Processo di affinamento

L’affinamento è un processo di aggiustamento del modello al fine di ottenere un migliore accordo fra i fattori di struttura calcolati e quelli osservati, accordo misurato da un parametro noto come fattore di disaccordo, Rfactor, così definito:

]

∑

∑

L’aggiustamento del modello consiste in cambiamenti dei parametri posizionali e dei fattori di temperatura per tutti gli atomi della struttura, ad eccezione degli atomi di idrogeno. Poiché gli atomi di idrogeno hanno un solo elettrone, la loro influenza sullo scattering dei raggi X è bassa ed essi sono normalmente trascurati nella risoluzione delle strutture non a livello atomico. Come detto, per ogni atomo, devono essere affinati tre parametri posizionali (x,y e z) ed un altro parametro, il fattore di temperatura isotropo (B). Dal momento che gli atomi da affinare sono molti, il rapporto fra osservabili e parametri è molto basso per cui nell’affinamento vengono introdotte delle ”osservazioni” addizionali; queste sono, in primo luogo, i dati stereochimici ricavati da strutture di piccole molecole. Le loro lunghezze ed i loro angoli di legame sono stati determinati con alta precisione e si può assumere che i dati relativi ai piccoli peptidi siano validi anche per le proteine (Murshudov G.N. 2004; Tickle I.J. 2007).

L’affinamento è condotto ottimizzando, allo stesso tempo, sia la densità elettronica, che riflette l’accordo fra i fattori di struttura osservati e calcolati, sia la geometria, analizzando il

fit fra la geometria ideale e quella osservata. Tale affinamento è detto restrained. Ancora

diverso è l’affinamento a corpo rigido: in tale affinamento si assegna una geometria rigida alla molecola o a parti di una struttura così da affinare i parametri posizionali di queste parti “costrette”. Questo procedimento può essere visto come un affinamento dell’orientazione e della posizione nella cella unitaria di tale corpo rigido.

Solitamente dalle coordinate atomiche della struttura modello di partenza (file .pdb) e dalle ampiezze dei fattori di struttura sperimentali (file .mtz) si esegue prima di tutto un ciclo di affinamento a corpo rigido per correggere l’orientazione e la posizione della proteina nell’unità asimmetrica.

La bontà dell’affinamento è valutata sulla base di due parametri che il programma fornisce in uscita, Rfactor ed Rfree. Via via che l’affinamento procede, l’Rfactor si abbassa. Per strutture risolte a 2Å di risoluzione valori di Rfactor attorno al 20% sono da considerarsi piuttosto buoni. L’Rfree si calcola formalmente allo stesso modo del Rfactor, ma i fattori di struttura considerati nel computo dell’Rfree sono solo il 5% delle osservabili, scelti casualmente fra le riflessioni indipendenti raccolte. Queste riflessioni non vengono mai impiegate né nella risoluzione né nell’affinamento della struttura sicché l’Rfree risulta indipendente dal processo di affinamento ed è un parametro correlato all’accuratezza del modello e alla predizione dei dati di diffrazione del modello. Una differenza minima tra l’Rfactor e l’Rfree rivela che il modello non è sovraffinato e che c’e’ solo un piccolo bias introdotto dalle fasi del modello. Sia nel caso del peptide che in quello del complesso sono stati effettuati entrambi i tipi di affinamento. Fin dai primi cicli, intervallati dal modeling strutturale per fittare al meglio la densità elettronica, è stato possibile individuare la struttura del peptide KE1 che, sebbene dotato solamente dei Cα, interpretava bene le mappe di densità elettronica. Per quanto riguarda invece il complesso con l’avidina, dai primi cicli di affinamento usando la struttura isomorfa, il valore di Rfactor risultava pari a 36%, indice di una buona correlazione di partenza tra modello e dato sperimentale. Questo dato, assieme all’analisi dei parametri di cella, confrontati con quelli del modello, ci ha fatto supporre che il complesso ternario composto da Avidina-bioconiugato e KE1 poteva essere in realtà caratterizzato solamente dalla presenza di Avidina in complesso con il bioconiugato. Ulteriori cicli di affinamento e modeling, al fine di ottenere il miglior accordo sia tra il dato sperimentale e quello calcolato, sia tra l’Rfactor e l’Rfree, sono stati eseguiti sino ad ottenere i valori sperimentali descritti in tabella 11.

4.2.3.

Modeling

Il modello iniziale della struttura della proteina è spesso non sufficientemente buono per poter impiegare un metodo di affinamento completamente automatizzato. Se nel modello sono presenti errori grandi, ad esempio se la catena principale non è ben posizionata o i residui aminoacidici sono spostati di una o più posizioni lungo la catena polipeptidica, una procedura automatizzata difficilmente correggerà questi errori. Per queste ragioni, alcuni cicli di minimizzazione sono seguiti da un aggiustamento manuale del modello (modeling), che si effettua con il programma di grafica molecolare WinCooT (Emsley P. 2010), che consente la visione tridimensionale del modello e delle mappe di densità elettronica. Il programma permette all’utente di modificare manualmente il modello in modo da migliorarne l’accordo con la mappa di densità elettronica. Si possono virtualmente mutare aminoacidi, ruotare frammenti di molecole attorno ai legami mantenendo la corretta stereochimica, muovere singoli atomi o interi gruppi di atomi, variare gli angoli torsionali

per un residuo, etc.. Il risultato finale dell’aggiustamento manuale del modello viene impiegato successivamente come input in un nuovo ciclo di affinamento. Le fasi dell’affinamento strutturale sono schematizzate nel diagramma a blocchi di Figura 11.

MODELLO DI PARTENZA

CICLI DI AFFINAMENTO CON Refmac o ShelX

CALCOLO DEI FATTORI DI STRUTTURA E QUINDI DELLE FASI

CALCOLO DELLE MAPPE DI DENSITA’ ELETTRONICA Fo; αc; 2mFo-DFc; mFo-DFc

FIT MANUALE TRA IL MODELLO E LE MAPPE

FINE AFFINAMENTO

Figura 11. Fasi dell’affinamento strutturale.

Il modeling strutturale che ha permesso di ottenere il miglior accordo tra il dato osservato e quello calcolato è stato condotto inizialmente seguendo la catena principale della molecola. Per il peptide KE1, inizialmente poli-Ala, sono stati mutati gli aminoacidi in base alla sequenza primaria (KVSALKE)2QFLMLMF(KVSALKE)2. Per la struttura del complesso si è partiti invece eliminando la biotina dalla struttura di partenza. Successivamente sono state modellizzate le conformazioni delle catene laterali di ogni singolo residuo tenendo conto del disordine occupazionale associato ai moti termici dei singoli atomi (fattore B). Questo è stato effettuato per entrambe le strutture. La maggiore mobilità conformazionale dei gruppi laterali è stata osservata principalmente per i residui carichi e posti prevalentemente sulla superficie della molecola, quali lisine, glutammine, asparagine, glutammati e aspartati. Per quanto riguarda il complesso Avidina-biorecettore sono stati identificati alcune catene laterali di residui interni e superficiali mancanti, specialmente valine, isoleucine, lisine e aspartati; questi sono stati mutati usando il programma Coot per ripristinare l’intero residuo

e la conformazione è stata adattata nella mappa di densità elettronica. I residui terminali, quali Arg2, Lys3 e Arg124, non presenti nel modello di partenza, sono stati introdotti ex-novo.

Per interpretare la densità elettronica residua, derivante dall’analisi della mappa 2Fo-Fc, sono state inserite le molecole di solvente, dapprima le molecole di acqua e successivamente sali o ioni presenti nel reservoir al momento della crescita dei cristalli, come gli ioni solfato, trovati nella struttura di KE1. Infine è stata analizzata la densità elettronica non ancora interpretata, ossia quella presente nel sito di legame dell’avidina per il bioconiugato. La molecola bioconiugato, ossia biotina-linker-caffeina (figura12), è stata preparata tramite il programma ChemSketch, la sua geometria è stata ottimizzata ed è stata creata una libreria con il programma Sketcher di CCP4i usata per la fasi di affinamento e modeling.

I dati relativi all’affinamento delle strutture del peptide KE1 e del complesso con Avidina-bioconiugato sono riportati nella seguente Tabella 3.

N N N N NH _NH O O O _O C H₃ CH₃ C H₃ ^S NH N H O

Figura 12. Bioconiugato usato nelle cristallizzazioni (da dx a sx, Biotina – Linker – Caffeina).

KE1 Avidina-bioconiugato

N° riflessioni usate 10851 11211

N° riflessioni per R_free 543 565

N° restrain introdotti 1099 8628

N° parametri 1230 8448

R_factor 0.158 0.195

R_free 0.185 0.263

Numero di atomi della proteina 277 1935

Numero di molecole di acqua 29 51

Altri atomi di solvente 1

Numero di atomi dell’inibitore 123

Deviazione quadratica media dai valori ideali

Lunghezze di legame (Å) 0.017 0.004

Angoli (Å) 0.032 0.019

Statistica dei B-factor:

Catene principali dell’enzima 15.196 48.085 Catene laterali dell’enzima 24.740 52.765

Molecole di acqua 27.365 43.048

Altri atomi di solvente 47.250

Inibitore 62.3

Tabella 3. Statistiche di affinamento per la struttura del peptide KE1 e per quella del complesso con Avidina-bioconiugato.

RISULTATI e DISCUSSIONE