Cristallizzazione e Determinazione della struttura

Le soluzioni di proteina impiegate nelle prove di cristallizzazione sono state preparate partendo dai campioni di proteasi ottenuti seguendo i protocolli di espressione, purificazione e refolding, di cui sopra. Le soluzioni di inibitore impiegate sono composte dalle molecole FT99 e FT107, sciolte in DMSO. Le concentrazioni dell’enzima, da 0.97 a 1.2mg/mL, sono state quantificate tramite elettroforesi SDS-Page. Per entrambe le cristallizzazioni si è utilizzato la tecnica Hanging-Drop. Le condizioni ottimali da cui ottenere i cristalli sono riportate in tabella 1. Per entrambi i complessi sono stati ottenuti cristalli (figura 8a) in grado di ruotare la luce polarizzata e di dimensioni ottimali per la diffrazione di raggi x.

Tabella 1. Condizioni di cristallizzazione per i complessi HIV/FT99 e HIV/FT107.

4.1. Raccolta dati e Riduzione

Le informazioni strutturali sul complesso proteasi da HIV-1/inibitore sono state ottenute mediante diffrazione di raggi X da cristallo singolo sfruttando la luce di sincrotrone. La tecnica impiegata per la crioprotezione è quella del flashcooling usando una soluzione di glicerolo 30% e pescando i cristalli con loop delle dimensioni tra 0.10 – 0.25 mm. Presso la linea di diffrazione XRD1 del sincrotrone Elettra (Trieste) sono stati raccolti i due data set migliori (HIV-FT99: 1.93Å, 150s/immagine e 110 immagini; HIV-FT107: 1.4Å, 100s/immagine e 120 immagini) usando un area detector tipo MarCCD (2048 x 2048 pixel/immagine), a 100K e con ∆ϕ=1° e λ=1.1Å. L’immagine di diffrazione in figura 8b mostra la presenza di anelli di ghiaccio formatosi durante la raccolta dati del complesso HIV-FT99 probabilmente a causa di un malfunzionamento temporaneo del sistema di raffreddamento.

a b

B

Figura 8. a. Cristalli del complesso HIV-1/inibitore. b. Immagine di diffrazione di un cristallo del complesso HIV-FT99 a 1.93Å ( dettaglio B) in cui si sono formati anelli di ghiaccio.

HIV-FT99 HIV-FT107 0.25M Sodio Citrato pH 6 10 %(v/v) DMSO 30%-45% (NH4)2SO4 0.8–1.0M NaCl 0.1M Sodio Acetato pH 4.5 0.25M Sodio Citrato 10%(v/v) DMSO 45%-65% (NH4)2SO4

Per la riduzione dei dati è stato usato il programma MOSFLM (Kabsch W. 1993). Gli anelli di ghiaccio sono stati esclusi in modo automatico selezionando l’apposita opzione in fase di indicizzazione. I parametri di cella, il gruppo spaziale e la stima del volume di Matthews (Matthews B.W. 1968), riportati in tabella 2, sono stati valutati conoscendo Z, MW (21457.44Da per il dimero) e il volume della cella. Le statistiche di scalatura sono riportate invece in tabella 3. HIV-FT99 HIV-FT107 Gruppo spaziale P21 21 2 P21 21 2 a [Å] 57.731 57.910 b [Å] 83.965 85.980 c [Å] 45.946 46.181 Volume [Å3] 228022.87 229934.94 VM [Å3/Da] 2.59 2.61 % V solvente 52.56 52.96

Tabella 2. Parametri di riduzione dati ottenuti per i complessi PR-Wt/Inibitore. HIV-FT99 HIV-FT107 Intervallo di risoluzione (Å) 50.0–1.93 28.66-1.45

Intervallo ultima shell (Å) 2.07–1.99 1.53-1.45

Mosaicità (°) 0.86 0.85

<I>/σ(I) 8.30 3.5

<I>/σ(I) ultima shell 2.88 0.4

N° osservazioni 82774 123851

N° riflessioni uniche 16479 40178

Rmerge(I) 0.16 0.22

Rmerge(I) ultima shell 0.36 0.41

Completezza (%) 91.6 97.8

Completezza ultima shell (%) 84.8 98.4

Molteplicità 5.0 3.1

Molteplicità ultima shell 3.8 3.2

4.2. Risoluzione della fase, affinamento e

Modeling

Circa 250 strutture della proteasi HIV-1 in complesso con diversi composti sono disponibili nel Protein Data Bank, 242 strutture depositate con 99 amminoacidi e 30 unreleased, con risoluzione da 3Å fino a 0.8Å. La scelta delle coordinate da utilizzare inizialmente per l’affinamento delle nostre strutture è stata fatta all’interno delle strutture isomorfe a maggiore risoluzione, considerando che la qualità del modello è funzione del limite della diffrazione. È stata scelta come modello di partenza per i cicli di affinamento e modeling la struttura pdb=2a1e, risolta ad una risoluzione di 1.3Å (Geremia S. 2006).

Il modello di partenza è stato privato dell’inibitore legato e di tutte le molecole di solvente. Dall’analisi dei parametri di cella della struttura di partenza, confrontati con quelli trovati sperimentalmente per il complesso HIV-FT99, è stato possibile effettuare una permutazione degli assi (a’=b, b’=c e c’=a), per ricondurre la cella della proteina modello alla cella sperimentale; in questo modo è stato possibile affinare il modello sulla base partendo da valori di errore del 26%. REFMAC5 (Murshudov G.N. 1997) del pacchetto CCP4i e WinCoot (Emsley B. 2010) sono stati i programmi usati per l’affinamento e il modeling strutturale, rispettivamente.

Dopo alcuni cicli di affinamento a corpo rigido, atti a compensare le lievi differenze di impaccamento della proteina tra la struttura in esame e quella isomorfa, sono stati eseguiti alcuni cicli restrained. Sulle mappe ottenute in questo processo è stato condotto il modelling per correggere il modello della struttura della proteina identificando, in un primo momento le conformazioni alternative della catena polipeptidica seguendo i Cα ed in seguito quelle delle catene laterali; tenendo conto dei moti termici dei singoli atomi sono state identificate 5 catene laterali disordinate in due posizioni equamente popolate, quali Ser37A e Ser37B, Lys14B, Ile33B e Ile66B ed infine Glu35B.

Per interpretare la densità elettronica residua, derivante dall’analisi della mappa 2Fo-Fc, sono state inserite nel modello le molecole di solvente, quali molecole d’acqua, DMSO, NaCl e glicerolo. Infine la densità elettronica relativa alla disposizione dell’inibitore nel sito catalitico è stata interpretata cercando il miglior fit tra la mappa e il modello della molecola inserito. Per entrambi i complessi con la proteasi è stato trovato un disordine occupazionale delle molecole di inibitore nel sito, la cui conformazione è direttamente associata al disordine stesso. I dati relativi all’affinamento delle strutture sono riportati nella seguente Tabella 4.

HIV-FT99 HIV-FT107

N° riflessioni usate 15270 36737

N° riflessioni per Rfree 812 1875

N° restrain introdotti 5483 6731

N° parametri 7190 7431

Rfactor 0.194 0.157

Rfree 0.31 0.196

Numero di atomi della proteina 1888 1540

Numero di atomi dell’inibitore 58 81

Numero di molecole di acqua 284 233

Altri atomi di solvente 32 3

Deviazione quadratica media dai valori ideali

Lunghezze di legame (Å) 0.023 0.008

Angoli (Å) 0.093 0.028

Statistica dei B-factor [Å2]

Catene principali dell’enzima 21.19 17.11 Catene laterali dell’enzima 23.35 22.73

Inibitore 32.11 21.31

Molecole di acqua 32.67 33.40

Altri atomi di solvente 35.47 28.23