LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARINöS MAISTO SAUGOS STUDIJŲ PROGRAMA MAISTO SAUGOS IR KOKYBöS KATEDRA
RAIMONDA KRAKYTö
LIETUVIŠKŲ ŽUVIES GAMINIŲ SAUGOS ĮVERTINIMAS
HISTAMINO ATŽVILGIU
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
DARBO VADOVAS: dr. GINTARö ZABORSKIENö
2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas (pavadinimas)
LIETUVIŠKŲ ŽUVIES GAMINIŲ SAUGOS ĮVERTINIMAS HISTAMINO ATŽVILGIU 1. Yra atliktas mano paties/pačios:
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Raimonda Krakyt÷ (data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Raimonda Krakyt÷ (data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
Gintar÷ Zaborskien÷
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
Mindaugas Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros ved÷jo/jos vardas, pavard÷ (parašas) Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (parašas)
3 Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) vardas, pavard÷) (parašas)
4
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5 SUMMARY ... 6 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Žuvų chemin÷ sud÷tis ir struktūra ... 10
1.1.1 Žuvų chemin÷s sud÷ties ir struktūros pokyčius įtakojantys veiksniai... 10
1.1.2 Žuvų gedimą sąlygojantys veiksniai... 12
1.2 Histamino susidarymas žuvyje ir žuvies produktuose ... 12
1.2.1 Bakterijų įtaka histamino susidarymui ... 14
1.2.2 Žuvyje nustatomi histamino kiekiai ... 15
1.2.2.1 Įvairių žuvų ir žuvies produktų laikymo, apdorojimo poveikis biogeninio amino histamino formavimui ... 16
1.2.3 Biogeninio amino histamino susidarymas g÷lavandenių ir jūrinių žuvų gaminiuose ... 17
1.2.4 Histamino kiekio reglamentavimas ... 18
1.3 Histamino įtaka natūraliai vykstantiems organizmo procesams... 20
1.3.1 Biogeninių aminų poveikis sveikatai... 21
1.3.2 Skumbroidinis apsinuodijimas ... 22
1.4 Histamino nustatymo metodai ... 22
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 25
3. REZULTATAI ... 26
3.1 Žuvyje ir žuvies gaminiuose nustatyti histamino kiekiai ... 26
3.2 Histamino kiekio palyginimas tarp žuvų rūšių ... 30
3.3 Histamino kiekio svyravimus žuvų gaminiuose sąlygojantys veiksniai ... 36
4 REZULTATŲ APTARIMAS ... 38
IŠVADOS... 40
5
SANTRUMPOS
BA – biogeniniai aminai; TMA – trimetilaminas; TMAO – trimetilaminooksidas feniletil – feniletilaminas; put – putrescinas; kad – kadaverinas; his – histaminas; tir – tiraminas; spmd – spermidinas; sp – sperminas; trip – triptaminas; agma – agmatinas;ESCH - Efektyviosios skysčių chromatografija; PCH – Plonasluoksn÷ chromatografija.
6
EVALUATION OF LITHUANIAN FISH PRODUCTS SAFETY AND AMOUNT
OF HISTAMINE
SUMMARY
Raimonda Krakyt÷ – Master Student (Faculty of Veterinary) Advisor – Dr. Gintar÷ Zaborskien÷
University of Health Sciences Veterinary Academy, Food Safety and Quality Department, Kaunas This final study is written in Lithuanian language, containing 45 pages and includes:
introduction, literature review, materials and methods, results, conclusions, a list of used literature including – 53 references, 10 tables, and 8 pictures.
Histamine is produced by bacteria after the amino acid histidine decarboxylation. Scombroid fish have high levels of histamine. Histamine poisoning is one of the main causes of food– spreading illness associated with fish consumption.
Taking large amounts of histamine can cause for several minutes to several hours of short-term changes in organism. Histamine content in fish and fish products depends on: the initial quality of the raw water, where fish was caught, as long and extensively fish was fed, as well as technological parameters, seasonality, temperature control, ensuring adequate sanitary conditions.
The chemical composition of fish is highly dependent on the species and individual, depending on sex, age, environment and season.
Objective:
• To evaluate the safety of Lithuanian fish products against histamine.
Tasks:
• The literature analysis on the formation of biogenic amine – histamine in freshwater and marine fish products, and the gauging levels of histamine.
• To analyze the histamine detection methods.
• To determine histamine levels and assess their compliance with Lithuanian regulated sizes in freshwater and marine fish products.
7 • To perform histamine content monitoring in Lithuanian fish products, evaluate products for
safety.
Histamine levels in fish and fish products were determined by high – performance liquid chromatography.
Investigated and was found that histamine levels in fish vary within a wide range: in Salmon histamine level was in the range of 5 – 240 mg kg-1, and the average value was 36.17 mg kg-1, which was slightly lower than in the herrings, when p ≥ 0.05, in the herring histamine ranged from 5 – 177 mg kg-1, and the average value was 38.46 mg kg-1. Salmon are more dangerous in respect of histamine quantity, histamine level exceeded standards in 16 percent of tested salmon samples. It was influenced by the seasonality, after spawning caught fish had significantly more histamine than in autumn and winter period. Also, it had an influence on the technological processing, in fresh fish were more histamine than in fish products.
Histamine level in fish products was established significantly higher than in fish at p<0.05. In silk products histamine levels were highest, ranging from 7 – 124 mg kg-1, and the average value was 59.89 mg kg-1. In Analyzed Lithuanian fish products histamine level ranged from 5 – 240 mg kg-1, and the average value was 36.97 mg kg-1. After evaluating products safety, silk goods are the most unsafe because they contained much higher levels of histamine than the other analyzed products, as p<0.05.
8
ĮVADAS
Histamino apsinuodijimas yra viena iš pagrindinių priežasčių, maistu plintantis susirgimas, susijęs su suvartojama žuvimi. Tod÷l yra reikšminga visuomen÷s sveikatos ir apsaugos problema (Oliveira et al., 2012).
Atsižvelgiant į biogeninių aminų (BA) poveikio žmonių sveikatai ir maisto saugai aktualumą, svarbu steb÷ti jų kiekį maisto produktuose. Didel÷s BA koncentracijos gali būti maisto produktuose, kaip pvz., žuvyje ir žuvies produktuose, sūriuose, vyne, dešrose ir fermentuotose daržov÷se.
Žuvys yra svarbus baltymų, vitaminų ir mineralų šaltinis. Tačiau žuvų baltymai yra greit gendantys, kai fermentai formuoja bakterijų augimą, kurios gamina BA, įskaitant histaminą. Tod÷l žuvyje aminų kiekybinis kiekis yra laikomas kokyb÷s indeksu ir gali būti svarbi priemon÷ sanitarine priežiūra (Zhai et al., 2012).
Histaminas yra biogeninis aminas susidaręs žuvyje po post mortem ir tam tikruose žuvies produktuose d÷l netinkamo tvarkymo, t.y. laikymo, temperatūros svyravimų. Laisvas histidinas nustatomas tam tikrų žuvų raumenyse (ypač tune, mahi mahi, skumbr÷je) yra paverčiamas, dalyvaujant gedimo bakterijų fermentams į histaminą, kuris sukelia į alergiją panašius simptomus, kaip skumbroidinis apsinuodijimas (Hungerford, Wu, 2012).
Histaminas skumbroidinį apsinuodijimą sukelia, vartojant nesaugų maistą (Hwang et al., 2011). Skumbroidinis apsinuodijimas paprastai yra lengva liga su įvairiais simptomais, įskaitant išb÷rimu, dilg÷line, pykinimu, v÷mimu, viduriavimu odos paraudimu, niežuliu (Taylor, 1986). Simptomų stiprumas gali gerokai skirtis nuo suvartoto histamino kiekio ir individualaus jautrumo histaminui (Hwang et al., 2011). Skumbroidin÷ žuvis, kaip tunas, skumbr÷, turi daug laisvo histamino raumenyse, yra dažnai susijusi su skumbroidinio apsinuodijimo atvejais (Taylor, 1986).
Skumbroidinis apsinuodijimas yra labiausiai problematiškas cheminis apsinuodijimas iš jūros g÷rybių (Hungerford, 2010) ir sudaro daugumą žuvimis plintančių ligų.
Jungtin÷se Amerikos Valstijose skumbroidinis apsinuodijimas sudar÷ 38 proc. visų jūros g÷rybių susijusių protrūkių (Hungerford, Wu, 2012). Anglijoje ir Velse 32 proc. visų jūros g÷rybių susijusių protrūkių 1990 metais(Dalgaard et al., 2008). Protrūkiai buvo fiksuojami visame pasaulyje, įskaitant didelį protrūkį (71 asmenys) 2011 metais Senegale (Hungerford, Wu, 2012).
9 Darbo tikslas:
Įvertinti lietuviškų žuvies gaminių saugumą histamino atžvilgiu. Darbo uždaviniai:
1. Literatūros apie biogeninio amino histamino susidarymą g÷lavandenių ir jūrinių žuvų gaminiuose, bei histamino kiekio reglamentuojamus dydžius analiz÷.
2. Išanalizuoti histamino nustatymo metodus.
3. Nustatyti histamino kiekius ir įvertinti jų atitikimą Lietuvoje reglamentuojamiems dydžiams g÷lavandenių ir jūrinių žuvų gaminiuose.
4. Atlikti histamino kiekio lietuviškuose tirtuose žuvies gaminiuose monitoringą, įvertinti gaminius saugos aspektu.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Žuvų chemin÷ sud÷tis ir struktūra
Žuvis chemine sud÷timi ir struktūra artima m÷sai, nors turi nemažai skiriamųjų požymių. Žuvyje yra daug vandens – 75–80 proc. (a w = 0,98). Žuvienoje yra apie 15 – 20 proc. baltymų ir mažiau kaip 1
proc. angliavandenių. Neriebiose žuvyse (pvz., menk÷je) riebalų yra tik apie 0,5 proc., tuo tarpu riebiose žuvyse, tokiose kaip silk÷ ir skumbr÷, riebalų kiekis gali kisti nuo 3 proc. iki 25 proc. (priklausomai nuo sezono ir brandumo). Riebalai gali kauptis įvairiose žuvies kūno dalyse. Eršk÷tinių žuvų jie pasiskirstę tarp raumeninių audinių, menkių – susikaupę kepenyse, lašišinių – pilvo dalyje, silkinių – po oda. Žuvų riebalai turtingi polinesočiųjų riebalų rūgščių, kurios lengvai oksiduojamos, tod÷l žuvų riebalai greit chemiškai apkarsta.
Palyginti su m÷sa, žuvyje yra daug mažiau jungiamojo audinio – maždaug 3 proc. žuvies mas÷s (m÷sos mas÷s – 15 proc.). Raumenų struktūra taip pat skiriasi. Žuvies raumenų skaidulos trumpos, atskirtos plonu jungiamojo audinio sluoksniu. Tai suteikia žuvies m÷sai būdingą sluoksniuotą ir purią struktūrą.
Žuvyje yra nemažai nebaltyminių azoto junginių, laisvųjų aminorūgščių. Esama trimetilaminooksido (skumbrinių, silkinių, menkinių šeimos žuvyse, pvz., silk÷je – 250, menk÷je – 350 mg 100 g-1), kurio redukcijos produktas yra trimetilaminas, taip pat histidino (silk÷je – 86 mg 100 g-1), kuriam dekarboksilinantis susidaro histaminas. Šiais biogeniniais aminais galima apsinuodyti. Net mažas trimetilamino (TMA) kiekis suteikia žuviai stiprų nemalonų kvapą. G÷lųjų vandenų žuvys turi mažiau trimetilaminooksido (TMAO) nei jūrin÷s. Tokios žuvys kaip rykliai turi daug TMAO (500 – 1000 mg 100g-1), karbamido (3 kartus daugiau nei silk÷s ir 2 kartus daugiau nei menk÷s), o silk÷s – laisvųjų aminorūgščių (Masteikien÷, 2007).
1.1.1 Žuvų chemin÷s sud÷ties ir struktūros pokyčius įtakojantys veiksniai
Žuvų chemin÷ sud÷tis labai skiriasi nuo rūšių ir individualiai nuo kitų priklausomai nuo lyties, amžiaus, aplinkos ir sezono. Tod÷l esminis normalus pokytis yra stebimos žuvų sudedamosios raumenų dalys. Per bado laikotarpį, žuvys naudoja energijos sankaupas iš lipidų ir taip pat daug sunaudoja
11 proteinų, taip išeikvojamos atsargos, sumaž÷ja biologin÷ būkl÷. Tod÷l žinios apie žuvų rūšių sud÷tį yra svarbios skirtingiems technologiniams procesams. Ar žuvys yra liesos ar riebios, faktinis riebalų kiekis turi įtakos technologin÷ms savyb÷ms post – mortem. Tiesiogin÷ sud÷tis yra taip pat svarbus žaliavos kokyb÷s aspektas, juslin÷s savyb÷s ir stabilumas sand÷liuojant (Yeannes, Almandos, 2003).
Žuvis yra šaltakrauj÷, jos kūno temperatūra artima vandens, kuriame ji gyvena, temperatūrai. Tik ką sugautos sveikos žuvies raumenys paprastai yra sterilūs. Mikroorganizmų būna žuvų paviršiaus gleivių sluoksnyje, žiaunose ir virškinamajame trakte.
Žuvies m÷sa turi labai mažai angliavandenių, kurie greitai išeikvojami, sugautai žuviai grumiantis d÷l gyvyb÷s. Tod÷l po žūties žuvies audiniuose susidaro mažai pieno rūgšties, ir pH retai nukrinta žemiau 6,0. Tokiomis sąlygomis gali augti rūgštims jautrios bakterijos. Taigi, žuvies chemin÷ sud÷tis ir struktūra yra tinkama mikroorganizmams daugintis ir žuvis labai greitai genda, greičiau negu m÷sa, nes:
• turi daug vandens ir visada labiau užteršta mikroorganizmais;
• turi nelabai standžią konsistenciją, d÷l to palengv÷ja mikrobų skverbimasis gilyn; • žuvies kūnas padengtas gleiv÷mis, o jose mikroorganizmai lengvai ir aktyviai dauginasi; • žuvyje yra nemažai nebaltyminių azoto junginių, kuriuos lengvai panaudoja bakterijos;
• kai kurios žuvys, ypač smulkios, laikomos neskrostos, d÷l to per autolizuotas žarnyno sieneles mikroorganizmai lengvai patenka į audinius;
• žuvų fermentai ilgiau išsilaiko žemoje temperatūroje;
• žuvų riebalai greičiau genda d÷l sąlygiškai didelio polinesočiųjų riebalų rūgščių kiekio.
Ant 1 cm2 žuvies paviršiaus gali būti 103 – 106 bakterijų, žiaunose ir žarnyne – 103 – 107. Mikrobiniam užterštumui turi įtakos vandens, kuriame žuvis sugauta, mikrobin÷ sud÷tis ir tai, ar seniai bei gausiai žuvis maitinosi. Įvairių rūšių žuvys, sugautos maždaug tuo pačiu metu vienoje jūroje, turi beveik panašią mikrobinę sud÷tį. O skirtingų vandenų žuvų mikroorganizmų sud÷tis skirtinga, atspindinti to vandens telkinio mikrobiologinę būseną.
Temperatūros sezoniniai pokyčiai taip pat turi įtakos mikroorganizmų sud÷čiai: vasarą padaug÷ja mezofilinių bakterijų. Svarbu ir žvejybos būdas, žūkl÷s įranga.
Po žvejybinei žuvų kokybei turi įtakos ir jų patirtas stresas. Žuvys, kurios normaliomis sąlygomis paprastai būna labai aktyvios, pvz., tunas ir skumbr÷, pagavimo metu gali patirti labai stiprų stresą ir net nugaišti. Nustatyta, kad žuvų bakterinis užterštumas padid÷ja būtent streso metu. Bet koks fizinis
12 žuvų žalojimas pagreitina jų gedimą, mažina prekinę vertę ir tinkamumą toliau perdirbti. Be to, žuvų užteršimo šaltinis gali būti laivo įrenginiai ir patys žvejai (Masteikien÷, 2007).
1.1.2 Žuvų gedimą sąlygojantys veiksniai
Netekusios gyvyb÷s, žuvies raumenų atsparumas mikroorganizmų dauginimuisi sumaž÷ja, gleiv÷s tampa bakterijų mitybine terpe, o iš žarnyno, žiaunų ir odos paviršiaus mikroorganizmai pradeda aktyviai skverbtis į audinius. Prasideda aerobinis ir anaerobinis žuvies gedimas.
Gedimo savitumą lemia nedidelis žuvies raumenų rūgštingumas (pH 6,2 – 6,5) ir angliavandenių trūkumas, tod÷l į žuvį patekusios bakterijos ima naudoti tirpias, lengvai pasisavinamas azotines medžiagas ir išskirti pašalinio kvapo lakiuosius junginius. Kaip azoto šaltinį, mikroorganizmai gali naudoti laisvąsias aminorūgštis, trimetilaminooksidą (TMAO), karbamidą, nukleotidus (Masteikien÷, 2007).
Laikas, per kurį žuvis ima gesti, priklauso nuo laikymo temperatūros, pradinio mikrobinio užteršimo lygio ir žuvies rūšies. Šiltų vandenų atšaldytos žuvys ges ne taip greitai kaip šaltų, nes pastarosios jau užterštos psichrotrofin÷mis gramneigiamomis gedimo bakterijomis. Atšaldytos žuvies pagrindiniai mikroorganizmai yra pseudomonos, achromobakterijos, flavobakterijos ir kt. Visos šios bakterijos gerai dauginasi žemoje temperatūroje ir jų veiklos metu išsiskiria nemažai trimetilamino (TMA), suteikiančio gendančiai žuviai būdingą nemalonų puvimo kvapą. TMA daugiausiai atsiranda 6 – 8 paras laikytoje atšaldytoje žuvyje, kada pseudomonų padaug÷ja iki 105 – 106 ksv g-1. Svarbiausios bakterijos, augančios ant tirpstančio ledo, yra Sawanella ir Pseudomonas genčių, kurioms tenka apie 80 proc. visos atšaldytos žuvies mikrobinio užterštumo. Mažiau būna Moraxella ir Acinetobacter genčių bakterijų. Jų daug÷ja laikant žuvį aukštesn÷je temperatūroje (nuo 5 0C iki 10 0C). Kambario temperatūroje ( apie 20 0C) tarp bakterinio gedimo vyrauja Proteus genties bakterijos (Masteikien÷, 2007).
1.2 Histamino susidarymas žuvyje ir žuvies produktuose
Biogeniniai aminai įskaitant triptaminą (Trip), feniletilaminą (Feniletil), tiraminą (Tir), histaminą (His), putresciną (Put), kadaveriną (Kad), sperminą (Sp), spermidiną (Spmd) yra mažos molekulin÷s mas÷s junginiai (Zhai et al., 2012).
13 His (skombrotoksinas) Put, Kad, Tir ir agmatinas (Agma), biogeninių aminų yra gaminami dekorboksilinant iš histidino, ornitino, lizino, tirozino ir arginino atitinkamai pagal dekorboksilaz÷s fermentų iš kai kurių bakterijų, esančių sugedusioje žuvyje.
Histamino žuvies apsinuodijimas yra dažnai vadinamas skumbrotoksino apsinuodijimu, nes dažnai asocijuojasi su liga vartojant sugędusios skumbroidin÷s žuvies, tokios kaip tunas ir skumbr÷. Histamino susidarymas žuvų produktuose yra tiesiogiai koreliuojantis su histidino koncentracija į audinio ir mikroorganizmų, esančio tame produkte lygį, d÷l bakterijų histidino dekarboksilaz÷s reakcijos.
Biogeniniai aminai yra žuvies sugedimo rodikliai. Tai įdomu pažym÷ti, kad dauguma biogeninių aminų yra stabilūs terminiam apdorojimui, tod÷l jų buvimas pagamintuose konservuotose, produktuose yra požymis, kad žaliavos buvo sugędusios prieš kaitinimą (Malle et al., 1996; Duflos et al., 1999; EU, 2005).
Skumbroidin÷s žuvys natūraliai turi didelius histidino kiekius, kurie paverčiami į toksišką histaminą, kaip rezultatas histidino dekarboksilazę gaminančių bakterijų, jei laikymo sąlygos netinkamos kontroliuoti bakterijų augimą (Pav. 1).
1 pav. Histamino susidarymas žuvyse
Histaminas yra karščiui stabilus ir išlieka tolimesniame technologijos procese, pvz., koncervuojant, ir nurijimo žuvies su histamino lygis viršija 1000 ppm (100 mg 100 g-1) bei gali sukelti negalavimus. Bakterinis gedimas ir histamino gamyba gali įvykti bet kuriame maisto grandin÷s etape (t.y. nuo žuvies iškrovimo, apdirbimo įmon÷je arba išplatinimo sistemoje ar viešojo maitinimo patalpose, ar namuose) ir atitinkama temperatūros kontrol÷ yra svarbiausia užkirsti kelią bakterijų augimui ir histamino susidarymui. D÷l žuvų ryšio kontrol÷s, skumbroidinių šeimos leistinas vidutinis histamino koncentracijos lygis ES įstatymų kiekvienai žuvų partijai yra mažesnis kaip 100 ppm (10 mg 100 g-1) (McLauchlin et al., 2005).
14 Iš žuvies išskiriamos histamino susidarymui turinčios įtakos bakterijos yra daugiausia žarnin÷s lazdel÷s (Morganella morganii – produktyviausia histaminą sudaranti bakterija, Klebsiella pneumoniae, Hafnia alvei) ir natūraliai pasitaikančios jūrin÷s bakterijos (Photobacterium spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp., Aeromonas spp., ir kai kurios gramteigiamos bakterijos) (Shakila et al., 2002; Cinquina et al., 2004).
Visame maiste yra bakterijų, nes jis gaunamas iš natūralios aplinkos, kuri n÷ra sterili. Tai svarbu tod÷l, kad žuvyje yra aminorūgšties histidino, o bakterijos jį paverčia į histaminą, kuris yra fiziologinis aminas, sukeliantis daug alerginių reakcijų. Susidaręs histaminas nesuardomas nei žuvį šaldant, verdant, rūkant ar konservuojant. Geriausias būdas užtikrinti mažiausią histamino kiekį yra kontroliuoti temperatūrą, kuri turi būti ne aukštesn÷ kaip 5 ºC (Križek et al., 2002; Cinquina et al., 2004).
1.2.1 Bakterijų įtaka histamino formavimuisi
Histaminas yra gaminamas iš laisvo histidino d÷l bakterijų veiklos histamino dekarboksilaz÷s. Nors skumbroidinis apsinuodijimas yra apibr÷žiamas, kaip liga susijusi su žuvies sugedimu (Kim et al., 2000, 2001) ir žuvies produktais (Kimura et al., 2001; Kung et al., 2009), histamino ir kitų biogeninių aminų yra taip pat kituose maisto produktuose ir g÷rimuose.
Histidinas yra paplitusi amino rūgštis, taigi histaminas gaminamas, veikiant bakterijų dekarboksilaz÷ms, vyne (Coton et al., 1998) sūryje (Sumner et al., 1990) ir fermentuotoje m÷soje (Roig–Sagués et al.,1997). Tačiau, histaminas fermentuotose produktuose, kaip antai, vyne (Lonvaud– Funel, Joyeux, 1994) sūryje (Leuschner et al., 1998) ir žuvies padaže (Kimura et al., 2001) yra gaminamas gramteigiamų pieno rūgšties bakterijų, tačiau šviežios žuvies produktuose histaminas susidaro daugiausia d÷l gramneigiamų enterobakterijų (Kim et al., 2001 a, b).
Yra skirtumų tarp histidino dekarboksilaz÷s tipo. Egzistuoja dvi skirtingos histidino dekarboksilazių fermentų klas÷s: gramteigiamos bakterijos gamina heterometrinę histidino dekarboksilazę, kurios sud÷tyje yra aktyvi pavojinga piruvin÷ grup÷ (Konagaya et al., 2002), ir gramneigiamų bakterijų histidino dekarboksilaz÷, kuri priklauso piridoksal 5–fosfato grupei (Kamath et al., 1991). Taip pat yra įmanoma, kad produktai, kaip antai, fermentuotas žuvies padažas, kuriame gali būti abiejų tipų histidino dekarbokzilaz÷s, pirmiausiai gramneigiamų bakterijų ir gramteigiamų, kurios veikia fermentacijos metu. Nors histamino susidarymas gali būti kontroliuojamas, teisingai parenkant temperatūrinį r÷žimą ir vengiant prastovų technologinio proceso metu, dabar yra žinoma, kad
15 bakterijos, gaminančios histidino dekarboksilazes gali vystytis temperatūroje, žemesn÷je, kaip 0 – 5 oC (Kanki et al., 2004; Emborg et al., 2006).
Ankstesni tyrimai parod÷, kad mezofilin÷s enterobakterijos ir ypač Morganella morgani, yra priežastis d÷l histamino susidarymo. Naujausi tyrimai Danijoje ir Japonijoje įrodo, kad psichrotolerantiškos bakterijos Morganella psychrotolerans ir Photobacterium phosphoreum buvimas
gaminamame žuvies produkte yra histamino toksiškų koncentracijų priežastis Ši nauja informacija yra
svarbi, nes šios psichrotolerantiškos bakterijos gali įtakoti toksinę histamino koncentraciją jūros g÷ryb÷se ypač, kai produktai saugomi atšaldyti.
Atlikti tyrimai patvirtino toksiško histamino formavimąsi atšaldytose jūros g÷ryb÷se, laikymo metu. Daugiau, kaip 500 ppm histamino buvo nustatyta 18–oje iš 59 tyrimų (31 proc.), atliktų analizuojant natūraliai užteržtas jūros g÷rybes, kai jos buvo laikomos nuo –1 0C iki + 5 0C (Emborg, Dalgaard, 2008).
1.2.2 Žuvyje nustatomi histamino kiekiai
Histaminas n÷ra tolygiai pasiskirstęs visoje sugedusioje žuvyje ar jos dalyse, tod÷l histaminu apsinuodyti gali ne visi vartotojai, vartoję žuvį (Lehane and Olley, 2000). Tai reiškia, kad 50 mg kg-1 gali būti nustatoma vienoje žuvies dalyje, o kitoje - skaičius gali siekti daugiau, kaip 500 mg kg-1. Histaminą dekarboksilinančios bakterijos pasiskirsto nevienodai, histamino susidarymas ir difuzija į audinius labai skiriasi (Tao et al., 2009). Histamino koncentracijų žuvyje poveikis žmonių sveikatai pateiktas 1 lentel÷je.
1 lentel÷. Histamino koncentracijų žuvyje poveikis žmonių sveikatai. Maisto kategorija Histamino koncentracija Poveikis
Žuvis <50 mg kg-1 Saugu vartoti
Žuvis 50 – 200 mg kg-1 Gali būti nuodinga, toksiška
Žuvis 200 –1000 mg kg-1 Toksiškas
Žuvis 500 mg kg-1 Apsinuodijimas
žuvies histaminu
Tunas 500 mg kg-1 Pavojingumo lygis
Žuvis 500 – 1000 mg kg-1 Apsinuodijimas
16
Žuvis >1000 mg kg-1 Toksiškas ir nesaugus vartoti
(Gabernig et al., 2009).
Austrų mokslininkai Gabernig ir kt. (2009) atliko išsamią literatūros analizę apie histamino poveikį žmogaus sveikatai ir apibendrino 2001 – 2006 metų histamino tyrimų maisto gaminiuose rezultatus. Autoriai, išanalizavę mokslinę literatūrą, teigia, kad nepavojinga sveikatai histamino koncentracija žuvyje yra mažesn÷ nei 50 mg kg-1, o nuo 50 iki 200 mg kg-1 jau gali sukelti intoksikacijas, 200 – 1000 mg kg-1 – ypač pavojinga koncentracija. Histamino koncentracija 500 mg kg-1 tune pripažinta pavojinga. Kiti autoriai pateikia, kad, kai histamino yra daugiau 1000 mg kg-1, produktą vartoti nesaugu (Miliauskien÷ ir kt., 2009).
Lehane ir Olley (2000) apžvalgoje minima kad žmogui vartojant per burną, toksiškas kiekis žuvų raumenyse pasiūlytas, kuris sukelia nežymius histamino apsinuodijimus 80 – 400 mg kg-1 (ppm), vidutinio sunkumo apsinuodijimas daugiau, kaip 400 mg kg-1 ir sunkus daugiau, kaip 1000 mg kg-1. Remiantis apsinuodijimo atvejų įvertinimu, rekomenduojami histamino kiekiai jūros g÷ryb÷se pasiūlyti yra saugūs suvartojant mažiau, kaip 50 mg kg-1.
1.2.2.1 Įvairių žuvų ir žuvies produktų laikymo, apdorojimo poveikis biogeninio amino
histamino formavimui
25 0C temperatūroje histamino gamyba M. morganii dirbtinai užkr÷stų skumbrių, ilgapelekių, mahi-mahi žuvų raumenyse (Kim et al., 2002). Histamino kiekis smarkiai išaugo po 6 valandų esant 25
0
C temperatūrai. Kim ir kt. (2002) nustat÷ aukštą histamino lygį 4610 ppm skumbr÷je po 24 valandų laikymo; 3430 ppm ilgapelek÷se ir 3340 ppm mahi-mahi. Esant 4 0C temperatūroje atsiliko visuose rūšyse M. morganii augimas iki 14 dienų.
Economou ir kt. (2007) įvertino temperatūros piktnaudžiavimo poveikį histamino formavimuisi tuno raumenyse laikant skirtinguose temperatūrose. Kadangi, laikymo temperatūra 0 – 2 0C, 258,3 ppm histamino buvo aptikta šviežių tunų nugarin÷je piktnaudžiaujant 30 0C temperatūroje 2 valandas kasdien 12 dienų. Aukšta histamino koncentracija 1962 ppm buvo aptikta tune laikant 6 – 7 0C po 12 dienų laikymo temperatūros piktnaudžiavimo. Ledo temperatūroje buvo nustatyta, kad sul÷tina histamino susidarymą.
17 Rodtong ir kt. (2005) nustat÷ histaminą produktyvių gamintojų sugedusio indiško ančiuvio (Stolephorus indicus), kaip M. morganii, Proteus vulgaris, ir Enterobacter aerogenes. Esant 5 proc. NaCl, šios trys paderm÷s vis dar buvo paj÷gios gaminti didelį histamino koncentraciją terp÷je. Tačiau visos paderm÷s nustojo gaminti histaminą, kai NaCl siek÷ ≥10 proc. NaCl.
Lakshmanan ir kt. (2002) ištyr÷ amino pasikeitimus susidariusių mikroorganizmų džiovintose sardin÷se druskoje (Sardinella gibbosa). Druskos kiekis galutiniame produkte svyravo nuo 10 iki 16 proc. Autorius rado, kad tik kavaverinas ir putrescinas buvo pagaminti bakterijų izoliuotų ir nebuvo rasta histaminą formuotojų tarp druskos džiovinimo proceso metu. Autorius padar÷ išvadą, kad amino formavimui mikrofloros augimą slopina daugiau, kaip 10 proc. NaCl.
Tačiau, Kongpun (2000) pasteb÷jo, kad histamino kiekio padid÷jimas su padid÷jusiu druskos kiekiu ispaniškoje skumbr÷je ir pasiek÷ didžiausią koncentraciją, kai. druskos kiekis buvo 13 – 15 proc. Autorius paaiškino, kad tai gali būti d÷l bendro bakterijų skaičiaus padid÷jimo ir padid÷jusio histaminą sudarančių bakterijų skaičiaus druskos kiekį.
1.2.3 Biogeninio amino histamino susidarymas g÷lavandenių ir jūrinių žuvų gaminiuose
Paprastieji karpiai (Cyprinus carpio), vaivorykštiniai up÷takiai ir ešeriai (Perca fluviatilis) yra svarbios g÷lavanden÷s žuvys, kuriose gausu nesočiųjų riebiųjų rūgščių (Buchtová et al., 2007). Europoje šios žuvys populiarios žvejų tarpe, taip pat populiarus yra jų auginimas.
Križek ir kt. (2011) tyr÷ biogeninių aminų susidarymą g÷lavanden÷se žuvyse. Paprastųjų karpių, vaivorykštinių up÷takių ir ešerių fil÷ buvo laikoma 3 0C ir 15 0C temperatūroje 7 dienas. Laikant 3 0C temperatūroje nebuvo nustatyta didelių histamino kiekių, tačiau laikant 15 0C temperatūroje, jau antrą dieną, buvo galima aptikti histaminą, ir 7 dieną paprastųjų karpių m÷soje vidutiniškai histamino buvo nustatyta – 38,6 mg kg-1, vaivorykštinių up÷takių – 79,7 mg kg-1, karpių m÷soje – 110 mg kg -1. Chemin÷ įvairių žuvų sud÷tis pateikta 2 lentel÷je.
2 lentel÷. Chemin÷ įvairių žuvų sud÷tis % Sud÷tis (m / dr÷gno produkto svorio)
Žuvis Vanduo Baltymai Riebalai Angliavandeniai Pelenai Jūrin÷s
pelekin÷s žuvys
Menk÷ 80 18 0,7 <0,5 1,2
18
Lašiša 68 – 78 20 3,5 – 11 <0,5 1,2 – 2,5
G÷lavanden÷ žuvis
Up÷takis 72 20 3 - 6 <0,5 1,3
(Gram, Huss, 2000) keista iš Shewan (1974).
Autorių Coban, Patir (2008) nurodyti histamino kiekiai gauti iš jūros ir g÷lųjų vandenų žuvų, pateikti 3 lentel÷je.
3 lentel÷. Histamino kiekis gautas iš kai kurių jūros ir g÷lųjų vandenų žuvų mg kg-1 (ppm) M÷nesiai Ančiuvis Arklin÷
skumbr÷ Skumbr÷ Veidrodinis karpis Vaivorykštinis up÷takis Rugs÷jis 31,94 33,17 32,48 15,31 16,37 Spalis 30,10 27,72 31,68 13,99 15,84 Lapkritis 27,98 26,67 31,41 11,35 16,11 Gruodis 24,82 22,97 27,46 9,77 13,99 Sausis 18,22 21,39 18,87 7,68 20,29 Vasaris 17,82 21,12 21,12 7,41 7,66 Kovas 24,55 20,60 21,12 7,39 9,24 Balandis 25,08 24,03 21,37 10,30 8,20
(Coban and Patir, 2008)
Lyginant g÷lavandenes (karpis, vaivorykštinis up÷takis) ir jūrines (ančiuvis, skumbr÷, arklin÷ skumbr÷) žuvis, histamino nustatymo kiekiai skiriasi. Jūrin÷se žuvyse aptinkama net 2 kartus didesni histamino kiekiai, nei g÷lavanden÷se žuvyse. Tačiau lyginant d÷l sezoniškumo, Rudens – Žiemos laikotarpiu, histamino nustatymo kiekiai tolygiai maž÷jo, bet vaivorykštiniame up÷takyje histamino kiekiai, kas antrą m÷nesį kito, padid÷jo ir sumaž÷jo. Pavasario laikotarpiu sugautose žuvyse histamino nustatymo kiekiai pradeda did÷ti, tačiau vaivorykštinio up÷takio maž÷ja.
1.2.4 Histamino kiekio reglamentavimas
Histamino kiekis 50 ppm yra yrančioje žuvyje cheminis indikatorius ir kelios šalys turi nustatytas teisines histamino koncentracijos ribas, kurios yra laikomos saugiu žmon÷ms vartoti, kiekiu. Australijoje – 200 ppm, Europoje – 100 ppm, JAV – 50 ppm, Pietų Afrikoje – 100 ppm. Yra trys prielaidos aukšto post-mortem histamino kiekio koncentracijos žuvyse:
1. Pakankamai didelis laisvo histidino kiekis; 2. Buvimas bakterin÷s histidino dekarboksilaz÷s;
19 3. Aplinkos sąlygos, pavyzdžiui aukšta temperatūra (Lehane and Olley, 2000).
Histamino kiekis žuvies produktuose reglamentuojamas Europos Bendrijų Komisijos reglamentu (EB) Nr. 2073/2005 d÷l maisto produktų mikrobiologinių kriterijų.
Reglamente (EB) 2073/2005 nustatoma histamino didžiausios leistinos koncentracijos, iš rūšių kur ypač gausu histidino.
„Devyni m÷giniai turi būti imami iš kiekvienos partijos. Jie turi atitikti šiuos reikalavimus: vidutin÷ vert÷ neturi viršyti 100 ppm;
Dviejuose m÷giniuose gali būti daugiau kaip 100 ppm, bet mažiau kaip 200 ppm; Ne vienas m÷ginys negali viršyti 200 ppm.“
Jokie m÷giniai negali viršyti 200 ppm.
Žuvų rūšys siejamos su dideliu histidino kiekiu. Tokios rūšys priklauso šioms šeimoms: Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae, Pomatomidae, Scombresosidae (Skumbrin÷s, Silkin÷s, Ančiuvin÷s, Auksin÷s skumbr÷s, Melsvieji ešeriai ir Lydekin÷s skumbr÷s).
Tačiau, žuvys priklausančios šių šeimų, kurios buvo apdorotos fermentais brandinamas apdorojimas sūryme gali tur÷ti aukštesnį histamino lygį, bet ne daugiau, negu du kartus pirmiau nurodytų verčių dydžio.
JAV maisto ir vaistų administracija (FDA) 1998 m. nustat÷ toksines gaires, kad tunus, didžioji korifena (mahi mahi) susijusios su histamino kiekiais „500 ppm nustatyta remiantis toksiškumu, 50 ppm nustatytas kaip trūkumas veiksmų lygis, nes histaminas yra paprastai netolygiai pasiskirstęs yrančioje žuvyje. Tod÷l, jei 50 ppm yra nustatyta vienoje dalyje, yra galimyb÷, kad kiti vienetai gali viršyti 500 ppm.“ (Malle et al., 1996; Duflos et al., 1999; EU, 2005).
Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2073/2005 d÷l maisto produktų mikrobiologinių kriterijų nustato histamino normas partijai m – 100 mg kg-1 ir M – 200 mg kg-1. Reglamentuotas histamino kiekis žuvininkyst÷s produktuose, pagamintuose iš žuvų rūšių, kur daug histidino, yra patenkinamas, kai vykdomi tokie reikalavimai: 1) nustatyta vidutin÷ vert÷ yra mažesn÷ arba lygi m; 2) dviejų iš devynių nustatytų verčių maksimumas yra tarp m ir M; 3) nei viena iš nustatytų verčių neviršija M ribos. Nepatenkinama, jeigu nustatyta vidutin÷ vert÷ viršija m; arba daugiau nei dvi iš devynių verčių yra tarp m ir M; arba viena ar daugiau nustatytų verčių yra daugiau už M (Miliauskien÷ ir kt., 2009).
20
1.3 Histamino įtaka natūraliai vykstantiems organizmo procesams
Histaminas – svarbus alerginių reakcijų mediatorius. Jis išsiskiria kaip atsakas į IgE ir antigeno sąveiką ląstelių paviršiuje. Susidaro dekarboksilinant histidiną, katalizuojant specifinei histidino dekarboksilazei. Dekarboksilinimas vyksta dideliu greičiu. Intensyviausiai dekarboksilinimas vyksta jungiamojo audinio putliosiose ląstel÷se, kuriose daugiausia nustatoma histidino dekarboksilaz÷s. Labai daug histamino yra plaučiuose, odoje, žarnyno gleivin÷je, nugaros smegenyse ir požievyje. Putliosiose ląstel÷se histaminas sudaro kompleksinius junginius su baltymais bei heparinu ir kaupiasi specialiose sekrecin÷se granul÷se. Išsiskiria iš putliųjų ląstelių, veikiant specialioms medžiagoms – histamino liberatoriams. Kraujyje histamino yra bazofiluose ir eozinofiluose. Nedaug jo yra kraujo plazmoje ir kituose biologiniuose skysčiuose (Praškevičius ir kt., 2003).
Histaminui būdingas stiprus ir įvairus biologinis aktyvumas. Jis išplečia smulkiąsias kraujagysles ir didina kapiliarų pralaidumą. Išpl÷sdamas kraujagysles, histaminas greitina leukocitų tek÷jimą ir padeda organizmui kovoti su infekcija, tod÷l uždegimo židinyje susidaro dideli histamino kiekiai. Išsipl÷tusioms galvos kraujagysl÷ms, did÷ja vidinis kaukol÷s spaudimas, atsiranda galvos skausmai. Padid÷jęs histamino išsiskyrimas vyksta organizmo sensibilizacijos ir anafilaksinio šoko metu. Esant didel÷ms histamino koncentracijoms, d÷l bronchų spazmų kyla pavojus gyvybei. Jis veikia kaip alerginių reakcijų ir skausmo mediatorius. Kai organizmo jautrumas padid÷jęs (alergija, sensibilizacija), kliniškai vartojami antihistamininiai preparatai. Histaminas sutraukia bronchų ir žarnyno lygiuosius raumenis ir stimuliuoja skrandžio sulčių ir seilių sekreciją, tod÷l vartojamas, kaip dirgiklis, tiriant skrandžio sulčių sekreciją ir skrandžio sulčių rūgštingumą.
Organizme jis inaktyvuojamas oksidacinio deaminimo būdu, katalizuojant monoaminooksidazei (MAO) ar diaminooksidazei (DAO). Šioje reakcijoje išsiskiria amoniakas ir susidaro imidazolilacetatas, kuris pasišalina iš organizmo su šlapimu. Histaminas taip pat netenka aktyvumo, jį metilinant ar acetilinant. Susidaro N1–metilimidazolilacetatas, kuris pasišalina su šlapimu. Metilo
(CH3) grup÷s donoras šioje reakcijoje yra S–adenozilmetioninas, o acetilin÷s grup÷s donoras – acetil–
CoA .
Histaminas yra ne tik biologiškai aktyvus aminas, sutraukiantis kraujagyslių lygiuosius raumenis bei veikiantis kaip alerginio atsako mediatorius, jis taip pat yra ir pa gumburio neuronų mediatorius (Praškevičius ir kt., 2003).
21
1.3.1 Biogeninių aminų poveikis sveikatai
Mažas BA kiekis maiste n÷ra laikoma rimta sveikatos rizika. Tačiau jei yra pakankamai dideli kiekiai, žmogaus detoksikacijos sistema negali pašalinti juos pakankamai ir gali sukelti įvairių fiziologinių poveikių (Anderson, 2008).
Dažnas simptomas BA yra apsvaigimas, pykinimas, kv÷pavimo sutrikimai, karščio pylimas, prakaitavimas, galvos skausmai, ryškiai raudonas b÷rimas, burnos deginimas, hipertenzija, hipotenzija (Becker et al., 2001).
Putrescinas ir kadaverinas neturi neigiamos gr÷sm÷s sveikatai, bet gali vaidinti svarbų vaidmenį apsinuodijimu maistu, nes jie gali sustiprinti tiramino ir histamino tooksiškumą. Be to, biogeniniai poliaminai, pvz., putrescinas, sperminas, kadaverinas gali reaguoti su nitritais ir sudaryti kancerogeninius nitrozoaminus (Zhai et al., 2012).
Skumbrotoksinis žuvų apsinuodijimas yra susijęs su užterštų žuvų vartojimu Skombroid šeimos (įskaitant tunus, skumbres, silkes, marlinus, pelamides). Skumbrotoksinis žuvų apsinuodijimas yra cheminis apsinuodijimas ir simptomai pasireiškia per 10 minučių iki 2 h po suvartojimo, susidariusio histamino skumbroidin÷se žuvyse ir apima b÷rimą ant veido, kaklo ir viršutin÷s krūtin÷s ląstos, paraudimą, prakaitavimą, pykinimą, v÷mimą, viduriavimą, pilvo spazmus, galvos skausmus, galvos svaigimus, smarkų širdies plakimą, burnos deginimo pojūtį, metalo skonį burnoje ir hipotoniją (kraujospūdžio sumaž÷jimą).
Simptomai paprastai išsisklaido per 24 h., nors ir, net jei daugiausia susirgimų nereikalauja medicinin÷s priežiūros, kai kurias atvejais simptomai, gali būti pakankamai sunkūs skubiais atvejais reikalauja skubios medicinin÷s priežiūros, gali būti naudojami prieš histamininiai vaistai (McLauchlin et al., 2005).
22
1.3.2 Skumbroidinis apsinuodijimas
Terminas „skumbroidinis“ išvestas iš rūšies (t.y. Scombridae) pirmas turintis savyje, kaip tunas ir skumbr÷. Kur (skumbroidinis) žuvų dalyse paplitęs aukštas laisvo histidino lygis, raumeniniuose audiniuose (Ruiz–Capillas, Moral, 2004).
Skumbroidinis apsinuodijimas arba žuvies apsinuodijimas histaminu yra maisto apsinuodijimo tipas su simptomais ir panašiu gydymu, kuris susijęs su jūros g÷rybių alergijomis. Skumbroidinio apsinuodijimo pasekm÷ – vartojama, blogai tvarkoma žuvis. Histaminas ir kiti pūvantys produktai yra sukurti per laiką, temperatūrą, piktnaudžiaujant žalia žuvimi per bakterijų, fermentų virtimą iš laisvo histidino (Rawles et al., 1996).
Dabar yra žinoma, kadkitos (ne sumbroidin÷s) žuvų rūšys yra, taip pat įtrauktos į skumbroidinį apsinuodijimą, kaip mahi-mahi (Coryphaena spp.), sardin÷s (Sardinella spp.), sardin÷s (Sardinapilchardus), ančiuviai (Engraulis spp.), silk÷ (Clupea spp.), marlinas (Makaira spp.) melsvažuv÷ (Pomatomus spp.) (Taylor, 1986; Hwang et al.,1997), vakarų australiška lašiša (Arripis truttaceus), raudonoji lašiša (Oncorhynchusnerka), (Gessner et al., 1996) ir kardžuv÷ (Xiphias gladius) (Chang et al., 2008). Daugiausia šios žuvys yra turtingos laisvu histidinu (Antoine et al., 1999) su lašišomis ir kardžuv÷mis yra išimtys (Suzuki et al., 1987).
Skumbroidinis apsinuodijimas yra aiškiai susijęs su histamino kiekiu (Taylor, 1986).
1.4 Histamino nustatymo metodai
Aminų nustatymui maiste yra dvi priežastys: pirma – d÷l jų potencialaus toksiškumo, antra – galimyb÷ naudoti juos, kaip maisto produkto kokyb÷s žymenis (Križek et al., 2004).
Skirtingi nustatymo metodai nustato histamino analizę, įskaitant plonasluoksnę chromatografiją ir, dujų chromatografiją, kolorimetrinį tyrimą, fuorometrinį tyrimą, fermentinį tyrimą, imunologinį tyrimą ir efektyvią skysčių chromatografiją.
Histamino nustatymo rimta problema yra atskirti histaminą visiškai, iš labai didelio kiekio trukdančių junginių, kaip antai histidinas ar karnozinas. Daugumai analiz÷s metodų reikia kruopštumo ir priežiūros pašalinti potencialiai trukdančias medžiagas, kurios yra laike dominuojančios ir pratęsia analitinį procesą. Taip pat pl÷tojamas paprastas ir greitas metodas lapo elektroforez÷, bet taip pat reikia elektroforez÷s įrangos ir maitinimo šaltinio.
Paprasta ir greita metodo steb÷sena, histamino kiekio žuvyje ir žuvies produktuose, ir tod÷l reikalinga šalinti atid÷liojimus analiz÷je, kad užtikrinti saugą žuvies produktuose. Tikslas buvo
23 pasisavinti paprastą ir greitą plonasluoksn÷s chromatografijos (PCH) histamino analiz÷s metodą, steb÷ti žuvies produktų tinkamumą, kontroliuoti pagal rekomendacijas histamino nustatymus FDA. PCH tyrimas paremtas reakcijomis tarp imidazolo žiedo ir azotintos sulfanilo rūgšties, esant silpnoms šarmin÷ms sąlygoms formuojasi raudoni azo dažai. Bet to, 5 – 6 m÷giniai tuo pat metu gali būti analizuojami ant vienos plokštel÷s mažai išnaudojama tirpiklių (Tao et al., 2011).
Histamino ir biogeninių aminų analiz÷s metodai
Biologiniai tyrimo metodai buvo pirmieji vertinimo metodai skumbroidinių toksinų, jie matuojami tokiais parametrais kaip histamino kiekio maž÷jimas jautrus organo, kaip jūrų kiaulyt÷s klubin÷s žarnos ir pirmasis AOAC histamino nustatymo metodas maiste buvo biologinis metodas (AOAC oficialusis metodas 954.04), bet šie būdai buvo išstumti iš paprastesnių ir daugiau patogesnių metodų.
• Kiekybiniai metodai: fluorimetrijos metodai buvo išvystyti histamino tiksliems matavimams ir su naujomis metodų evoliucijos procedūromis buvo išbandyta. Dabar chromatografijos metodai, pvz., dujų chromatografija (DCH), didelio efektyvumo skysčių chromatografija (DESCH), taip pat kaip kapiliarin÷ elektroforez÷ teikia vieną pagrindinį pranašumą. Jie leidžia vienu metu histamino analizę ir kitų biogeninių aminų žuvies ir žuvininkyst÷s produktuose. HPLC metodai yra labiausiai naudojami šiandien.
• Pusiau kiekybiniai metodai: jie yra tinkami įprastai histamino atrankai. Kai patogu imunofermentiniai rinkiniai yra parduodami ir kiti metodai, pavyzdžiui kolorimetrin÷s, plonasluoksn÷s chromatografijos ir fermentiniai metodai yra naudojami daugelį metų.
Įprastiniai bandymų metodai laboratorijose
Atsižvelgiant į skumbrotoksino kokyb÷s kontrol÷s metodus: užtikrinti saugą d÷l histamino, tai yra geriau naudoti padarytą greitą metodo atranką, net jei metodas yra pusiau kiekybinis, nes jis leidžia patikrinti didelį kiekį m÷ginių. Tačiau, yra būtina apibr÷žti metodo ribas ir patikrinti jo patikimumą, palyginti su pamatiniu metodu ir kilus abejonių d÷l tyrimo rezultatų arba kilus ginčui turi būti naudojamas oficialus metodas.
24 Kolorimetriniai, PCH ir fermentiniai metodai reikalauja apskritai mažai įsipareigojimų įrangai ir nebrangūs reagentai, tačiau jie yra kokybiniai arba geriausiu atveju pusiau kiekybiniai.
Imunofermentiniai tyrimo rinkiniai suteikia kiekybinių rezultatų, reikalauja mažai įrangos, fotometru, ir keleto regentų, kurie yra parduodami paruošti naudoti. Keli imuno fermentin÷s analiz÷s (IFA) metodų procedūros buvo parengtos bendrovių, kurios gamina histamino kokybinius ir / ar kiekybinius analiz÷s metodų priemones. Jie gali atskirti tarp produktų, kuriuose yra mažiau, nei 50 ppm ir tuose kur yra daugiau kaip 50 ppm.
DESCH gali būti naudojamas kaip atrankos bandymas kokyb÷s kontrol÷s laboratorijose. Jis gali pakeisti senus PCH metodus, pagerinti rezultatų kokybę, nebrangus ir nereikalauja sud÷tingų prietaisų. Jis taip pat yra jautrus ir atkuriamas metodas.
Patvirtinimo metodai
AOAC fluorimetrinis metodas (977,13) yra naudojamas palyginti naujų metodų tinkamumo lyginamosios studijos. Yra rekomenduojama Codex Alimentarius, kaip pamatinis metodas.
Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCH) metodas pagrįstas d÷l biogeninių aminų ekstrakcijos su perchlorato rūgštimi, steb÷ti tiesiogiai ESCH analizę ekstrakto d÷l atvirkštinių fazių kolon÷l÷ su derivatizacija, su optinio tankio ir fluorescenciniu aptikimu, esant 365/418 nm. Jis yra Vokietijos pamatinis metodas (Amtliche–Sammlung–von–Untersuchungsverfahren–nach–Paragraph– 35–LMBG. L 10,00–5).
Kiekybiniai tikslūs metodai dažnai reikalauja santykinai sud÷tingos įrangos ir kvalifikuotų specialistų. ESCH metodas yra sud÷tingas, metodas gali būti naudojamas specializuotose laboratorijose patikrinami kai kurie m÷giniai po pirmojo atrankos bandymo (Malle et al., 1996; Duflos et al., 1999; EU, 2005).
25
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
Tyrimai atlikti 2010 – 2012 metais Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitete Veterinarijos Akademijoje, Maisto saugos ir kokyb÷s katedroje ir Kauno technologijos universiteto Maisto institute, Chemijos laboratorijoje.
Biogeninių aminų tyrimams atrinkti įvairių gamintojų silkių, lašišų, menkių, karpių, up÷takių gaminiai, įsigyti prekybos centre. Iki bandinių paruošimo ir biogeninių aminų tyrimo žuvis ir žuvies gaminiai buvo laikomi gamintojo rekomenduojamomis laikymo sąlygomis.
Histamino kiekiai buvo nustatyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Buvo pasverta 5g homogenizuoto žuvies ar žuvies gaminio. Biogeninis aminas histaminas išskirtas, ekstrahuojant 0,4 mol l-1 perchloro rūgštimi. Ekstrakto dalis 45 min. derivatizuota 40 ºC temperatūroje dansilchlorido tirpalu (5–dimethylaminonaphtalene–1–sulfonyl chloride). Atlikus derivatizaciją, atv÷sinus iki kambario temperatūros, dansilchlorido likutis pašalintas 25 proc. amoniaku. M÷giniai filtruoti per 0,45 µm membraninį filtrą, 20µl įšvirkšta į chromatografinę sistemą. Analizei naudota kolon÷l÷ LiChroCART® 125–4, užpildyta LiChrospher® 100 RP–18 e (5 µm), nešančioji faz÷ − eliuentai: B – acetonitrilas, A – amonio acetatas 0,1mol l-1. Analizuota 28 min, pirmąsias 19 min keičiant eliuento sud÷tį nuo 50 proc. B iki 90 proc. B (atitinkamai nuo 50 proc. A iki 10 proc. A), tada 1 min, paliekant eliuento sud÷tį pastovią – 90 proc. B (10 proc. A), v÷liau, kad būtų užtikrintas kitos analiz÷s medžiagų atskyrimas, 8 min kolon÷l÷ pildyta eliuentu, kurio sud÷tis − 50 proc. B ir 50 proc. A. Debitas visos analiz÷s metu nekito – 0,9 ml min
-1
, UV detekcija vyko esant 254 nm. Histaminas identifikuotas, lyginant nustatomo amino sulaikymo trukmę kolon÷l÷je su atitinkamos etalonin÷s medžiagos sulaikymo trukme. Kiekybin÷ analiz÷ atlikta pagal vidinio standarto metodą, skaičiuojant smail÷s plotą apibr÷žtam etalonin÷s medžiagos kiekiui.
Histamino vidutin÷ reikšm÷ apskaičiuota pagal du pakartojimus.
Analizuojant duomenis buvo naudota Microsoft Corporation Excell 2007 programa, apskaičiuota: vidurkiai (x), vidutiniai kvadratiniai nuokrypiai , skirtumų patikimumo lygmuo (p).
26
3. REZULTATAI
3.1 Žuvyje ir žuvies gaminiuose nustatyti histamino kiekiai
Tyrimui pasirinkti žuvys ir žuvies gaminiai, kur randama daug histidino. Žuvų ir žuvies produktų m÷giniai buvo tirti d÷l histamino kiekio. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose lašišų m÷giniuose pateikta 4 lentel÷je.
4 lentel÷. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose lašišų m÷giniuose
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis Atšaldyta 13 – 117 65,00 73,54 Atšaldyta Atlantin÷ 14 14,00 – Sušaldytos papilv÷s 122 122,00 – Silpnai sūdyta Atlantinių fil÷ 8 – 48 28,00 28,28 Marinuota fil÷ 5 2,50 –
Šaltai rūkyta fil÷ 5 – 240 44,82 82,61
Šaltai rūkyta Atlantinių
fil÷ 5 – 78 17,67 22,91
Atliktuose tyrimuose daugiausiai svyruoja histamino kiekis šaltai rūkytose lašišų m÷ginių 5 – 240 mg kg-1 ribose. 48 kartus histamino kiekis mažesnis marinuotų lašišų m÷giniuose lygint su šaltai rūkytų lašišų gaminiais ir vidutiniškai 23,4 kartus lyginant su atšaldytų lašišų gaminiais.
Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose silkių m÷giniuose pateikta 5 lentel÷je.
5 lentel÷. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose silkių m÷giniuose
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis
Šaldyta silkių fil÷ 6 – 158 34,42 48,86
Silkių fil÷ 8 – 124 66,00 82,02
Sūdyta silkių fil÷ aliejuje
6 – 60
12,50 18,72
Silpnai sūdyta silkių fil÷ aliejuje
6 – 177
27
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis Silpnai sūdyta Atlantin÷
silk÷
14 – 47
30,50 23,33
Silkių fil÷ aliejuje 8 – 121 59,75 44,75
Atlantinių silkių fil÷ aliejuje
5 – 68
36,50 44,55
Dūmo skonio silkių fil÷ aliejuje
10 – 142
65,33 68,54
Marinuota silkių fil÷ aliejuje 67 – 93 80,00 18,38 Marinuota, be odos garstyčių padaže 7 7,00 –
Vytintos silk÷s fil÷ 8 8,00 –
Iš atliktų tyrimų matome, kad silkių gaminiuose histamino kiekis svyruoja 6 – 177 mg kg-1 ribose. Lyginat tarpusavyje 5,3 kartus histamino kiekis mažesnis yra sūdytų silkių fil÷ aliejuje tarp silkių fil÷ ir 3,5 karto mažesnis lyginant su silpnai sūdytų silkių fil÷ aliejuje.
Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose silkių mišrainių m÷giniuose pateikta 6 lentel÷je.
6 lentel÷. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose silkių mišrainių m÷giniuose
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis Troškintomis daržov÷mis 12 – 124 68,00 79,20 Troškintomis daržov÷mis ir pupel÷mis 7 7,00 – Majonezo ir šampinjonų padaže 7 7,00 – Saul÷grąžomis, be odos 67 67,00 – Pomidorų padaže 108 108,00 – Burok÷liais ir majonezu 100 100,00 – Gabaliukai su morkomis 107 107,00 –
Nustatyta, kad silkių mišrainių gaminiuose histamino kiekis svyruoja 7 – 124 mg kg-1 ribose. 15,4 karto histamino kiekis mažesnis silkių fil÷ su troškintomis daržov÷mis ir pupel÷mis, ir silkių fil÷ majonezo ir šampinjonų padaže lyginant su silkių fil÷ pomidorų padaže ir vidutiniškai 9,7 karto mažesni histamino kiekiai lyginant silkių fil÷ su troškintomis daržov÷mis.
28 Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose skumbrių m÷giniuose pateikta 7 lentel÷je.
7 lentel÷. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose skumbrių m÷giniuose
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis Šaldyta 12 – 28 11,25 12,03 Šaldytos Atlantin÷s, b/g, išdarin÷tos 14 14,00 – Atlantin÷s skumbr÷s 6 6,00 – Skumbr÷ 8 8,00 – K. R. Atlantin÷s, b/g, išdarin÷tos 17 – 18 17,50 0,71 K.R b/g, išdarin÷tos 103 103,00 – Š.R. Atlantin÷s, b/g, išdarin÷tos 6 – 26 13,67 7,50 Š.R. b/g, išdarin÷tos 23 – 102 56,00 37,48
Tirtuose skumbrių gaminiuose nustatyta, kad histamino kiekis svyruoja 6 – 103 mg kg-1 ribose. 17,2 karto histamino kiekis mažesnis Atlantin÷je skumbr÷je lyginant su karštai rūkyta skumbr÷ be galvos išdarin÷ta ir vidutiniškai 9,3 karto mažesnis histamino kiekis lyginat su šaltai rūkyta skumbre be galvos išdarin÷ta.
Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose įvairių žuvų rūšių gaminiuose pateikta 8 lentel÷je.
8 lentel÷. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose įvairių žuvų rūšių gaminiuose
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis Sušaldytos, virtos
krevet÷s, lukštentos 8 – 9 8,50 0,71
Šaltai rūkyti paltuso
gabaliukai 5 – 25 13,75 15,91
Šaltai rūkyta riebžuv÷ 176 176,00 –
Konservai. Menkių
kepen÷l÷s savo sultyse 10 10,00 –
Strimelių fil÷ su
29 Nustatyta, kad įvairių žuvų rūšių gaminiuose histamino kiekis svyruoja 5 – 176 mg kg-1 ribose. 22 kartus histamino kiekis mažesnis strimelių fil÷ su aliejumi ir saldikliu lyginant su šaltai rūkyta riebžuve ir 1,7 karto histamino kiekis mažesnis lyginant su šaltai rūkytais paltuso gabaliukais.
Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose vytintuose įvairių žuvų rūšių gaminiuose pateikta 9 lentel÷je.
9 lentel÷. Histamino koncentracija mg kg-1 tirtuose vytintuose įvairių žuvų rūšių gaminiuose
Apdorojimo būdas Ribos mg kg-1 Vidutin÷ vert÷ Standartinis
nuokrypis
Vytinti karšiai 9 9 –
Vytintos plekšn÷s 63 63 –
Vytintos silk÷s file 8 8 –
Vytintos stintel÷s 7 7 –
Vytintos jūrų lydekos 62 62 –
Vytintos kuojos 2,5 2,5 –
Ištirtuose vytintų žuvų gaminiuose histamino koncentracija svyruoja 7 – 63 mg kg-1 ribose. 9 kartus histamino kiekis mažesnis vytintų stintelių lyginant su vytintomis plekšn÷mis. Vytintuose kuojose histamino kiekis nustatytas mažesnis, kaip 5 mg kg-1.
30
3.2 Histamino kiekio palyginimas tarp žuvų rūšių
Histamino kiekio palyginimas, ištyrus skirtingais technologiniais procesais apdorotas lašišas ir lašišos gaminius. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui lašišos m÷giniuose pateikta 2 pav.
65.00 14.00 122.00 28.00 2.50 43.91 17.67 0 50 100 150 200 Atšaldyta Atšaldyta Atlantin÷ Sušaldytos papilv÷s Silpnai sūdyta Atlantinių file
Marinuota file Šaltai rūkyta
file Šaltai rūkyta Atlantinių file H is ta m in o k ie k is , m g k g -1
2 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui lašišos m÷giniuose
Ištyrus lašišinių žuvų gaminių m÷ginius, pastebimas gana didelis sušaldytų lašišų papilvių 122 mg kg-1 histamino koncentracijos padid÷jimas.
Kadangi, riebalai kaupiasi įvairiose žuvies kūno dalyse, lašišinių žuvų pasiskirstę pilvo dalyje (Masteikien÷, 2007), tod÷l ir nustatome sušaldytose lašišų papilv÷se histamino koncentracijos padid÷jimą.
Taipogi, pastebimi ženklūs skirtumai tarp atšaldytos lašišos ir atšaldytos Atlantin÷s lašišos, tarp šaltai rūkytos lašišos ir šaltai rūkytos Atlantin÷s lašišos. Atlantin÷s lašišos gaminiuose nustatomas 4,6 karto mažesnis histamino koncentracija, nei lašišos gaminiuose.
Marinuotoje lašišų fil÷ nustatytas mažesnis, kaip 5 mg kg-1 histamino kiekis.
31 Silkin÷se žuvyse riebalai kaupiasi po oda. Pagal NaCl kiekį sūdytos žuvys skirstomos į silpnai sūdytas – nuo 3 iki 10 proc., vidutiniškai sūdytas - nuo10 iki 14 proc. ir stipriai sūdytas – daugiau kaip 14 proc. NaCl. Daugelis žuvieną ardančių mikroorganizmų sparčiai dauginasi tol, kol NaCl kiekis žuvyje dar nepasiek÷ 3 proc.. Sūdant prastos kokyb÷s žuvis aukštesn÷je temperatūroje, jos gali sugesti sparčiau, negu NaCl prasiskverbs į audinius (Masteikien÷, 2007). Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui silkių fil÷ m÷giniuose pateikta 3 pav.
33.37 66.00 11.54 43.13 30.50 59.75 36.50 65.33 80.00 8.00 0 50 100 150 200
Šaldyta file Silkių file Sūdyta file
aliejuje Silpnai s ūdyta file aliejuje Silpnai s ūdyta Atlantin÷ Silkių file aliejuje Atlantinių file aliejuje Dūmo s konio file aliejuje Marinuota file aliejuje Vytinta file H is ta m in o k ie k is , m g k g -1
3 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui silkių fil÷ m÷giniuose
Ištirtuose silkių gaminiuose didesni histamino kiekiai nustatyti marinuotoje silkių fil÷ ir silkių fil÷, atitinkamai 80 mg kg-1 ir 66 mg kg-1, o mažesni kiekiai nustatyti vytintoje silkių fil÷ ir sūdytoje silkių fil÷, atitinkamai 8 mg kg-1 ir 11,54 mg kg-1. Tirti gaminiai atitiko 100 mg kg-1 koncentracijos ribas.
32 Tyrimui pasirinktos įvairios mišrain÷s su silkių fil÷, nustatyti histamino kiekio svyravimus skirtinuose gaminiuose. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui silkių gaminių m÷giniuose pateikta 4 pav. 68.00 7.00 7.00 67.00 108.00 100.00 7.00 107.00 0 50 100 150 200 Troškintomis daržov÷mis Troškintomis daržov÷mis ir pupel÷mis Majonezo ir šampinjonų padaže Saul÷grąžomis Pomidorų padaže Burok÷liais ir majonezu Marinuota,be odos garstyčių padaže Gabaliukai su morkomis H is ta m in o k ie k is , m g k g -1
4 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui silkių gaminių m÷giniuose
Ištirtuose silkių gaminiuose, pastebimas ženklus histamino koncentracijos padid÷jimas su daržov÷mis t. y. silk÷s pomidorų padaže ir silkių gabaliukai su morkomis atitinkamai 108 mg kg-1 ir 107 mg kg-1, o mažesni kiekiai nustatyti silk÷ majonezo ir šampinjonų padaže ir marinuota silkių fil÷ be odos garstyčių padaže, atitinkamai 7 mg kg-1.
5-uose m÷giniuose nustatyti mažesni kiekiai, kaip 100 mg kg-1 ir 3–uose gaminiuose nustatyta 100 – 200 mg kg-1 ribose. Nebuvo gaminių viršijančių 200 mg kg-1 koncentraciją.
33 Tyrimui pasirinktos skirtingo apdorojimo skumbr÷s, nustatyti technologinio proceso įtaką histamino kiekiui skumbr÷s m÷giniuose 5 pav.
10.00
14.00
6.00
8.00
17.50
103.00
13.67
56.00
0 50 100 150 200 Šaldyta Šaldytos Atlantin÷s, b/g, iš darin÷tos Atlantin÷s s kum br÷s Skumbr÷ K. R. Atlantin÷s, b/g, išdarin÷tos K.R b/g, išdarin÷tos Š.R. Atlantin÷s, b/g, išdarin÷tos Š.R. b/g, išdarin÷tos H is ta m in o k ie k is, m g k g -15 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui skumbr÷s m÷giniuose
Tirtuose skumbr÷s gaminiuose didesni kiekiai nustatyti karštai rūkytoje skumbr÷je be galų išdarin÷toje ir šaltai rūkytoje skumbr÷je be galvų išdarin÷toje, atitinkamai 103 mg kg-1 ir 56 mg kg-1, o mažesni kiekiai nustatyti atlantin÷je skumbr÷je ir skumbr÷je, atitinkamai 6 mg kg-1 ir 8 mg kg-1.
7–uose tirtuose gaminiuose histamino koncentracija buvo mažesn÷, kaip 100 mg kg-1 ir vienas gaminyje histamino koncentracija siek÷ daugiau, kaip 100 mg kg-1, tačiau nesiek÷ 200 mg kg-1 koncentracijos.
Lyginat tarpusavyje technologinio proceso įtaką histamino kiekio susidarymui, daugiau kaip 4 kartus didesni histamino kiekiai nustatyti šaltai rūkytoje skumbr÷je be galvų išdarin÷tose, nei šaltai rūkytoje Atlantin÷je skumbr÷je be galvų išdarin÷tose.
Taipogi, karštai rūkytose skumbr÷se be galvų išdarin÷se 5,9 karto didesni histamino kiekiai, nei karštai rūkytose Atlantin÷se skumbr÷se be galvų išdarin÷tose.
34 Taigi, Atlantin÷se skumbr÷se, nepriklausomai nuo technologinio proceso įtakos, mažesn÷ histamino koncentracija.
Tyrimui pasirinktos vytintos skirtingų rūšių žuvys. Technologinio proceso įtaką histamino kiekiui vytintose žuvų m÷giniuose 6 pav.
9.00 63.00 8.00 7.00 62.00 2.50 0 50 100 150 200
Vytinti karšiai Vytintos plekšn÷s Vytintos silk÷s file Vytintos stintel÷s Vytintos jūrų lydekos Vytintos kuojos H is ta m in o k ie k is , m g k g -1
6 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui vytintose žuvų m÷giniuose
Tirtuose vytintuose žuvų gaminiuose, didesni histamino kiekiai nustatyti vytintuose plekšn÷se ir vytintuose jūrų lydekose, atitinkamai randami tokie kiekiai 63 mg kg-1 ir 62 mg kg-1, o mažesni kiekiai nustatyti vytinuose stintel÷se ir vytintoje silkių fil÷ 7 mg kg-1 ir 8 mg kg-1.
Vytinuose kuojose histamino kiekis nustatytas mažesnis, kaip 5 mg kg-1. Viename gaminyje histamino kiekis nustatytas mažesnis nei 5 mg kg-1, o kiti gaminiai atitinka 100 mg kg-1 nustatytas ribas.
35 Tyrimui pasirinkti įvairių žuvų rūšių gaminiai, įvertinti histamino kiekį technologinio proceso atžvilgiu. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui įvairiuose žuvų rūšių gaminiuose pateikta 7 pav. 8.50 12.50 176.00 10.00 8.00 0 50 100 150 200 Sušaldytos , virtos krevet÷s Š/R paltuso gabaliukai
Š/R riebžuv÷ Menkių kepen÷l÷s
savo sultys e
Strim ÷lių file su aliejum i ir s aldikliu H is ta m in o k ie k is , m g k g -1
7 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui įvairiuose žuvų rūšių gaminiuose
Tirtuose įvairių žuvų rūšių gaminiuose nustatyta, kad didžiausias kiekis rastas šaltai rūkytoje riebžuv÷je176 mg kg-1, o mažesni kiekiai pasiskirsto tolygiai, atitinkamai 8 mg kg-1, 8,5 mg kg-1, 10 mg kg-1 ir 12,5 mg kg-1.
36 Lyginama technologinio proceso įtaka histamino kiekiui įvairiose žuvų grupių m÷giniuose 8 pav.
36.17
38.46
59.89
25.85
43.07
28.7
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
H
is
ta
m
in
o
k
ie
k
is
m
g
k
g
-1Lašiša Silk÷ Silkių mišrain÷ Skumbr÷ Įvairios žuvų rūšių gaminiai
Vytinti žuvys
8 pav. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui įvairiose žuvų grupių m÷giniuose
Iš tirtų žuvų rūšių gaminių matome, kad didesni kiekiai nustatyti silkių mišrain÷se ir įvairių žuvų rūšių gaminiuose atitinkamai 59,89 mg kg-1 ir 43,07 mg kg-1, o mažesni kiekiai nustatyti skumbr÷se ir vytintuose žuvyse, atitinkamai 25,85 mg kg-1 ir 28,7 mg kg-1.
3.3 Histamino kiekio svyravimus žuvų gaminiuose sąlygojantys veiksniai
Histamino kiekių svyravimas žuvies gaminiuose priklauso nuo: • Pradin÷s žaliavos kokyb÷s, jos mikrobinio užterštumo;
• Žaliaų temperatūrinio r÷žimo laikymosi; • Įrenginių, įrangos sanitarin÷s būkl÷s; • Darbuotojų asmens higienos laikymosi;
37 • Pagamintų žuvies gaminių temperatūrinio r÷žimo laikymosi;
• Technologijų tam tikruose žuvų gaminiuose ir t.t.
Taipogi, silkių gaminiai su aliejumi, kuriuose nustatytas histamino kiekis 59,80 mg kg-1 didesnis lyginant su kitais gaminiais.
D÷l to, kad riebalus skaidančioms bakterijoms priklauso Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Serratia, Proteus ir Achromobacter gentys. Jos išskiria ne tik lipazes, bet ir kitus fermentus, skaidančius angliavandenius, baltymus, tod÷l aptinkamos daugelyje maisto produktų. Psichrotrofai (Pseudomonas, Achromobacter) gadina riebalų turinčius produktus, laikomus šaltai (Masteikien÷, 2007).
38
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Histamino formavimo M. psychrotolerans ir P phosphoreum negalima išvengti jūros g÷rybes vien šaldant 0 – 5 0C. Taigi, siekiant valdyti histamino susidarymą saugojimo laike ir pasiskirstyme, (saugus galiojimo laikas) turi būti apribotas, priklausomai nuo laikymo sąlygų, gaminio charakteristikos(Emborg, Dalgaard, 2008).
Taip pat, Du ir kt. (2002) autoriai aptiko tik 18 ppm histamino tune po 9 dienų laikymo 0 °C
temperatūroje, o 68.8 ppm ir 564 ppm histamino buvo aptikta, atitinkamai tuną laikant 4 °C ir 10 °C. Atlikusi tyrimus, nustačiau tokius pat histamino kiekio kitimus įvairiuose atv÷sintų žuvų produktų gaminiuose priklausomai nuo laikymo temperatūros. Histamino svyravimai žaliavoje ar gaminyje priklauso nuo laiko ir temperatūros, kurioje ji laikoma.
Histamino koncentracija buvo nustatoma šviežiuose ir perdirbtuose jūros g÷ryb÷se. Buvo tirta septyniolika šviežių ir perdirbtų skumbroidinių ir neskumbroidinių žuvų, ir jūros moliuskų, ir v÷žiagyvių. Histamino kiekis šviežiuose jūros g÷ryb÷se buvo mažas (0 – 9 ppm) išskyrus vieną m÷ginį snoek (skumbroidin÷ žuvis >50 ppm) ir vienas m÷ginys gelsvapelek÷s (neskumbroidin÷ žuvis >50 ppm). Abiejuose rūšyse yra daug laisvo histidino kiekio (1,5 – 5,3 ppb). Perdirbtuose jūros g÷ryb÷se maža histamino koncentracija (0 – 3 ppm) išskyrus žuvų miltus (76 ppm) ir sūdyta silk÷ (47 ppm). Eksperimentinis histamino formavimas parod÷ stiprią priklausomybę temperatūros ir laiko (Auerswald et al., 2006). Atlikusi tyrimus, nustačiau, kad šviežiuos jūros g÷ryb÷se histamino kiekis neatitinka, nustatomi kiekiai ženkliai svyruoja d÷l didesnio histamino kiekio šviežiuose jūros g÷ryb÷se. Taipogi, perdirbtuose jūros g÷ryb÷se histamino kiekis neatitinka autoriaus atliktiesms tyrimams, gauti rezultatai ženkliai svyruoja aukštame histamino lygį.
Šviežiuose jūros g÷ryb÷se histamino kiekis svyravo (11,5 – 66 mg kg-1) ribose, o jūros g÷rybių gaminiuose histaminas svyravo (13 – 56 mg kg-1) ribose pateikta 10 lentel÷je.
39 10 lentel÷. Technologinio proceso įtaka histamino kiekiui
Apdorojimo būdas mg kg-1
Atšaldyta lašiša 65,00
Šaldyta silk÷ 33,37
Silkių fil÷ 66,00
Šaldyta skumbr÷ 11,15
Silpnai sūdyta Atlantin÷ lašišų fil÷ 28,00
Silpnai sūdyta silkių fil÷ 30,50
Silpnai sūdyta silkių fil÷ aliejuje 43,13
Šalto rūkymo lašišų fil÷ 43,01
Šaltai rūkyta skumbr÷ 56,00
Šalti rūkyta Atlantin÷ lašiša 17,67
Šaltai rūkyta skumbr÷ 13,67
Lašišų žaliavoje histamino kiekiai nustatyti didesni, nei gaminiuose t.y. neatlantin÷se. O Atlantin÷se atvirkščiai, žaliavoje nustatyti mažesni kiekiai, nei gaminiuose.
Silkių žaliavoje ir gaminiuose nustatyti didesni kiekiai. Silk÷s ir silkių gaminiai saugos požiūriu, tur÷tų būti atidžiau kontroliuojami visi veiksniai įtakojantys histamino atsiradimą.
Skumbrių žaliavoje mažiau nustatyta histamino kiekio, nei gaminiuose. Tačiau lyginant Atlantines ir neatlantines, bei šaltus ir karštus apdorojimo būdus, tarpusavyje tolygiai pasiskirsto histamino kiekiai, bet pagal apdorojimo būdus skiriasi karšto rūkymo nuo šalto rūkymo 1,8 karto, t.y. karštai rūkytose nustatyti didesni kiekiai.
Literatūros šaltinių analiz÷ rodo, kad histamino susidarymą žuvyje ir žuvies gaminiuose gali įtakoti naudojamos žaliavos chemin÷ sud÷tis, bakterinis užterštumas, temperatūra, technologiniai parametrai, higieniniai faktoriai ir kt. Kadangi, yra daug faktorių įtakojančių histamino kiekio susidarymą žuvyje ir žuvies produktuose. Reikia kontroliuoti histamino susidarymą ir jį įtakojančius veiksnius.
40
IŠVADOS
1. Histamino nustatymui naudojama efektyvioji skysčių, plonasluoksn÷, dujų chromatografija, kulonometrinis tyrimas, fermentinis tyrimas ir kt., tyrimai.
2. Ištirta ir nustatyta, kad histamino kiekis žuvyse svyruoja plačiose ribose: lašišose histamino kiekis svyravo nuo 5 - 240 mg kg-1, o vidutin÷ vert÷ 36.17 mg kg-1, kuri buvo nežymiai mažesn÷ negu silk÷se, kai p≥0,05, silk÷se histamino kiekis svyravo nuo 5 - 177 mg kg-1, o vidutin÷ vert÷ 38.46 mg kg-1,
3. Lašišos yra pavojingesn÷s histamino kiekio atžvilgiu, histamino kiekis leistinas normas viršijo 16% tirtų lašišos m÷ginių. Tam tur÷jo įtakos sezoniškumas, po neršto pagautose žuvyse buvo žymiai daugiau histamino, negu rudens ir žiemos periodu. Taipogi, tur÷jo įtakos technologinio apdorojimo būdas, šviežiose žuvyse daugiau histamino, nei žuvies produktuose.
4. Žuvies gaminiuose histamino kiekis buvo nustatytas žymiai didesnis, negu žuvyse, kai p<0,05. Silkių gaminiuose histamino kiekis buvo didžiausias, svyravo nuo 7 – 124 mg kg-1, o vidutin÷ vert÷ 59.89 mg kg-1
5. Ištirtuose lietuviškuose žuvies gaminiuose histamino kiekis svyravo nuo 5 - 240 mg kg-1, o vidutin÷ vert÷ 36.97 mg kg-1 . Įvertinus gaminių saugą, nesaugiausi būtų silkių gaminiai, nes juose buvo nustatyti žymiai didesni histamino kiekiai negu kituose tirtuose gaminiuose, kai p<0,05.
