Il core proteico

Il gruppo eme c è legato alla proteina tramite due legami covalenti che si formano tra i gruppi etile, presenti su due sostituenti degli anelli imidazolici della porfirina, e quelli tiolici delle catene laterali delle citate cisteine (Cys14 e Cys17) ed è di tipo tioetereo. Le lunghezze medie del legame sulle tre catene fra questi gruppi hanno valori diversi per i due legami tioeterei: per i legami formati con i sostituenti dell’anello B della porfirina, le distanze misurate tra l’atomo di zolfo della Cys14 ed il carbonio ad esso legato del gruppo etile è di 1.80Å, nella forma ossidata, e 1.78Å, nella forma ridotta; nel caso del legame tioetereo formato con il sostituente dell’anello C della porfirina, le distanze medie sono di 2.06Å, nella forma ossidata, e 2.07Å, nella forma ridotta, misurate tra l’atomo di zolfo della Cys17 ed il carbonio del gruppo etile. Lo ione ferro, al centro del gruppo eme (figura 2b), è esa- coordinato: nelle posizioni equatoriali forma legami di coordinazione con gli atomi di azoto degli anelli pirrolici del gruppo eme, mentre nelle posizioni assiali forma legami con l’atomo di azoto del gruppo imidazolico della His18 e con l’atomo di zolfo della Met80. La media delle lunghezze di legame fra il ferro e l’atomo di azoto di His18 sono 2.01Å e 1.97Å, rispettivamente nelle forme ossidata e ridotta, mentre quelle tra ferro e l’atomo di zolfo di Met80 sono 2.34Å (forma ossidata) e 2.37Å (forma ridotta). Le lunghezze dei legami di coordinazione del ferro nelle forme ossidata e ridotta, calcolate sulla media delle distanze tra i 4 atomi di azoto (NA, NB, NC e ND) e l’atomo di ferro, assumono infine i valori di 2.05Å e 2.01, rispettivamente.

Il gruppo prostetico è quasi completamente racchiuso all’interno di una tasca idrofobica formata dalla catena polipeptidica. Solo quattro atomi dell’eme, due carboni metilici legati a due anelli pirrolici, denominati CMC e CMD nello schema 1, e due carboni metilici legati al carbonio che forma il legame covalente con i residui di Cys (CBB e CBC), si trovano nella regione esterna, esposti al solvente.

La superficie dell’eme c esposta al solvente, valutata con il programma ASA (Accessible

Surface Area) del pacchetto CCP4 (Murshudov G.N. 1997) e visualizzata in tabella 1, mostra

che solo una frazione della superficie totale dell’eme, calcolata dalla media sulle tre catene e pari a 3.7% (ossidata) e 3.8% (ridotta), può interagire direttamente con le molecole esterne di solvente o con il partner red-ox. Il programma calcola l’area accessibile in cui possono avenire i contatti proteina–solvente, che viene definita sulla base del raggio di una sfera “sonda” usata per monitorare lo spazio delimitato dai raggi di Van der Waals della superficie proteica

Superficie dell’eme C accessibile al solvente (Å2) Mol CAC CBC CMC CMD Hem Tot.Hem %

A 0.60 25.40 4.50 1.30 31.80 853.50 3.7 B 0.50 24.60 6.80 1.20 33.10 860.60 3.8 C 0.90 23.20 5.10 1.10 30.30 854.00 3.5 Fe III Media 0.6 24.4 5.4 1.2 31.73 856.03 3.7 A 0.30 25.20 5.20 1.50 32.30 859.00 3.8 B 1.10 23.80 2.30 2.40 29.60 857.90 3.5 C 0.70 27.40 4.90 2.30 35.30 858.20 4.1 Fe II Media 0.7 25.5 4.1 2.1 32.40 858.36 3.8

Tabella 1. Superficie esposta (Å2) degli atomi del gruppo eme nelle molecole a, b, c per le forme ossidata e ridotta del citocromo c.

I valori ottenuti per l’atomo CBC sull’anello pirrolico variano da 24.4Å2 nella forma ossidata a 25.5Å2 in quella ridotta, suggerendo che l’atomo CBC del gruppo metile, legato all’atomo CAC (implicato nel legame con Cys17), è significativamente un po’ più esposto al solvente nella forma del Ferro- cyt C rispetto a quella del Ferri- cyt C. Non solo la porzione del gruppo eme costituita dall’anello C sporge dall’involucro proteico, ma anche l’atomo di zolfo della Cys17, che lega covalentemente l’anello pirrolico C alla catena proteica, è particolarmente esposto al solvente, con valori pari a 4.1Å2 (ossidata) e 4.4Å2 (ridotta), simili a quelli che si riscontano per il cyt C da Tuna, 2.1Å2 per la forma ossidata (pdb:3CYT) e 3.8Å2 per quella ridotta (pdb:5CYT).

Studiando a livello prettamente strutturale le differenze nella regione del core si osservano variazioni significative a livello dei legami covalenti, legami ad idrogeno o interazioni di natura più debole che si generano tra gli atomi dell’eme C e quelli dei residui proteici o del solvente. Queste variazioni possono essere correlate alla presenza di una molecola di acqua,

in un sito analogo a quello occupato da una molecola di solvente nelle strutture di citocromi batterici e la cui diversa posizione tra forma ossidata e ridotta è stata associata alla variazione dello stato di ossidazione (Sogabe S. 1995). Anche nell’H.H. cyt C, la stessa molecola d’acqua mostra una variazione significativa della sua posizione tra le due forme (figura 3). L’importanza di questa molecola d’acqua, presente in un sito adiacente al gruppo prostetico, è dovuta al fatto che forma legami ad idrogeno con i gruppi ossidrilici della Tyr67 (che forma a sua volta un legame ad idrogeno con la Met80) e della Thr78, e con il gruppo carbonilico della Asn52 (figura 3). La variazione della posizione determina anche un cambiamento del network di legami ad idrogeno tra le due strutture, con differenze nelle distanze di legame di 0.1-0.2Å, valore significativo per strutture a questa risoluzione. Nella forma ossidata, il legame ad idrogeno che si forma fra l’OH della Thr78 e la molecola d’acqua è pari a 2.82Å, mentre nella forma ridotta la stessa interazione misura 2.61Å (figura 3). Il legame ad idrogeno fra l’OH della Tyr67 e l’acqua è pari a 3.06Å (ossidata) e a 2.87Å (ridotta) (figura 3). Le lunghezze di legame tra l’OH della Tyr67 e l’S della Met80 sono invece 3.10Å (ossidata) e 3.16Å (ridotta) (figura 3). Il terzo legame che coinvolge la molecola di acqua è un altro legame ad idrogeno con i gruppi C=O (ossidata) e N-H2 (ridotta) dell’Asn52; in questo caso le distanze di legame, che coinvolgono gruppi differenti, misurano 2.76Å nella forma ossidata (legame O-O) e 3.04Å nella forma ridotta (legame N-O). Il residuo di asparagina è il più interessato dalla variazione del network, in quanto esso presenta due differenti conformazioni che dipendono dallo stato di ossidazione, come si può vedere in figura. Considerando che i fattori di scattering per gli atomi di ossigeno e azoto sono molto simili, per attribuire la corretta conformazione del residuo e quindi il corretto schema di legami ad idrogeno sono stati confrontati i moti termici dei due atomi (N_δ e O_δ1) in relazione alla formazione di un legame ad idrogeno con l’H2O, considerando che un valore più basso del fattore termico B è previsto per l’atomo implicato nel legame. Nell’affinamento condotto introducendo nel modello della forma ridotta una interazione via N sono stati ottenuti i valori B[N_δ2]=7.3 e B[O_δ1]=8.2; utilizzando, invece, un modello con gli atomi scambiati l’affinamento ha portato a valori pari a B[N_δ2]=6.7 e B[O_δ1]=8.2. Nel primo caso il fattore termico dell’atomo N_δ2, significativamente più basso rispetto a quello dell’atomo O_δ1, è giustificato dal fatto che l’atomo del gruppo amminico è coinvolto nel legame ad idrogeno con la molecola d’acqua ed è perciò stabilizzato da questa interazione. Nel secondo caso, in cui il legame ad idrogeno con la molecola d’acqua si forma attraverso l’ossigeno carbossilico, in base a considerazioni chimiche, è attesa una relazione di tipo B[O_δ1]<B[N_δ2] tra i due moti termici, a causa dell’aggiuntiva stabilizzazione dovuta al legame ad idrogeno. Il risultato ottenuto dall’affinamento, tuttavia, non è compatibile con le

precedenti considerazioni. Si conclude perciò che la corretta conformazione della catena laterale dell’Asn52 nella struttura della forma ridotta sia quella mostrata in figura 3b. È da notare che nella struttura del ferro- cyt C questa interazione forte coinvolge un atomo donatore di legame (Nδ2), mentre il caso contrario (atomo accettore Oδ1) avviene per il ferro- cyt C. Generalmente i legami ad idrogeno NH
O sono più deboli dei legami OH
O e questo suggerisce che il cambio di conformazione della catena laterale della Asn52 porti ad una stabilizzazione relativa della forma ossidata rispetto a ciò che avviene per la forma ridotta, con un conseguente abbassamento del potenziale di riduzione. La forza relativa di questi legami ad idrogeno si riflette anche sulla posizione della molecola d’acqua nelle due forme.

Figura 3. Network di legami ad idrogeno in prossimità dell’eme c nel ferri- (a) e ferro- (b) cyt C.