Il Centro di Reazione (RC)

Il centro di reazione è un macrocomplesso proteico presente in tutti gli organismi fotosintetici, da molti tipi di alghe e batteri a tutte le piante verdi. La struttura determinata ai raggi X di questo macrocomplesso sino a 2.8Å di risoluzione da Rhodobacter sphaeroides (J. P. ALLEN 1988) consiste di 3 subunità (L, M ed H) ed alcuni cofattori fra cui vi sono i chinoni (QA e QB). L’RC catalizza trasferimenti elettronici con due diverse modalità, ovvero il trasferimento mediato dai chinoni o dal citocromo c2. In particolare, l’interazione tra il citocromo c2 ed il macrocomplesso del centro di reazione (RC), presente nella membrana dei tilacoidi, è stata caratterizzata attraverso studi di diffrazione di raggi X.

Analizzando la struttura cristallografica del complesso, ottenuta dal batterio Rhodobacter

sphaeroides, sono state evidenziate all’interfaccia tra le due proteine specifiche interazioni di

tipo elettrostatico, interazioni di van der Walls, interazioni catione-π e legami ad idrogeno (Axelrod H.L. 2002; Paddock M.L. 2005). La regione del citocromo c2 che contiene le Lys99, 103 e 105 presenta un elevato numero di residui con carica elettrostatica, che permettono la formazione di interazioni elettrostatiche (d>4Å) con la regione acida sulle catene M ed L della batterio clorofilla, proteina appartenente al complesso del centro di reazione (Pogorelov T.V. 2007). I legami ad idrogeno coinvolgono, in particolare, i residui di Asn187M, Asn188M e Gln258L di RC che interagiscono con i residui Lys99 e Lys103 del citocromo c2 (d<3Å). Si generano anche numerose interazioni idrofobiche, quale per esempio l’interazione catione-π tra l’Arg32 del citocromo c2 e la Tyr295M di RC (d<4Å). Da studi computazionali sulla cinetica di formazione del complesso si è visto che i residui superficiali di Lys54, Lys93 e Lys99 del citocromo c2 interagiscono con i residui di Glu95M, Glu184M e

Glu292M sul complesso RC. È stata calcolata anche l’energia elettrostatica necessaria alla formazione rapida del complesso per la reazione di trasferimento elettronico, osservando che la migliore orientazione del citocromo c2 sulla subunità M è verso la Tyr162 sulla subunità L (Miyashita O. 2004).

Il complesso tra l’RC e il citocromo c2 è stato recentemente studiato anche tramite analisi filogenetiche basate sulla struttura e tramite tecniche di meccanica molecolare (Pogorelov T.V. 2007). L’energia libera di legame tra l’RC e il citocromo c2 ossidato è stata ottenuta usando il metodo di Poisson-Boltzmann per il calcolo dell’area di superficie. In questo caso il gruppo di ricerca era interessato a studiare il meccanismo di formazione e rottura del complesso tra le due proteine evidenziando in particolare la strategia di ingresso e di uscita della proteina solubile (citocromo c2) dal macrocomplesso. Dai dati teorici ottenuti è stato ipotizzato che il citocromo c2 adotti un meccanismo di dissociazione che lo vede migrare sulla superficie del Centro di Reazione seguendo una traiettoria parallela alla superficie stessa e diretta dalla subunità M verso la subunità L (figura 8).

Figura 8. Energia di interazione calcolata sulla superficie del complesso RC per il citocromo C2 (la regione in blu è la più favorita). La direzione ipotizzata per il meccanismo di dissociazione è rappresentata dalla direzione dell’asse dalla subunità M a quella L.

4. Scopo del progetto

Le strutture tridimensionali dei citocromi di tipo c con i relativi partner naturali permettono di ottenere informazioni sui meccanismi di trasferimento elettronico che stanno alla base dell’associazione e dissociazione dei macrocomplessi. Il processo che prevede il trasferimento dell’elettrone tra i gruppi eme provoca lo spostamento di alcuni residui amminoacidici situati in prossimità di questi gruppi. Questo comporta cambiamenti a livello delle posizioni dei

residui sulle superfici che portano ad arrangiamenti delle cariche elettrostatiche in queste regione e a variazioni nel network delle interazioni proteina – proteina. Il tutto dipende dallo stato di ossidazione dei metalli dei gruppi prostetici che caratterizzano il partner accettore e quello donatore.

Gli studi biocristallografici sono fondamentali per mettere in evidenza le differenze strutturali dipendenti dallo stato di ossidazione della proteina, riguardanti le posizioni dei residui localizzati in prossimità dei gruppi eme e di quelli superficiali; tramite queste analisi è inoltre possibile studiare il riarrangiamento della carica elettrostatica superficiale e quindi il network delle interazioni proteina – proteina. Alcuni di questi studi sono stati affrontati proprio grazie all’utilizzo di sonde naturali, quali gli stessi complessi molecolari (Pelletier H. 1992; Guo. M. 2004; Miyashita O. 2004). La particolarità del processo di trasferimento elettronico, che avviene nel mitocondrio, è la sua altissima resa dal punto di vista energetico, in termini di elevate moli di ATP prodotte e di una quantità minima di energia libera dissipata sottoforma di calore. Per fare ciò, alla base della cascata di reazioni mediate dalle proteine deputate al trasferimento, vi è la loro capacità di effettuare scambi con un’altissima resa minimizzando le perdite e le reazioni secondarie grazie ad un’elevatissima specificità di interazione.

Precedentemente al CEB erano state analizzate alcune strutture derivanti dal cyt C da cuore di cavallo nei due stati di ossidazione, Fe(II) e Fe(III), e co-cristallizzate con una sonda anionica quale lo ione nitrato (NO3-). Il lavoro è stato effettuato in collaborazione con il gruppo del Prof. Messori dell’Università di Firenze, dove sono stati prodotti i cristalli del ferri- e del ferro- cyt c da cuore di cavallo. Questo era stato effettuato per valutare la distribuzione delle cariche elettrostatiche sulla superficie della proteina che era poi stata messa in relazione, da una parte, ai cambiamenti strutturali dei residui vicino al sito catalitico e di quelli superficiali, e, dall’altra, allo spostamento della molecola d’acqua conservata ed omologa nei citocromi batterici. Analizzando nuove strutture del cyt c da cuore di cavallo ottenute sempre tramite co-cristallizzazione con ioni nitrato, durante il periodo del dottorato sono stati ottenuti nuovi interessanti dati di diffrazione.

Lo scopo di questo lavoro di tesi è l’analisi dei siti (hot spots) della catena proteica nelle strutture del citocromo ossidato e ridotto che si generano dall’interazione con gli ioni nitrato usata per stimare il riarrangiamento della carica elettrostatica superficiale legata allo stato ossido-riduttivo. Usando questa mappatura sperimentale e sulla base dei precedenti studi riportati sin qui, si è voluto indagare il comportamento del cyt C con i partners naturali nell’ambito della formazione e rottura dei macrocomplessi biologici che si formano nella catena respiratoria nei mitocondri, dando un contributo alla comprensione del fine meccanismo di trasferimento degli elettroni da un partner all’altro del cyt c.

La seconda parte di questo studio, invece, è mirata ad ottenere nuovi dati cristallografici, tramite diffrazione di raggi X, su un nuovo complesso di trasferimento elettronico, isolato dal batterio Shewanella Baltica e composto dalla nuova classe di citocromi tipo C, quali DHC (Di Heme Protein) e BHP (Baltica Heme Protein). Da una parte si cercherà di ottenere cristalli singoli dell’intero complesso, generato dall’associazione tra le due proteine, in grado di dare dati di diffrazione misurabili ed utilizzabili eventualmente per risolverne la struttura cristallografica. Di fondamentale importanza, in questo senso, saranno le fasi di cristallizzazione e di raccolta dati, indispensabili per la determinazione dei parametri di cella e del volume di Matthews, che saranno usati per ottenere informazioni preliminari sulla formazione del complesso. Dall’altra, saranno effettuate ulteriori cristallizzazioni, in condizioni differenti rispetto a quelle dell’intero complesso, per ottenere cristalli singoli della proteina DHC da Shewanella Baltica, la cui struttura cristallina è stata determinata sino ad ora solamente per l’omologa DHC, isolata dal batterio Rodobacter spheroides. L’ottimizzazione delle condizioni di crescita e la raccolta di dati di diffrazione ad elevata risoluzione saranno premessa necessaria per risolvere la struttura della nuova proteina, che assume un carattere innovativo all’interno della caratterizzazione strutturale dei citocromo tipo C batterici.

MATERIALI E METODI