Struttura terziaria

La struttura terziaria della avidina è caratterizzata da un

β

che ne determina il folding finale (figura 5).

Figura 5. Struttura sperimentale β-Sheet ANTI tipo β-Barrel (a) (struttura terziaria)

dell’omodimero (b) (struttura quaternaria) per il complesso avidina-BCG. E’ visualizzata la mappa di densità elettronica 2Fo-Fc, calcolata per il conformero BCGC sul monomero A (cartoon), e i principali residui che formano interazioni con il legante (lines).

La così chiamata tipologia β-barrel è caratterizzata da un insieme di β-sheet che si attorcigliano e si avvolgono a formare un sistema compatto e chiuso a poro in cui il primo e l’ultimo β-foglietto formano legami ad idrogeno. Generalmente in questo tipo di strutture terziarie i foglietti β sono orientati in modo antiparallelo e i residui idrofobici stanno verso il

lato interno, generando una cavità apolare che può diventare sito di legame per molte molecole. La facciata esterna del barile è invece caratterizzata da residui polari o carichi che formano interazioni elettrostatiche o legami ad idrogeno con le molecole di solvente. I β -barrels sono classificati in tre categorie, chiamate Up and down, Greek key e Jelly roll.

La prima categoria è la più semplice struttura a barile ed è determinata da una serie di legami ad idrogeno che si generano tra foglietti β di aminoacidi consecutivi. La seconda invece si forma quando si ottengono β-sheet tra foglietto non adiacenti, dunque quando i legami ad idrogeno che generano il β-sheet avvengono tra residui distanti nella sequenza. La terza ed ultima categoria si forma quando 4 paia di β-sheet antiparalleli, di cui solamente uno presenta una sequenza adiacente, si aggregano formando un vero e proprio barile. In natura queste strutture sono caratteristiche di molte proteine di membrana, tra cui le porine, trasportatori di ioni o piccole molecole che non sono in grado di passare attraverso la membrana cellulare, ma anche di proteine come le lipocaline, che trasportano molecole idrofobiche. La struttura tridimensionale della avidina è visualizzata in figura 5.

Dall’analisi delle mappe di densità elettronica, in particolare dalla mappa 2Fo-Fc è stato possibile determinare la presenza della molecola di bioconiugato nel sito di legame della proteina che, come mostrato in figura, è stato trovato disordinato. In particolare non è stato, infatti, possibile determinare in maniera univoca la posizione dell’estremità caffeinica del legante. Essendo la struttura quaternaria dell’avidina caratterizzata da un omodimero (figura 8), in ogni singolo monomero è stata posizionata la molecola di bioconiugato nel sito.

In questo senso sono state assegnate 3 configurazioni al BCG, una singola configurazione sul monomero A (chiamata C) e 2 differenti configurazioni per il monomero B (D ed E). Mentre i conformeri C e D, descritti dalla densità elettronica sperimentale, assumono posizioni molto simili tra loro, il conformero E mostra una diversa disposizione degli atomi che appartengono alla regione del linker e della molecola di caffeina, che è orientata in modo perpendicolare rispetto a quella dei conformeri C eD. La regione del bioconiugato composta dalla molecola di biotina è stata invece trovata ordinata e conservata nei due monomeri. Le interazioni elettrostatiche, quelle idrofobiche ed i legami ad idrogeno che si generano sono molteplici e sono rappresentate, per i 3 conformeri, in figura 6.

a

c

Figura 6. Contatti tra i residui della proteina avidina e i tre conformeri del bioconiugato effettuati con il programma LigPlot. Sono rappresentate le interazioni deboli ed i legami ad idrogeno tra il conformero C e i residui del monomero A (a), il conformero D e il monomero B (b) ed infine il conformero E ed il monomero B (c).

Come detto sopra le interazioni conservate sono rappresentate dai residui che entrano in contatto con la porzione biotinilata del coniugato. I principali legami ad idrogeno in questa regione si formano tra gli ossidrili della Ser16, Thr77 e Tyr33 e gli atomi O41, N40 e S33 del legante, tra il gruppo NH della Ala39 e l’atomo O29 e tra l’ossidrile della Ser75 e l’atomo N20 del BCG. Quest’ultimo contatto, definisce in particolare la regione del 3° loop sulla proteina. In uno studio recente, infatti, è stato dimostrato come la regione del loop 3-4 possa essere trovata disordinata in alcune strutture dei complessi dell’avidina con leganti derivati dalla biotina, così come avviene per la forma non complessata (Pazy Y. 2002). In particolare si è visto che piccoli cambiamenti nella struttura del derivato, quale anche la semplice aggiunta di gruppi CH2 come nel passaggio da biotina a norbiotina e poi a homobiotina, comportano la perdita del network di legami ad idrogeno in questa zona e causano lo spostamento dell’intero loop che di conseguenza si trova in una configurazione disordinata e quindi difficilmente determinabile sperimentalmente. Le interazioni idrofobiche nella regione conservata si formano con i residui di Val39, Leu14 e 99 e Asn12 e 118, mentre le interazioni tipo

π

idrofobiche. Un interessante legame ad idrogeno si ha tra l’atomo O28 ed il gruppo OH della Ser73 o il gruppo NH del Glu74. Questi due residui, assieme alla Ser75, definiscono la regione del 5° loop. Le principali interazioni che caratterizzano i 3 conformeri sono visualizzate in tabella 3. Interazioni Avidina BCG Conformero C – Monomero A Conformero D – Monomero B Conformero E – Monomero B

BCG _(tipo/atomo) ^{RESIDUO Distanza} _(Å) BCG _(tipo/atomo) ^{RESIDUO Distanza} _(Å) BCG _(tipo/atomo) ^{RESIDUO Distanza} _(Å) N14 Ser 73 OG 3.80 N9 Thr 40 OG1 4.68 N14 Thr 40 OG1 3.09

C18 Ser 101 OG 3.54 N14 Glu 74 N 3.78 C15 Thr 40 CB 3.51

N20 Ser 75 OG 3.07 N20 Ser 75 OG 2.80 C17 Ser 101 OG 4.00 C21 Thr 38 CG2 3.78 C21 Thr 38 CG2 4.23 Arg 114

NH2

3.17 C22 Phe 72 CE2 3.48 C22 Thr 38 CG2 3.41 C19 Ala 39 CB 3.86 C23 Trp 70 CE2 3.36 C23 Phe 72 CZ 4.57 N20 Ser 75 OG 3.67 C25 Trp 70 CZ2 3.68 O27 Ser 41 OG 2.84 C21 Thr 38 CB 3.76

O26 Ser 41 N 2.50 O28 Ser 73 OG 2.88 C22 Phe 72 CE2 3.78

O28 Ser 73 OG 2.98 Glu 74 N 2.82 C24 Trp 70 CE2 3.42 Glu 74 N 3.27 O29 Ala 39 N 3.25 C25 Thr 35 CB 3.86 O29 Ala 39 N 3.21 C31 Asn 42 CG 4.42 O27 Ser 41 OG 4.39 S33 Thr 77 OG1 3.42 S33 Thr 77 OG1 3.13 O28 Thr 40 OG1 2.87 C34 Trp 97 CD2 3.45 C34 Trp 97 CD2 3.45 Ser 73 OG 3.42 N38 Asn 118 OD1 3.00 N38 Asn 118 OD1 3.00 Glu 74 N 4.13 N40 Thr 35 OG1 2.87 N40 Thr 35 OG1 2.87 O29 Ala 39 N 3.22 O41 Asn 12 ND2 2.76 O41 Asn 12 ND2 3.75 S33 Thr 77 OG1 3.34 Ser 16 OG 2.65 Ser 16 OG 2.30 C34 Trp 97 CE2 3.30 Tyr 33 OH 2.56 Tyr 33 OH 3.59 N38 Asn 118 OD1 3.05 N40 Thr 35 OG1 2.97 O41 Asn 12 ND2 3.66 Ser 16 OG 2.87 Tyr 33 OH 2.67 Tabella 3. Legami ad idrogeno e principali interazioni elettrostatiche ed idrofobiche tra i residui dell’avidina e i tre conformeri del bioconiugato (C, D ed E). Le interazioni visualizzate in grasseto sono peculiari del singolo conformero.

1.2.1. La regione L3-L5

I loop sono le strutture secondarie maggiormente soggette a variazioni strutturali. All’interno di una proteina è possibile trovare lo stesso loop disposto in maniere differenti: questo può essere causato per esempio dalle diverse condizioni di cristallizzazione (come nelle forme isomorfe di una stessa proteina), da diversi possibili leganti esogeni (molecole con proprietà chimiche e funzionali diverse) o dal disordine strutturale intrinseco del cristallo (le regioni superficiali maggiormente esposte al solvente risultano spesso più disordinate). È possibile inoltre che all’interno della stessa struttura proteica, tra monomeri uguali, vengano trovati residui ordinati su alcuni monomeri e disordinati su altri (Barker K.D. 2009). È proprio questa la situazione che caratterizza l’avidina. Tra le strutture determinate nel PDB e riportate in tabella 1, infatti, si riscontra che in alcune la regione tra il 2° e 4° loop sia disordinata e non sia stato possibile dunque determinare la posizione dei

residui in essa. In particolare questo avviene per i complessi della proteina con l’homobotina, il BNI ed il B-Cap, dove non sono determinati gli aminoacidi che compongono il 3° loop e dove viene perso il caratteristico pattern di legami ad idrogeno che coinvolge la Ala39 e le Ser73 e 75. Questa situazione accade anche per la forma non complessata (Pazy Y. 2002). In figura 7 è mostrato il confronto della regione L3-L5 con le strutture 1avd, 1ldo, avi-BCG, 3fdc, 1ldq, 1lel e 1ij8. Come si nota, a differenza di ciò che accade per i 3 complessi sopra citati, quelli ottenuti in presenza di Biotina, Norbiotina e BTF mostrano tutti i residui nel loop e con esse anche il caratteristico pattern di legami ad idrogeno. Anche per il complesso avidina-BCG si ha lo stesso risultato. Una possibile spiegazione di questa situazione può derivare dall’ulteriore osservazione che ciò che differenzia le due situazioni (ordine/disordine del loop 3) è la disposizione dei leganti nel sito ed in particolare la posizione degli atomi coinvolti nei legami ad idrogeno. Nelle 4 strutture dove i residui del loop 3 sono ordinati, e quindi determinati, si ha la formazione di un legame ad idrogeno tra l’atomo donatore NH della Ala39 e l’atomo accettore C=O del legante, mentre in quelle dove c’è disordine strutturale il gruppo carbossilico del coniugato è rivolto a formare un legame con l’ossidrile della Ser75. Anche nei complessi con Biotina, Norbiotina e BTF questo residuo interagisce con il gruppo carbossilico accettore del legante che è rivolto verso quella direzione. Nel complesso avidina-BCG invece, il residuo di Ser75 interagisce fino a 3.1Å con il gruppo ammidico accettore. Essendo il legame ad idrogeno tra la coppia N-H
C=O più forte rispetto a quello tra la coppia O-H
C=O, è possibile che le strutture in cui quest’ultimo è presente siano meno stabili dal punto di vista conformazionale e quindi mostrino maggior disordine in questa regione.

Anche dunque un piccolo cambiamento nella struttura del legante può causare una variazione strutturale considerevole a livello proteico ed una possibile spiegazione che qui è offerta è data dall’importanza del network di legami ad idrogeno e dalle interazioni che il legante stesso forma con i gruppi carichi o idrofobici dei residui sulla proteina. La somma delle interazioni elettrostatiche e di quelle idrofobiche risultano quindi di fondamentale importanza per la stabilità di sistemi proteina-legante e questo gioca un ruolo chiave all’interno di uno studio di modellazione e progettazione molecolare mirato allo sviluppo di nuove molecole leganti con elevata affinità per l’avidina che ha importanti risvolti nell’ambito della chimica immunologica, biochimica e immunoistochimica.

Biotina Norbiotin BTF BCG Ala39 Ser75 Glu74 Ala39 Ala39 Ala39 Ser75 Ser75 Ser75 2.9Å 3.8Å 2.9Å 3.2Å 3.1Å 3.3Å 3.2Å Homobiotina B-Cap BNI Ser75 Ser75 Ser75 L3 L3 L3 L5 L3 L5 L5 L3 L3 L3 L5 L5 L5 L5 3.6Å 3.1Å

Figura 7. Confronto della regione L3-L5 con le strutture riportate in tabella 1 (1avd, 1ldo, avi-BCG, 3fdc, 1ldq, 1lel e 1ij8). In cartoon la regione della proteina ed in sticks i leganti.