Classe I eucariotici

Negli organismi eucarioti esistono due tipi di citocromi contenenti il gruppo eme c che sono il citocromo c e il citocromo c1. Entrambe queste proteine partecipano al trasporto di elettroni durante la fosforilazione ossidativa nella catena respiratoria, un processo che avviene nel mitocondrio e che permette la sintesi di ATP a partire dall’ossidazione di metaboliti che derivano dalla degradazione di zuccheri o grassi. Nella catena respiratoria, il citocromo è uno dei trasportatori coinvolti nel trasferimento di elettroni dai donatori primari NADH e FADH2 all’accettore finale, O2. Il trasferimento elettronico è accoppiato alla formazione di un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna, che, a sua volta, permette la sintesi di ATP. L’intero processo è chiamato accoppiamento chemioosmotico o respirazione cellulare, in quanto l’ossidazione di composti complessi consuma ossigeno e produce anidride carbonica (Stryer L. 1996).

La sequenza respiratoria (figura 5) coinvolge numerose proteine integrali di membrana, che si suddividono in quattro complessi enzimatici separati, i complessi I, II, III e IV. E’ stato ipotizzato che gli elettroni vengano trasportati da un complesso all’altro da trasportatori relativamente mobili (non legati alla membrana), quali il coenzima Q ed il citocromo c. L’energia, liberata dalla catena di reazioni di ossidoriduzione e immagazzinata dai complessi I, III e IV in un gradiente protonico transmembrana, promuove la sintesi di ATP da parte di un quinto complesso, detto complesso F0F1 - ATP sintasi (Stryer L. 1996).

Il complesso I, detto complesso della NADH-coenzima Q reduttasi trasferisce gli elettroni dal NADH al coenzima Q (ubichinone), che si riduce a QH2 (ubichinolo). Questo trasferimento elettronico avviene attraverso il flavinmononucleotide (FMN) e due diversi centri Fe-S (proteine ferro-zolfo tipo non-eme). Il complesso II, detto succinato-coenzima Q reduttasi, trasferisce gli elettroni dal succinato al FADH2 (questa reazione fa parte del ciclo dell’acido citrico) e poi da questo al coenzima Q. Anche in questo processo sono coinvolti

centri Fe-S, che riducono il coenzima Q. Il complesso III, detto coenzima Q-citocromo c reduttasi, trasferisce gli elettroni dal coenzima Q ridotto (QH2) al citocromo c. Il complesso della citocromo c reduttasi è costituito dai citocromi b e c1 e da una proteina Fe-S.

Infine, il complesso IV, detto citocromo ossidasi, trasferisce gli elettroni dal citocromo c all’ossigeno molecolare, mentre avviene anche il trasferimento contro gradiente di protoni verso il lato della membrana interna rivolto verso la matrice. Questo complesso è formato da 13 subunità; tre di queste subunità, tra cui i citocromi a e a3, sono codificate dal genoma del mitocondrio, mentre le altre 10 sono codificate dal genoma nucleare. I citocromi a e a3 si distinguono dai citocromi c, oltre che per la loro funzione, per il diverso gruppo eme, che è legato alla proteina senza legami covalenti con i residui proteici. In queste proteine è presente anche uno ione rame coordinato (Stryer 1996).

Figura 5. Schema della catena di trasporto degli elettroni attraverso la membrana interna del mitocondrio.

Durante il trasferimento elettronico nella catena respiratoria, si possono generare composti tossici per il mitocondrio e per la cellula stessa, quali il radicale superossido (O2·-), che viene eliminato dall’enzima superossido Dismutasi, ed il perossido di idrogeno (H2O2), che viene ridotto ad acqua e ossigeno molecolaredagli enzimi Catalasi o citocromo c Perossidasi (Polle A. 2001). In quest’ultimo caso il cyt c partecipa direttamente all’eliminazione dei prodotti tossici, trasferendo gli elettroni alla citocromo c Perossidasi, che catalizza a sua volta la riduzione del perossido di idrogeno (Stryer L. 1996). Il ruolo nell’eliminazione dei composti tossici da parte del cyt C è documentato anche nelle cellule germinali maschili di topo, in cui esso ne partecipa all’eliminazione dei radicali liberi dell’ossigeno (Zhe L. 2006).

2.2.1. Citocromi C1

Il citocromo c1 (figura 6) è una proteina di membrana che costituisce una delle tre subunità del complesso bc1 nei mitocondri, che è conosciuto anche come complesso III della catena di trasporto degli elettroni.

Questa proteina è ancorata alla membrana da un segmento transmembrana posizionato vicino al C terminale. La parte solubile del citocromo c1 assomiglia al citocromo c (cyt C). In particolare, nel citocromo c1 bovino, il gruppo prostetico è legato covalentemente ai residui di Cys37 e a Cys40 ed il ferro completa la sua coordinazione assialmente con l’His41 e la Met160. Il citocromo c1 contiene un certo numero di inserzioni e delezioni fra le eliche rispetto al cyt C. Si ritiene che queste differenze siano collegate alle specifiche interazioni del citocromo c1 con i partner proteici (Iwata S. 1998).

Figura 6. Struttura a raggi X del citocromo C1 bovino (PDB: 2a06).

2.2.2. Citocromi C (Cyt C)

I citocromi c eucariotici (cyt C) sono proteine costituite da una singola catena polipeptidica, che nei vertebrati è composta di 103 o 104 residui, mentre in altri organismi di phyla differenti può presentare sino a 8 residui in più nella regione N-terminale. Lo ione ferro, coordinato nelle posizioni equatoriali ai quattro atomi di azoto degli anelli pirrolici del gruppo eme c, completa la sua sfera di coordinazione ottaedrica con due legami assiali: il primo coinvolge un atomo di azoto del residuo di His18 della catena polipeptidica, conservato e successivo al residuo di Cys17, mentre il secondo coinvolge l’atomo di zolfo della Met80. Il ferro eminico può essere presente sia come Fe(II) (ferro- citocromo) che come Fe(III) (ferri- citocromo).

Dal confronto tra le sequenze amminoacidiche di citocromi c di 113 specie eucariotiche con diversa complessità, dal lievito all’uomo, è stato messo in luce che il cyt c è una proteina il cui centro attivo si è sostanzialmente conservato durante l’evoluzione (Banci L. 1999). Infatti, i residui interni del citocromo c, in particolare quelli presenti nella tasca dell’eme, tendono ad essere invarianti o sostituiti conservativamente, mentre quelli posizionati sulla superficie hanno una notevole variabilità (Voet D. 1995). In particolare, tra i residui invarianti sono importanti quelli di Cys14, Cys17, His18 e Met80 poiché formano legami

covalenti con il gruppo prostetico. Anche dodici residui altamente conservati di glicina (Gly1, 6, 23, 24, 29, 34, 37, 41, 45, 56, 77, 84) sono importanti, poiché occupano posizioni in cui una catena laterale di dimensioni maggiori altererebbe la struttura tridimensionale della proteina. I residui di lisina altamente conservati, Lys8, 13, 25, 27, 72, 73 79, 86 e 87, sono distribuiti a formare un anello sul bordo esposto della tasca in cui è inserito il gruppo eme. Questo cluster di cariche positive sembra essere coinvolto nell’interazione del cyt c con i suoi partner fisiologici, la citocromo c Reduttasi e la citocromo c Ossidasi. Il residuo conservato di Phe82, il cui anello aromatico si dispone quasi parallelo al gruppo eme, rappresenta probabilmente una componente essenziale nel sistema di conduzione degli elettroni (Banci L. 1999). Uno studio sulla struttura a raggi X del cyt c da lievito ha evidenziato come le caratteristiche che contraddistinguono lo stato ossidato da quello ridotto interessano principalmente le catene laterali degli aminoacidi situati in prossimità del gruppo prostetico, in particolare le regioni dei residui 47-59, 65-72 e 81-85 (Hickey D.R. 1991). Inoltre, in questo particolare sito della proteina, la struttura a raggi X mostra che la variazione dello stato di ossidazione provoca uno spostamento significativo di una molecola d’acqua, situata in posizione analoga a quella evolutivamente conservata nella famiglia dei citocromi c2 (Takano T. 1980). La variazione delle posizioni delle catene laterali nella regione in prossimità del gruppo eme, quali quelle di Met80, Tyr67, Thr78 e Asn52, comporta una riorganizzazione dei legami ad idrogeno che può determinare, a sua volta, anche lo spostamento della molecola d’acqua (Hickey D.R. 1991).

Lo stato di ossidazione in relazione al potenziale elettrostatico è stato studiato anche tramite l’uso di diversi tipi di anioni che si complessano a livello della superficie proteica (Battistuzzi G. 1996). Questi lavori forniscono prove del fatto che il cambiamento dello stato di ossidazione del metallo all’interno del gruppo eme comporta modificazioni conformazionali nella struttura tridimensionale, che, sebbene lievi, incidono notevolmente sulla disposizione dei legami forti e sulle interazioni che esistono tra i gruppi carichi all’interno della proteina. E’ inoltre probabile che tali modificazioni conformazionali abbiano un ruolo chiave nel riconoscimento molecolare dei citocromi con i propri partner naturali.