Cristallizzazione, Raccolta dati e Riduzione

Il processo di cristallizzazione di una proteina o di un composto molecolare in soluzione inizia quando la concentrazione del campione risulta essere superiore rispetto alla concentrazione massima prevista in base alla costante di solubilità, cioè quando il sistema si trova in uno stato di sovrasaturazione. Questa condizione può essere ottenuta per evaporazione del solvente e diffusione di precipitanti volatili in fase di vapore attraverso la tecnica dell’hanging drop. La proteina citocromo c da cuore di cavallo è stata acquistata da Sigma Aldrich (cytochrome c from equine heart con codice C2867) e presenta un grado di purezza ≥ 99%. Cristalli di citocromo c nelle forme ossidata e ridotta sono stati ottenuti presso il laboratorio del Prof. L. Messori dell’Università di Firenze, cocristallizzando la proteina con sali di nitrato. La tecnica di cocristallizzazione permette di ottenere cristalli che contengono anche ioni nitrato, utilizzati in questo studio come sonda. Un altro metodo applicabile a questo scopo è la diffusione degli ioni inorganici nei cristalli di proteina pre-formati, ma con questo secondo metodo una riduzione di cristallinità, potere di diffrazione e risoluzione dei dati cristallografici sono molto probabili. Il Ferricitocromo (forma ossidata) è stato cristallizzato in 0.1M Na2HPO4 pH 7.4 e un largo eccesso di NaNO3, mentre per il ferrocitocromo (forma ridotta) alla stessa soluzione è stata aggiunta una soluzione 10% ditionito per favorire la riduzione del metallo presente all’interno dell’eme.

1.1. Raccolta dati

Per la raccolta dati sui cristalli singoli ottenuti per entrambe le forme è stata utilizzata una sorgente di raggi X convenzionale, di tipo Oxford Diffraction PX Ultra diffractometer con anodo rotante al rame e detector OnixCCD, presente nei Laboratori dell’Università di Firenze. Questa sorgente, del tutto simile a quella presente al CEB, sfrutta l’emissione di fotoni-X da parte di una superficie di rame bombardata da un fascio di elettroni opportunamente accelerati. Gli elettroni incidenti causano la transizione di elettroni del guscio interno degli atomi di rame. Gli stessi elettroni, ritornando ai livelli elettronici fondamentali, emettono una radiazione quantizzata a diverse lunghezze d’onda, dipendenti dal livello elettronico originario. In particolare, nello strumento utilizzato, viene sfruttata una transizione al livello Kα, ad una lunghezza d’onda di 1.54Å). Per evitare il surriscaldamento eccessivo dell’anodo, l’anodo metallico di questo strumento viene fatto

ruotare in modo che il fascio di elettroni colpisca un punto sempre diverso della superficie metallica, rendendo più efficiente il meccanismo di dissipazione del calore. Il cristallo di proteina è stato montato su una testina goniometrica a geometria K come quella presente al CEB (figura 1). Le raccolte dei dati di diffrazione per entrambi i cristalli di citocromo sono state condotte a 100K, mediante un flusso di azoto diretto sulla testina goniometrica. La tecnica del flash cooling, che consiste nel congelamento rapido del campione, unita all’uso di una soluzione di crioprotettore a base di glicerolo 30%, ha permesso di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio, favorendo invece la transizione di fase dell’acqua presente nel campione ad una fase vetrosa. La presenza di cristalli di ghiaccio, che generano a loro volta diffrazione dei raggi-X, è visibile sul diffrattogramma come una serie di cerchi concentrici a ben determinati valori di θ, che si sovrappongono ai riflessi del campione proteico. Le raccolte dei dati di diffrazione presentate in questa tesi sono state effettuate con la tecnica dell’oscillante, con un angolo di rotazione ∆ϕ di 0.5°, per entrambe le strutture, raccogliendo più set di 40-50 immagini ciascuno con tempi di esposizione di 300 s/immagine. Nei diversi set, l’angolo θ del goniometro a geometria K è stato variato.

Figura 1. Diffrattometro ad anodo rotante. Nella figura sono visibili il detector di forma circolare, il sistema criogenico e il goniometro a geometria K; a destra, invece, si vede la sorgente di raggi X ad anodo rotante

1.2. Riduzione dei dati

Nell’ambito di questo progetto sono stati raccolti dati di diffrazione su cristalli di ferri- e ferro-citocromo c da cuore di cavallo. I processi di indicizzazione e integrazione sono stati eseguiti con il programma MOSFLM (Kabsch W. 1988), mentre per la scalatura è stato usato il programma SCALA (Evans P. 1993) da CCP4 (Serc Daresbury 1994). Sono state identificate 2 nuove forme cristalline differenti da quelle riportate nel Protein DataBank

(Berman H. 2000), una forma trigonale per il citocromo ossidato ed un monoclina per quello ridotto. I parametri di cella e le statistiche di scalatura per entrambe le forme cristalline del ferri- e ferro- citocromo c sono visualizzate in tabella 1 e 2, rispettivamente. In alcuni cristalli , sia di proteine che di altri composti molecolari, è possibile che nella cella elementare ci siano più molecole cristallograficamente indipendenti, ovvero che non sono relazionate da elementi di simmetria cristallografici. Esistono in genere altri elementi di simmetria che relazionano queste molecole. Queste operazioni di simmetria sono indicate come pseudosimmetrie o simmetrie non cristallografiche (NCS – Non Crystallographic Symmetry) e comprendono, ad esempio, assi di rotazione e/o traslazioni che non coincidono con gli elementi di simmetria del gruppo spaziale. In entrambe le celle elementari delle strutture riportate in questo lavoro, del ferricitocromo e del ferrocitocromo, sono state individuate 3 molecole di proteina nell’unità asimmetrica.

Ferricitocromo Ferrocitocromo Sistema G. Spaziale Trigonale P3121 Monoclino C2 A (Å) 79.695 90.091 B (Å) 79.695 52.028 C (Å) 89.247 80.733 α (°) 90 90 β (°) 90 126.190 γ (°) 120 120 V.M. (Å3/Da) N°mol 2.16 3 2.04 3

Tabella 1. Parametri di cella del citocromo c ossidato e ridotto.

Ferricitocromo Ferrocitocromo Risoluzione (Å) 44.63 - 1.75 65.09 - 1.90 <I>/σ(I) 21.5 9.0 N° di osservazioni 261279 58077 N° di riflessioni uniche 33571 22833 Rmerge(I) 0.087 0.113 Completezza (%) 100 95.3

Tabella 2. Statistiche di scalatura per le strutture del citocromo c ossidato e ridotto.

Nel sistema trigonale esiste la possibilità di scegliere fra due celle con orientazione non equivalente, come si può osservare nello schema sottostante. Lungo l’asse cristallografico c, il sistema trigonale prevede la presenza di un asse di simmetria ternario: le molecole di proteina nel cristallo si ripetono dopo angoli di rotazione di 120° attorno a quest’asse. La seconda cella elementare (verde) è quindi indipendente dalla prima (rossa) e non può essere ridotta a questa utilizzando le operazioni di simmetria del cristallo. Gli assi a’ e b’ (assi cristallografici della seconda cella) sono disposti a 60° dagli assi a e b (assi cristallografici

della prima cella). Se si indica per la prima cella un riflesso con indici h, k e l, lo stesso riflesso verrà definito per la seconda cella con i nuovi indici h’ = -k, k’ = h+k e l’ = l.

Figura 2. Schema delle due possibili scelte di cella nel sistema trigonale