RISULTATI e DISCUSSIONE A. IL BIORECETTORE KE1
B. IL COMPLESSO CON L’AVIDINA
1.1. Struttura primaria e secondaria
L’avidina appartiene alla famiglia e superfamiglia delle proteine streptavidina-avidina della classe delle β-proteine con fold tipo streptavidina. In questa famiglia del database SCOOP si possono trovare 40 catene proteiche con omologia strutturale >95%, alcune delle quali si riferiscono alla stessa proteina, la cui struttura è stata determinata in presenza di diversi leganti. Alla classe delle β-proteine appartengono anche gli enzimi con dominio tipo β -sandwich delle immunoglobuline, alcuni superantigeni, le proteine dell’olfatto, le proteine con motivo tipo chaperon-HSP-20 e gli enzimi con fold tipo Tumor Necrosis Factor.
L’avidina è una proteina composta di 128 aminoacidi con formula molecolare C627H992N180O197S4.
Di seguito è visualizzata la sequenza primaria della avidina sperimentalmente determinata in questo lavoro, in cui le posizioni del residuo all’N terminale e di 4 residui al C-terminale non sono state identificate a causa dell’alta mobilità di queste zone. Come descritto nella parte sperimentale, seguendo le mappe di densità elettronica e partendo dal modello isomorfo con codice 1AVD, sono stati aggiunti gli aminoacidi Arg2 e Lys3 che mancavano dalla struttura all’N-terminale e gli aminoacidi Leu123e Arg124 al C-terminale.
Dall’analisi delle mappe alla risoluzione ottenuta non è stato possibile determinate la presenza dei restanti residui per completare la sequenza completa. Le percentuali di ogni singolo aminoacido sono state calcolate dalla sequenza ottenuta (figura 2) con ProtParam e sono 3.9% Ala, 6.2% Arg, 7.8% Asn, 3.9% Asp, 1.6% Pro, Cys e Met, 2.3% Gln, 5.5% Glu, Ile, Leu, Phe e Val, 8.6% Gly, 0.8% His e Tyr, 7.0% Lys e Ser, 3.1% Trp ed infine 16.4% Thr. Il punto isoelettrico di 9.51 conferisce proprietà basiche alla proteina ed è dovuto principalmente alla presenza di aminoacidi carichi positivamente (16 tra Arg e Lys) e negativamente (11 tra Asp e Glu). Il peso molecolare calcolato è di 14332.10Da per monomero, il coefficiente di estinzione molare a 280nm 23615M-1cm-1, l’indice alifatico 62.42 e il valore di idrofobicità -0.557. L’indice di instabilità, stimato a 23.63, permette statisticamente di classificare l’avidina come una proteina stabile che presenta alcuni potenziali siti di glicosilazione sulle treonine 34, 35, 38, 40 e 52.
1 20 40 60
RKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTENTVNKRTQPT
80 100 124
FGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLR
Figura 2. Sequenza primaria della Avidina cristallizzata. I residui carichi positivamente sono evidenziati in blu, in azzurro quelli basici, in viola quelli carichi negativamente, in rosa quelli acidi ed infine in giallo Cys e Met.
Con il programma DALI (Holm L. 2010), sulla base della sequenza è stata effettuata una analisi strutturale per omologia con le proteine sopra citate, ottenendo elevati valori di identità di sequenza (>95%) e di omologia strutturale (>97%) (figura 3). Dal punto di vista strutturale sono evidenziate in blu 8 regioni tipo β-foglietto, 9 regioni tipo loop in verde chiaro e 1 regione tipo α-elica in verde scuro (H), che risultano ben conservate in tutte le strutture analizzate. Alcune regioni in cui sono presenti gaps sono riconducibili ad aminoacidi non determinati sperimentalmente a causa del disordine interno associato anche alla bassa risoluzione dei dati ottenuti per le singole strutture.
Usando invece i programmi Procheck (Laskowski R.A. 1993) di CCP4 e ProMotif (Hutchinson E.G. 1996) è stata analizzata, sulla base delle coordinate del modello affinato sulle mappe di densità elettronica, la struttura secondaria della avidina.
Sequenze
Avis RKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAVTATSNE-IKESPLHGTENTVNKRTQPTFGF 1avd RKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAVTATSNE-IKESPLHGTENTINKRTQPTFGF 2avi -KCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAVTATSNE-IKESPLHGTENTINKRTQPTFGF 3fdc -KCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAVTATSNE-IKESPLHGTENT--KRTQPTFGF 1ij8 -KCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAV---tNE-IKESPLHGTENTINKRTQPTFGF 1ldo -KCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTAVTATSNE-IKESPLHGTENTINKRTQPTFGF 1ldq -KCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTA---ESPLHGTENTINKRTQPTFGF 1lel -KCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYTTA---E-IKESPLHGTENTINKRTQPTFGF Avis TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLR- 1avd TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRt 2avi TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRL-- 3fdc TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRL-- 1ij8 TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRL-- 1ldo TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRL-- 1ldq TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRL-- 1lel TVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRL-- Strutture
Avis LLLLLLEEEELLLLLEEEELLLLLLLEEEEEEELLLLLLLLL-LLLEEEEEEELLLLLLLLLEEEEEEE 1avd LLLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEELLLLLLLLL-LLLEEEEEEELLLLLLLLLEEEEEEE 2avi -LLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEELLLLLLLLL-LLLEEEEEEELLLLLLLLLEEEEEEE 3fdc -LLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEELLLLLLLLL-LLLLEEEEEELL--LLLLLEEEEEEE 1ij8 -LLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEEEEL---lLL-EEEEEEEEEELLHHHLLLLEEEEEEE 1ldo -LLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEELLLLLLLLL-LLLEEEEEEELLHHHLLLLEEEEEEE 1ldq -LLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEELL---LEEEEEEELLLLLLLLLEEEEEEE 1lel -LLLLLEEEEELLLLEEEELLLLLLLEEEEEEEEL---L-LEEEEEEEEELLLLLLLLLEEEEEEE Avis LLLLLLEEEEEEEEEELLLLLEEEEEEEEEELLLLLHHHHHHLEEEEEEEEEELL-
1avd LLLLLLEEEEEEEEEELLLLLEEEEEEEEEELLLLLHHHHHHLEEEEEEEEEELLl 2avi LLLLLLEEEEEEEEEEELLLEEEEEEEEEEELLLLLLLLHHHLEEEEEEEEEEL-- 3fdc LLLLLLEEEEEEEEEEELLLEEEEEEEEEEELLLLLLLLLHHHEEEEEEEEELL-- 1ij8 LLLLLLEEEEEEEEEELLLLLEEEEEEEEEELLLLLHHHHHHLEEEEEEEEEEL-- 1ldo LLLLLLEEEEEEEEEELLLLLEEEEEEEEEELLLLLHHHHHHLEEEEEEEEEEL-- 1ldq LLLLLLEEEEEEEEEELLLLLEEEEEEEEEELLLLLLLLHHHLEEEEEEEEEEL-- 1lel LLLLLLEEEEEEEEEEELLLEEEEEEEEEEELLLLLHHHHHHLEEEEEEEEEEL—
Figura 3. Allineamento di sequenza e struttura tra l’avidina sperimentale (avis) e le proteine con codice 1avd, 2avi, 3fdc, 1ij8, 1ldo, 1ldq e 1lel, usando il programma DALI.
Osservando il plot di Ramachandran calcolato sul monomero A (figura 4) si vede che le tre regioni che descrivono la conformazione dei residui aminoacidici della proteina, descritte degli angoli torsionali ψ e φ e corrispondenti alle strutture α-elica, α-elica sinistrorsa e β -foglietto, sono occupate per il 96% da residui posizionati in zone favorite energeticamente per quella determinata conformazione. Il 6.6% dei residui è localizzata in zone non favorite ma comunque permesse dai valori degli angoli torsionali monitorati e solamente lo 0.8% sta in una zona non favorita e non permessa. Questa ultimo valore interessa il residuo di Asn24 che interpreta in maniera corretta la densità elettronica e sembra essere localizzato all’inizio di un
β
-turns tipo I (tabella 1), possibile spiegazione per il suo intrinseco disordineconformazionale. La maggior parte degli aminoacidi è localizzata nella regione del foglietto β, come è dato a pensare essendo l’avidina appartenente alla classe delle β-proteine.
I valori degli angoli diedri che caratterizzano una struttura di questo tipo si differenziano sulla base dell’orientazione parallela o antiparallela che si genera e rientrano nel range tra ψ=113° e φ=-119° e tra ψ=135° e φ=-139°, rispettivamente. Il pattern di legami ad idrogeno
caratteristico di questa struttura differisce da quello presente nelle eliche ed è determinato dall’interazione tra il gruppo C=O del residuo i su un foglietto β ed il gruppo N-H del residuo j sul foglietto β adiacente, che sia esso parallelo o antiparallelo. Lo stesso legame ad idrogeno si può formare con il gruppo N-H del residuo j+1 o j-1; in questo caso il legame viene chiamato wide pair. I valori degli angoli ψ e φ che caratterizzano l’elica sinistrorsa invece misurano circa 47° e 57°, rispettivamente, e interessano solamente due residui.
Figura 4. Plot di Ramachandran per la struttura sperimentale della avidina. Sono visualizzate le conformazioni favorite di ogni singolo residuo (elica α, foglietto β e elica αL) dai valori degli angoli diedri ψ e φ.
Foglietti β (A, B)
8-11 17-20 28-34 47-53
GKWT NMTI EFTGTYT SPLHGTE
63-69 76-85 91-100 113-122
TFGFTVN TTVFTGQCFI EVLKTMWLLR TRVGINIFTR
Eliche 310 Bulges
56-58 106-11 12-15-16 24-27-28 86-89-90
INK IGDDWK NGS NGE DGK
A A,B B B A,B
Hairpins (A, B)
8-20 17-34 28-53 47-69 63-85 76-100 91-122
GKWT NMTI EFTGTYT SPLHGTE TFGFTVN TTVFTGQCFI EVLKTMWLLR
β
-Turns12-15 24-27 55-58 56-59 59-62 70-73 86-89
NDLG NSRG TVNK VNKR RTQP WKFS DRNG
A,B (I) A,B (I) A (II) A (IV) A,B (IV) A,B (I) A,B (I) Tabella 2. Strutture secondarie e motivi supersecondari trovati per la Avidina usando il programma Procheck. Per ogni struttura sono evidenziati il numero e il tipo di residui coinvolti, i monomeri interessati e la tipologia di struttura.
Ci sono in totale 8 foglietti β su entrambi i monomeri e 3 eliche tipo 310 con la formazione di 2 ponti disolfuro tra la cys4 e la cys83 su entrambi i monomeri. L’elica 310 differisce dall’α -elica standard (3.613) per il numero di aminoacidi presenti in un passo d’elica, che sono appunto 10, per la lunghezza del passo e per il suo diametro interno; inoltre il pattern di legami ad idrogeno si verifica tra il residuo i e i+3. Le altre strutture secondarie presenti sono