TRASFERIMENTO ELETTRONICO nei CITOCROMI tipo C
1. Proteine e centri metallici
La presenza di metalli, quali ferro, cobalto, rame, manganese, calcio e zinco, nei sistemi biologici è premessa fondamentale per il corretto funzionamento di molti enzimi, proteine e recettori. Alcune delle più importanti reazioni chimiche che avvengono nella biosfera, quali la conversione dell'energia solare in energia metabolica nel processo della fotosintesi, la degradazione di fonti organiche complesse nel processo di fosforilazione ossidativa e molti importanti processi biosintetici, come le reazioni che intervengono nel meccanismo di fissazione dell'azoto da parte di alcuni organismi ancestrali, sono catalizzate da centri metallici. Il Ferro, ad esempio, si trova in molte proteine ed è usato per il legame con l’ossigeno molecolare ma anche per il trasporto degli elettroni. Lo ione calcio Ca2+, presente nel minerale osseo come idrossilapatite Ca10(PO4)6(OH)2, costituisce anche uno degli elementi fondamentali per la regolazione di processi fisiologici, quali la contrazione muscolare, ed è coinvolto nell’attivazione di numerosi enzimi idrolitici calcio dipendenti (proteasi, topoisomerasi, fosfolipasi). Altri ioni metallici hanno un ruolo nella stabilizzazione della struttura degli acidi nucleici. Infatti, è noto che, sia nelle macromolecole di DNA sia in quelle di tRNA, lo ione magnesio Mg2+ interagisce in posizioni ben specifiche della loro sequenza, contribuendo alla formazione della struttura tridimensionale (Lippard S.J. 1994). Inoltre, un doppio ruolo, strutturale e catalitico, è stato osservato per l’interazione di alcuni metalli con molecole di RNA, quali i ribozimi, che sono in grado di catalizzare reazioni di idrolisi su se stesse o su altre specifiche molecole di RNA (Krasilnikov A.S. 2003). Quando un centro metallico si trova nel sito catalitico di una proteina e, come tale, interviene in modo attivo alla catalisi della reazione, l’intero sistema viene chiamato metalloproteina. Spesso il ruolo del centro metallico è duplice, in quanto oltre alla funzione catalitica, contribuisce a stabilizzare la struttura tridimensionale dell’intera molecola (Fraústo da Silva J.J.R. 1991). Alcuni esempi di reazioni catalizzate da metallo proteine sono il trasferimento elettronico e la catalisi di reazioni di ossidoriduzione (riduzione di N2 a NH3, ossidazione di H2O a O2 e reazione opposta di riduzione di ossigeno molecolare ad acqua) (Barynin V.V. 2001; Mckee M.L. 2007), il trasporto e lo scambio intercellulare di O2 mediati da proteine globulari (emoglobina e mioglobina) (Mazzarella L. 2006), la regolazione dell’espressione genica attraverso fattori di trascrizione che contengono Zinco (zinc-finger o LeuZipper) (Godwin M. 1997).
Altri esempi sono il trasferimento e riarrangiamento di gruppi funzionali in reazioni di catalisi enzimatica, come le reazioni di metilazione catalizzate dalla vitamina B12 (Toohey J.I. 2006) e il corretto ripiegamento di alcune proteine (folding proteico) e degli acidi nucleici catalizzato da ioni metallici che ne stabilizzano la struttura (Lippard S.J. 1994). Le principali classi di proteine che richiedono la presenza di un centro metallico sono riportate nella Tabella 1. Carbossipeptidasi Zn Fosfatasi Zn, Cu Mg Idrolisi Amminopeptidasi Mg, Mn Ossigenasi, Idrogenasi Fe Nitrogenasi Mo
Ossidasi, Riduttasi, Idrossilasi Fe, Cu, Mo
Ossido-Riduttasi
Superossido dismutasi Zn, Cu, Mo
Aconitasi, EndoIII Fe
Enzimi
Isomerasi-Sintasi Vitamina B12, Coenzimi B12 Co
Citocromi Fe-S Fe, S
Trasporto di e -Citocromi blu Cu Cu Ferritina, Transferrina Fe Ceruloplasmina Cu Deposito metalli Metallotioneina Zn, Hg Proteine trasporto/deposito
Leganti l’O2 Emoglobina, Mioglobina,
Emocianina Fe
Tabella 1. Principali metalloproteine: classe, famiglia, nome e metallo coordinato.
Lo sviluppo evolutivo di sistemi biologici che utilizzano un metallo piuttosto che un altro o differenti geometrie di coordinazione può essere razionalizzato considerando che, per garantire la funzionalità del sistema, i centri attivi delle macromolecole a cui gli ioni metallici sono complessati devono formare unità labili dal punto di vista cinetico e stabili dal punto di vista termodinamico. La labilità permette la rapida formazione del legame con i substrati e la rapida dissociazione dei prodotti della reazione enzimatica. La stabilità termodinamica, invece, permette l’utilizzo della metallo proteina in più cicli catalitici. In particolare, per le metalloproteine trasportatrici di elettroni, è richiesta la stabilità del metallo in diversi stati di ossidazione. Questo garantisce una elevata efficienza d’azione che permette di ridurre al minimo la dissipazione di energia nella catena di trasportatori e il rilascio di elettroni per reazioni secondarie, con la formazione di specie altamente reattive. In Tabella 2 sono riportati i potenziali di riduzione di alcuni ioni metallici presenti nei sistemi biologici.
Tra i metalli mostrati in Tabella 2 spicca per importanza strutturale e funzionale il ferro, che oltre ad essere il più abbondante metallo di transizione sulla terra è anche un importante costituente di molti sistemi bioinorganici. Esso risulta perciò un elemento indispensabile per la maggior parte degli organismi viventi. Il ferro presenta due stati di ossidazione stabili,
Fe(II) e Fe(III), ed una geometria di coordinazione preferenziale ottaedrica, con sei siti di legame. Questo metallo forma complessi molto stabili con leganti che hanno l'azoto come atomo donatore, come ad esempio gli anelli porfirinici nelle proteine che trasportano l’O2 nel sangue, quali emoglobina e mioglobina. Il ferro è incorporato nelle metalloproteine anche attraverso il legame di residui aminoacidici al centro metallico. Un particolare esempio di questa complessazione è rappresentato dal motivo supersecondario four-helix bundle che si osserva in alcune proteine deputate al trasporto di O2, alla conversione del metano in metanolo e alla riduzione di ribonucleotidi a deossiribonucleotidi (Nordlund P. 1995).
Specie E° (V)
Cu2+ + e- Cu+ +0.153
Fe3+ +
e-
Fe2+ +0.771Mn3+ + e- Mn2+ +1.510
Co3+ + e- Co2+ +1.842
Tabella 2. Potenziali di riduzione, a pH 7 e a 25°C in soluzione acquosa, riportati rispetto all’elettrodo standard ad idrogeno (NHE), per alcuni dei più importanti ioni metallici con attività ossidoriduttiva nei sistemi biologici (Lippard S.J. 1994).
1.1. Le eme-proteine
Come accennato sopra, nelle metalloproteine la coordinazione degli specifici ioni avviene tramite gruppi prostatici o legami con catene laterali di alcuni residui aminoacidici. Tra questi, sono frequenti i legami di metalli con il gruppo tiolato di Cys, con l’anello imidazolico di His, con i gruppi carbossilato di Asp e Glu e il gruppo fenolato di Tyr, mentre meno frequenti sono le coordinazioni con il gruppo ossidrilico di Ser e Thr, tioetereo di Met, carbossiammidico di Gln e Asn o amminico di Lys. In questo caso le combinazioni amminoacido/metallo, con il relativo stato di ossidazione, che si trovano più di frequente nelle metalloproteine (Fraústo da Silva J.J.R. 1991) sono:
Cys Zn(II), Cu(I-II), Fe(II-III), Mo(IV-VI), Ni(I-III), Cd(II) Glu e Asp Fe(II-III), Mn(II-III), Zn(II), Mg(II), Ca(II) His Zn(II), Cu(I-II), Fe(II), Cd(II), Mn(II)
Met Fe(II-III), Cu(I-II), Cd(II) Tyr Fe(III)
La coordinazione di metalli può avvenire anche tramite cluster, come avviene per le proteine Fe/S e per la ferritina (Lippard S.J. 1994; Cotton F.A. 1999), oppure tramite gruppi prostatici, come macrocicli di tipo porfirinico o corrinico. Esempi di questo tipo di coordinazione sono le emeproteine e le clorofille. In quest’ultimo caso, le funzioni delle metalloproteine sono la catalisi di reazioni di trasferimento di elettroni (citocromi b e c),
trasporto e immagazzinamento di O2, (emoglobina e mioglobina), riduzione di ossigeno molecolare ad acqua (citocromo ossidasi), ossigenazione di substrati organici (monoossigenasi tipo citocromi P-450) e catalisi di reazioni di riduzione di perossidi (catalasi e perossidasi). La Tabella 3 mostra 9 differenti emeproteine. È subito evidente una notevole variabilità funzionale per questa classe di proteine.
Proteina MM (kDa) Complessi Fe-eme Funzione biologica
Emoglobina 64.5 4 Trasporto O2
Mioglobina 17.8 1 Accumulo O2
Catalasi 260 4 Metabolismo H2O2
Perossidasi Variabile 1 Metabolismo H2O2
Citocromo P450 50 1 Ossidazione di O2
Citocromo a3 11.7 1 Trasferimento e
-Citocromo-c 12.5 1 Trasferimento e
-DHP 17.5 2 Legame O2
SHP 13.4 1 Legame O2
Tabella 3. Funzioni biologiche delle principali emeproteine, loro massa molecolare e numero di complessi ferro-porfirina presenti.
Il gruppo eme in questo senso può essere considerato il centro ossidoriduttivo più versatile in biologia. La versatilità delle emeproteine naturali deriva dalle differenze presenti sia nelle catene polipeptidiche sia nei gruppi eme, i più comuni dei quali sono riportati in Figura 1a. Il gruppo prostatico eme a costituisce il cofattore dei citocromi a e a3 appartenenti al complesso della citocromo ossidasi. L’eme b è il gruppo prostetico della mioglobina, dell’emoglobina, delle catalasi, della maggior parte delle perossidasi, dei citocromi di tipo b e dei citocromi di tipo P-450. L’eme c è il gruppo prostetico dei citocromi di tipo c ed, infine, l’eme d1 si trova come gruppo prostetico nelle nitrito riduttasi chiamate citocromi cd1. L’interazione dei vari gruppi eme con altri cofattori (flavine) e con altri vari ioni metallici (molibdeno e rame, oltre al ferro) permette a questo gruppo di partecipare ad un più ampio range di processi enzimatici, quali reazioni di deidrogenazione e di riduzione di piccole molecole.
Nello studio delle caratteristiche e delle funzionalità di questi gruppi, sono state anche disegnate metalloproteine artificiali, come il Mimocromo IV (Di Costanzo L. 2004) che contiene un gruppo eme tipo c legato ad un atomo di Co(III) (Figura 1b).
Un ruolo cruciale per la reattività delle emeproteine è giocato dalla natura del legame fra il ferro dell’eme e la proteina stessa. In alcuni casi, oltre ai quattro siti equatoriali occupati dell’anello porfirinico, il quinto e/o il sesto sito di coordinazione, rimangono liberi o vengono legati in modo labile da acqua, in modo da essere disponibili per legare molecole esogene. Questo è il caso, ad esempio, di alcune proteine della classe HTHP (Hexameric
Tyrosine coordinated Heme Protein) con attività catalasica e peossidasica (Jae-Hun J. 2007). Nei
citocromi, invece, il ferro si trova sempre esacoordinato con una configurazione elettronica a basso spin e racchiuso all’interno di una cavità idrofobica (Sadler P.J. 1997). Ad esempio, il citocromo b5, una proteina transmembrana del reticolo endoplasmatico che gioca un ruolo chiave assieme al citocromo P-450 nella catena di trasporto degli elettroni, contiene un gruppo eme il cui ione ferro è coordinato in modo assiale a due residui di istidina, che fanno parte di due domini della proteina con struttura secondaria di tipo α-elica.
N N N N O H O O H O O H H O F e e m e a N N N N O H O O H O F e e m e b a N N N N O H O O H O S (C ys ) S (C ys ) e m e c F e N N N N O H O O H O O O O H O H O O e m e d 1 F e b
A seconda della natura del complesso che forma con la proteina e della eventuale coordinazione con leganti esterni, il gruppo prostetico Fe-eme presenta una notevole varietà di caratteristiche chimico-fisiche. Le proprietà del metallo, infatti, variano a seconda dei gruppi sostituenti presenti sull’anello porfirinico, inoltre, sia nel caso di complessi di Fe3+
che nel caso di complessi di Fe2+, lo stato di spin del ferro dipende dai leganti assiali. La natura idrofobica della superficie della porfirina consente la formazione di forti interazioni idrofobiche, sia con piccole molecole sia con la superficie della proteina, perciò il potenziale di riduzione del metallo dipende anche dalla distribuzione di carica in prossimità del gruppo eme, che varia in relazione al pattern di legami ad idrogeno e alle distorsioni geometriche dei residui stessi che legano il gruppo prostetico.