Regione dei flap

Le maggiori differenze strutturali che si ritrovano fra le diverse forme cristalline della proteasi da HIV studiate tramite diffrazione di raggi X e depositate nel Protein Data Bank, si manifestano essenzialmente a livello dei flap che rivestono un ruolo critico nel legame della proteasi con substrati ed inibitori. Sulla mobilità di queste regioni è da considerare anche l’effetto delle mutazioni che alterano i contatti che stabilizzano le forme chiuse o aperte dell’enzima. Infatti, molti dei residui che costituiscono i flap, pur non essendo coinvolti in contatti diretti con il substrato, influenzano in modo significativo l’attività dell’enzima. Mutazioni anche in queste posizioni della proteina possono modificare in modo significativo la stabilità dei complessi enzima/inibitore e conferire resistenza ai farmaci come conseguenza di una diversa capacità dei flap di cambiare conformazione aprendosi per permettere l’accesso al sito di legame dell’inibitore, come è dimostrato da un recente confronto tra i complessi HIV-Amprenavir e HIV-Saquinavir (Shen C.H. 2010). Dalla sovrapposizione di tutte queste strutture è possibile catalogare la conformazione di questo enzima in tre famiglie.

CLOSED è la conformazione più compatta della proteina ed è quella riscontrata nel momento in cui la proteina lega S, in quanto ottimizza i contatti con la molecola che occupa il canale catalitico. L’impaccamento dei flap è così stretto che sono presenti contatti energeticamente favorevoli che rompono la simmetria C2, fenomeno che si riscontra anche in presenza dell’inibitore legato. La conformazione chiusa è stabilizzata in modo significativo anche da diversi legami ad idrogeno con molecole d’acqua e da contatti idrofobici, come Ile50-Ile54.

OPEN è la conformazione in cui i flap distano circa 8Å l’uno dall’altro e sono assenti i contatti tra i residui delle due catene. La sovrapposizione delle strutture aperte e chiuse mostra uno spostamento traslazionale dei flap di circa 7Å ed una mutua rotazione di circa 2° attorno all’asse C2 (Wlodawer A. 1989). Simulazioni di dinamica molecolare mostrano che questa conformazione sia è cruciale per l’accesso di S al sito attivo (Tóth G. 2006).

CURLED (arricciata) è la conformazione che raggruppa la maggior parte delle strutture dell’apoproteina che si trovano in letteratura. In queste strutture i flap sono tra loro vicini ed affacciano le catene laterali dei residui compresi tra le posizioni 48 e 53 di entrambi i monomeri. Nonostante la vicinanza in queste strutture non si riscontra la formazione di legami ad idrogeno intradimero. Ciò porta invece alla formazione di contatti idrofobici tra le catene laterali di monomeri diversi consentendo così di mantenere la simmetria C2. Rispetto alla conformazione closed c’è quindi un drastico cambiamento dei contatti accompagnato anche da un certo spostamento traslazionale rispetto al sito attivo. La conformazione curled, intermedia tra le precedenti, è detta anche semi-aperta (Hornak V. 2006).

Questa catalogazione è verificata dai grafici della deviazione standard quadratica media (RMSD), rispetto alla posizione dei residui nella struttura, che sono stati costruiti confrontando la catena principale della struttura con i dati di letteratura (figura 5 sopra). Entrambe le strutture dei complessi con i derivati sulfonammidici usati in questo lavoro, come si riscontra nelle strutture dei complessi Pr-S, appartengono alla famiglia “Closed” (figura 5 sotto). HIVFT99 - 1A2E 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 Residuo R M S D C a HIVFT99 - 1TW7 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 Residuo R M S D C a HIVFT99 - 2G69 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 Residuo R M S D C a

Figura 5. RMSD (sopra) e overlap strutturale (sotto) tra la struttura del complesso con FT99 (presa da esempio) (cartoon oro) e le strutture a più alta risoluzione delle tre famiglie “Closed” (1G6L-giallo), “Curled” (2G69-verde) e “Open” (1TW7-blu).

Andando ad analizzare, tramite il programma LSQ_Kab del pacchetto CCP4i (C.C.P.4 1994) ed il programma di grafica molecolare PyMol, le differenze per singolo residuo tra la struttura del complesso con l’FT99 (presa come esempio) e le strutture a più alta risoluzione delle tre famiglie (1A2E-“Closed”, 2G69-“Curled” e 1TW7-“Open”) si vede che effettivamente queste sono significative (RMSD≅9Å) solo nella regione dei flap e solo per le strutture con flap aperti o arricciati. Proprio a causa della loro mobilità e variabilità strutturale, la zona dei flap è anche la regione della proteina con una maggiore propensione al disordine strutturale (figura 6). Studiando in termini statistici usando il programma GlobPlot (Linding R. 2003) (www.expasy.org) il disordine di una proteina, che è relazionato ai moti termici delle coordinate atomiche sperimentali affinate sulla base delle mappe di densità elettroniche ottenute, si ottiene un grafico in cui, in funzione del residuo si ottiene una valore probabilistico del disordine conformazionale relativo. Il risultato in figura conferma il fatto che i residui aminoacidici con una maggiore propensione ad essere disordinati, visualizzati sul grafico in blu (42-49aa e 141-147aa), si riferiscono conformazionalmente ai β-foglietti dei flap (in rosso).

Figura 6. Disordine conformazionale della proteina. I residui della proteina con una maggiore probabilità di essere disordinati (nel grafico in blu) corrispondono alla regione mobile dei flap (sulla struttura in rosso).

1.3. Impaccamento cristallino

L’impaccamento cristallino è relazionato in modo diretto alla % di solvente presente in cella e alla forma cristallina della molecola stessa. Le strutture della proteasi da HIV, ottenute in complesso con i nuovi inibitori sulfonammidici FT99 e FT107 a valori di risoluzione di 1.93Å e 1.45Å, presentano celle elementari molto simili (riportate nella parte di materiali e metodi) che appartengono al sistema cristallino rombico con simmetria P21212. Dallo studio dell’impaccamento cristallino in corrispondenza degli assi a, b e c, visualizzato per il complesso con l’inibitore FT99 (figura 7) e omologo a quello del complesso con l’FT107, si possono notare gli ampi canali che si formano tra le varie unità proteiche e che vengono riempiti dalle molecole di solvente, quali H2O, DMSO e glicerolo. In particolare osservando la rappresentazione lungo l’asse c (sinistra), si nota che i 2 omodimeri in cella, che sono ruotati di 180° l’uno rispetto all’altro lungo a, sono relazionati ad altri 2 omodimeri lungo b da una traslazione di ½ cella. Lungo l’asse c inoltre, i canali inter-dimeri lasciano maggior spazio all’ingresso del solvente rispetto a quelli che si riscontrano lungo gli assi a (centro) e

b (destra), che mostrano una disposizione molecolare simile. Questa forma cristallina è la più

comunemente trovata per le strutture dei complessi PR-I. In particolare per quanto riguarda i complessi con gli inibitori commerciali di tipo sulfonammidico, da cui sono state ottimizzate le strutture dei due inibitori usati in questo lavoro, solamente il complesso HIV-PR/Darunavir, con codice pdb:3GGT risolto ad una risoluzione di 2Å, cristallizza nel sistema esagonale con simmetria P61 (a=b=62.54Å, c=82.64Å; γ=120°). Per questa struttura l’impaccamento cristallino è che si ottiene è più complesso, dato l’elevato grado di simmetria interna: per ogni molecola indipendente, infatti se ne generano altre 6 relazionate da una rotazione di 30° ed una traslazione di 1/3 di cella. Lo spazio libero per l’ingresso del

solvente è molto limitato lungo gli assi a (centro) e b (destra), che anche in questo caso mostrano un impaccamento simile, mentre lungo c (sinistra) si generano veri e propri canali accessibili. a c b O a b O c a O b

0 0

a

0

b

b a

c c

Figura 7. Impaccamento cristallino (a) della forma rombica P21212 sperimentalmente ottenuta per i complessi con FT99 e FT107 lungo l’asse c, a e b, rispettivamente, e (b) della forma esagonale ottenuta per il complesso con il farmaco Darunavir (3ggt).