Veislinių bulių reprodukcijos organų veiklos įvertinimas Evaluation of the reproductive organs’ performance of breeding bulls

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Kamilė Liūnaitė

Veislinių bulių reprodukcijos organų veiklos įvertinimas

Evaluation of the reproductive organs’ performance of

breeding bulls

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: Prof.hab.dr. Henrikas Žilinskas

2

DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Veislinių bulių reprodukcijos organų veiklos įvertinimas“:

1. yra atliktas mano pačios.

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.

(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)

vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1. Patinų lytinės veiklos neurohumoralinė reguliacija, spermatogenezė ... 9

1.1.1. Bulių reproduktorių spermatogenezė ... 9

1.1.2. Hipotalamuso ir hipofizės poveikis į lytinį brendimą ... 11

1.2. Įvairių faktorių įtaka bulių reproduktorių spermos produkcijai ir kokybei ... 13

1.2.1. Reproduktorių amžiaus įtaka spermatogenezei ir reprodukcijai ... 13

1.2.2. Metų laiko ir temperatūros įtaka bulių reprodukcijai ... 13

1.2.3. Mitybos įtaka bulių reproduktorių spermatogenezei ir reprodukcijai ... 14

1.2.4. Pagrindinės sėklidžių ligos, įtakojančios vingiuotų kanalėlių pokyčius ... 17

1.2.5. Sėklidžių priedinės lytinės liaukos ir pagrindiniai sutrikimai ... 20

1.2.6. Atskirų veislių bulių sėklidžių dydis ir spermos produkcija ... 21

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 23

2.1. Sėklidžių matavimai ... 23

2.2. Histomorfologinis mėginių paruošimas ir tyrimas ... 24

2.2.1. Histologinių mėginių paruošimas ... 24

2.2.2. Sėklidžių vingiuotų kanalėlių morfometrinis tyrimas ... 24

2.3. Spermatozoidų tyrimai ... 25

2.3.1. Spermatozoidų koncentracijos tyrimas ... 25

2.3.2. Spermatozoidų judrumo nustatymas ... 25

2.3.3. Spermatozoidų morfologinis tyrimas ... 26

2.4. Statistinė duomenų analizė ... 27

3. TYRIMO REZULTATAI ... 28

3.1. Įvairių veislių bulių sėklidžių sėklinių kanalėlių morfometrijos tyrimai ... 28

3.2. Bulių sėklidžių išsivystymo duomenys ... 31

3.3. Spermos kokybės rodikliai ... 32

3.4. Pieninio ir mėsinio tipo reproduktorių įtaka spermos kokybei ... 34

4

3.6. Koreliaciniai ryšiai tarp vingiuotų kanalėlių histologinių požymių ... 35

3.7. Koreliaciniai ryšiai tarp histomorfologinių parametrų ir spermos patologijų ... 36

3.8. Bulių spermos kokybės rodikliai ... 38

5

VEISLINIŲ BULIŲ REPRODUKCIJOS ORGANŲ VEIKLOS ĮVERTINIMAS Kamilė Liūnaitė

Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Patologijos centre bei Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Tyrimo laikotarpis apima 2018 – 2019 metus. Magistro baigiamasis darbas apima 52 puslapius, jame pateikiama 20 paveikslų, 8 lentelės, 46 literatūros šaltiniai ir 3 priedai.

LSMU VA Patologijos centre buvo atliktas 12 bulių reproduktorių 24 sėklidžių histopatologinis tyrimas ir morfometriniai matavimai. Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje buvo atlikti spermos mėginių tyrimai ir jų vertinimas. Mikroskopiškai įvertinti bulių sėklidžių pakitimai bei atliktas sėklidžių morfometrinis tyrimas, kurio metu buvo apskaičiuoti 480 kanalėlių (pilnų ir nepilnų) matmenys: aukštis, plotis, plotas, spermatogeninio epitelio aukštis bei plotas ir Sertoli ląstelių skaičius. Taip pat atlikti sėklidžių matavimai: apimtis, ilgis, plotis, aukštis, svoris ir antsėklidžio svoris. Atliktas bulių kriokonservuotos ir spermos iš antsėklidžio morfologinis tyrimas.

Atliekant sėklidžių matmenų bei morfometrinius matavimus nustatyta, jog kairės ir dešinės sėklidės tirti rodikliai tarpusavyje nesiskyrė. Visi išmatuoti pilnų kanalėlių matmenys buvo didesni nei nepilnų kanalėlių. Atliekant spermos kokybės tyrimus tarpusavyje buvo lyginta kriokonservuota bei iš antsėklidžio uodegėlės paimta sperma. Vertintos spermatozoidų patologijos, tačiau jokio statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių spermos mėginių nenustatyta. Spermos morfologiniai pokyčiai buvo lyginti ir tarp pieninių bei mėsinių bulių ir nustatyta, jog mėsinių bulių spermoje buvo 78,8 proc. patologinių spermatozoidų, o pieninių - 59,9 proc. (p=0,028). Tarp jaunesnių ir vyresnių bulių buvo lyginamas spermatozoidų judrumas proc. ir nustatėme, jog jaunesnių bulių reproduktorių spermos judrumas buvo 72,9 proc., o vyresnių – 57 proc. (p=0,01). Bendras spermatozoidų galvučių bei uodegėlių skaičius proc. bei spermos koncentracija tarp šių dviejų amžiaus grupių statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Nustatyta nepilnų sėklidės kanalėlių ploto koreliacija su patologinių spermatozoidų galvučių skaičiumi kriokonservuotoje spermoje (r=0,768, p=0,004). Ištirti ruošiamos kriokoncervavimui spermos kokybės rodiklių vidurkiai ir palyginti tarp pieninių ir mėsinių bulių. Nustatyta, jog pieninių bulių spermatozoidų judrumas yra 79,40 proc., o mėsinių bulių - 85,46 proc. (p<0,001). Taip pat palyginta ir spermos koncentracija – pieninių bulių - 1.836,12 mlrd/ml, o mėsinių - 1.543,41 mlrd/ml (p<0,001). Įvertinome metų sezono įtaką spermatozoidų judrumui ir nustatėme, jog vasaros laikotarpiu spermatozoidų judrumas buvo mažesnis (76,3 proc.) ir statistiškai patikimai skyrėsi nuo kitų metų sezonų (p<0,001).

6

EVALUATION OF THE REPRODUCTIVE ORGANS PERFORMANCE OF BREEDING BULLS Kamilė Liūnaitė

Master‘s Thesis

SUMMARY

The research was performed at the Lithuanian University of Health Sciences, the Veterinary Academy, in the Centre of Pathology and the Animal Reproduction Laboratory. The research was conducted in 2018 - 2019. The master's thesis consists of 52 pages, contains of 20 illustrations, 8 tables, 46 literature sources and 3 annexes.

At LSMU VA Pathology Center we performed histopathological examination and morphometric measurements of 12 bulls - 24 testicles. In the Animal Reproduction Laboratory, tests and evaluations of sperm samples were performed. We made microscopic evaluation of bulls‘ testicular changes and testicular morphometry of 480 seminiferous tubules (full and incomplete). We evaluated their height, width, area, spermatogenic epithelial height, area and Sertoli cell count. Also we measured testicular volume, length, width, height, weight and epididymis weight. Morphological examination of frozen bulls‘ semen and semen from epididymis was performed.

Testicles‘ dimensions and morphometric measurements revealed no difference between left and right testicles (p>0,05). All measured dimensions of full seminiferous tubules were larger than those of incomplete tubules (p<0,05). We were comparing semen morphology abnormalities between cryoconservated semen and semen from epididymis tail, but no statistically significant difference was not found. Morphological changes in semen were also compared between dairy and beef bulls. The semen of beef bulls had 78.8% of pathological sperm cells and dairy bulls - 59.9% (p=0,028). Sperm motility in percent was compared between younger and older bulls. Sperm motility in younger bulls was found to be 72.9% and in older bulls - 57% (p=0,01). Total sperm cells‘ heads and tails pathologies and sperm concentration was not statistically significant between these two groups of age (p<0,05). We found a correlation between incomplete seminiferous tubular area and number of pathological sperm cells‘ heads in frozen semen (r=0.768, p=0.004). Average of semen for cryoconcervation was evaluated and compared between dairy and beef bulls. Dairy bulls‘ semen motility was 79.40% and beef bulls‘ - 85.46% (p <0.001). The sperm concentration in dairy bulls was also counted. It was 1.836,12 milliard/ml and in beef bulls‘ - 1.543,41 milliard/ml (p <0.001). We evaluated the influence of season of the year and established that during the summer sperm motility was lower (76.3%) and statistically reliable differed from other seasons (p <0.001).

7

SANTRUMPOS

JAV – Jungintės Amerikos Valstijos

GnRH – (angl. gonadotropin - releasing hormon) gonadotropinus atpalaiduojantis faktorius LH –liuteinizuojantis hormonas

FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas LH-R – liuteinizuojančio hormono receptorius

8

ĮVADAS

Veislininkystės įmonėse labai didelis dėmesys skiriamas buliams-reproduktoriams. Telyčioms ir karvėms apvaisinti dažniausiai naudojama šiaudeliuose kriokonservuota sperma, tad norint pasiekti geriausių apvaisinimo rezultatų spermos kokybė turi būti itin gera. Iš sveikų bulių reproduktorių sperma imama tam tikru režimu, tad kiekvieną paimtą spermos dozę svarbu įdėmiai vizualiai įvertinti ir ištirti laboratorijoje [1].

Karvėms sėklini naudojama sperma privalo būti ne tik geros kokybės, bet ir aukštos genetinės vertės. Svarbu ištirti, ar sperma atitinka kokybės reikalavimus, ar nėra užkrėsta patogeniniais mikroorganizmais, bei gerai įvertinti ir būsimą apvaisinimo galią. Spermos kokybei bei spermatogenezei įtakos turi daug įvairiausių veiksnių, kurie veikia tiesiogiai arba netiesiogiai. Pagrindiniai veiksniai yra aplinka, stresas, amžius, temperatūros pokyčiai, įvairūs toksinai, infekcijos, genetika, šėrimas nekokybiškais ir nevisaverčiais pašarais, endokrininės sistemos sutrikimai ir kt. Visi šie veiksniai gali sukelti sėklidžių ar priedinių lytinių liaukų ligas ir turi įtakos ne tik spermos kiekybiniams ir kokybiniams rodikliams, bet ir apvaisinimo rezultatams [2].

Norint išlaikyti geras genetines savybes, labai svarbu parinkti tinkamus bulius-reproduktorius, kad palikuonims nebūtų perduotos ligos ar įvairūs sutrikimai. Kartais pakitimai sėklidėse pasireiškia be jokių klinikinių simptomų, tad svarbu dažnai tikrinti bulių sveikatingumą, atlikti klinikines apžiūras, tikrinti spermos kokybę – judrumą, koncentraciją, galvučių ir uodegėlių patologijų skaičių bei nustatyti spermatozoidų gyvybingumą. Norint veisimui išsaugoti bulių reproduktorių svarbu kuo anksčiau pradėti tinkamą gydymą iškart pastebėjus pokyčius ar klinikinius požymius. Nesėkmingas karvių apvaisinimas taip pat yra vienas iš svarbiausių rodiklių, nukreipiančių į bulių reprodukcinių organų išsamią analizę. Tad labai svarbu nuolatinė reproduktorių patikra ir sveikatingumas, kad būtų pasiekti geriausi rezultatai veislininkystėje [3].

Darbo tikslas: Įvertinti veislinių bulių reprodukcinius organus ir jų veiklos dinaminius pokyčius. Darbo uždaviniai:

1. Ištirti ir palyginti įvairių veislių bulių reproduktorių spermos parametrus ir sėklidžių sėklinių kanalėlių histomorfologinius pokyčius po jų paskerdimo.

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Patinų lytinės veiklos neurohumoralinė reguliacija,

spermatogenezė

1.1.1. Bulių reproduktorių spermatogenezė

Sėklidė atlieka dvi pagrindines funkcijas – egzokrininę ir endokrininę. Egzokrininė funkcija atsakinga už diferencijuotų gametų – spermatozoidų – gamybą, kurie vėliau per sėklinius kanalėlius patenka į antsėklidį ir jame būna tam tikrą laiką. Endokrininė funkcija vykdoma Leidigo ląstelėse, kurios yra intersticiniame sėklidės audinyje, už kanalėlių ribų. Pagrindinis šių ląstelių vaidmuo – testosterono gamyba.Sėklidėse vyksta spermatogenezė – ilgas ir organizuotas procesas, kurio metu lytinės ląstelės dauginasi ir diferencijuojasi. Visa tai lemia vyriškų lytinių gametų gamybą. Spermatogenezė gali būti suskirstyta į tris dalis: spermatocitogenezė (mitozė), mejozė ir spermiogenezė [4].

Spermatocitogenezės metu kamieninės lytinės ląstelės pirmą kartą dalijasi mitozės būdu, ko pasekoje gaunama spermatogonija. Pastarosios dauginasi savo ruožtu atlikdamos kelis iš eilės vykstančius mitozinius dalijimusis, dėl kurių susidaro spermatocitai. Šie prieš leptoteninę stadiją kerta kraujo ir sėklidžių barjerą ir įsitraukia į mejozės profazę. Pirmosios mejozės profazės metu lytinės ląstelės diferencijuojasi į skirtingas stadijas (leptotena, zigotena, pachitena, diplotena) prieš pereidamos į antrąjį mejozės dalijimąsi [5]. Pirmasis mejozinis dalijimasis yra redukcinis (chromosomų skaičiaus sumažinimas, homologinių chromosomų atskyrimas), o antrasis mejozinis dalijimasis yra lygiavertis (atskyrimas iš dukterinių chromatidžių). Todėl mejozė leidžia gaminti apvalius haploidinius spermatozoidus. Spermiogenezė susideda iš apvalių spermatidų diferenciacijos į spermatidus esant įvairiems elongacijos laipsniams ir galiausiai – į spermatozoidus. Šie, pasibaigus spermiogenezei, į sėklinių kanalėlių spindį išskiriami paskutinės stadijos – spermacijos metu. Spermatogenezės metu įvyksta lytinių ląstelių degeneracija, bet dažniau tai stebima spermatocitogenezės ir mejozės metu, o tai gali skirtis priklausomai nuo lytinio brendimo periodo, amžiaus ir rūšies [5,6].

Bulių spermatogeninio epitelio vystymosi ciklas trunka apie 13,5 dienų. Visas spermatogenezės ciklas trunka 61 dieną, o tai yra 4,5 karto ilgesnis procesas nei spermatogeninio epitelio vystymosi ciklas. Spermatogenezės ciklas gali būti suskirstytas į 3 dalis: mitozinis dalijimasis (spermatocitogenezė), mejozė ir „citodiferenciacija“ (angl. Cytodifferentiation) (spermiogenezė), kurių trukmės atitinkamai yra 21, 23 ir 17 dienų [4].

Yra 8 spermatogeninės stadijos:

10

II stadijai būdinga A spermatogonija, pirminiai zigoteniniai spermatocitai, pirminiai pachiteniniai spermatocitai ir Sb2 spermatidai.

III stadijai būdingos dvi A kartos spermatogonijos, pirminiai zigoteniniai spermatocitai, pirminiai diploteniniai spermatocitai (kai kuriuos dar galima pamatyti IV stadijoje) ir Sc spermatidai.

IV stadijai būdinga A spermatogonija, tarpinė spermatogonija, pirminiai zigoteniniai spermatocitai (kai kuriuos dar galima pamatyti V stadijoje), antriniai spermatocitai ir Sc spermatidai.

V stadijai būdinga A spermatogonija, tarpinė spermatogonija, pirminiai pachiteniniai spermatocitai ir dvi spermatidų kartos (Sa ir Sd1).

VI stadijai būdinga A spermatogonija, tarpinė spermatogonija (kai kurios tarpinės spermatogonijos vis dar gali būti stebimos VII stadijoje), pirminiai pachiteniniai spermatocitai ir dvi spermatidų kartos (Sa ir Sd1).

VII stadijai būdinga A spermatogonija, B spermatogonija, pirminiai pachiteniniai spermatocitai ir dvi spermatidų kartos (Sa ir Sd2).

VIII stadijai būdinga A spermatogonija, dvi B spermatogonijų kartos (B1 ir B2), pirminiai pachiteniniai spermatocitai ir dvi spermatidų kartos (Sa ir Sb2 prieš pat spermaciją) [4].

1 pav. 8 spermatogeninės stadijos (I-VIII). A - A spermatogonija; In – tarpinė spermatogonija; B

- B spermatogonija; L- leptoteninis pirminis spermatocitas; Z - zigoteninis pirminis spermatocitas; P - pachiteninis pirminis spermatocitas; D - diploteninis pirminis spermatocitas;

11

Sertoli ląstelės užtikrina degeneracinių lytinių ląstelių ir liekamųjų kūnų fagocitozę bei subrendusių spermatozoidų patekimą į sėklinių kanalėlių spindį. Sertoli ląstelės, kontroliuojamos FSH ir androgenų, sintetina daugybę baltymų, kurie išskiriami link sėklinių kanalėlių spindžio, lytinių ląstelių ir intersticiumo. Minint tik pagrindinius – inhibiną ir aktyviną, – šie baltymai vaidina svarbų vaidmenį pagumburio–hipofizės (posmegeninės liaukos) sąveikoje išskirdami gonadotropinus, taip pat dalyvauja sėklidžių Leidigo ląstelių funkcijoje. Veikiant FSH ir androgenams, atpalaiduojamas androgenus jungiantis baltymas, kuris svarbus biologiniam androgenų prieinamumui, spermatogenezės reguliavimui ir spermos gamybai [4]. Transferinas – tai glikoproteinas, kuris nuneša geležį reikalingoms ląstelėms, jo koncentracija spermos plazmoje yra tiesiogiai susijusi su spermatozoidų gamyba ir vaisingumu [7]. Daugelis augimo faktorių, tokių kaip sėklinių kanalėlių augimo faktorius, kuris daro įtaką spermatogonijų ląstelių proliferacijai, nervo augimo faktorius vaidina svarbų vaidmenį preleptoteno spermatocitų DNR sintezės fazėje, ir į insuliną panašus augimo faktorius (IGF-1), kuris veikia lytinių ląstelių diferenciaciją [4].

Sertoli ląstelės kartu su lytinėmis ląstelėmis geba stimuliuoti RNR ir DNR sintezę. Po didžiulio proliferacijos etapo vaisiaus gyvenimo metu Sertoli ląstelės palaipsniui praranda gebėjimą dalintis. Bulių organizme po 6 gyvenimo mėnesių nėra tolesnio Sertoli ląstelių dalijimosi, tačiau Holšteino veislės bulių Sertoli ląstelių skaičius maksimumą pasiekia tik apie 28-ąją jų gyvenimo savaitę. Taigi, gaminamų spermatozoidų kiekis tiesiogiai koreliuoja su Sertoli ląstelių skaičiumi, kuris jau yra fiksuotas prieš brendimo laikotarpį [4]. Nesant galimybės pagerinti spermatogenezės efektyvumą po buliaus subrendimo, galima paspartinti brendimo pradžią Holšteinų veislės bulius pirmuosius 6 jų gyvenimo mėnesius maitinant geros kokybės pašarais ir tokiu būdu optimizuoti parduodamos spermos dozes [8], ir Holšteino fryzų veislės bulių [9] nedarant įtakos spermos kokybei [10]. Sertoli ląstelių skaičius yra svarbus norint nustatyti kasdienę spermatozoidų gamybą bulių ir kitų rūšių organizme [4].

1.1.2. Hipotalamuso ir hipofizės poveikis į lytinį brendimą

Visus su reprodukcija susijusius procesus patinų organizme daugiausiai reguliuoja hormonai. Hormonas yra specifinė cheminė medžiaga, kurią gamina specializuota liauka, vadinama endokrinine. Jos išskiriami hormonai patenka į kraują bei limfą ir yra gabenami į įvairias kūno sritis, kuriose jie daro tam tikrą specifinį poveikį. Sėklidė veikia kaip endokrininė liauka dėl vyriškojo hormono testosterono gamybos [3,7].

12

libido ir elgesys poravimosi metu; 4) svarbus normaliai spermos gamybai ir spermatozoidų vystymuisi [11].

Sėklidės taip pat yra veikiamos hormonų, kuriuos gamina kitos organizme esančios liaukos. Pagrindiniai sėklidę reguliuojantys hormonai yra: gonadotropiniai hormonai, kuriuos gamina priekinė hipofizės skiltis. Hipofizė yra maža liauka, esanti po didžiaisiais galvos smegenų pusrutuliais, ties kaukolės pagrindu. Hipofizės hormonai, reguliuojantys ir patinų, ir patelių reprodukciją (stimuliuodami sėklides ar kiaušides), yra vadinami gonadotropiniais hormonais. Ne tik sėklidės gaminamų hormonų išskyrimas reguliuojamas priekinės hipofizės dalies išskirtais hormonais, bet ir atvirkščiai. Testosterono lygis kraujyje reguliuoja gonadotropinių hormonų sekreciją naudojant grįžtamojo ryšio mechanizmą [11].

Normalus grįžtamojo ryšio mechanizmo veikimas priklauso nuo atitinkamo hormonų balanso, tad jų turėtų būti nei per mažai, nei per daug. Esant hormonų disbalansui, gali būti taikoma terapija. Tačiau ji neturėtų būti atliekama reguliariai, kai nėra vieno ar kito hormono trūkumo [11].

Endokrininę spermatogenezės sistemą reguliuoja neuroendokrininė reguliacija per pagumburio–hipofizės–sėklidės sąveiką. Pagrindinis hipotalaminis signalas į hipofizę yra dekapeptidas – gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas (GnRH), kuris išskiriamas stiprių pikų būdu ir veikia per transmembraninius GnRH receptorius. Savo ruožtu du svarbūs endokrininės sistemos siunčiami signalai keliauja į sėklidę. Šie signalai kilę iš hipofizės gonadotropų, kurie turi GnRH receptorius, yra skirtingi heterodimeriniai glikoproteinų hormonai FSH ir LH. Paprastai 70– 90% gonadotropų išskiria ir bendruosius a, ir specifinius b gonadotropinų subvienetus, o LH ir FSH gali būti randami tos pačios sekrecijos granulėse, kurios egzocitozės būdu gonadotropinus išskiria į periferinę kraujotaką. Gonadotropinai išsiskiria pulsuojančiai, reaguodami į GnRH. Santykinai pulsuojantis LH išsiskyrimas yra tvirtas ir panašus į GnRH, tuo tarpu pulsuojantis FSH išskyrimas yra gana vangus [12,13].

Sėklidės lygyje du gonadotropinai, FSH ir LH, veikia atitinkamai per specifinius transmembraninius receptorius – FSH-R ir LH-R. FSH-R yra išskiriamas į Sertoli ląsteles per sėklinius kanalėlius, o tuo tarpu LH-R yra išskiriamas į intersticiume esančias Leidigo ląsteles. Tiek FSH (tiesiogiai), tiek LH (netiesiogiai per testosterono-androgeno receptorius) daro įtaką spermatogenezei daugiausia per Sertoli ląstelių reguliaciją [13].

13

Gonadotropinų vaidmuo brendimo metu: pirmiausia jie atsakingi už Sertoli, Leidigo ir kamieninių lytinių ląstelių formavimąsi ir jų funkcijas, kurios lemia normalią spermatogenezę ir spermos gamybą. Todėl hormonų netekimas šioje gyvenimo fazėje natūraliai paveiks normalų sėklidžių kapšelio nusileidimą ir sėklidžių vystymąsi, o suaugusiesiems hormonų trūkumas iš esmės veikia lytinių ląstelių struktūrą, ypač dėl funkcinių sutrikimų Sertoli ląstelėse.

Sudėtingi veiksmai per pagumburio–hipofizės–sėklidės sąveiką parodo, jog šie kompleksiniai procesai, palaikantys normalią spermatogenezę, yra linkę į sutrikimus dėl toksinio poveikio ne tik tiesiogiai sėklidės lygyje, bet ir per netiesioginius kelius – per pagumburio–hipofizės–sėklidės ašį [13].

1.2. Įvairių faktorių įtaka bulių reproduktorių spermos produkcijai

ir kokybei

1.2.1. Reproduktorių amžiaus įtaka spermatogenezei ir reprodukcijai Bulių amžiaus įtaka vaisingumui menkai aprašyta mokslinėje literatūroje. Taip yra todėl, nes dirbtinio apvaisinimo centruose vyresni buliai yra pakeičiami jaunesniais prieš dar pajuntant realų jų vaisingumo sumažėjimą ir tikrą sėklidžių degeneraciją, kuri daro įtaką spermos kokybei.Wolf et al. (1965 m.) brendimo laikotarpį apibrėžė kaip amžių, kuriame pirmasis gautas ejakuliatas yra sudarytas iš ne mažiau kaip 50 milijonų spermatozoidų ir jų judrumas yra ne mažesnis kaip 10 proc. Šis apibrėžimas tebegalioja ir šiandien; brendimas pasiekiamas vidutiniškai apie 42-ąją gyvenimo savaitę, tačiau šis amžius gali svyruoti nuo 38-osios iki 46-osios savaitės, priklausomai nuo veislės, nes jų spermos kokybė gerėja iki visiško subrendimo, tada bulius gali pagaminti pakankamai spermatozoidų dviem tinkamiems ejakuliatams per dieną. Sperma paprastai imama tris kartus per savaitę, nes tai dažniausiai yra tinkamas santykis tarp pagaminamos spermos kiekio ir kokybės. Didėjant reproduktoriaus amžiui, spermos gamyba linkusi mažėti, tačiau mokslinėje literatūroje aprašoma, jog kai kurie buliai išlieka vaisingi net iki 19 metų amžiaus [4].

Dėl sumažėjusio vyresnio amžiaus bulių vaisingumo galima kelti keletą hipotezių. Lytinių ląstelių degeneracija mejozės profazėje yra ląstelių su chromosomų anomalijomis naikinimo būdas. Lytinių ląstelių degeneracija taip pat gali vykti dėl Sertoli ląstelių, nes A spermatogonijų skaičius tiesiogiai koreliuoja su Sertoli ląstelių skaičiumi. Su amžiumi susijęs spermatogeninio epitelio potencialo mažėjimas gali būti paaiškinamas Sertoli ląstelių skaičiaus sumažėjimu [4].

1.2.2. Metų laiko ir temperatūros įtaka bulių reprodukcijai

14

kad prijaukinimo procesas jį prislopino. Kai kurių veislių karvių, tokių kaip Holšteino fryzų, vasaros metu sumažėjęs vaisingumas yra plačiai aprašytas [15]. Pastaraisiais metais išsiaiškinta, jog metų laikai, ypač vasara, įtakos turi ne tik karvių vaisingumui, bet ir bulių spermos kokybei bei jos tinkamumui po kriokonservavimo. Ypač vasaros metu užšaldyta bulių sperma yra prastesnės kokybės, mažesnis spermatozoidų judrumas, didesnis spermatozoidų, turinčių pažeistą akrosomą ir lipidų suardymą spermatozoidų membranų sudėtyje, procentas [16–18]. Tai iškėlė hipotezę, kad molekuliniai mechanizmai, grindžiantys prastą spermos kokybę šiltuoju metų laiku, gali būti susiję su sumažėjusia jonų koncentracija spermos plazmoje [17]. Vis dėlto tikslūs molekuliniai mechanizmai, atsakingi už sezoniškumo kintamumą, ypač – dėl proteominių pokyčių, dar nėra iki galo išaiškinti [19].

Vieno atlikto tyrimo metu stebimas aiškus metų laiko reikšmingumas spermos judrumui (P=0,02). Didžiausias spermos judrumo procentas buvo užregistruotas žiemą ir rudenį, mažiausias – pavasarį ir vasarą. Reikšmingų pokyčių dėl sezono pasikeitimo poveikio spermos gyvybingumui nebuvo (P=0,13).Metų laiko poveikis buvo reikšmingas negyvų spermos ląstelių procentinei daliai (P=0,03). Didžiausias negyvų spermos ląstelių procentas buvo užfiksuotas vasarą. Jokio reikšmingo metų laiko poveikio spermos oksidacijai nebuvo užfiksuota (P=0,09) [19].

Žemiausia spermos kokybė, kurią rodo mažas spermatozoidų judrumas ir didelis negyvų spermatozoidų procentas, buvo užfiksuotas vasarą ir pavasarį. Aukščiausia spermos kokybė buvo užfiksuota žiemą ir rudenį. Sezoniniai proteomo pokyčiai spermos centrifūgate apėmė 10 baltymų. Aštuoni iš tų baltymų parodė didžiausią pagausėjimą tarp žiemos ir vasaros [19].

1.2.3. Mitybos įtaka bulių reproduktorių spermatogenezei ir reprodukcijai Atsiradus dirbtiniam karvių apvaisinimui, vaisingų bulių, turinčių geros kokybės spermą, poreikis tapo daug svarbesnis. Bulių vaisingumas priklauso nuo įvairių veiksnių, tokių kaip genetika, aplinka, sezonas ir mityba. Mityba vaidina svarbų vaidmenį didinant bulių vaisingumą. Subalansuota buliukų mityba prieš nujunkymą ir po nujunkymo daro didelę įtaką sėklidžių steroidogenezei ir gonadotropinus išskiriantiems hormonams, kurie galiausiai lemia bulių vaisingumą. Svarbu išsiaiškinti skirtingų bulių mitybos poreikio lygį įvairiais augimo etapais ir jo poveikį augimui, lytiniam brendimui ir vaisingumui [20].

15

veiksnių, tokių kaip genetika, epigenetika, aplinka ir epistazė [21]. Bulių vaisingumui įtakos turi ne tik genetinė prigimtis, bet ir mityba, bandos valdymas, aplinka, tokia kaip klimatas, stresas, tarša ir elgesys, pavyzdžiui, patirtis ir temperamentas [20,22].

Bulių reprodukcinės savybės (spermos kokybė, lytinis potraukis ir kiti) taip pat tiesiogiai priklauso nuo kūno sudėjimo, fizinių savybių, raumeningumo ir bendros sveikatos. Fizinis buliaus pasirengimas priklauso nuo šėrimo savybių ir tinkamo svorio pasiekimo tam tikrai veislei. Taigi, bulių spermos kiekis ir kokybė labai priklauso nuo gaunamų pašarų maistinės vertės [23]. Be to, dėl nepakankamos ir netinkamos mitybos ar mitybos pusiausvyros sutrikimo sumažėja androgenų sekrecija ir suaugusių gyvūnų spermos kokybė tampa prasta. Subalansuota buliukų mityba prieš nujunkymą ir po nujunkymo daro didelę įtaką sėklidžių steroidų gamybai, dėl to sustiprėja Leidigo ląstelių funkcija. Be to, bulių vaisingumas yra sudėtingas, įvairus ir jautrus procesas, todėl nėra patikimų vaisingumo žymenų, kurie galėtų numatyti spermos kokybę ir bulių vaisingumą ankstyvame bulių gyvenimo amžiuje, kad būtų galima sumažinti auginimo išlaidas. Norint pasiekti gerų rezultatų auginant galvijus, svarbu išsiaiškinti apie energijos, baltymų, mineralų ir vitaminų daromą įtaką bulių brendimui, spermos kokybei ir vaisingumui [20].

Energijos kiekis ir baltymai parašuose

Pagerinus buliukų mitybos planą per pirmuosius 6 gyvenimo mėnesius, padidėja gonadotropino sekrecija ir sėklidžių vystymasis, todėl anksčiau prasideda brendimas. Naujausi tyrimai rodo, kad tai vyksta per medžiagų apykaitos produktus ir hormonus, kurie tarpininkaujant specializuotiems neuropeptidams įtakoja neuroendokrininius centrus smegenyse. Dėl to sustiprėja gonadotropinų sintezė ir sekrecija, o visa tai savo ruožtu kontroliuoja sėklidžių vystymąsi ir funkcionavimą [24].

16

sekrecija, stebimas didesnis sėklidžių ląstelių dauginimasis ir geros kokybės spermos gamyba subrendusiems buliams [27]. Taip pat rašoma apie didesnį spermatozoidų progresyvųjį judrumą, padidėjusį spermos kiekį ir spermos koncentraciją. IGF-I reguliuoja Leidigo ląstelių skaičių ir funkciją, tuo tarpu LH yra susijęs su sėklidžių ląstelių dauginimusi ir sustiprinta jų funkcija. Auginant bulius svarbu, kad būtų gaunama daug energijos ir mažai stambiųjų pašarų, tačiau per didelis energijos kiekis gali inicijuoti riebalų atsidėjimą kapšelyje, o šie gali trukdyti normaliai spermos gamybai, nes riebalų perteklius sutrikdo kraujo temperatūros sumažėjimą, kuris svarbus spermatogenezei, nes aukšta temperatūra šiam procesui yra nepalanki [20].

Polinesočiosios riebalų rūgštys pašaruose

Kaip ir visos žinduolių ląstelės, sperma turi plazminę membraną, kurią sudaro dvigubas fosfolipidų sluoksnis ir kurioje yra didelis kiekis polinesočiųjų riebalų rūgščių. Lipidai, esantys spermoje ir jos plazmoje dalyvauja ne tik spermos energijos metabolizme, bet ir daugelyje funkcijų, kurios lemia apvaisinimą. Visų naminių gyvūnų rūšių spermoje yra daug polinesočiųjų riebalų rūgščių, tačiau lipidų prigimtinė sudėtis priklauso nuo gyvūno rūšies. Žinduolių spermos riebalų rūgščių sudėtis pasižymi labai dideliu omega-3 polinesočiųjų riebalų rūgščių, ypač dokozaheksaeno rūgšties kiekiu [28]. Polinesočiosios riebalų rūgštys dalyvauja spematozoido kapacitacijos procese, kurio metu vyksta fiziniai ir cheminiai pokyčiai spermatozoido galvutėje. Taip pat, jos suteikia spermos membranai nestabilumo, skystą būseną, kad ji galėtų dalyvauti membranų susiliejimo metu vykstant apvaisinimui [29]. Įrodyta, kad polinesočiųjų riebalų rūgščių papildai keičia avinų ir bulių [30,31] spermos riebalų rūgščių profilį ir spermos kokybę. Sperma yra labai jautri lipidų peroksidacijai, nes jos plazmos membranoje gausu polinesočiųjų riebalų rūgščių, ypač ilgos grandinės dokozaheksaeno ir dokozapentaeno rūgščių. Šių polinesočiųjų riebalų rūgščių koncentracija mažėja buliams senstant. Polinesočiųjų riebalų rūgščių poveikio įvairumas skirtingų žinduolių spermos savybėms yra stebėtinai didelis [28]. Atrajotojams polinesočiosios riebalų rūgštys gali būti veiksmingos tik tada, kai jos yra apsaugotoje nuo prieskrandžio formoje arba gaunamos labai dideliais kiekiais [20].

Vitaminas A pašaruose

17

Vitaminas E pašaruose

Vitamino E poveikis tiesiogiai ar netiesiogiai pasireiškia sėklidės viduje vykstančiuose procesuose, kurie reguliuoja lytinių ląstelių vystymosi stadijas. Velasquez-Pereira ir kt. aprašė, kad bulių, šeriamų 14 mg laisvu gosipoliu 1 kg kūno svoriui, normalioji spermatozoidų procentinė dalis buvo mažesnė (P <0,05), nei tų, kurie gosipolio gavo kartu su vitaminu E. Bulių, gaunančių gosipolį, seksualinis aktyvumas sumažėjo (P> 0,05), nei bulių, kuriems buvo paskirtas kitoks gydymas. Galima daryti išvadą, kad vitaminas E yra veiksmingas mažinant gosipolio toksiškumą buliams. Hong ir kt. teigė, kad vitamino E papildai padidina vitamino E koncentraciją serume ir sėklidėse, o tai padidina sėklidžių audinio gebėjimą kovoti su oksidaciniu stresu. Erdinç ir kt. pasiūlė, kad raciono papildymas vitaminu E galėtų pagerinti bandos vaisingumą [20,32].

Veislinių bulių vaisingumas yra pagrindinis tvarios galvijų auginimo ir vystymosi programų veiksnys. Be bendrojo bandos valdymo, šėrimas yra pagrindinis tinkamo buliaus auginimo veiksnys. Svarbūs bulių šėrimo etapai yra maitinimas prieš ir po nujunkymo, prieš veisimosi sezoną, veisimosi sezono metu ir laikotarpis po jo. Šių fazių metu optimali šėrimo programa ir mitybos planas yra svarbūs ne tik norint palaikyti bulių fizinę būklę, bet ir daryti įtaką gonadotropinų sekrecijai bei atitinkamam bulių lytiniam vystymuisi. Norint maksimaliai padidinti buliaus vaisingumą, ypač svarbus yra tinkamas energijos, baltymų, mineralų ir vitaminų lygis pašaruose skirtingais augimo ir vaisingumo etapais [20].

1.2.4. Pagrindinės sėklidžių ligos, įtakojančios vingiuotų kanalėlių pokyčius Sėklidės yra vienas iš pagrindinių reprodukcijos organų, tačiau neretai pasitaiko įvairios ligos, kurios pažeidžia vingiuotųjų sėklinių kanalėlių struktūrą ir pažeidžia spermatogenę. Dėl šių pakitimų sutrinka spermos gamyba, todėl labai svarbu laiku aptikti ir pažinti pagrindines sėklidžių ligas [2].

Orchitas

Orchitas prasideda nuo lengvos sėklidžių infekcijos, kurios beveik neįmanoma atskirti nuo sėklidžių degeneracijos, iki pūlingo ar nekrozinio organo audinio sunaikinimo. Orchitas gali atsirasti dėl pirminės infekcijos arba hematogeniniu keliu. Buliams orchitą gali sukelti Brucella abortus, o granulomatozinis orchitas dažnai stebimas dėl tuberkuliozės. Tačiau dauguma orchito atvejų yra arba dėl nespecifinės bakterijos ar mikoplazmos, arba yra ypač piogeninė infekcija, būdinga tik tai gyvūnų rūšiai, pavyzdžiui, Trueperella pyogenes galvijams [2,14].

18

Sėklidė dažnai būna labai skausminga, todėl gyvūnas neleidžia jos palpuoti. Skausmas gali būti pakankamai stiprus, tad neretai pasikeičia eisena ir gali atsirasti sisteminė pireksija. Lokalizuotas uždegimas paprastai sukelia nuo temperatūros priklausomą degeneraciją nepažeistoje sėklidėje. Jei liga progresuoja į lėtinę fazę, sėklidė susitraukia, tampa fibrozinė ir prikibusi prie kapšelio. Jei sėklidėje yra abscesai, jie gali prasiskverbti net pro kapšelio odą ir atsiverti į išorę. Sudėtingesniais atvejais gali būti dideli, kartu suaugę abscesai, užimantys didžiąją sėklidės parenchimos dalį arba ji gali būti nekrozinė, o tokiu atveju dauguma sėklinių kanalėlių būna sunaikinti [33].

Orchitas visada sukelia didelį sėklidės audinio nykimą, tad medikamentinis gydymas gali būti veiksmingas tik, kai liga dar yra pradinės stadijos. Gydymas trunka mažiausiai 10 dienų vartojant plataus veikimo spektro antibiotikus (ypač makrolidus), nesteroidinius vaistus nuo uždegimo ir taikant šaldymą. Pažeistos sėklidės su akivaizdžiai sunkiais, apčiuopiamais pokyčiais išsaugojimo prognozė yra nulinė. Jei tikimasi išgelbėti bulių, skirtą veisimui, reikėtų kuo anksčiau pašalinti paveiktą sėklidę, siekiant sustabdyti nepažeistos sėklidės degeneraciją. Jei atsiranda abiejų sėklidžių orchitas, toks bulius niekada nebebus naudojamas veisimui, o kastracija turėtų būti atliekama kaip įmanoma greičiau. Pirminis gydymas antimikrobinėmis medžiagomis gali sumažinti hematogeninės infekcijos plitimo riziką operacijos metu [2].

Hipoplazija

Sėklidžių hipoplazija reiškia, kad dėl nepakankamo sėklinių ląstelių skaičiaus nevisiškai išsivystė sėklinių kanalėlių spermatogeninis epitelis. Lytinių ląstelių nepakankamumas gali atsirasti dėl dalinio ar visiško lytinių ląstelių vystymosi sutrikimo trynio maišelyje dar esant embrionui. Lengvais atvejais gali būti vidutinio sunkumo oligospermija arba bloga spermos morfologija, tačiau sunkiais atvejais – aspermija [33].

Nustatyta, jog paveldima hipoplazijos forma yra būdinga Švedijos hailendų veislės galvijams, dažniau paveikianti kairę sėklidę nei dešinę. Jaučių sporadinės sėklidžių hipoplazijos priežastis – Klinefelterio sindromas (XXY kariotipas). Tokių gyvūnų spermatogonijų vystymasis yra sutrikęs, todėl sėkliniai kanalėliai iš esmės neturi lytinių ląstelių. Nors ejakuliatas spermatozoidų neturi, tačiau libido yra normalus, nes Leidigo ląstelės nepažeistos [2].

19

Dėl tikėtino sėklidžių hipoplazijos paveldimumo reikėtų vengti bandymo veisti šį sutrikimą turinčius bulius-reproduktorius. Didžiausia ekonominė nauda būtų juos brokuoti, nes bandymai gydyti egzogeniniais hormonais visada nesėkmingi [2].

Degeneracija

Sėklidžių kanalėlių spermatogeninis epitelis yra labai jautrus išoriniams ir vidiniams veiksniams, kurie gali sukelti įvairaus laipsnio degeneraciją. Degeneracija atsiranda reaguojant į padidėjusią sėklidžių temperatūrą (aplinkos temperatūros pokyčiai, padidėjęs riebalų kiekis kapšelyje, sisteminė pireksija, vietinis uždegimas, kapšelio nušalimas), toksinus, stresą (transportavimas), aplinką (radiacija, sunkieji metalai), endokrininės sistemos sutrikimus, dietą (cinko, vitamino A trūkumas) bei infekcijas (galvijų rinotracheitas). Didžioji dalis sėklidžių degeneracijos atvejų nepasireiškia nevaisingumo sukėlimu tiesiog iš karto, yra 4–8 savaičių laiko intervalas, per kurį tam tikras spermatogenezės etapas (ypač pirminiai spermatocitai) yra paveikiamas ir sperma galutinai ejakuliuojama [33].

Pradiniai spermos kokybės pokyčiai sėklidžių degeneracijos metu yra spermatozoidų judrumo sumažėjimas ir padidėjęs patologinių spermatozoidų procentas, ypač – proksimalinių lašelių ir spermatozoidų galvučių be uodegėlių skaičius. Jei sperma yra kriokonservuota, šiaudelius atšildžius, galimas greitas judrumo sumažėjimas. Vėliau spermatozoidų skaičius pradeda mažėti, nors ejakuliato tūris paprastai nepakinta, bet atsiranda vis didesnė morfologiškai pakitusių spermatozoidų dalis. Morfologiniai pakitimai apima spermatozoidų galvutes, mažas nenormalias bei atskiras galvutes be uodegėlių, po galva susisukusias uodegėles, akrosomų pakitimus ir proksimalinius lašelius. Spermatozoidų skaičius gali sumažėti tiek, kad ejakuliate pasireiškia aspermija. Gydymo ir sveikimo metu spermos morfologija ir judrumas paprastai pagerėja anksčiau nei padidėja spermatozoidų skaičius, tačiau spermatozoidų su distaliniais lašeliais procentas išauga [2].

Kriptorchizmas

20

Dažniausia atrajotojų kriptorchidizmo priežastis yra jatrogeninė dėl mažos patirties naudojant guminius kastracijos žiedus. Netinkamai uždėtas žiedas gali priversti sėklidę nukeliauti atgal į kirkšnies kanalą arba dažniausiai – į kapšelio kranialinę dalį. Kriptorchidai neturėtų būti naudojami veisimui, nes yra manoma, jog šis sutrikimas gali persiduoti palikuonims. Šie gyvūnai turėtų būti kastruojami arba brokuojami [2].

1.2.5. Sėklidžių priedinės lytinės liaukos ir pagrindiniai sutrikimai

Dvi priedinės lytinės liaukos yra randamos, kur sėklinis latakas (vas deferens) susivienija ir pereina į šlaplę. Šios liaukos išskiria sekretą, kuris sudaro didžiąją bulių ejakuliato dalį. Šis sekretas suaktyvina spermatozoidus ir šie tampa judrūs [11].

Didžiausia iš jų – pūslinė liauka, kuri gamina didžiausią sėklinio skysčio dalį. Ji susideda iš dviejų skilčių, kurių ilgis yra nuo 10 iki 12,5 cm ir kiekviena skiltis sujungta lataku su šlaple. Kita pridėtinė lytinė liauka – prostata, esanti prie šlapimo pūslės kaklelio, kur jis pereina į šlaplę. Bulių prostata yra menkai išsivysčiusi ir gamina tik labai nedidelį kiekį sekreto [11]. Trečioji – Kuperio liauka, kuri yra gana maža, tvirta, randama abipus šlaplės. Viena iš pagrindinių jos sekrecijos funkcijų yra išvalyti, praplauti šlaplę, kad joje neliktų šlapimo, kuris gali pažeisti spermatozoidus. Skaidrų sekretą, tekantį iš varpos, buliui lytiškai susijaudinus pagamina ir išskiria Kuperio liauka [35].

Prostatos bei Kuperio liaukų sutrikimai pas bulius pasitaiko rečiau nei porinės pūslinės liaukos. Prostatos ligos pasireiškia itin retai, tačiau Kuperio liaukos ligos randamos dažniau: adenitas, litiazė, aplazija, fuzija, kanalėlio išsiplėtimas, bei cistos. Pastarosios yra dažniausiai pasitaikantis sutrikimas [2,11].

21

nuo orchito ar antsėklidžio uždegimo [2].

Infekcija dažniausiai būna vienos liaukos pusės, tačiau gali būti abipusė. Diagnozę dažnai galima patvirtinti rektinio tyrimo metu atliekant vezikulinių liaukų palpaciją. Liaukos esant T. pyogenes infekcijai yra padidėjusios, įsitempusios ir skausmingos esant ūminei fazei arba labai skiltėtos ir paveiktos fibrozinio audinio esant lėtinei fazei. Retas reiškinys, kai T. pyogenes užkrėstose liaukose susidaro abscesai, kurie gali sprogti ir sukelti generalizuotą peritonitą. Pagrindinė sėklinio vezikulito pasekmė – spermoje padaugėja polimorfonuklearinių leukocitų, kurie, esant T. pyogenes infekcijai, gali pasireikšti kaip pūliai ejakuliate arba rudos spalvos sperma dėl raudonųjų kraujo kūnelių, susijusių su liaukos uždegimu. Poveikis spermos kokybei yra įvairus: kai kuriais atvejais sumažėja spermatozoidų judrumas ir padidėja patologinių spermatozoidų procentas, o kitais atvejais nėra jokio poveikio spermos kokybei ar vaisingumui [2,11,35].

1.2.6. Atskirų veislių bulių sėklidžių dydis ir spermos produkcija

Yra nustatyta, kad priklausomai nuo rūšies matuojama kapšelio apimtis (tiems patinams, kuriems kapšelis nusileidęs) arba plotis labai koreliuoja su sėklidžių svoriu ar tūriu ir su kasdienėmis spermos dozėmis. Sėklidžių kapšelio apimties ar pločio matavimai leidžia nustatyti, ar bulių sėklidės vystėsi normaliai, ar buvo pakitimų. Tai ypač svarbu renkantis bulius, kurie bus naudojami veisimui, nes sėklidės vystymosi ypatumai yra labai paveldimas bruožas, kuris koreliuoja su patelių vaisingumu [14]. Norint išmatuoti kapšelį reikia, kad bulius būtų gerai fiksuotas, užpakalinės galūnės turi būti tvirtai supančiotos ar pririštos prie staklių [36]. Abi sėklides reikia įmasažuoti į kapšelį taip, kad jos gulėtų viena šalia kitos, o ant kapšelio neturi būti raukšlių. Sėklidės matuojamos specialia matavimo juosta, kuri dedama ant plačiausios sėklidžių vietos [2].

22

riebalų atsidėjimas kapšelio viršutinėje dalyje bei aplink sėklides, o tai klaidingai padidina kapšelio apimtį [2].

23

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos fakulteto, Patobiologijos katedros, Patologijos centre. Patologiniam tyrimui buvo naudojamos bulių sėklidės, kurios iš Lietuvos veislininkystės įmonės „X“ į Patologijos centrą buvo atvežtos po bulių paskerdimo. Tyrimai buvo atliekami 2018-2019 metais. Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje atliekant sėklidžių matavimus ir taikant histologinius tyrimus iš viso ištirtos 12-kos bulių (pieninių ir mėsinių) 24 sėklidės. Atlikti šviežios, kriokonservuotos bei spermos, paimtos iš antsėklidžio uodegėlės, morfologiniai spermatozoidų tyrimai. Tirta spermos koncentracija, spermatozoidų judrumas, galvučių, uodegėlių bei kitos patologijos. Išanalizuoti 9 bulių 2 metų kriokonservuotos spermos duomenys: ejakuliato tūris, spermatozoidų judrumas, spermos koncentracija, atskiestos spermos tūris ir šiaudelių skaičius saugykloje. Visi tyrimai buvo atlikti pagal schemą (3 pav.).

3 pav. Tyrimo schema

2.1. Sėklidžių matavimai

24

2.2. Histomorfologinis mėginių paruošimas ir tyrimas

2.2.1. Histologinių mėginių paruošimas

LSMU, Veterinarijos akademijos, Patologijos centre, histologijos laboratorijoje buvo paruošti histologiniai preparatai. Sėklidžių mėginiai buvo fiksuojami 10 proc. formalino fosfatiniame buferyje (pH – 7,4). Po fiksacijos - supjaustyti bei sudėti į biopsines kasetes ir 24 val. plauti šaltu tekančiu vandeniu. Po 24 val. biopsinės kasetės su tiriamaisiais mėginiais buvo sudedamos į audinių įmirkimo procesorių – „Shandon Pathcentre“ (Thermo Scientific, JAV), kuriame audiniai dehidratuojami po 2 val. ir 30 min. 60°, 80° ir 96° etilo alkoholyje bei praskaidrinti palaikius izopropanolyje po 1 val. ir 30 min. 3 kartus iš eilės ir chloroforme po 1 val. ir 30 min. 3 kartus. Atlikus dehidrataciją ir skaidrinimą tiriamieji audinių mėginiai 4 val. ir 30 min. buvo impregnuojami 60° C temperatūros parafinu. Praėjus 24 val. mėginiai įlieti į parafininius blokus naudojant audinių įliejimo įrangą „Tess 99“ (MEDITE, JAV). Parafininiai blokai su tiriamuoju audiniu buvo atvėsinti ant šaldomojo stalelio ir supjaustyti 4 μm storio pjūviais naudojant rotacinį mikrotomą 20 „Accu - Cut®SRMTM“ (Sakura, Japonija). 37° C temperatūros termostatinėje vandens vonelėje buvo ištiesintas atpjautas pjūvis ir perkeltas ant objektinio stalelio. Objektiniai staleliai su pjūviais 5 val. buvo palikti ant reguliuojamos 37°C temperatūros kaitinimo plokštės „Hotplate“ (Thermo Scientific, JAV). Vėliau 24 val. sudėti į 37° C temperatūros termostatą „B28“ (BINDER, Vokietija) ir buvo džiovinami. Po 24 val. termostate išdžiūvę parafininiai audinių pjūviai buvo dažomi hematoksilinu – eozinu naudojant histologinių pjūvių automatinį dažymo įrenginį – „Tissue - Tek®DRSTM“ (Sakura, Japonija) [37].

Histologinių audinio pjūvių deparafinavimo ksilenu metu iš audinio pašalinamas parafinas - 2 kartus po 6 ir 7 min. Rehidratavimas izopropanoliu – 2 min. ir 96° etilo alkoholiu – 4 min. Prieš dažant mėginys 3 min. skalaujamas vandeniu, kuris pašalina alkoholį. Dažymas hematoksilinu – 10 min., 5 min. preparatas įmerkiamas į vandenį, 2 min. į 96° etilo alkoholį, 5 min. į vandenį, 5 min. dažoma eozino dažais ir 1 min. plaunama vandeniu. Nudažius pjūviai vėl dehidratuojami 96° etilo alkoholiu – 1 min., izopropanoliu – 1 min. praskaidrinami ksilenu – 1 min. ir uždengiami dengiamaisiais stikleliais, naudojant ilgalaikio saugojimo dengiamąją terpę „Shandon Consul – MountTM“ (Thermo Scientific, JAV) [37].

2.2.2. Sėklidžių vingiuotų kanalėlių morfometrinis tyrimas

Tyrimui buvo naudojama biologinių vaizdų analizės sistema - pilnai motorizuotas šviesos mikroskopas Olympus 61, didelės skiriamosios gebos vaizdo kamera Evolution QEi, vaizdo analizės sistema Image Pro Plus 6,0 (Media Cybernetics). Įvertinta: sėklidžių kanalėlių aukštis (μm), plotis (μm), plotas (μm2_{), spermatogeninio epitelio aukštis (μm) bei plotas (μm}2_{) ir Sertoli}

25

spermatogenezė) ir 10 nepilnų kanalėlių (spermatogenezė nevyksta). Bendrai įvertinta 480 kanalėlių.

2.3. Spermatozoidų tyrimai

2.3.1. Spermatozoidų koncentracijos tyrimas

Spermatozoidų koncentracija buvo nustatyta fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 100 kartų padidinantį objektyvą ir hematocitometrinę (NewBauer) kamerą. Sperma buvo praskiesta distiliuotu vandeniu (santykiu 1:20) bei išmaišoma. Hematocitometrinė kamera buvo užpildyta paruoštu skiediniu. Spermatozoidai skaičiuojami 0,2 mm2 plote arba 5 dideliuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių). Skirtinguose kvadratuose ląstelės skaičiuojamos tris kartus, o po to vedamas šių skaičiavimų vidurkis. Spermatozoidų koncentracija buvo nustatyta naudojant šią formulę:

K = S × Pr × 5 ×10 × 1000

kur, K – spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre (koncentracija), S – spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratėlių,

Pr – praskiedimo laipsnis,

5 – koeficientas (spermatozoidai buvo skaičiuoti 0,2 mm2 kameros plote), 10 – daugiklis (kameros gylis yra 0,1 mm),

1000 – daugiklis (spermatozoidus perskaičiuojant į 1 ml).

Apskaičiuotas spermatozoidų kiekis mililitre dauginamas iš spermos dozės tūrio (mililitrais), ka norima nustatyti spermatozoidų koncentraciją spermos dozėje [38].

Spermatozoidų koncentracija bulių spermos dozėje apskaičiuojama naudojant šią formulę: SK = K × 100

kur, K – spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre, 100 – daugiklis (spermos dozės tūris yra 100 ml) [38].

2.3.2. Spermatozoidų judrumo nustatymas

Spermatozoidų judrumas buvo nustatytas dviem skirtingais būdais: mikroskopuojant ir naudojantis kompiuterine spermos judrumo vertinimo programa Sperm Class Analyzer (SCA, Microptic, Ispanija). Bulių spermatozoidų judrumas buvo nustatomas 37 ± 0,5 oC temperatūroje, nes tik tokiose sąlygose jie tampa maksimaliai aktyvūs.

Prieš atliekant spermatozoidų judrumo nustatymą mėgintuvėliai su bulių sperma 5 minutėms buvo įstatomi į vandens vonelę, kurioje (Memmert, Vokietija) nuolat palaikoma pastovi 37±0,5 o_C

26

Atliekant spermatozoidų judrumo vertinimą pirmuoju būdu buvo naudojamas fazių kontrastinis mikroskopas (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija) su integruotu šildomuoju staleliu, kuris palaiko pastovią 37 оC temperatūrą, tam kad nesumažėtų spermatozoidų aktyvumas. Atliekant spermatozoidų judrumo tyrimus, svarbu naudoti pašildytus objektinius ir dengiamuosius stiklelius bei pipečių antgalius. Šiltos spermos lašas buvo užlašintas ant 37 oC temperatūros objektinio stiklelio ir uždengtas šiltu dengiamuoju stikleliu. Judrumas vertinamas akimi trijuose - penkiuose mikroskopo matymo laukuose nustatant judančių spermatozoidų kiekį procentais. Galutiniam rezultatui gauti buvo apskaičiuotas visų matavimų aritmetinis vidurkis.

Naudojantis kompiuterine programa spermatozoidų judrumas buvo nustatomas prie mikroskopo, kuriame įrengta kamera. Ja vaizdas, matomas mikroskope, perduodamas į kompiuterį, kur instaliuota kompiuterinė spermos judrumo vertinimo sistema SCA (MICROPTIC S.L., Ispanija). Kiekviename mėginyje buvo išanalizuota ne mažiau kaip 1500 spermatozoidų (ne mažiau kaip 3 matymo laukuose). Kompiuteriu buvo fiksuojamas bendras spermatozoidų judrumas išreikštas procentais (Judrumas SCA) [38].

2.3.3. Spermatozoidų morfologinis tyrimas

Patologinių spermatozoidų kiekio nustatymas (morfologiniai tyrimai) buvo atliktas pagal A. Januškausko aprašytą metodiką [38]. Spermatozoidų galvučių patologijos ir patologinės uodegėlės vertinamos atskirai. Spermatozoidai buvo dažomi metileno mėlynaisiais dažais pagal gamintojo instrukcijas (Sperm Blue, MICROPTIC S.L., Ispanija), tam kad įvertinti spermatozoidų galvučių ir uodegėlių patologijas [38].

Spermatozoidų dažymas Sperm Blue dažais:

1. Tepinėlis padaromas ant objektinio stiklelio ir džiovinamas ore, 2. Stiklelis merkiamas į fiksavimo tirpalą ir laikomas 10 min., 3. Po to stiklelis merkiamas į dažus 20 – 30 min.,

4. Nudažius stiklelį, jis merkiamas į distiliuotą vandenį trims sekundėms ir džiovinamas ore [38].

27

Spermatozoidų uodegėlių patologijoms įvertinti buvo naudojamas Hancock’o (šlapio preparato) metodas. Sperma buvo skiedžiama buferinio formalino tirpalu santykiu 1 : 10. Lašas atskiestos spermos (5 – 10 μl) dedamas ant objektinio stiklelio bei uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Viršus atsargiai nusausinamas filtriniu popieriumi. Kelias minutes mėginys turi pastovėti, kad spermatozoidai nusėstų ant stiklelio dugno. Vėliau naudojant 400 kartų padidinimą mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija). Įvertinama 200 spermatozoidų. Stebimi spermatozoidų uodegėlių pakitimai: vidurinės dalies pažeidimai, paprastai ir po galva susisukusios bei dvigubai sulinkusios uodegėlės, bei kitos patologijos: spermatozoidų galvutės be uodegėlių, proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, akrosomų defektai ir pakitimai, vakuolės. Apskaičiuojamas bendras uodegėlių patologijų ir bendras kitų patologijų procentas, bei bendras visų patologijų (galvučių, uodegėlių ir kitų) kiekis procentais [38].

2.4. Statistinė duomenų analizė

Gauti duomenys buvo apdoroti „Microsoft Excel“ (Microsoft Office Excell, 2016) programa. Statistinė duomenų analizė buvo atlikta SPSS statistinio paketo Nr. 23 versija (SPSS for Windows 23.0, SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). Analizuojant duomenis buvo atliekamas jų aprašymas naudojantis aprašomaja statistika. Tirtų duomenų pasiskirstymo grupėse normalumas buvo tirtas Kolmogorov-Smirnov testu.

Kiekybinių rodiklių palyginimui buvo naudojami parametriniai ir neparametriniai testai, atsižvelgiant į duomenų normalų pasiskirstymą grupėse. Esant normaliam duomenų pasiskirstymui taikytas nepriklausomų imčių t testas, kitu atvejų – neparametrinis Mann-Whitney testas. Koreliacijos nustatymui tarp dviejų kiekybinių rodiklių buvo naudojamas Pearson testas. Parametrų vidurkių skirtumai skirtingose grupėse buvo tiriami dispersinės analizės (ANOVA) metodu bei daugybinių palyginimų (angl. Multiple comparisons) metodu. Taip pat parametrų skirtumams tarp antsėklidžio ir kriokonservuotos spermos taikytas susijusių imčių t testas.

28

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Įvairių veislių bulių sėklidžių sėklinių kanalėlių morfometrijos

tyrimai

Pritaikius metodikoje pateiktą histomorfologinės medžiagos analizę, buvo ištirta ir analizuota iš 12-os bulių sėklidžių paruošta medžiaga. Kiekvienam tirtam parametrui iš viso buvo atlikta 480 skirtingų matavimų ir skaičiavimų. Gauti rezultatai suskirstyti į 4 grupes: pilnų kanalėlių dešinėje ir kairėje sėklidėje bei nepilnų kanalėlių dešinėje ir kairėje sėklidėje. 1 lentelėje pateikti kiekvienos grupės histomorfologinio parametro vidurkiai su standartine paklaida. Taip pat rezultatai pateikiami (4 pav.).

1 lentelė. Bulių sėklidžių histomorfologinių parametrų vidurkiai (µm) (M±m)

Siekiant įvertinti vidurkių skirtumus tirtose kanalėlių grupėse naudotas dispersinės analizės (ANOVA) metodas. Statistiškai reikšmingas skirtumas buvo nustatytas tarp kanalėlio aukščio (p<0,001), kanalėlio ploto (p<0,001), epitelio aukščio (p<0,001), epitelio ploto (p<0,001) ir Sertoli ląstelių sk. grupių (p<0,001). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp kanalėlio ploto grupių dispersinės analizės metodu nenustatyta (p=0,058).

Statistiškai reikšmingiems dispersinės analizės rezultatams taikytas daugybinių palyginimų (angl. Multiple comparisons) metodas. Atlikę tyrimus, nustatėme pirmąją gautų rezultatų tendenciją: visų tirtų histomorfologinių kanalėlių parametrų dešinės sėklidės pusės nepilnų kanalėlių vidurkiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) nuo kairės pusės nepilnų sėklidės kanalėlių, dešinės pusės tirtų pilnų kanalėlių parametrų vidurkiai taip pat nesiskyrė (p>0,05) nuo kairės pusės pilnų kanalėlių parametrų. Antroji tirtų parametrų tendencija: nepilnų sėklidžių kanalėlių dešinės pusės parametrų vidurkiai statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,05) nuo pilnų sėklidžių kanalėlių dešinės ir kairės pusės atitinkamų parametrų vidurkių, o nepilnų kanalėlių kairės pusės vidurkiai skyrėsi (p<0,05) nuo pilnų kanalėlių dešinės ir kairės pusės parametrų vidurkių.

29

4 pav. Bulių sėklidžių histomorfologinių parametrų vidurkiai kairėje ir dešinėje sėklidėse (µm)

5 pav. Bulių sėklidžių Sertoli ląstelių skaičiaus vidurkis kairėje ir dešinėje sėklidėse (vnt.)

Įvertinus šias tendencijas nuspręsta atlikti nepriklausomų imčių t testų palyginimus atskirai tarp kairės ir dešinės pusės sėklidžių kanalėlių histomorfologinių parametrų vidurkių bei tarp pilnų ir nepilnų kanalėlių analogiškų parametrų vidurkių.

30

2 lentelė. Histomorfologinių parametrų vidurkių skirtumų vertės dešinėje ir kairėje sėklidėse (µm)

Nepriklausomų imčių t testas atliktas ir lyginant atskirai pilnų ir nepilnų kanalėlių histomorfologinius parametrus dešinėje ir kairėje sėklidėje kartu. Statistiškai reikšmingi skirtumai buvo rasti visuose 6 lygintuose parametruose. 3 lentelėje pateikti histomorfologinių parametrų vidurkiai pilnų ir nepilnų kanalėlių grupėse bei t testo rezultatai. Rezultatai taip pat pateikti (5 pav.).

3 lentelė. Histomorfologinių parametrų vidurkių skirtumų statistinės vertės pilnuose ir nepilnuose

kanalėliuose (µm)

6 pav. Histomorfologinių parametrų vidurkių skirtumai pilnuose ir nepilnuose sėklidės kanalėliuose

31

7 pav. Sertoli ląstelių skaičiaus vidurkiai pilnuose ir nepilnuose sėklidės kanalėliuose (µm)

3.2. Bulių sėklidžių išsivystymo duomenys

Atliekant bandymą buvo tirti 12-os bulių kairės ir dešinės sėklidžių parametrų ypatumai. Dešinės pusės visų sėklidžių apimties vidurkis buvo 22.1±0.54 cm, ilgis – 14.2±0.44 cm, plotis – 8.5±0.35 cm, aukštis – 5.3±0.18 cm, sėklidės bendras svoris 459.8±28.85 g, antsėklidžio svoris – 45.2±3.15 g. Kairės pusės sėklidžių apimties vidurkis buvo 21.9±0.54 cm, ilgis – 13.8±0.38 cm, plotis – 8.5±0.3 cm, aukštis – 5.3±0.18 cm, bendras svoris – 458.5±28.77 g, antsėklidžio svoris – 44.3±2.99 g.

Siekiant nustatyti skirtumus tarp skirtingų pusių sėklidžių, atliktas nepriklausomų imčių t testas. Dešinės ir kairės sėklidžių apimtis (p=0,540), sėklidės ilgis (p=0,054), sėklidės plotis (p=1), sėklidės aukštis (p=0,615), sėklidės bendras svoris (p=0,861), antsėklidžio svoris (p=0,218) statistiškai reikšmingai nesiskyrė.

Tirtųjų bulių amžiaus vidurkis mėnesiais buvo 58.6±4.03 mėn., o jų svoris – 912.8±40.91 kg.

32

9 pav. Bulių sėklidžių ir antsėklidžių svorių vidurkiai kairėje ir dešinėje sėklidėse (g)

3.3. Spermos kokybės rodikliai

Atliekant tyrimą buvo tirti visų 12-os bulių spermos kokybiniai rodikliai: kriokonservuotos spermos, gautos buliui esant gyvam, ir spermos iš antsėklidžio, kuri gauta skrodimo metu.

Tirta kriokonservuota sperma, kurios koncentracija vidutiniškai buvo 86.6±5.33 mln/ml, spermos koncentracija dozėje – 21.6±1.33 mln., spermatozoidų judrumas – 66.3±3.38 proc., spermatozoidų judrumas po 5 val. – 43.3±3.78 proc. Proksimalinių spermatozoidų lašelių vidutiniškai buvo rasta 0.33±0.19 proc., distalinių spermatozoidų lašelių – 0.58±0.23 proc., patologinių spermatozoidų galvučių – 2.58±0.45 proc., vidurinės spermatozoidų dalies pakitimų – 0.75±0.3 proc., paprastai susisukusių spermatozoidų uodegėlių – 1.25±0.49 proc., po galva susisukusių spermatozoidų uodegėlių – 1.42±0.42 proc., dvigubai sulinkusių spermatozoidų uodegėlių – 0.5±0.29 proc., kriaušės formos spermatozoidų galvučių – 0.25±0.13 proc., siauro pagrindo spermatozoidų galvučių – 0.58±0.26 proc., nenormalių spermatozoidų galvutės kontūrų – 1.58±0.19 proc., neišsivysčiusių spermatozoidų – 0.33±0.19 proc., didelių spermatozoidų – 0.42±0.19 proc., mažų normalių spermatozoidų – 0.17±0.17 proc. Bendras spermatozoidų galvučių patologijų skaičius buvo 3.33±0.4 proc., bendras spermatozoidų uodegėlių patologijų skaičius – 3.92±0.67 proc., bendrai kitų patologijų – 3.5±0.5 proc., iš viso spermatozoidų patologijų – 10.8±1.13 proc.

33

uodegėlių, 0.33±0.14 proc. kriaušės formos spermatozoidų galvučių, 0.17±0.11 proc. siauro pagrindo spermatozoidų galvučių, 1.33±0.22 proc. nenormalių spermatozoidų galvutės kontūrų, 0.08±0.08 proc. palaidų spermatozoidų galvučių, 0.58±0.23 proc. neišsivysčiusių spermatozoidų, 0.17±0.17 proc. didelių spermatozoidų, 0.08±0.08 proc. mažų normalių spermatozoidų. Bendras spermatozoidų galvučių patologijų skaičius buvo 2.75±0.33 proc., bendras spermatozoidų uodegėlių patologijų skaičius – 4.67±1.02 proc., bendrai kitų patologijų – 58.8±4.33 proc., iš viso spermatozoidų patologijų – 66.2±4.32 proc. Visi šie duomenys taip pat pateikti 3 priede.

Siekiant nustatyti skirtumus tarp bulių antsėklidžio ir kriokonservuotos spermos patologijų buvo atliktas susijusių imčių t testas. Statistiškai reikšmingai skyrėsi distalinių spermatozoidų lašelių skaičius (p=0,001) ir proksimalinių spermatozoidų lašelių skaičius (p=0,007). Kitos tirtos patologijos, pavaizduotos (10 pav.), statistiškai reikšmingai tarp antsėklidžio ir kriokonservuotos spermos nesiskyrė (p>0,05 visais atvejais).

10 pav. Bulių spermos kokybės rodiklių vidurkių palyginimas tarp antsėklidžio ir šaldytos spermos

(proc.)

Pearson’o koreliacijos testu nagrinėti ryšiai tarp spermos kokybinių rodiklių. Iš antsėklidžio surinktoje bulių spermoje rastos stipriausios koreliacijos tarp vidurinės spermatozoido dalies pakitimų ir bendro spermatozoidų uodegėlių patologijų skaičiaus (r=0,895, p<0,001), patologinių spermatozoidų galvučių ir neišsivysčiusių spermatozoidų skaičiaus (r=0,803, p=0,002), dvigubai sulinkusių spermatozoido uodegėlių ir mažų normalių spermatozoidų skaičiaus (r=0,674, p=0,016).

34

3.4. Pieninio ir mėsinio tipo reproduktorių įtaka spermos kokybei

Atlikto tyrimo imtyje buvo dviejų tipų buliai: pieniniai – 8, mėsiniai – 4. Ieškota įvairių parametrų skirtumų tarp šių tipų. Buvo atliktas Mann-Whitney U testas ir nustatyta, jog amžius (p=0,283) ir svoris (p=0,214) statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Sėklidžių išmatavimai tarp skirtingų bulių tipų taip pat nesiskyrė (Mann-Whitney, p>0,05 visais atvejais). Analizuojant histomorfologinius parametrus tarp tipų statistiškai reikšmingo skirtumo nerasta (Mann-Whitney, p>0,05 visais atvejais). Bendra spermatozoidų patologijų dalis antsėklidyje statistiškai reikšmingai skyrėsi tarp pieninių ir mėsinių bulių veislių (Mann-Whitney, p=0,028). Rezultatai pateikti 4 lentelėje.

4 lentelė. Skirtumai tarp pieninių ir mėsinių bulių spermos kokybinio rodiklio

Rodiklis Pieniniai buliai N=8* Mėsiniai buliai N=4* Mann-Whitney U testas** Bendra spermatozoidų patologijų dalis antsėklidyje, proc. 59,9±4,66 78,8±5,01 p=0,028

*- pateiktas rodiklio vidurkis ± standartinė paklaida

**- pateiktas Mann-Whitney U testo statistinis patikimumas p

3.5. Buliaus amžiaus įtaka spermos kokybei

Atliekant tyrimą buvo analizuota buliaus amžiaus įtaka histomorfologiniams sėklidžių parametrams ir spermos kokybei. Atliktas Pearson’o koreliacijos testas, kuriuo ieškota statistiškai reikšmingų ryšių. Nustatyti teigiami koreliaciniai ryšiai tarp bulių amžiaus ir kai kurių spermos kokybės parametrų: kriaušės formos spermatozoido galvučių antsėklidyje (p=0,017), didelių spermatozoidų antsėklidyje (p=0,032), didelių sulinkusių spermatozoido uodegėlių kiekio kriokonservuotoje spermoje (p=0,001) ir spermatozoidų judrumo kriokonservuotoje spermoje (p=0,009). Statistiškai reikšmingų ryšių tarp amžiaus ir histomorfologinių duomenų nerasta.

35

11 pav. Bulių spermos kokybės rodiklių vidurkių palyginimas tarp jaunesnių ir vyresnių bulių

(proc.)

12 pav. Bulių spermos koncentracijos vidurkių palyginimas tarp jaunesnių ir vyresnių bulių (mln)

3.6. Koreliaciniai ryšiai tarp vingiuotų kanalėlių histologinių

požymių

36

Tirdami taip pat ieškojome koreliacinių ryšių tarp pilnų ir nepilnų kanalėlių histologinių parametrų. Atliktas Pearson’o testas. Rasti koreliaciniai ryšiai pateikiami 5 lentelėje.

5 lentelė. Histologinių parametrų koreliacijos tarp pilnų ir nepilnų kanalėlių (µm)

Kanalėlio aukštis, µm Nepilni Kanalėlio plotis, µm Nepilni Kanalėlio plotas, µm2 Nepilni Epitelio aukštis, µm Nepilni Epitelio plotas, µm2 Nepilni Sertoli ląstelių sk. Nepilni Kanalėlio aukštis, µm Pilni r = 0,581 p=0,047 r = 0,229 p=0,457 r = 0,480 p=0,114 r = -0,568 p=0,054 r = 0,502 p=0,096 r = -0,784 p=0,003 Kanalėlio plotis, µm Pilni r = 0,785 p=0,002 r = 0,822 p=0,001 r = 0,836 p=0,001 r = 0,315 p=0,318 r = 0,806 p=0,002 r = -0,135 p=0,676 Kanalėlio plotas, µm2 Pilni r = 0,763 p=0,004 r = 0,480 p=0,114 r = 0,694 p=0,012 r = -0,316 p=0,317 r = 0,702 p=0,011 r = -0,668 p=0,017 Epitelio aukštis, µm Pilni r = 0,394 p=0,205 r = 0,553 p=0,062 r = 0,470 p=0,123 r = 0,109 p=0,736 r = 0,496 p=0,101 r = -0,388 p=0,212 Epitelio plotas, µm2 Pilni r = 0,729 p=0,007 r = 0,498 p=0,100 r = 0,676 p=0,016 r = -0,295 p=0,353 r = 0,689 p=0,013 r = -0,671 p=0,017 Sertoli ląstelių sk. Pilni r = -0,423 p=0,171 r = -0,029 p=0,930 r = -0,306 p=0,334 r = 0,347 p=0,269 r = -0,275 p=0,388 r = 0,834 p=0,001 Lentelėje pateikti Pearson‘s koreliacinių ryšių stiprumas r tarp histologinių parametrų ir statistinis šio ryšio reikšmingumas p.

Remiantis lentelėje pateiktais duomenimis stipriausi statistiškai reikšmingi koreliaciniai ryšiai rasti tarp pilnų kanalėlių pločio ir nepilnų kanalėlių aukščio (r=0,785, p=0,002), pločio (r=0,822, p=0,001), ploto (r=0,836, p=0,001) be epitelio ploto (r=0,836, p=0,001). Taip pat stiprus koreliacinis ryšys nustatytas tarp Sertoli ląstelių skaičiaus pilnuose ir nepilnuose kanalėliuose (r=0,834, p=0,001). Visi atitinkami pilnų ir nepilnų kanalėlių histologiniai parametrai tarpusavyje koreliavo (p<0,05), išskyrus epitelio aukštį (p=0,736).

3.7. Koreliaciniai ryšiai tarp histomorfologinių parametrų ir

spermos patologijų

37

pločiu (r=0,721, p=0,008) bei plotu (r=0,674, p=0,016), epitelio aukščiu (r=0,619, p=0,032) bei plotu (r=0,674, p=0,016). Dvigubai sulinkusi spermatozoido uodegėlė koreliavo su nepilnų (r=0,623, p=0,030) bei pilnų (r=0,576, p=0,050) kanalėlių Sertoli ląstelių sk. Siauro pagrindo spermatozoido galvutė koreliavo su nepilnų kanalėlių plotu (r=0,588, p=0,044). Neišsivysčiusių spermatozoidų kiekis koreliavo su nepilnų kanalėlių aukščiu (r=0,584, p=0,046), pločiu (r=0,694, p=0,012), plotu (r=0,672, p=0,017), epitelio plotu (r=0,620, p=0,032) bei pilnų kanalėlių pločiu (r=0,703, p=0,011). Bendras spermatozoidų galvučių patologijų sk. koreliavo su nepilnų kanalėlių aukščiu (r=0,686, p=0,014), pločiu (r=0,769, p=0,003), plotu (r=0,768, p=0,004), epitelio plotu (r=0,620, p=0,032) ir aukščiu (r=0,588, p=0,044) bei pilnų kanalėlių pločiu (r=0,747, p=0,005).

Spermos, paimtos iš antsėklidžio, atveju taip pat rastos koreliacijos: po galva susisukusių spermatozoidų uodegėlių skaičius su nepilnų kanalėlių epitelio aukščiu (r=-0,605, p=0,037) ir Sertoli ląstelių sk. (r=-0,737, p=0,006), taip pat su pilnų kanalėlių aukščiu (r=0,844, p=0,001), kanalėlių plotu (r=0,764, p=0,004), epitelio plotu (r=0,779, p=0,003) bei Sertoli ląstelių sk. (r=-0,602, p=0,039). Iš antsėklidžio paimtos spermos atveju Sertoli ląstelių skaičius nepilnuose kanalėliuose taip pat koreliavo su dideliais spermatozoidais (r=0,708, p=0,010) bei bendru spermatozoidų galvučių patologijų skaičiumi (r=0,709, p=0,010), o pilnuose kanalėliuose su dideliais spermatozoidais (r=0,765, p=0,004), bendru spermatozoidų galvučių patologijų skaičiumi (r=0,763, p=0,004) bei bendru spermatozoidų uodegėlių patologijų skaičiumi (r=-0,709, p=0,010). Su bendru spermatozoidų uodegėlių patologijų skaičiumi iš antsėklidžio spermoje taip pat koreliavo ir pilnų kanalėlių aukštis (r=0,612, p=0,035).