510 moterys ir 298 vyrai) grupės [4]. Priešingai nei mūsų tyrime, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas pagal genotipų pasiskirstymą pacientams, sergantiems HA, ir kontrolinės grupės asmenims, atsiţvelgiant į lytį (p < 0,001). Atlikus analizę nustatyta, kad HA C/C lyginant su T/T genotipu galimybę susirgti didina 7,5 kartus (p < 0,001), o C/C lyginant su T/T ir T/C genotipais kartu, didina galimybę susirgti 9 kartus (p < 0,001). Taip pat nebuvo nustatyta statistiškai reikšmingo skirtumo tarp neinvazinių ir invazinių, pasikartojančių ir nepasikartojančių HA ir kontrolinės grupių. Atlikus SIRT1 rs12778366 polimorfizmo dvinarę logistinę regresiją, palyginta HA be recidyvo ir kontrolinė grupės ir nustatyta, kad SIRT1 rs12778366 C/C lyginant su T/T genotipu

33 galimybę susirgti didina 7,5 kartus (p < 0,001), o lyginant su T/T ir T/C genotipais kartu – 9 kartus (p < 0,001). Palyginus HA su recidyvu ir kontrolinė grupės nustatyta, kad SIRT1 rs12778366 C/C lyginant su T/T genotipu galimybę susirgti didina 7,8 kartus (p <0,001), o lyginant su T/T ir T/C genotipais kartu – 9,5 kartus (p < 0,001). Palyginus neinvazinės HA ir kontrolinės grupės nustatyta, kad SIRT1 rs12778366 C/C lyginat su T/T genotipu galimybę susirgti didina 7,5 kartus (p <0,001), o lyginant su T/T ir T/C genotipais kartu – 9 kartus (p < 0,001). Palyginus invazinės HA ir kontrolinės grupės nustatyta, kad SIRT1 rs12778366 C/C lyginant su T/T genotipu galimybę susirgti didina 7,5 kartus (p < 0,001), o lyginant su T/T ir T/C genotipais kartu – 9 kartus p < 0,001. Naviko aktyvumas šiame tyrime tirtas nebuvo [4].

Ki-67 antigenas nustatomas ląstelės branduolyje, jos ciklo dalijimosi metu, išskyrus G0 fazėje. Antigeno proliferacijos indeksas nurodo, kiek Ki-67 yra ląstelės branduolyje, procentais. Pagal PSO, aptinkant daugiau 3 proc. antigeno yra nulemiamas agresyvus naviko augimas [24]. Tiriant įvairų rūšių HA kitose moksliniuose tyrimuose, buvo stebėtas Ki-67 raiškos padidėjimas būtent invazyvioje HA nei neinvazyviniame navike. Tačiau kas lemia Ki-67 padidėjimą piktybiniuose navikuose nėra ţinoma iki šiol [57-61].

Mūsų tyrime, nustatant Ki-67 PI, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme (p=0,534). Tyrime, kuriame buvo ieškoma sąsajų SIRT1 rs12778366polimorfizmo su HA, invazinėse HA buvo nustatytas statistiškai reikšmingai didesnis Ki-67 PI nei neinvazinėse HA [4].

Apibendrinant, nustatėme, kad SIRT1 rs3740051 A/A genotipas maţina galimybę susirgti HA su recidyvu, o G/A ir G/G genotipai bei kiekvienas G alelis didina galimybę susirgti neinvazyvia HA. Tačiau reikalingi tolimesni tyrimai, įtraukiant daugiau pacientų sergančių HA bei įtraukiant kitus SIRT1vieno nukleotido polimorfizmus.

34

14. IŠVADOS

1. Ištyrus SIRT1 rs3740051 polimorfizmą HA ir kontrolinei grupėms, statistiškai reikšmingų skirtumų nustatytanebuvo.

2. Išanalizavus SIRT1 rs3740051 polimorfizmą HA ir kontrolinei grupėms, atsiţvelgiant į lytį, statistiškai reikšmingų rezultatų nustatytanebuvo.

3. SIRT1 rs3740051 A/A genotipas maţina galimybę susirgti HA su recidyvu. SIRT1 rs3740051 G/A ir G/G genotipai bei kiekvienas G alelis didina galimybę susirgti neinvazyvia HA. Vertinant SIRT1 rs3740051 polimorfizmo sąsajas su HA hormoniniu aktyvumu, statistiškai reikšmingų rezultatų nustatyta nebuvo.

4. Analizuojant SIRT1 rs3740051 ir Ki-67 proliferacijos indekso sąsajas, statistiškai reikšmingų rezultatų nenustatėme.

35

15. LITERATŪRA

1. Clark, Stephen J. et al. Association of Sirtuin 1 (SIRT1) Gene SNPs and Transcript Expression Levels With Severe Obesity. Obesity (Silver Spring, Md.) 20.1 (2012): 178–185.

2. Liu Y, Dentin R, Chen D, et al. A fasting inducibles witch modulates gluconeogenesis via activator/coactivator exchange. Nature. 2008 Nov 13;456(7219):269-73.

3. Bitterman KJ, Anderson RM, Cohen HY, et al. Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 and human SIRT1. J Biol Chem. 2002 Nov 22;277(47):45099-107.

4. Glebauskiene B, Vilkeviciute A, Liutkeviciene R, et al. Association of FGFR2 rs2981582, SIRT1 rs12778366, STAT3 rs744166 gene polymorphisms with pituitary adenoma. Oncol Lett 2017; 13(5):3087-3099.

5. Scheithauer BW, Gaffey TA, Lloyd RV et al. Pathobiology of pituitary adenomas and carcinomas. Neurosurgery. 2006 Aug;59(2):341-53; discussion 341-53.

6. Vasilev V, Rostomyan L, Daly AF, et al. Management of endocrine disease: Pituitary “incidentaloma“: neuroradiological assessment and differential diagnosis. Eur J Endocrinol. 2016 Oct;175(4):R171-84.

7. Fontana E, Gaillard R. Epidemiology of pituitary adenoma: results of the first Swiss study. Rev Med Suisse. 2009 Oct 28;5(223):2172-4.

8. Raappana A, Koivukangas J, Ebeling T, et al. Incidence of pituitary adenomas in Northern Finland in 1992-2007. J Clin Endocrinol Metab. 2010 Sep;95(9):4268-75.

9. Gruppetta M, Mercieca C, Vassallo J. Prevalence and incidence of pituitary adenomas: a population based study in Malta. Pituitary. 2013 Dec;16(4):545-53.

10. Tjörnstrand A, Gunnarsson K, Evert M, et al. The incidence rate of pituitary adenomas in western Swedenfor the period 2001-2011. Eur J Endocrinol. 2014 Oct;171(4):519-26.

11. Agustsson TT, Baldvinsdottir T, Jonasson Jget al. The epidemiology of pituitary adenomas in Iceland, 1955-2012: a nation wide population-based study. Eur J Endocrinol. 2015 Nov;173(5):655-64.

12. Melmed S. Pathogenesis of pituitary tumors. Nat Rev Endocrinol. 2011 May;7(5):257-66.

13. Stunkel W, Peh BK, Tan YC, et al. Function of the SIRT1 protein deacetylase in cancer. Biotechnol J 2007; 2(11):1360– 1368.

14. Jang KY, Hwang SH, Kwon KS, et al. SIRT1 expression is associated with poor prognosis of diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol 2008; 32(10):1523–1531.

15. Huffman DM, Grizzle WE, Bamman MM, et al. SIRT1 is significantly elevated in mouse and human prostate cancer. Cancer Res 2007; 67(14): 6612–6618.

36 16. Cha EJ, Noh SJ, Kwon KS, et al. Expression of DBC1 and SIRT1 is associated with poor

prognosis of gastric carcinoma. Clin Cancer Res 2009; 15(13):4453–4459.

17. Herranz D, Maraver A, Canamero M, et al. SIRT1 promotes thyroid carcinogenesis driven by PTEN deficiency. Oncogene 2012; 32(34):4052-6.

18. Sung JY, Kim R, Kim JE, et al. Balance between SIRT1 and DBC1 expression is lost in breast cancer. Cancer Sci 2010; 101:1738–1744.

19. Rizk SM, Shahin NN, Shaker OG. Association between SIRT1 Gene Polymorphisms and Breast Cancer in Egyptians. PLOS ONE 2016; 11(3): e0151901.

20. Lv Y, Lin S, Peng F. SIRT1 gene polymorphisms and risk of lung cancer. Cancer Manag Res. 2017; 9:381-386.

21. Mete O, Lopes MB, Asa SL. Spindle cell oncocytomas and granular cell tumors of the pituitary are variants of pituicytoma. Am J Surg Pathol. 2013 Nov;37(11):1694-9.

22. Slatkevičienė G, Kasputytė R, Liutkevičienė R, et.al. Hipofizės adenoma. Literatūros apţvalga. Neurologijos seminarai. 2012;16(53):205-209

23. Wikimedia commons; search; pituitary adenoma and gene. [https://commons.wikimedia.org/wiki]. Ţiūrėta 1 geguţės 2018.

24. Lloyd RV, Osamura RY, Klöppel G, et al. WHO classification of tumours of endocrine organs, 4th edn. IARC Press, Lyon 2017;4:11-44.

25. Kalra RR, Taussky P, Niazi T, et al. Pituitary tumors: genetics and heritable predisposition. Tumors of the central nervous system. 2013;10(8):71-84

26. Molitch ME. Diagnosis and Treatment of Pituitary Adenomas: A Review. JAMA. 2017;317:516– 24

27. Kairys N, Schwell A. Cushing Disease [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK448184]. Ţiūrėta 1 geguţės 2018.

28. Trouillas J, Roy P, Sturm N, et al. A new prognostic clinicopathological classification of pituitary adenomas: a multicentric case–control study of 410 patients with 8 years post-operative follow-up. Acta Neuropathol. 2013;126:123-135.

29. Hirohata T, Ishii Y, Matsuno A. Treatment of pituitary carcinomas and atypical pituitary adenomas: a review. Neurol Med Chir (Tokyo). 2014;54(12):966-73.

30. Schoemaker M, Swerdlow A. Risk factors for pituitary tumours – a case-control study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18:1492–500.

31. Schoemaker M, Swerdlow A. Risk of pituitary tumors in cellular phone users. A case-control study. Epidemiology 2009; 20(3):348–54.

32. Verloes A, Stevenaert A, Teh BT, et al. Familial acromegaly: case report and review of the literature. Pituitary. 1999;1(3- 4):273-7.